發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)涉及癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗有效的新肽，使用所述肽治療和/或預(yù)防腫瘤的方法，以及包含所述肽的藥物組合物。本申請(qǐng)要求提交于2014年08月04日提交的日本專利申請(qǐng)(日本專利申請(qǐng)?zhí)?014-158922、2014-158923,和2014-158924)的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提述并入本文。發(fā)明背景已經(jīng)顯示細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctls)可識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物(mhc)i類分子上發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(taa)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從發(fā)現(xiàn)黑素瘤抗原(mage)家族以來(lái)，已經(jīng)通過(guò)免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了許多其它taa(npl1:boont,intjcancer1993may8,54(2):177-80；npl2:boont&vanderbruggenp,jexpmed1996mar1,183(3):725-9)。這些taas中的一些目前正在作為免疫治療靶標(biāo)進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)。在這些taas中的數(shù)個(gè)中，鑒定了可以被ctls識(shí)別的表位肽，并且預(yù)期它們?cè)谟糜诟鞣N類型的癌癥的免疫治療中的應(yīng)用(npl3:harriscc,jnatlcancerinst1996oct16,88(20):1442-55；npl4:butterfieldlh等人,cancerres1999jul1,59(13):3134-42；npl5:vissersjl等人,cancerres1999nov1,59(21):5554-9；npl6:vanderburgsh等人,jimmunol1996may1,156(9)3308-14；npl7:tanakaf等人,cancerres1997oct15,57(20):4465-8；npl8:fujiet等人,intjcancer1999jan18,80(2):169-72；npl9:kikuchim等人,intjcancer1999may5,81(3):439-66；npl10:oisom等人,intjcancer1999may5,81(3):387-94)。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了使用這些taa衍生的ctl表位肽的幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)。不幸的是，許多這些臨床試驗(yàn)顯示出低的客觀反應(yīng)率(npl11:bellif等人,jclinoncol2002oct15,20(20):4169-80；npl12:couliepg等人,immunolrev2002oct,188:33-42；npl13:rosenbergsa等人,natmed2004sep,10(9):909-15)。因此，仍然需要鑒定可以用于癌癥免疫治療的新的ctl表位。cdca1(細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白1；也描述為nuf2、ndc80動(dòng)粒復(fù)合物組分(ndc80kinetochorecomplexcomponent):nuf2；參考序列：genebank登錄號(hào)nm_145697(seqidno:81)或genebank登錄號(hào)nm_031423(seqidno:83))，已被鑒定為與cdc2、細(xì)胞周期蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶ii和其它細(xì)胞周期基因共表達(dá)的基因的成員(npl14:walker等人,currcancerdrugtargets2001may；1(1):73-83)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cdca1與經(jīng)歷有絲分裂的hela細(xì)胞的著絲粒相關(guān)，并被認(rèn)為是酵母nuf2的功能同源物(npl15:wiggepa等人,jcellbiol2001jan22；152(2):349-60)。同時(shí)，通過(guò)使用包含23,040個(gè)基因的全基因組cdna微陣列的基因表達(dá)譜分析，已經(jīng)將cdca1鑒定為在非小細(xì)胞肺癌中上調(diào)的基因(npl16:hayama等人,cancerres2006nov1；66(21):10339-48；ptl1:wo2007/013480；ptl2:wo2005/089735)。cdca1表達(dá)在腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中上調(diào)，并且在除睪丸外的正常器官中檢測(cè)不到(npl16；ptl1)。此外，sirna介導(dǎo)的cdca1表達(dá)的下調(diào)引起表達(dá)cdca1的肺癌細(xì)胞系中細(xì)胞增殖的抑制。最近，已經(jīng)鑒定了cdca1衍生的hla-a2限制性ctl表位肽(npl17：haraoetal.,intjcancer.2008:123(11):2616-25；ptl3:wo2009/025117)和hla-a24限制性ctl表位肽(ptl4:wo2009/153992)。這些肽在具有hla-a2型或hla-a24型的癌癥患者中有效，但不能預(yù)期對(duì)不具有這些hla型的癌癥患者具有效果。