本申請要求享有于2014年8月12日提交的申請?zhí)枮?2/036,412的美國臨時申請和于2015年4月2日提交的申請?zhí)枮?2/142,400的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。這些和所有其它參考的外部材料通過引用整體并入本文。當(dāng)通過引用并入的參考文獻的定義或術(shù)語的使用與本文所提供的該術(shù)語的定義不一致或相反時，以本文提供的該術(shù)語的定義為準(zhǔn)。

本發(fā)明的領(lǐng)域為肉毒桿菌神經(jīng)毒素。

背景技術(shù)：

下面的描述包括有助于理解本發(fā)明的信息。但這里并非承認(rèn)，本文所提供的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)或與現(xiàn)有要求保護的發(fā)明有關(guān)，或本文明確或隱含引用的任何披露為現(xiàn)有技術(shù)。

來自疾病特異性的細(xì)胞類型的分泌過多是許多內(nèi)分泌、免疫和分泌性疾病的特征。例如，肥大細(xì)胞的分泌支持嚴(yán)重過敏反應(yīng)、過敏反應(yīng)、自身免疫和其它炎癥性疾病，而來自上皮細(xì)胞的粘蛋白的分泌引起囊性纖維化(cf)和慢性阻塞性肺病(copd)。通過靶向分泌所需的核心機制來減少分泌能夠為這樣的疾病提供新的且有效的治療方式。這樣的來自疾病特異性細(xì)胞類型的分泌由snare(可溶性n-乙基馬來酰亞胺—敏感因子附著蛋白受體)蛋白介導(dǎo)，所述snare蛋白是膜相關(guān)蛋白家族，其形成復(fù)合物，所述復(fù)合物介導(dǎo)與質(zhì)膜的囊泡融合以及隨后囊泡內(nèi)容物的釋放。

非神經(jīng)元snare對于內(nèi)分泌和代謝途徑是至關(guān)重要的，所述內(nèi)分泌和代謝途徑調(diào)節(jié)激素、生長因子和其他信號分子的釋放。這樣的分泌途徑中的功能障礙導(dǎo)致疾病。例如，所述非神經(jīng)元snare蛋白snap-23對于多個疾病途徑的分泌是至關(guān)重要的，所述多個疾病途徑的分泌包括關(guān)節(jié)炎中的il-6(白細(xì)胞介素-6)和tnf(腫瘤壞死因子)的釋放，copd、cf和特發(fā)性支氣管擴張中的粘蛋白分泌過多，止血中的血小板分泌，糖尿病中的胰島素分泌，血壓調(diào)節(jié)中的腎素釋放以及在腫瘤細(xì)胞侵襲中的基質(zhì)降解酶的釋放。類似地，非神經(jīng)元snare蛋白snap-29被認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì)釋放的負(fù)調(diào)節(jié)劑，并且是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑的關(guān)鍵組成部分，snap-29的突變導(dǎo)致稱為cednik的神經(jīng)皮膚綜合癥。

通過調(diào)節(jié)snare蛋白的活性阻斷分泌已經(jīng)通過以下事實被證明了：通過使用肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bont)降解介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的神經(jīng)元snare蛋白，從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)從運動神經(jīng)元的釋放。肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bont)，是由細(xì)菌肉毒桿菌(clostridiumbotulinum)產(chǎn)生的鋅內(nèi)肽酶家族，是一類被fda批準(zhǔn)用于廣泛的治療和美容應(yīng)用的功能強大的藥物。有七個廣泛認(rèn)知的bont血清型(bont/a～bont/g)，和最近報告的血清型h。bont切割在運動神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的一種或多種可溶性n-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(snare)蛋白，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并導(dǎo)致弛緩性麻痹。

盡管在已知的最致命的天然物質(zhì)中，bont被廣泛用于各種藥物和美容應(yīng)用，包括頸部肌張力障礙、多汗癥、斜視、眼瞼痙攣、眉間皺紋和慢性偏頭痛。在中毒期間，bont經(jīng)由該分子的h鏈部選擇性地結(jié)合并進入運動神經(jīng)元。在進入運動神經(jīng)元時，該分子的l鏈部被釋放，并以高度序列特異性的方式降解受控的神經(jīng)遞質(zhì)分泌所需的靶向snare蛋白。這導(dǎo)致與治療運動神經(jīng)元相關(guān)聯(lián)的肌肉收縮的特定且長期的減少。與運動神經(jīng)元的結(jié)合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放中利用的snare的降解都是高度特異性的。例如，bont/a是大多數(shù)基于bont的藥物的基礎(chǔ)，其通過特異性切割蛋白snap-25來阻斷來自暴露的運動神經(jīng)元的分泌，但不與其它細(xì)胞類型結(jié)合或切割其它(例如那些在非神經(jīng)元細(xì)胞中表達的)snap-25同種型。之前，bont已通過h鏈修飾被重定向到了非神經(jīng)元細(xì)胞類型。然而，重定向的bont的治療效用受到神經(jīng)元snare蛋白的水解特異性的限制。因此，bont的治療用途目前限于神經(jīng)元相關(guān)的疾病/病癥，對于治療非神經(jīng)元分泌紊亂不起作用。

