專利名稱：活化膠原蛋白支架材料及其專用融合活性修復因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及活化膠原蛋白創(chuàng)傷修復支架材料及其具有膠原蛋白特異結合能力的融合活性修復因子。
背景技術：
由創(chuàng)傷、感染、腫瘤以及發(fā)育異常等原因造成的骨缺損是骨科臨床每天都要面臨的問題。人骨多形性蛋白BMP2具有很強的骨誘導活性。它是一個全長396個氨基酸殘基的糖基化蛋白，包括一段由19個氨基酸殘基組成的信號肽，由263個氨基酸殘基組成的pro-region以及由114個氨基酸殘基組成的成熟肽。成熟肽含有7個半胱氨酸和一個N-糖基化位點，其功能形式是通過一對二硫鍵聯(lián)系形成的同型二聚體，每個單體內的其余六個半胱氨酸形成三個鏈內二硫鍵(Wozney，J.M.et al.Novelregulators of bone formationmolecular clones and activities.Scienee 242，1528-34，1988)。但是天然BMP2含量很少，從人或動物骨基質中分離純化BMP2具有很大局限性。目前，人們著重研究通過基因工程的方法制備重組BMP2，以滿足臨床和基礎研究的需要。此外，功能類似于BMP2其它的可以誘導組織再生和創(chuàng)傷修復的因子還包括BMP3，PDGF，F(xiàn)GF，EGF，TGF，VEGF，NGF，NT3/4等。
膠原材料是常用的骨修復材料。膠原是骨的主要有機成分，I型膠原及其交聯(lián)纖維結構是骨細胞外基質中最豐富的蛋白。膠原結構對礦物沉積具有誘導作用，其表面含有礦物沉積的位點，可有效引發(fā)和控制礦化過程，促進骨形成并誘發(fā)至植入物中。傳統(tǒng)的膠原載體是通過膠原分子的分子結構阻止BMP2成分彌散，維持宿主靶細胞周圍的BMP2濃度，這樣一方面也要求其孔徑不能太大，但孔徑過小又不利于成骨細胞的生長，這就需要控制一定的膠原孔徑，給工藝學上帶來一定難度。另一方面，使用目前的生物材料作為BMP2的載體，BMP2的用量很大，往往要達到毫克級(Kirker-Head，C.A.，Gerhart，T.N.，Armstrong，R.，Schelling，S.H.& Carmel，L.A.Healingbone using recombinant human bone morphogenetic protein 2 and copolymer.ClinOrthop Relat Res，205-17(1998)；Kokubo，S.et al.Bone regeneration byrecombinant human bone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradablecarrier in a rabbit ulnar defect model.Biomaterials 24，1643-51(2003))。由于目前市場上BMP2很昂貴，僅sigma公司用于實驗研究的BMP2，每10μg售價達500美元，國內病人很少能負擔起B(yǎng)MP2的使用費用，另外，幾毫克的BMP2，相當于從一頭牛抽提的BMP2總和，而且這樣大量地使用BMP2，安全性也很令人擔憂。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有膠原蛋白特異結合能力，可用于活化膠原蛋白創(chuàng)傷修復支架材料的融合活性修復因子。
本發(fā)明所提供的用于活化膠原蛋白創(chuàng)傷修復支架材料的專用融合活性修復因子，是在修復因子的氨基端(N端)或羧基端(C端)融合膠原結合結構域(collagen bindingdomain，CBD)得到的融合蛋白；所述膠原結合結構域是由7-27個氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1。
所述修復因子可為BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4等可以誘導組織再生和創(chuàng)傷修復的因子，優(yōu)選為BMP2。
序列表中的SEQ ID №1由7個氨基酸殘基組成。
其中，在BMP2的N端融合膠原結合結構域得到的融合活性修復因子可具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №2由159個氨基酸殘基組成，其膠原結合結構域的保守序列為自氨基端第22-28位氨基酸殘基；編碼此融合活性修復因子的DNA序列為序列表中的SEQ ID №3，序列表中的SEQ ID №3由477個堿基組成。
上述融合蛋白可按照基因工程領域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的第二個目的是用上述專用融合活性修復因子活化的膠原蛋白創(chuàng)傷修復支架材料。
本發(fā)明所提供的活化膠原蛋白支架材料，是加載有上述專用融合活性修復因子的膠原蛋白。
所述專用融合活性修復因子的加載量為1-4000pmol蛋白/mg膠原蛋白。