[引用列表][專利文獻(xiàn)][ptl1]wo2007/013480[ptl2]wo2005/089735[ptl3]wo2009/025117[ptl4]wo2009/153992[非專利文獻(xiàn)][npl1]boont,intjcancer1993may8,54(2):177-80[npl2]boont&vanderbruggenp,jexpmed1996mar1,183(3):725-9[npl3]harriscc,jnatlcancerinst1996oct16,88(20):1442-55[npl4]butterfieldlh等人,cancerres1999jul1,59(13):3134-42[npl5]vissersjl等人,cancerres1999nov1,59(21):5554-9[npl6]vanderburgsh等人,jimmunol1996may1,156(9):3308-14[npl7]tanakaf等人,cancerres1997oct15,57(20):4465-8[npl8]fujiet等人,intjcancer1999jan18,80(2):169-72[npl9]kikuchim等人,intjcancer1999may5,81(3):459-66[npl10]oisom等人,intjcancer1999may5,81(3):387-94[npl11]bellif等人,jclinoncol2002oct15,20(20):4169-80[npl12]couliepg等人,immunolrev2002oct,188:33-42[npl13]rosenbergsa等人,natmed2004sep,10(9):909-15[npl14]walker等人,currcancerdrugtargets2001may,1(1):73-83[npl15]wiggepa等人,jcellbiol2001jan22,152(2):349-60[npl16]hayama等人,cancerres2006nov1,66(21):10339-48[npl17]harao等人,intjcancer2008dec1,123(11):2616-25發(fā)明概述本發(fā)明涉及肽，其可以誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)cdca1的細(xì)胞特異性的細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctls)。當(dāng)這些肽通過(guò)人白細(xì)胞抗原(hla)呈遞在抗原呈遞細(xì)胞(apcs)上時(shí)，誘導(dǎo)顯示出針對(duì)表達(dá)cdca1的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性活性的ctls。迄今已經(jīng)鑒定的具有ctl誘導(dǎo)能力(ctl誘導(dǎo)力)的cdca1衍生肽是hla-a2限制性肽或hla-a24限制性肽，其不能誘導(dǎo)針對(duì)不表達(dá)這些hlas的細(xì)胞的ctls。因此，常規(guī)肽不適合在不具有這些hla的受試者中進(jìn)行免疫治療。hla-a11和hla-a33是亞洲人常見(jiàn)的等位基因(settea,sidneyj.,immunogenetics1999,50:201-12),而hla-a03是在高加索人中常見(jiàn)的等位基因(cao等人,humimmunol2001；62(9):1009-30)。期望對(duì)hla-a11陽(yáng)性受試者施用hla-a11限制性肽，對(duì)hla-a33陽(yáng)性受試者施用hla-a33限制性肽，和對(duì)hla-a03陽(yáng)性受試者施用hla-a03限制性肽。因此，本發(fā)明涉及cdca1衍生肽，其具有對(duì)hla-a11,hla-a33,或hla-a03限制性的ctl誘導(dǎo)能力?；诒疚墓_(kāi)的結(jié)果，已經(jīng)證明本發(fā)明的肽是表位肽，其能夠誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a11，hla-a33，或hla-a03的細(xì)胞的強(qiáng)力和特異性的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的目的之一是提供能夠以hla-a11-，hla-a33-，或hla-a03-限制性方式誘導(dǎo)ctl的cdca1衍生肽。這些肽可以用于體外、離體或體內(nèi)誘導(dǎo)ctl，或可用于施用至受試者用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的目的。優(yōu)選的肽是包含選自以下氨基酸序列的肽seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47；更優(yōu)選的肽是九肽或十肽；和甚至更優(yōu)選的肽是選自由以下氨基酸序列組成的肽seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47。本發(fā)明的肽包含以下肽，其中一個(gè)，兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，只要所得修飾肽保留了原始肽的ctl誘導(dǎo)能力。本發(fā)明還提供了分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的任一種肽。與本發(fā)明的肽類似，這些多核苷酸可用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc，并可施用至受試者用于誘導(dǎo)針對(duì)cdca1表達(dá)的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種類型的肽，編碼本發(fā)明的一種或多種類型的肽的一種一種或多種類型的多核苷酸，本發(fā)明的apcs，呈遞本發(fā)明肽的外來(lái)體，和/或本發(fā)明的ctls。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防癌癥，以及防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)。它們還可以用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。當(dāng)施用于受試者時(shí)，本發(fā)明的肽呈遞于apc的表面上，結(jié)果誘導(dǎo)了靶向肽的ctl。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于誘導(dǎo)ctls的組合物，其中組合物包含一種或多種類型的本發(fā)明的肽，編碼一種或多種類型的本發(fā)明的肽的一種或多種類型的多核苷酸，本發(fā)明的apc，和/或呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的方法，其中所述方法包括將本發(fā)明的一種或多種類型的肽與apc接觸的步驟，或?qū)⒕幋a本發(fā)明的任何一種肽的多核苷酸引入apc的步驟。