因此，仍然存在對在非神經(jīng)元細(xì)胞中的具有治療性分泌抑制作用的bont和/或修飾的bont的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主題在于提供一種裝置、系統(tǒng)以及方法。

下面將通過優(yōu)選實施例和附圖的詳細(xì)描述來具體闡述本發(fā)明主題的各種目的、特征、方面和優(yōu)點，附圖中的相同標(biāo)記表示相同組成部分。

附圖說明

圖1的a和b描述了本發(fā)明構(gòu)思的方法的示例性結(jié)果。圖1的a描繪了示例性的肉毒桿菌lc(輕鏈)的strep-tactin(鏈霉親和素(streptavidin)的突變體)純化的電泳結(jié)果以及來自一組分子量標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。圖1的b通過使用具有將供體熒光團接合到受體熒光團的lc切割區(qū)域的fret構(gòu)建體，示出了fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定獲得的典型結(jié)果，所述fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定應(yīng)用于lc制劑的連續(xù)稀釋，所述lc制劑從5毫升或200微升培養(yǎng)體積的轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到。

圖2示意性地描述了本發(fā)明構(gòu)思的測定方法。示出了工作流程中肉毒桿菌輕鏈(lc)的三個不同的切入點，代表三種不同的測定方法。

圖3說明了兩個非神經(jīng)元snare蛋白(snap-23和snap-29)與如在針對肉毒桿菌神經(jīng)毒素a或e的示例性報告構(gòu)建體中所表示的神經(jīng)元snaresnap-25序列的一部分的比對。示出了所述snap-25序列的a-外部位點(a-exosite)和β-外部位點(β-exosite)的識別區(qū)域，由箭頭示出了與肉毒桿菌神經(jīng)毒素a的輕鏈(lc)的特定氨基酸相互作用的殘基。也同時示出了與肉毒桿菌神經(jīng)毒素a輕鏈活性有關(guān)的snap-25切割位點。

圖4示出了示例性的微孔板，其中在單個孔中進行的試驗的布置通過使用本發(fā)明構(gòu)思的方法便于高通量測試。

具體實施方式

下面的描述包括有助于理解本發(fā)明的信息。但這里并非承認(rèn)，本文所提供的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)或與現(xiàn)有要求保護的發(fā)明有關(guān)，或本文明確或隱含引用的任何披露為現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明主題提供組合物和方法，所述方法用于產(chǎn)生和鑒定提供突變的bont輕鏈(lc)的組合物，所述突變的bont輕鏈(lc)具有對于非神經(jīng)元snare蛋白的蛋白水解活性。非神經(jīng)元snare蛋白包括涉及非神經(jīng)元細(xì)胞(包括神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞)的分泌過程的snare蛋白。現(xiàn)有bont蛋白(例如bont/a)的輕鏈(lc)內(nèi)的選定氨基酸可以在一個或多個位點突變，以提供一個或多個例如snap-23和/或snap-29的非神經(jīng)元snare蛋白的識別、底物特異性和/或增強的反應(yīng)動力學(xué)。提供了鑒定有用的或合適的突變輕鏈的輕鏈分離和表征方法，以及利用這樣的構(gòu)建體的治療方法。

應(yīng)當(dāng)理解，所公開的組合物和方法提供許多有利的技術(shù)效果，所述技術(shù)效果包括提供了對來自非神經(jīng)元細(xì)胞的分泌過多的特定且長期的控制以及減輕相關(guān)疾病。

如本文的描述和隨后的權(quán)利要求書中所使用的，除非文中另有明確說明，否則“一個”，“一種”和“所述”的含義包括復(fù)數(shù)指代。此外，如本文的描述中所使用的，除非文中另有明確說明，否則“在...中”的含義包括“在...中”和“在...上”。

除非文中有相反指示，否則本文所闡述的所有范圍應(yīng)解釋為包括其端點，并且開放式范圍應(yīng)解釋為僅包括商業(yè)實用價值。類似地，除非文中有相反指示，否則所有值的列表應(yīng)被認(rèn)為包括中間值。在本文中值的范圍的引用僅旨在用作單獨提及落在所述范圍內(nèi)的每個單獨的值的快捷方法。除非本文另有說明，具有范圍的每個單獨的值被并入本說明書中，如同其在本文中被單獨引用一樣。