本發(fā)明提供了一種活化膠原蛋白創(chuàng)傷修復支架材料及其專用融合活性修復因子。該專用融合活性修復因子是通過基因工程的方法在BMP2等修復因子的氨基端或羧基端融合CBD，以加強修復因子與膠原的結合，在修復因子與膠原蛋白之間建立一種較強的物理化學力，即可將BMP2等修復因子固定在膠原蛋白支架上，從而顯著提高骨損傷的修復能力，同時也可以大大減少BMP2等修復因子的用量，并降低了使用風險。本發(fā)明制備方法簡便，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產，并將在醫(yī)學領域特別是骨損傷的修復中發(fā)揮巨大作用。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為對經純化和復性的表達蛋白的15％ SDS-PAGE檢測結果圖2為濃度逐漸遞增的天然BMP2及專用融合活性修復因子rhBMP2-h與I型膠原蛋白結合量的統(tǒng)計結果圖3為等量天然BMP2及專用融合活性修復因子rhBMP2-h對I型膠原的結合能力的檢測結果圖4為專用融合活性修復因子rhBMP2-h的細胞活性檢測結果圖5為天然BMP2及專用融合活性修復因子rhBMP2-h的異位骨誘導實驗結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、專用融合活性修復因子的制備及其活性鑒定一、專用融合活性修復因子的制備1、專用融合活性修復因子原核表達載體的構建根據(jù)已知的人BMP2(hBMP2)的cDNA序列(GenBank號為650)設計PCR擴增引物，并在正向引物中引入膠原結合結構域(CBD)“TKKTLRT”(序列表中的SEQ ID №1)的編碼序列，引物序列如下hBMP2F15’-TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC-3’hBMP2F25’-CCGCATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGTACCGGTAGC-3’hBMP2R5’-CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3’以人BMP2 cDNA全長為模板，在引物hBMP2F1和hBMP2R的引導下進行PCR擴增，30μl PCR反應體系為正、反向引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶3ul；PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。反應結束后，對擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果經PCR擴增得到一條長度約400bp的DNA片段。對該片段進行回收并純化后，作為第二次PCR的模板，再在引物hBMP2F2和hBMP2R的引導下進行第二次PCR擴增，PCR反應體系及反應條件同上，擴增結束后，對PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到一條長度約430bp的條帶，對其進行回收并純化后，用限制性內切酶Nde I和Xho I雙酶切后與經相同酶雙酶切的原核表達載體pET-28a(Novagen)在16℃下，用T4DNA連接酶連接12-24小時，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質粒，對該表達載體多克隆位點區(qū)進行測序，結果插入序列與預期序列相符，具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由477個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，包括CBD區(qū)，linker區(qū)和hBMP2成熟肽編碼區(qū)，在插入?yún)^(qū)前還融合一段組氨酸親和標簽，其CBD區(qū)的保守序列為序列表中SEQ ID №2自氨基端第22-28位氨基酸殘基，linker區(qū)為自氨基端第31-43位氨基酸殘基，hBMP2成熟肽為自氨基端第46-159位氨基酸殘基，表明得到了正確的含有專用融合活性修復因子編碼序列的重組質粒，命名為pET-28a-BMP2-h。
2、專用融合活性修復因子的原核表達將步驟1構建的原核表達載體pET-28a-BMP2-h轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將篩選到的陽性單克隆轉接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-24小時，再以2％接種比例轉接于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時至OD600值達到0.8，加入終濃度為1mM的IPTG，相同條件下繼續(xù)誘導培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結束后，離心收集菌體，用PBS洗滌后再次離心收集菌體，用10mL PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，對裂解液進行15％ SDS-PAGE檢測，檢測結果表明得到了蛋白粗提液，表達蛋白以包涵體的形式存在。
3、專用融合活性修復因子的純化和復性首先將步驟2經超聲破碎的菌體離心收集包涵體。將稀釋復性得到的蛋白溶液進行超濾濃縮處理，然后將蛋白質溶劑體系用50mM MES緩沖液(購自GIBCO公司)置換，冷凍干燥后低溫保存。對經純化和復性的表達蛋白進行15％ SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖1所示(泳道M為Marker，泳道1為經純化的表達蛋白(還原條件下)，泳道2為經復性的表達蛋白)，泳道1的純化結果表明15KD的目的蛋白已經達到相當純度，由于BMP2的活性形式是通過一對二硫鍵形成的二聚體形式，在非還原條件下可看到其二聚體條帶，泳道2的檢測結果表明復性形成的二聚體已達到30％，將經純化的專用融合活性修復因子命名為rhBMP2-h。
