專利名稱：提高細菌基因表達的活化因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種提高細菌基因表達產(chǎn)物的新方法，可用于發(fā)酵工業(yè)，制備微 生物工程及基因工程的產(chǎn)品。本發(fā)明可以用應用于提高其它微生物基因表達等領(lǐng)域如環(huán) 境保護、石油裂解及開采，生物制藥及生物添加劑。
背景技術(shù)：
在Comamonas testosteroni 染色質(zhì) DNA 中克隆出的一段 DNA 片段(564bp)編碼了一種細菌活化因子蛋白，據(jù)資料報道；細菌中存在一種能與RNA聚合酶結(jié)合的活 化因子蛋白，該活化因子蛋白還能與細菌基因啟動子特異性地松散結(jié)合。本研究證明了 Comamonas testosteroni中的活化因子蛋白能夠提高大腸桿菌和Comamonastestosteroni某 些基因的表達，從而為該活化因子蛋白的應用提供了一個可行的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高細菌基因產(chǎn)物的表達，本發(fā)明提供如下質(zhì)粒
首先將280bp的tac啟動子DNA片段(Rai)克隆到質(zhì)粒pK18的BamHI酶切位點中，在tac啟動子下游再插入564bp的活化因子蛋白基因，從而構(gòu)建成為質(zhì)粒 pKtac_act5。如附圖2所示，pKtac_art5含有卡那霉素抗性基因，同時該質(zhì)?？稍诙鄶?shù)革 蘭氏陰性菌中復制。再不能復制的細菌中該質(zhì)?？烧系郊毦旧|(zhì)DNA中使細菌具有 卡那霉素抗性標志，從而達到篩選工程菌株的目的。在可復制的細菌中需要在培養(yǎng)基中 加入卡那霉素維持質(zhì)粒的存在，被整合的菌株則可在無抗生素的培養(yǎng)基中長期穩(wěn)定的保 持pKtac_act5的遺傳特性。
上述質(zhì)粒pKtac_act5提高細菌基因表達的主要特征在于
(1)在制藥工業(yè)中某些工程菌可以產(chǎn)生具有生物活性的藥物，但是由于表達量過 低，難以進行工業(yè)化生產(chǎn)。使用本質(zhì)粒pKtaC-aCt5可有效的提高工程菌的目的產(chǎn)物的表 達水平(5-50倍)，從而解決了分離提取的問題，并能達到藥品所規(guī)定的純度標準。
( 在自然環(huán)境中，有許多的化學農(nóng)藥污染，利用普通的微生物很難達到分解化 學農(nóng)藥的目的，使用本質(zhì)?？捎行У奶岣呶⑸锓纸饣瘜W有害物質(zhì)的能力。當本質(zhì)粒整 合到細菌染色質(zhì)DNA中之后，可相當穩(wěn)定的在卡那霉素的環(huán)境中保持50天以上。
采用了質(zhì)粒pKtaC-aCt5可有效的提高石油裂解菌群的石蠟液化能力，從而提高 石油產(chǎn)量。
(3)應用本質(zhì)粒重組的Comamonas testosteroni工程菌具有獨特的分解類固醇類化合物和脂肪功能，可以制備降低膽固醇類藥物及飼料添加劑.具體實施方案
實施例1
用氯化鈣方法直接將質(zhì)粒pKtaC-aCt5轉(zhuǎn)化到pK18可復制的細菌中，在培養(yǎng)基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可維持激活子蛋白的表達，從而提高基因表達產(chǎn)物的水平。
實施例2:
用點穿孔方法將質(zhì)粒pKtaC-aCt5轉(zhuǎn)化到pK18不可復制的細菌中，在培養(yǎng)基中加 入20-30ug/ml卡那霉素，即可在平皿中篩選出被質(zhì)粒pKtac_act5整合(細菌染色質(zhì)DNA) 的克隆。用PCR方法證明整合的正確性之后，該工程菌既可被使用。


本發(fā)明的提高細菌基因表達活化因子的基因序列、限制性內(nèi)酶切位點及生物學 活性結(jié)果見附圖1-6。
圖1 3a羥基睪丸酮氧化/脫氫酶(3a-HSD)的活化因子(激活子)基因及氨基 酸序列?；蛐蛄酗@示4個GTG起始密碼。在第3，4GTG附近制備的移碼突變pKPsSl 失去激活子活性，所以只有第1，2GTG是可能起始密碼。氨基酸序列顯示胰酶類似酶可 能的水解位點。
圖2:質(zhì)粒 pKtac_act5 (act5)的物理圖譜。