除非本文另有說明或與文中明顯矛盾，否則本文所述的所有方法能夠以任何合適的順序進行。任何及所有實例的使用或相對于某些實施例提供的示例性語言(例如，"如")僅僅是為了更好地說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明其他所要求保護的范圍的限制。說明書的語言不應(yīng)該被解釋為表明本發(fā)明實踐所必需的任何未要求保護的元素。

本文公開的本發(fā)明的替代元素的分組或?qū)嵤├粦?yīng)被解釋為限制。每組成員可以單獨地或者以與該組其它成員或本文中出現(xiàn)的其它元素的任何組合的形式來被引用和要求保護。出于方便和/或可專利性的原因，一個組的一個或多個成員能夠被包括在一個組中或從一個組中刪除。當(dāng)發(fā)生任何這樣的包括或刪除時，本文中的說明書被視為包含經(jīng)改進的組，從而實現(xiàn)所附權(quán)利要求中使用的所有馬庫什群組的書面說明。

以下討論提供了本發(fā)明主題的許多示例實施例。盡管每個實施例表示本發(fā)明元素的單個組合，但是本發(fā)明主題被認(rèn)為包括所公開元素的所有可能組合。因此，如果一個實施例包括元素a，b和c，并且第二實施例包括元素b和d，則即使沒有明確公開，本發(fā)明主題也被認(rèn)為包括a，b，c或d的其他剩余組合。

在本發(fā)明構(gòu)思的實施例中，對非神經(jīng)元snare具有特異性的修飾的bont衍生自與肉毒桿菌神經(jīng)毒素相關(guān)的天然序列，所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素包括bont/a，bont/b，bont/c，bont/d，bont/e和bont/f。這些神經(jīng)毒素包括輕鏈(lc)部分，例如bont/a(seqidno4)的輕鏈，其特異性結(jié)合并表現(xiàn)出對神經(jīng)元snare的蛋白水解活性。如下文詳述，本發(fā)明構(gòu)思的實施例包括通過lc序列內(nèi)的一個或多個選定氨基酸的位點特異性突變衍生的肽。

這些突變可以以細(xì)菌，酵母和/或攜帶編碼感興趣的肽的表達載體的其他細(xì)胞的形式提供。此類表達載體可以是短暫感染的結(jié)果，也可以是誘導(dǎo)型或非誘導(dǎo)型的?？梢允褂皿w外測定來鑒定對非神經(jīng)元snare具有增強的結(jié)合和/或具有底物特異性的突變的bontlc的存在，這有助于自動化操作。

報告子(reporter)廣泛用于高通量篩選(hts)研究，以鑒定bont抑制劑和基于bont的藥物產(chǎn)品效力測試。商用測定利用融合肽報告子，其包括由神經(jīng)元snare蛋白底物的一部分分離的肽熒光團的福斯特能量共振轉(zhuǎn)移(fret)對。神經(jīng)元snare蛋白底物的蛋白水解引起fret對的分離，從而引起可觀察的熒光的變化，所述可觀察的熒光的變化使bont蛋白水解切割的靈敏和精確的定量測量成為可能。為了表征具有期望的非神經(jīng)元snare特異性的突變的bont肽，提供了修飾的botest報告子，其包含代表期望的snare蛋白質(zhì)特異性的非神經(jīng)元snare序列，所述非神經(jīng)元snare序列插入在肽熒光團的fret對之間。例如，為了表征對snap-23具有增強的結(jié)合和/或具有底物特異性的突變的bont，可以使用包含snap-23氨基酸序列(例如，seqidno：2)的全部或一部分的報告構(gòu)建體，所述snap-23氨基酸序列插入在熒光肽(例如，黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白)的fret對之間。類似地，為了便于鑒定對snap-29具有增強的結(jié)合和/或具有底物特異性的突變的bont，可以使用包含snap-29氨基酸序列(例如，seqidno：3)的全部或一部分的報告構(gòu)建體，所述snap-29氨基酸序列插入在熒光肽(例如，黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白)的fret對之間。

在一些實施例中，報告構(gòu)建體能夠包括錨定區(qū)域。這種錨定區(qū)域可用于將報告構(gòu)建體定位于測試表面或膜。在這樣的實施例中，切割位點介于在錨定區(qū)域和報告區(qū)域(例如，一種或多種熒光蛋白)之間。切割位點的切割導(dǎo)致報告子從測試表面或從膜上釋放?？梢砸栽S多方式檢測所述切割活性，包括表征來自在測試表面或膜區(qū)域的報告子的殘留信號，在釋放后檢測來自報告子的信號，或在從測試表面或膜釋放之后由于報告子區(qū)域的降解而造成的來自報告子的信號丟失。在優(yōu)選的實施例中，錨定區(qū)域提供了對脂膜的定位。合適的脂膜包括施加到表面或由表面支承的細(xì)胞膜，質(zhì)膜，囊泡膜和/或脂質(zhì)層。在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，報告構(gòu)建體可以是在相同活細(xì)胞內(nèi)表達和表征突變的bont活性。