二、專用融合活性修復因子的膠原結合活性鑒定1、專用融合活性修復因子的膠原結合能力分析1)檢測等量膠原對不同量天然BMP2及專用融合活性修復因子的結合量將濃度逐漸遞增的天然BMP2及步驟一制備的專用融合活性修復因子加載在用等量的I型膠原制備的膠原膜上，充分吸附后，經PBS洗滌掉不能結合的蛋白，通過測定與融合標簽結合的抗體所產生的特異可定量的顏色反應得到蛋白結合量，統(tǒng)計結果如圖2所示(橫坐標為蛋白加載量，縱坐標為在405納米測定的吸光值)，在蛋白濃度達到一定域值后，膠原對蛋白的結合能力都能到達相同的飽和量。而在到達這個域值前，在相同的蛋白加載量情況下，經改造得到的rhBMP2-h的保留量明顯高于天然BMP2(rhBMP-2)，即前者的結合效率明顯高于后者。實驗結果表明，經過改造的BMP2對膠原的結合能力比天然BMP2顯著增強。
2)檢測等量天然BMP2及專用融合活性修復因子對I型膠原的結合能力將等量的天然BMP2及步驟一制備的專用融合活性修復因子加載在I型膠原制備的膠原膜上，待充分吸附后分別用不同濃度的尿素洗脫，通過測定與融合標簽結合的抗體所產生的特異可定量的顏色反應得到蛋白結合量，蛋白結合量的統(tǒng)計結果如圖3所示(橫坐標為尿素濃度，縱坐標為在405納米測定的吸光值)，經改造得到的rhBMP2-h對膠原的結合曲線明顯高于天然BMP2，而且在低劑量的尿素水平，天然BMP2在膠原上的保留量大幅降低，很快接近其本底水平。
上述實驗從不同角度驗證了BMP2對膠原的特異結合能力，表明經過改造得到的專用融合活性修復因子rhBMP2-h對膠原的結合能力得到顯著提高。
三、專用融合活性修復因子的細胞活性檢測BMP2對細胞的作用主要是促進細胞向成骨細胞分化。Hiraki通過體細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMP2對成骨樣細胞MC3T3-E1有強烈刺激作用，用100ng/mL BMP2能使這種細胞的ALPase(堿性磷酸酶)活性增加5-20倍(Hiraki，Y.et al.Bone morphogeneticproteins(BMP-2 and BMP-3)promote growth and expression of the differentiatedphenotype of rabbit chondrocytes and osteoblastic MC3T3-E1 cells in vitro.J Bone Miner Res 6，1373-85(1991).)，此外，其對成肌細胞C2C12也具有強烈地轉分化作用，可以抑制其向肌細胞方向分化轉而向成骨細胞方向分化?，F(xiàn)使用小鼠成肌細胞系C2C12(購自協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞庫)對步驟一制備的專用融合活性修復因子的體外活性進行檢測，方法為用不同濃度的rhBMP2-h刺激C2C12細胞，作用三天后檢測ALPase的活性，陽性對照組采用的是由CHO細胞產生的rhBMP-2(購自Sigma公司)，實驗對照組是不帶有膠原結合結構域的天然BMP2(rhBMP-2)，結果如圖4所示(橫坐標為蛋白濃度，縱坐標為ALPase活性)，隨著rhBMP2-h濃度劑量的升高，ALPase活性也隨之升高，顯示出劑量依賴效應，且經過統(tǒng)計分析，各實驗組與對照組都存在極顯著差異(P＜0.05)，上述實驗結果表明經過稀釋復性的專用融合活性修復因子具有較高的生物活性。
實施例2、動物實驗—異位骨誘導體內檢測BMP2誘骨活性大多采用經典的異位成骨的方法，即將BMP2植入骨組織以外的異位組織中，植入后不同時間做組織學切片、X-線照相等檢查，觀察其在該組織中的誘骨活性(Wozney，J.M.et al.Novel regulators of bone formationmolecular clones and activities.Science 242，1528-34(1988).；Urist，M.R.Boneformation by autoinduction.1965.Clin Orthop Relat Res，4-10(2002).)。
本實施例采用上述相同的方法對天然BMP2及實施例1制備的專用融合活性修復因子的進行活性測定，具體實驗方法及結果如下實驗分三組天然BMP2(rhBMP-2)組、專用融合活性修復因子rhBMP2-h組和對照組。首先將膠原(來源于牛肌腱)制成1cm×1cm×0.1cm的正方形薄片，每mg膠原加載30pmol蛋白，對照組只加載PBS，冷凍干燥后備用。
選用成年雄性SD大鼠，背部皮下包埋制備好的上述加載不同蛋白的膠原材料塊。包埋4周后，取出包埋物，切片并進行HE染色，結果如圖5所示(a，b，c標尺5毫米；d，e，f標尺30微米)。圖5中的a、d圖分別表示沒有加載任何蛋白的對照組植入的膠原材料塊及組織學切片觀察結果，由于所制備的膠原膜支架材料具有良好的生物降解性能，可見包埋物已部分降解，整體變薄變軟，邊緣變得不平整，組織學切片上的反映是沒有任何骨形成的跡象。b、e圖分別表示加載天然BMP2的實驗組植入的膠原材料塊及組織學切片觀察結果，由于rhBMP-2本身具有異位誘骨能力，將其加載在膠原材料上，通過膠原結構在一定程度上阻止了rhBMP-2成分的擴散，啟動了一定的骨化過程，誘導了少量間充質細胞向骨系細胞分化，因而粉末出少量膠原基質和鈣離子沉積于材料之上，表觀的表現(xiàn)是包埋物比陰性對照組厚，其降解速度也變慢，其組織學切片顯示有少量編織骨(woven bones，WB)形成。c、f圖本別表示加載專用融合活性修復因子rhBMP2-h的實驗組的膠原材料塊及組織學切片觀察結果，改造過的rhBMP2-h與膠原具有特異的結合作用，且作用力較強，植入體內不易擴散稀釋，始終在作用位點保持較高的濃度，誘導大量間充質細胞向骨系細胞分化。分化形成的骨系細胞又可以分泌出大量新的膠原基質和鈣離子沉積在原有膠原材料上，原有材料降解釋放出的rhBMP2-h又有部分可能結合在新形成的膠原上，其表觀表現(xiàn)是膠原材料塊的降解速度變慢，大小變化不明顯，而且由于大量鈣離子的沉積作用，材料更硬，組織學切片顯示有板層骨(lamella bones，LB)形成，并可見骨基質(bone marrows)形成。上述實驗結果表明加載專用融合活性修復因子的經活化的膠原材料的異位誘骨效果明顯優(yōu)于對照。