圖3 活化因子基因重組3a羥基睪丸酮氧化/脫氫酶(3a-HSD)后，酶聯(lián)免疫吸 附實驗檢測活性表達結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果證明將活化因子基因加到3 α -羥基睪 丸酮氧化/脫氫酶(3ci-HSD)基因的不同方向(Pl，Ρ23, Ρ24)都能提高3 α-羥基睪丸 酮氧化/脫氫酶(3 α -HSD)的表達(對照為Ρ6，無活化因子基因)。
圖4 酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果表明在E.Coli中當活化因子的表達量增高時3a羥 基睪丸酮氧化/脫氫酶(3a-HSD)表達也增高。
圖5 酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果表明在C.testosteroni菌中轉(zhuǎn)入pBBta t6，3a羥基睪 丸酮氧化/脫氫酶(3a-HSD)的表達都提高，對照為空質(zhì)粒PBBR1Mes_2和無質(zhì)粒野生菌。
圖6 活化因子作用機理。
1.活化因子能夠識別靶基因啟動子附近的特異對影DNA序列并結(jié)合成二或四聚 體。
2.該活化因子能與DNA依賴的RNA聚合酶結(jié)合，使靶基因啟動子處的RNA聚 合酶濃度大大增加，從而在轉(zhuǎn)錄水平上提高mRNA產(chǎn)量，使目的基因表達增加。
序列表
<110>熊光明任政華
<120>提高細菌基因表達的活化因子。
<160>2
<210>1
<211>567
<212>DNA
<213>假單胞旋毛菌(Comamonastestosteroni)
<400>1
1 gtg cgc gca gtg cac ttc cac age ate gaa gtt ggc ctg ctt ggc gcg cag ggc ggc cgc
60 age aaa cca ttc cac cat ctg tgc aat ate ggc ctt gtc cat cac gcg gta gcg gtc ggg
120gta ggg gcc aat ccc cac aaa ggt cga gaa ttc ctt ggg cgt gac ggt gcg cat ggc ttc
180ggc cac agg acc gtc ggg egg aat cga gga cac cca cat ctc gcg ccc gtg ggt gcg gtc
240att ggc age gac ctt gcc get gtg att gat ctg gat ggc gac ttt gcc gcc gtg cga gtg
300aac gcg gcg cgt gac ttc ggc cag acc ggg gat gaa get gtc gtt gga gat gcc cag ttg
360gtg egg ctc get ggt gcc ggt ggg cca gga gat ggc ggc cgt gcc cat gat gat gag gcc
420ggt gcc gcc ctt ggc acg ctc ttc gta ata gtc ctg ggc gcg ttc gcc gca gat acc gtc
480ggt gcc gcc gta gtt ctc gcc cat ggg ggc cat gat gat gcg gtt ctt cag ctc cat ggt
540gcc gat acg gcc egg ctg cag cat tga 567
<210>2
<211>150
<212>PRT
<213> 假單胞旋毛菌(Comamonas testosteroni)
<400>2
ValArgAlaValHisPheHisSerlieGluValGlyLeuLeuGly
151015
AlaGlnGlyGlyArgSerLysProPheHisHisLeuCysAsnlie
202530
GlyLeuValHisHisAlaValAlaValGlyValGlyAlaAsnPro
354045
HisLysGlyArgGluPheLeuGlyArgAspGlyAlaHisGlyPhe
505560
GlyHisArgThrValGlyArgAsnArgGlyHisProHisLeuAla
657075
ProValGlyAlaVallieGlySerAspLeuAlaAlaVallieAsp
808590
LeuAspGlyAspPheAlaAlaValArgValAsnAlaAlaArgAsp
95100105
PheGlyGlnThrGlyAspGluAlaValValGlyAspAlaGlnLeu