如上所述，bont存在于許多不同的血清型中：bont/a,bont/b,bont/c,bont/d,bont/e,bont/f和bont/g。最近還提出了bont/h。它們在氨基酸序列，作用時間和/或底物特異性方面存在差異。例如，bont/a和bont/e都對snap-25(seqidno1)具有底物特異性，然而bont/a具有幾個月的作用時間，而bont/e具有幾天的作用時間。能夠至少部分地基于期望的作用時間來選擇用于突變以改變底物特異性的bont。在一些實施例中，僅所選bont的輕鏈(lc)序列(即bont的提供底物識別和蛋白水解活性的部分)被突變。在一個優(yōu)選的實施例中，bont/a(lc/a，seqidno4)的lc肽用作突變的bont肽的基礎(chǔ)。

本發(fā)明構(gòu)思的一個實施例是用于鑒定突變的bont肽的方法，當(dāng)相比于具有天然bont序列(即沒有突變)的相應(yīng)肽時，所述突變的bont肽具有改進的對非神經(jīng)元snare的底物特異性和/或反應(yīng)動力學(xué)。例如，這種突變的bont肽能夠顯示出，其對于非神經(jīng)元snare的結(jié)合能為具有天然bont序列的相應(yīng)肽的對于非神經(jīng)元snare的結(jié)合能的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或比其更大。類似地，這種突變的bont肽能夠顯示出，其指示對于目的非神經(jīng)元snare的蛋白水解切割的反應(yīng)動力學(xué)為具有天然bont序列的相應(yīng)肽的對于目的非神經(jīng)元snare的蛋白水解切割的反應(yīng)動力學(xué)的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或比其更大。在一些實施例中，能夠?qū)θL或截短的lc序列進行利用如上所述的修飾的botest報告構(gòu)建體的篩選研究，以鑒定具有期望特征的那些lc序列。全長序列的使用有利地提供了完整bont的更準(zhǔn)確表示，并支持提供高度純化的活性肽產(chǎn)物的純化方案。在優(yōu)選的實施例中，對全長(448個氨基酸)lc/a(seqidno4)或lc/a衍生序列進行篩選研究。通過使用旋轉(zhuǎn)柱，能夠?qū)崿F(xiàn)用于培養(yǎng)體積從5ml至200μl培養(yǎng)物的微型化、簡化和重新優(yōu)化的方案。

在典型篩選研究的例子中，5ml和200μl培養(yǎng)物產(chǎn)生可測定量的lc/a。使用具有天然序列的lc/a，通常在小于1小時內(nèi)對于來自200μl樣品的高稀釋度(例如，1:20,000)的制備物觀察到完整的a/e報告子的切割。延長孵育能夠提高靈敏度。例如，將孵育時間延長至18小時通常顯示來自1:200,000稀釋的天然序列l(wèi)c/a的典型200μl規(guī)模的制備物的可檢測的活性。在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，提供了對照報告構(gòu)建體，其中供體和受體熒光團被未在神經(jīng)元或非神經(jīng)元的snare上表示的切割位點分開。這種對照報告構(gòu)建體可用于測定非特異性蛋白酶活性，例如由于突變lc部分的污染或不期望的活性。這種對照報告構(gòu)建體的例子是ko，其是對非bont蛋白酶敏感的對bont不敏感的對照a/e報告構(gòu)建體。

以下為能夠識別非神經(jīng)元snare蛋白snap-23和snap-29的bontlc/a突變體的鑒定的例子。

lc/a可以從少至200μl的細(xì)菌培養(yǎng)物獲得，使得蛋白能夠在96孔微孔板的單個孔中表達(參見圖1)。如圖所示，將培養(yǎng)體積從常規(guī)5ml體積減少至200μl(其可以方便地容納在常規(guī)96孔微孔板的單個孔內(nèi))對衍生自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的lc的產(chǎn)率或活性沒有明顯影響。由于在溶菌之后表達的突變lc/a結(jié)合于孔表面并且可以在測定前通過洗滌來純化，能夠使用市售包被的96孔板(來自iba)在單個孔中進行一些或全部測定步驟(圖2)。隨后可以通過向孔中加入含有包含snap-23或snap-29的報告構(gòu)建體的反應(yīng)緩沖液并孵育來進行測定。這種方法提供測定的高通量，并且減少了時間、成本和樣品操作。