序列表<160>3<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr1 5<210>2<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Thr Gly Thr20 25 30Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Val Asp Gln Ala Lys35 40 45His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro65 70 75 80Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu85 90 95Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val100 105 110Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu115 120 125Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val130 135 140Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg145 150 155<210>3<211>477<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atgactaaga aaaccctgcg tactggtacc ggtagcgcgg gcagtgctgc gggttctggc120ggtgtcgacc aagccaaaca caaacagcgg aaacgcctta agtccagctg taagagacac180cctttgtacg tggacttcag tgacgtgggg tggaatgact ggattgtggc tcccccgggg240tatcacgcct tttactgcca cggagaatgc ccttttcctc tggctgatca tctgaactcc300actaatcatg ccattgttca gacattggtc aactctgtta actctaagat tcctaaggca360tgctgtgtcc cgacagaact cagtgctatc tcgatgctgt accttgacga gaatgaaaag420gttgtattaa agaactatca ggacatggtt gtggagggtt gtggttgtcg ttaatag 47權利要求
1.融合活性修復因子，是在修復因子的氨基端或羧基端融合膠原結合結構域得到的融合蛋白；所述膠原結合結構域是由7-27個氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1。
2.根據(jù)權利要求1所述的專用融合活性修復因子，其特征在于所述修復因子為BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4。
3.根據(jù)權利要求2所述的專用融合活性修復因子，其特征在于所述修復因子為BMP2。
4.根據(jù)權利要求3所述的專用融合活性修復因子，其特征在于所述融合活性修復因子具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸殘基序列；編碼此融合活性修復因子的DNA序列為序列表中的SEQ ID №3。
5.活化膠原蛋白支架材料，是加載有權利要求1所述的融合活性修復因子的膠原蛋白。
6.根據(jù)權利要求5所述的活化膠原蛋白支架材料，其特征在于所述專用融合活性修復因子的加載量為1-4000pmol蛋白/mg膠原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了活化膠原蛋白支架材料及其專用融合活性修復因子。該專用融合活性修復因子，是在修復因子的氨基端或羧基端融合膠原結合結構域得到的融合蛋白；所述膠原結合結構域是由7－27個氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1?；罨哪z原蛋白支架材料，是加載有上述專用融合活性修復因子的膠原蛋白。本發(fā)明制備方法簡便，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產，將在創(chuàng)傷醫(yī)學領域發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C07K14/435GK1807459SQ20051013279
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權日2005年12月26日
發(fā)明者陳冰, 戴建武 申請人:煙臺正海生物技術有限公司, 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所