110115120
ValArgLeuAlaGlyAlaGlyGlyProGlyAspGlyGlyArgAla
125130135
HisAspAspGluAlaGlyAlaAlaLeuGlyThrLeuPheVallie
140145150
權(quán)利要求
本發(fā)明是通過基因篩選和重組得到一種質(zhì)粒pKtac-act5，其主要特征在于提高細菌基 因表達。構(gòu)建的質(zhì)粒pKtac_act5，將280bp的tac啟動子DNA片段和一個564bp的活化子基因 片段克隆到質(zhì)粒pK18中獲得本活性質(zhì)粒。本質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，同時該質(zhì)?？?在多數(shù)革蘭氏陰性菌中復制。在不能復制的細菌中該質(zhì)?？烧系郊毦旧|(zhì)DNA中使 細菌具有卡那霉素抗性標志，從而達到篩選工程菌株的目的。
1.本質(zhì)粒pKtac_act5 基因全序列為哲竺 CGC GCA GTG CAC TTC CAC AGC ATC GAA GTT GGC CTG CTT GGCGCG CAG GGC GGC CGC AGC AAA CCA TTC CAC CAT CTG TGC AAT ATCGGC CTT GTC CAT CAC GCG GTA GCG GTC GGG GTA GGG GCC AAT CCCCAC AAA GGT CGA GAA TTC CTT GGG CGT GAC GGT GCG CAT GGC TTCGGC CAC AGG ACC GTC GGG CGG AAT CGA GGA CAC CCA CAT CTC GCGCCC GTG GGT GCG GTC ATT GGC AGC GAC CTT GCC GCT GTG ATT GATCTG GAT GGC GAC TTT GCC GCC GTG CGA GTG AAC GCG GCG CGT GACTTC GGC CAG ACC GGG GAT GAA GCT GTC GTT GGA GAT GCC CAG TTGGTG CGG CTC GCT GGT GCC GGT GGG CCA GGA GAT GGC GGC CGT GCCCAT GAT GAT GAG GCC GGT GCC GCC CTT GGC ACG CTC TTC GTA ATAGTC CTG GGC GCG TTC GCC GCA GAT ACC GTC GGT GCC GCC GTA GTTCTC GCC CAT GGG GGC CAT GAT GAT GCG GTT CTT CAG CTC CAT GGTGCC GATACG GCC CGG CTG CAG CAT TGA對上述全基因序列(564bp+TGA) 具有知識產(chǎn)權(quán)保護。
2.對上述全基因序列的刪除、增添或突變具有保護。
3.使用本質(zhì)粒pKtaC-aCt5可有效的提高制藥工業(yè)中工程菌的目的產(chǎn)物的表達水平 (5-50倍)。有效的提高微生物分解化學有害物質(zhì)的能力，可有效的提高石油裂解菌群的 石蠟液化能力，從而提高石油產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高細菌基因表達的活化因子。該激活因子主要用于提高細菌基因組中目的產(chǎn)物的提高。該活化因子基因分離于Comamonas testosteroni一種革蘭氏陰性細菌的染色質(zhì)DNA。該基因含有564bp。首先將280bp的tac啟動子DNA片段克隆到質(zhì)粒pK18的BamHI酶切位點中，在tac啟動子下游再插入564bp的活化因子基因蛋白，從而構(gòu)建成為質(zhì)粒pKtac-act5。pKtac-act5含有卡那霉素抗性基因，并可在多數(shù)革蘭氏陰性菌中復制。利用該質(zhì)粒pKtac-act5可提高細菌基因表達。使工程菌的目的產(chǎn)物的表達水平(5-50倍)。采用了本質(zhì)粒pKtac-act5可有效的提高微生物分解化學有害物質(zhì)的能力，生物工程制藥。也可有效的提高石油裂解菌群的石蠟液化能力，從而提高石油產(chǎn)量。
文檔編號A61K35/74GK102021194SQ20091019218
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者任政華, 熊光明 申請人:任政華, 熊光明