如圖2所示，存在若干有用的測試策略。在所有這些測試策略中的工作流程是相似的：培養(yǎng)和誘導(dǎo)，隨后裂解誘導(dǎo)的細(xì)胞并分離表達的lc，隨后表征表達的lc的活性。所述方法在lc進入測試過程的進入點不同。在一些實施例中，生長和誘導(dǎo)，裂解和分離以及活性測試能夠在同一測試孔中發(fā)生。在其它實施例中，生長，誘導(dǎo)和裂解在另一個容器或測試裝備中進行，同時lc的分離和其活性的表征在測試板的相同的孔中進行。在另一個實施例中，lc的生長、誘導(dǎo)、裂解和分離發(fā)生在與測試板分離的容器和/或固定器中，并且被分離的lc被轉(zhuǎn)移到所述測試板的孔中用于表征其活性。在一些實施例中，單個測試板可以用于同時執(zhí)行這些測試工作流程中的兩個或更多個。如圖2所示，在一些情況下，包被的板可用于整個測定工作流程，在其它實施例中，這種板僅用于蛋白質(zhì)純化和/或篩選測試。

如圖2所示，表達突變的lc/a的細(xì)菌可以在常規(guī)96孔微孔板中培養(yǎng)，然后接種到標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板(圖2的策略2和3)或包被(圖2的策略1)的96孔微孔板中的新鮮培養(yǎng)基中，在其中所述表達突變的lc/a的細(xì)菌被培養(yǎng)，誘導(dǎo)并孵育足夠的時間(例如，過夜)，以使突變的lc/a生長和表達。誘導(dǎo)后，細(xì)菌裂解。來自包被板的培養(yǎng)物的表達的突變lc/a結(jié)合板孔壁，而在標(biāo)準(zhǔn)板中生長的裂解的培養(yǎng)物可以加入包被的板中并進行測試。隨后可以用合適的洗滌緩沖液(例如含有0.1％tween-20的磷酸鹽緩沖鹽溶液(pbs-t))洗滌測試孔以除去未結(jié)合的材料。也可以使用離心柱純化裂解的培養(yǎng)物，并在常規(guī)微孔板的孔中測試。在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，將對照報告構(gòu)建體如ko加入至少一些測試孔中以監(jiān)測非特異性蛋白酶活性。

由于相對于snap-25(seqidno1)的天然lc/a切割，具有改變的底物特異性的突變體可能具有改變的反應(yīng)速率和/或催化轉(zhuǎn)化，可以通過滴定在純化和測定期間使用的誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物的量以確定作出響應(yīng)的稀釋度，從而確定測定檢測限，所述稀釋度作出的所述響應(yīng)，與不含誘導(dǎo)培養(yǎng)物的對照的響應(yīng)相比具有大約2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在優(yōu)選的實施例中，以這種方式測試的突變lc在至少約4小時內(nèi)以至少約1:100的稀釋度產(chǎn)生適當(dāng)?shù)臋z測肽構(gòu)建體的可檢測的切割。

可以通過用先前表征的bont報告構(gòu)建體的相應(yīng)部分取代snap-23和/或snap-29序列的全部或部分來產(chǎn)生snap-23和snap-29的報告肽構(gòu)建體。例如，snap-23或snap-29可以通過用a/e中的snap-25片段分別與snap-23(例如seqidno2)和snap-29(例如seqidno3)的部分或全長交換來生產(chǎn)報告肽構(gòu)建體。由于名義為snap-23和snap-29插入片段(分別為seqidno：2和3)比snap-25(seqidno：1)(圖3)略短；可以添加間隔肽序列以保持所有報告子的大小一致性。表達載體可以被構(gòu)建，被表達并所得報告肽被純化，例如用于體外測試目的。由此可以定量產(chǎn)生的報告構(gòu)建體的大小，純度和產(chǎn)量?？梢杂胋ont/a和/或bont/e測試snap-23和snap-29報告構(gòu)建體以驗證這些蛋白酶缺乏底物活性。通過非bont蛋白酶(例如，胰蛋白酶)切割這種構(gòu)建體可用于驗證熒光肽的性能。

bont/a輕鏈(lc)和snap-25(seqidno：1)的一部分之間的結(jié)合位點和/或識別相互作用位點示于圖3中，同時示出了snap-25(seqidno：1)與非神經(jīng)元snare蛋白snap-23(seqidno：2)和snap-29(seqidno：3)之間的序列比對。相互作用中涉及的特定氨基酸和bont/alc的相應(yīng)的相互作用氨基酸由箭頭示出。還示出了由bontalc切割的snap-25(seqidno1)上的位點。當(dāng)被占據(jù)時，所示的α-和β-外部位點代表抑制與bont/alc的反應(yīng)的snap-25(seqidno1)的區(qū)域。

使用靶向被鑒定為與lc/a：：snap-25相互作用相關(guān)的關(guān)鍵殘基的定點lc/a誘變，可以實現(xiàn)具有所期望的改變的底物特異性的修飾的lc/a的開發(fā)，從而產(chǎn)生突變lc肽庫?？梢匀缟纤龊Y選這些庫的新的底物特異性和/或反應(yīng)動力學(xué)。

