專(zhuān)利名稱(chēng)：一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，更具體地說(shuō)，涉及一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在天然的20種氨基酸中，色氨酸具有至關(guān)重要的意義，例如血清中色氨酸含量的非正常偏高被認(rèn)為是某些疾病產(chǎn)生的關(guān)鍵影響要素，如慢性肝炎、帕金森病、再生障礙性貧血和肌肉萎縮等。所以發(fā)展有效地在活體內(nèi)識(shí)別和檢測(cè)色氨酸含量，尤其是應(yīng)用于血清樣本中色氨酸含量的檢測(cè)方法具有臨床上的意義。然而，設(shè)計(jì)合成出具有高選擇性和有效地識(shí)別該類(lèi)重要的生物小分子的探針在目·前是一個(gè)極具挑戰(zhàn)的課題，經(jīng)過(guò)科學(xué)工作者數(shù)十年的不懈努力，氨基酸分子熒光探針在基礎(chǔ)理論研究方面取得了巨大的進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定目標(biāo)氨基酸的高選擇性的檢測(cè)。但是，目前絕大部分的氨基酸識(shí)別探針要真正應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)生活中，科學(xué)工作者還需解決如下問(wèn)題
I.基于弱作用識(shí)別過(guò)程對(duì)氨基酸的識(shí)別，其中提高識(shí)別過(guò)程的選擇性是重點(diǎn)，因?yàn)榘被峒捌溲苌锒季哂邢嗨频慕Y(jié)構(gòu)，從而具有相同的弱作用識(shí)別位點(diǎn)，達(dá)到對(duì)單一氨基酸分子的識(shí)別在目前的研究中還有待解決。2.現(xiàn)在大部分高選擇性的氨基酸探針都是基于共價(jià)鍵反應(yīng)型機(jī)理，對(duì)于氨基酸的識(shí)別過(guò)程同時(shí)也伴隨著氨基酸分子結(jié)構(gòu)的變化，識(shí)別過(guò)程不可逆，不利于現(xiàn)實(shí)意義上的檢測(cè)應(yīng)用。3.小肽和蛋白質(zhì)對(duì)氨基酸識(shí)別過(guò)程的干擾目前研究的較少，大部分生物樣本中都會(huì)含有氨基酸、小肽和蛋白質(zhì)，真正的構(gòu)筑研究生命體系生物小分子的探針刻不容緩。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明目的是提供一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法。具體是將具有藍(lán)色熒光發(fā)射的三苯胺基團(tuán)作為熒光團(tuán)和芳香堆積作用位點(diǎn)，協(xié)同天然的酰胺基團(tuán)作為氫鍵授受體，構(gòu)筑具有特殊親疏水空腔的四面體籠狀結(jié)構(gòu)，不僅可以在20種天然氨基酸中高選擇性的識(shí)別色氨酸，小肽的存在對(duì)熒光識(shí)別過(guò)程沒(méi)有干擾，而且還將其應(yīng)用到生物活體細(xì)胞成像研究，最為有利的是實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清樣本中游離色氨酸含量的熒光法檢測(cè)，通過(guò)熒光定量檢測(cè)生物體內(nèi)的色氨酸。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，所述探針為含有式A的配合物，
[^LJ(A)
式A中，L為含有三苯胺基團(tuán)作為熒光團(tuán)，功能酰胺基團(tuán)作為氫鍵作用位點(diǎn)的配體，具有如下B分子結(jié)構(gòu)式；
權(quán)利要求
1.一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于探針含有式A的配合物，[MmLJ(A) 式A中，L為含有三苯胺基團(tuán)作為熒光團(tuán)，功能酰胺基團(tuán)作為氫鍵作用位點(diǎn)的配體，具有如下B分子結(jié)構(gòu)式；
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟 (a)、按照熒光法對(duì)于色氨酸的識(shí)別方法； 稱(chēng)取根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針材料，配制成c μ M的100 ml有機(jī)/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有機(jī)/水混合溶劑的溶液；量取標(biāo)準(zhǔn)探針溶液2 ml,向其中逐漸加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量達(dá)到7.5mM后，熒光增強(qiáng)直至平衡； (b)、按照熒光法對(duì)色氨酸的選擇性識(shí)別測(cè)試方法；取探針材料C μ M,加入色氨酸達(dá)到7. 5 mM,其它19種天然氨基酸,包括lie, Arg,Ala, Val, Leu, Pro, Met, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Ser, Gly, Cys, His, Phe 和 Tyr 分別加入15 mM,同時(shí)，含有5個(gè)色氨酸殘基的13肽(ILPWKWPffff PWRR-NH2)加入80 mM,在350nm處激發(fā)，測(cè)試其熒光發(fā)射譜圖； (C)、按照熒光法得到色氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法；稱(chēng)取根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針材料，配制成c μ M的100 ml有機(jī)/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有機(jī)/水混合溶劑的溶液； 量取標(biāo)準(zhǔn)探針溶液2 ml,加入計(jì)算量的色氨酸溶液,配制成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試溶液；上述溶液在350 nm處激發(fā)，測(cè)得熒光發(fā)射譜圖，然后以色氨酸的加入量為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線； (d)、熒光法直接檢測(cè)血清樣本中色氨酸含量的技術(shù)； 血清樣本從合作醫(yī)院取來(lái)后，未經(jīng)任何處理，直接用微量注射器加入到含有C μ M 2 ml的有機(jī)/水混合溶劑的標(biāo)準(zhǔn)探針溶液，在350 nm處激發(fā)，測(cè)得熒光增強(qiáng)曲線，按照熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中所含游離色氨酸的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述濃度C為10 μ M至20 μ Μ，濃度太低熒光發(fā)射峰較差，濃度太高則發(fā)生自淬滅。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述探針材料所用有機(jī)/水混合溶劑選自DMF和水，其比例為9:1或8:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述配制色氨酸所用有機(jī)/水混合溶劑選自DMF和水，其比例為I: I或4:6。
全文摘要
一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測(cè)方法，涉及一種游離色氨酸含量的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了一種基于熒光功能化的金屬有機(jī)四面體化合物應(yīng)用于天然氨基酸和血清樣本中游離色氨酸識(shí)別和檢測(cè)并實(shí)現(xiàn)生物細(xì)胞成像應(yīng)用的方法。該方法是以三苯胺為母體構(gòu)筑出的三三齒配體與硝酸鈰自組裝得到四面體化合物為材料，該材料能夠在20種天然氨基酸中高選擇性的識(shí)別色氨酸，響應(yīng)范圍在0～0.1mM；另外，該材料還能夠有效地區(qū)分游離的和結(jié)合的色氨酸，實(shí)現(xiàn)在血清樣本中對(duì)游離色氨酸含量的檢測(cè)，也很好的實(shí)現(xiàn)了在活體細(xì)胞成像上的應(yīng)用。因此，該材料提供了一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的測(cè)試血清樣本中游離色氨酸含量的方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102914527SQ20121039076
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者何成, 王健, 武鵬彥, 劉曉花, 段然 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)