與許多蛋白酶不同，bont需要大底物用于最佳切割。lc活性位點的幾何形狀和組成在bont血清型中高度保守，表明底物特異性起源于首先通過定向底物的外部位點相互作用發(fā)生的lc::底物結(jié)合，穩(wěn)定復(fù)合物，并促進額外的接觸，所述接觸使lc準(zhǔn)備好切割活性。發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到，非天然snare同種型的切割是有效底物結(jié)合的作用，因為lc活性位點高度保守，不參與底物側(cè)鏈相互作用，并且參與肽鏈切割的反應(yīng)不需要在切割位點的特異性氨基酸側(cè)鏈的存在。

例如，負(fù)責(zé)snap-25(seqidno1)相互作用的lc/a接觸殘基在snap-23和snap-29的相應(yīng)殘基中高度或部分保守(參見圖3)。飽和和特異性誘變的混合可用于基于它們所匹配的snap結(jié)構(gòu)域(例如α-外部位點，延伸的接頭和活性位點殘基)產(chǎn)生不同類別的突變體。沿著snap-25α-外部位點延伸的bont/alc疏水性側(cè)鏈相互作用在snap-23和snap-29中在很大程度上保守(參見圖3)。然而，snap-23和snap-29都在snap-25asp166上含有取代，破壞了具有l(wèi)c/alys337的鹽橋并且可能改變結(jié)合穩(wěn)定性。snap-29還含有snap-25gln152取代，其潛在地影響與lc/alys356的極性側(cè)鏈接觸和在snap-25ile156的另外的非保守性gly取代。在lc/alys356和lys337的飽和誘變可用于產(chǎn)生lc/a突變體，其補償在與snap-23和snap-29相互作用時穩(wěn)定性鹽橋和極性側(cè)鏈接觸的損失。

snap-25的arg176和lc/a的glu148之間的鹽橋提供了用于底物定位的潛在的關(guān)鍵錨定點，并且所述錨定點與snap-23和snap-29一起丟失。通過將lc/aglu148突變?yōu)閘ys或arg，可以提供在snap-29中重建鹽橋的突變lc/a肽庫。snap-23在所述位置含有pro取代，因此通過將lc/a的val304和ser143突變?yōu)閍sp或glu以利用鄰近的lys和arg殘基，可以提供針對所述底物的突變lc/a的備選鹽橋。極性側(cè)鏈相互作用發(fā)生在snap-25(seqidno1)glu193和lc/aasn136之間，并且在snap-23和snap-29中都被破壞。在snap-23中，通過將lc/aasni36突變?yōu)閘ys或arg，從而產(chǎn)生鹽橋，可以提供補償這種鹽橋的突變lc/a庫。類似地，也可以通過在所述位置的飽和突變產(chǎn)生突變lc/a庫以篩選補償snap-29中的thr取代的突變體。

snap-23和snap-29的活性袋包括大的帶正電荷的殘基(分別為lys和arg)，其代替snap-25thr200。這些取代可以通過擴大袋和/或在lc/a中的leu256和val258處引入帶負(fù)電荷的殘基來適應(yīng)?？梢栽谶@些位置進行asp，ala和gly取代以擴大和/或使活性袋更有利于snap-23和/或snap-29。snap-29還在snap-25asp193和asn196處分別含有兩個重要的lys和glu取代，其與lc/athr176和his227相互作用并導(dǎo)致轉(zhuǎn)化或引入帶電側(cè)基?？梢詷?gòu)建lc/athrl76和his227的飽和庫以篩選可以適應(yīng)snap-29中的這些變化的突變體。

在表1中總結(jié)了可以被認(rèn)為適合于本發(fā)明構(gòu)思的突變lc的bont/a輕鏈的突變的例子，其以“x”示出在肉毒桿菌血清型a神經(jīng)毒素輕鏈的序列內(nèi)的特定位點處的取代。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明構(gòu)思的突變lc可以包括單個取代，并且還可以包括這些取代中的兩個或更多個。

表1

在本發(fā)明構(gòu)思的其它實施例中，asn136，ser143，glu148，val304，thr176，his227，lys337，leu256，val258和/或lys356中的一個或多個可以被lc/a(seqidno4)內(nèi)任何非相應(yīng)的氨基酸取代，以提供相對于天然lc/a具有增強的對非神經(jīng)元snare蛋白的親和力和/或反應(yīng)動力學(xué)的蛋白酶的全部或部分。

可以通過產(chǎn)生適當(dāng)?shù)耐蛔凅w集合并針對snap-23和snap-29報告構(gòu)建體進行測試來鑒定對snap-23和/或snap-29具有底物特異性的lc/a突變體。在測試方案的典型例子中，96孔微孔板可容納20個突變lc/a肽以及對照，使得快速處理肽庫內(nèi)容物成為可能?？梢耘囵B(yǎng)和測定來自突變lc庫克隆的單個克隆。在測試期間可以將原始克隆儲存在4℃以允許克隆恢復(fù)和/或重新測試。通常，只有當(dāng)在與這些報告肽構(gòu)建體的孵育進行4小時后，陽性(即野生型)lc/a對照顯示a/e的完全切割且沒有顯著(即，<10)陰性對照報告構(gòu)建體(例如，ko)切割，才能評價板?？梢灾匦聹y試一開始不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的板。陽性突變lc/a可以定義為在重復(fù)測試的一個或兩個樣品中顯示大于約20％的適當(dāng)?shù)膱蟾孀忧懈畹娜魏瓮蛔僱c/a?？梢耘囵B(yǎng)任何陽性結(jié)果的原始親本培養(yǎng)物，并用甘油保存和儲存。所有陽性克隆可以重新測試，并且重新測試為陽性的克隆可以存儲并全部測序以鑒定突變?？梢则炞C顯示陽性結(jié)果的克隆，例如使用重組全長snap-23或snap-29和蛋白質(zhì)印跡分析以確認(rèn)底物切割，并且可以將所述顯示陽性結(jié)果的克隆轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以測量體內(nèi)分泌減少。

上述整合的生長/誘導(dǎo)，裂解，分離和活性測定使得鑒定這樣的突變lc成為可能。然而，在一些實施例中，對于實現(xiàn)高通量、自動化或半自動化(即，結(jié)合手動和自動步驟)篩選方法來促進這樣的鑒定是有用的。在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，這樣的方法可以通過使用24,48,96,384和/或1,536孔板來實現(xiàn)。在一些實施例中，在單個平板上進行生長，誘導(dǎo)，裂解，分離和活性測試的所有步驟。在其它實施例中，對于待表征的給定突變lc鏈，這些步驟可以跨兩個或更多個板進行。在其它實施例中，可以在加入微孔板的孔之前離線(例如，使用小親和柱用于分離突變lc)進行這些步驟中的一個或多個。

圖4中示出了促進用于篩選目的的lc突變的高通量和/或自動化測試的96孔微孔板的示例性布置。如圖所示，所述板包括使用botesta/e報告構(gòu)建體和針對非特異性蛋白酶的報告構(gòu)建體(例如，botestko)測試的lc/a陽性和空載體陰性對照。通過使用攜帶合適的非神經(jīng)元snare蛋白(例如，snap-23或snap-29)或其插入fret對的供體和受體熒光團之間的切割片段的報告構(gòu)建體來測試lc突變。在所描述的板的布局中，針對這樣的非神經(jīng)元snare報告構(gòu)建體測試每個lc突變兩次。此外，對于針對非特異性蛋白酶的報告構(gòu)建體(例如botestko)每第五次lc突變作為對照測試兩次。

應(yīng)當(dāng)理解，鑒定為對非神經(jīng)元snare蛋白具有期望活性的輕鏈序列可以與提供與非神經(jīng)元細(xì)胞的選擇性結(jié)合的靶向部分組合。合適的靶向部分包括天然或突變的肉毒桿菌重鏈序列，其當(dāng)與lc組合時提供能夠靶向細(xì)胞，被內(nèi)化和被加工的完整的功能性蛋白。在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，一個或多個突變lc鏈與bont./a，bont/b，bont/c，bont/d，bont/e，bont/f和/或bont/g的一個或多個天然或突變重鏈組合。應(yīng)當(dāng)理解，衍生自給定bont血清型的突變lc可以與來自相應(yīng)bont血清型或不同bont血清型的天然序列或突變重鏈組合。在本發(fā)明構(gòu)思的其它實施例中，一種或多種突變lc與一種或多種突變的肉毒桿菌重鏈組合，所述突變的肉毒桿菌重鏈對所需細(xì)胞類型顯示改變的細(xì)胞特異性。

在本發(fā)明構(gòu)思的其它實施例中，靶向部分可以是不對應(yīng)于肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈的肽或其他分子。例如，靶向部分可以是抗體，抗體片段或單鏈抗體。在其它實施例中，靶向部分可以是細(xì)胞表面受體(例如，藥物，激素，糖類，多糖或脂多糖)的配體或存在于靶細(xì)胞表面上的配體的受體(例如，凝集素)。在其他實施例中，靶向部分可以是親和對(例如，生物素和親和素)的一個成員，親和對的另一個成員具有對靶細(xì)胞的親和性(或者是具有對靶細(xì)胞的親和性的分子的一部分)。在另外的其它實施例中，非肽大分子(例如適體)可以用作靶向部分。在一些實施例中，靶向部分可以通過接頭肽連接到突變lc。這樣的接頭肽可以選擇為柔性的(例如，以減少空間位阻)，或者可以選擇為剛性的(例如，以提供期望的幾何形狀)。在一些實施例中，選擇接頭肽在內(nèi)化后的細(xì)胞過程切割或降解，從而釋放突變lc。

本發(fā)明構(gòu)思的另一個實施例是用于治療患有以分泌過多為特征的疾病的個體的方法。在這種方法中，將包含靶向非神經(jīng)元snare的突變lc的藥物組合物施用于患有這種疾病或需要這種治療的患者。在這樣的實施例中，可以選擇突變lc，其對與分泌相關(guān)的一種或多種非神經(jīng)元snare蛋白具有底物特異性和/或增強的反應(yīng)動力學(xué)(相對于其來源的天然序列l(wèi)c)，其中這樣的一個或多個snare蛋白存在于以患病個體中的分泌過多為特征的細(xì)胞中。這樣的藥物組合物可以是可注射液體的形式，并且這種形式可以包括適合于靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，眼內(nèi)，腹膜和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)使用的緩沖液和保存劑(preservatives)。在其它實施例中，藥物組合物可以作為局部用制劑提供，例如懸浮液，軟膏，凝膠，洗劑或霜劑。在這樣的實施例中，藥物組合物可以包括輔助成分，例如潤膚劑，賦形劑和/或有助于經(jīng)皮遞送的試劑。在一些這樣的實施例中，藥物組合物可以以局部施用的貼劑或膜的形式提供。在另外一些實施例中，藥物組合物可以以促進透粘膜遞送的形式提供。在這些實施例中，藥物組合物可以作為吸入物質(zhì)(例如，粉末，蒸氣和/或滴霧)，舌下滴劑或錠劑，鼻噴霧劑，滴眼劑，栓劑或陰道栓劑提供。在另外一些實施例中，藥物組合物可以供應(yīng)用于口服食用，例如作為食用液體或食物。在這些實施例中，藥物組合物可包括著色劑，調(diào)味劑和/或增稠劑。當(dāng)被包裝用于口服給藥時，包含突變lc的藥物組合物可以包括延遲釋放和/或吸收直至達到胃腸道的期望位置的制劑或機構(gòu)(例如，定時釋放包衣，具有穿孔的膠囊等)。

通過使用在最小化不期望的效應(yīng)的同時實現(xiàn)有效治療的給藥劑量/時間表可以進行使用修飾的lc輕鏈治療分泌過多疾病。例如，本發(fā)明構(gòu)思的突變lc可以以1μg/kg體重至100mg/kg體重的劑量施用。在一些本發(fā)明構(gòu)思的實施例中，包含本發(fā)明構(gòu)思的突變lc的藥物組合物的單劑量可足以產(chǎn)生有益效果。在本發(fā)明構(gòu)思的其它實施例中，在一段時間內(nèi)施用多個劑量。例如，包含突變lc的相對小劑量的藥物組合物可以按照規(guī)律的時間表(例如每隔一天，每天，每天2-12次)施用，直到達到所需的結(jié)果。由于它們的作用方法，一旦達到所需的治療效果，含有突變lc的藥物組合物可以具有延長的效果。如上所述，可以至少部分地基于選擇突變lc所源自的天然lc序列來選擇所述效果的持續(xù)時間。在一些實施例中，治療效果可以在施用突變lc后持續(xù)至少3個月。在其它實施例中，在施用有效劑量的突變lc后，治療效果可持續(xù)1天，3天，1周，2周，3周，4周，6周，8周或更長時間。

在本發(fā)明構(gòu)思的一些實施例中，可以施用具有相似底物特異性但不同序列的一系列突變lc，以減少患者體內(nèi)針對突變lc產(chǎn)生的抗體的效果和/或減少在用這種組合物治療的患者中這種抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)。在另外一些實施例中，可以施用具有相似底物特異性但不同序列的突變lc的混合物，從而將每種突變lc的濃度降低到可能誘導(dǎo)顯著免疫應(yīng)答的水平同時保持治療效果。類似地，可以修飾突變lc以降低抗原性(例如，通過peg化)。

應(yīng)該是顯而易見的是，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，除了已經(jīng)描述的那些，在不偏離本文的發(fā)明構(gòu)思的前提下，可以進行更多的修改。因此，除了所附的權(quán)利要求的精神之外，本發(fā)明的主題不受限制。此外，在說明書和權(quán)利要求的解釋中，所有術(shù)語應(yīng)該以與文中一致的最寬的可能方式解釋。特別是，術(shù)語“包括”和“包括了”應(yīng)當(dāng)被解釋為指以非排他的方式的元素、組分或步驟，表明所引用的元素、組分或步驟可以存在或被利用或與其他未明確引用的元素、組分或步驟組合。其中，本說明書的權(quán)利要求指至少一個選自由a，b，c......和n組成的組的物品，說明書正文應(yīng)當(dāng)被解釋為只需要一個來自所述組的元素，而不是a加n，或b加n等。