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)ctl的方法，包括將cd8-陽(yáng)性t細(xì)胞與在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的apc共培養(yǎng)的步驟，將cd8-陽(yáng)性t細(xì)胞與在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的外來(lái)體共培養(yǎng)的步驟，或?qū)⑤d體引入cd8-陽(yáng)性t細(xì)胞的步驟，所述載體包含編碼t細(xì)胞受體(tcr)的每個(gè)亞基的多核苷酸，所述tcr能夠結(jié)合由細(xì)胞表面上的hla抗原所呈遞的本發(fā)明的肽。本發(fā)明中優(yōu)選的hla抗原是hla-a11，hla-a33，或hla-a03。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離的apc，在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明的肽的復(fù)合物。本發(fā)明還提供靶向本發(fā)明肽的分離的ctls。這些apcs和ctls可以用于針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫治療。在本發(fā)明中，經(jīng)受免疫治療的癌癥是例如存在于具有hla-a11，hla-a33，或hla-a03的純合子或雜合子患者中的癌癥。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了用于表達(dá)cdca1和至少一種選自hla-a11，hla-a33，和hla-a03的hla抗原的癌癥的免疫治療。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括向受試者施用組合物，所述組合物包含本發(fā)明的肽，或編碼所述肽的多核苷酸，本發(fā)明的apc，呈遞本發(fā)明肽的外來(lái)體，和/或本發(fā)明的ctl的步驟。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在受試者中治療和/或預(yù)防癌癥以及預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，其中所述方法包括向受試者施用本發(fā)明的肽，編碼所述肽的多核苷酸，本發(fā)明的apc，呈遞本發(fā)明肽的外來(lái)體，和/或本發(fā)明的ctl的步驟。除了上述之外，當(dāng)結(jié)合附圖和實(shí)施例閱讀以下詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明的其它目的和特征將變得更加顯而易見(jiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的前述概述和以下詳細(xì)描述都是示例性實(shí)施方案，而對(duì)本發(fā)明或本發(fā)明的其它替代實(shí)施方案不是限制性的。特別地，盡管本文參照多個(gè)具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，該描述是本發(fā)明的說(shuō)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在不脫離如所附權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到各種修改和應(yīng)用。同樣地，本發(fā)明的其它目的，特征，益處和優(yōu)點(diǎn)將從該概述和下面描述的某些實(shí)施方案中變得明顯，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。從上述結(jié)合所附實(shí)施例，數(shù)據(jù)，附圖和從其中得出的所有合理推斷，單獨(dú)或與并入本文的參考文獻(xiàn)一同考慮，此類目的，特征，益處和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述圖1-1：圖1由照片(a)至(v)組成，其顯示了使用衍生自cdca1的肽誘導(dǎo)的ctls中的干擾素(ifn)-gamma酶聯(lián)免疫點(diǎn)(elispot)測(cè)定的結(jié)果。與對(duì)照相比，具有cdca1-a11-9-123(seqidno:3)的孔#7中(a)，具有cdca1-a11-9-105(seqidno:5)的孔#8中(b)；具有cdca1-a11-9-419(seqidno:6)的孔#1中(c)，具有cdca1-a11-9-219(seqidno:7)的孔#4中(d)，具有cdca1-a11-9-439(seqidno:9)的孔#2中(e)，具有cdca1-a11-9-343(seqidno:10)的孔#2中(f)，具有cdca1-a11-9-21(seqidno:12)的孔#8中(g)，具有cdca1-a11-9-157(seqidno:13)的孔#3中(h)，具有cdca1-a11-9-244(seqidno:14)的孔#7中(i)，具有cdca1-a11-9-213(seqidno:17)的孔#6中(j)，具有cdca1-a11-9-335(seqidno:19)的孔#7中(k)，具有cdca1-a11-9-25(seqidno:21)的孔#4中(l)，具有cdca1-a11-10-339(seqidno:30)的孔#3中(m)，具有cdca1-a11-10-452(seqidno:35)的孔#2中(n)，具有cdca1-a11-10-400(seqidno:38)的孔#7中(o)，具有cdca1-a11-10-289(seqidno:39)的孔#6中(p)，具有cdca1-a11-10-203(seqidno:40)的孔#5中(q)，具有cdca1-a11-10-156(seqidno:45)的孔#2中(r)，具有cdca1-a11-10-340(seqidno:53)的孔#2中(s)，具有cdca1-a11-10-106(seqidno:56)的孔#4中(t)，和具有cdca1-a11-10-358(seqidno:58)的孔#2中(u)的ctls顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生產(chǎn)。在這些照片中，孔上的正方形顯示繁殖來(lái)自相應(yīng)孔的細(xì)胞用于建立ctl系。與此相反，cdca1-a11-10-391(seqidno:33)(v)顯示為其中沒(méi)有特異性ifn-gamma產(chǎn)生的典型陰性數(shù)據(jù)的實(shí)例。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊(pulsed)的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。圖1-2顯示了圖1-1的延續(xù)。圖2-1：圖2由一系列的線型圖(a)至(i)組成，顯示了ifn-gamma酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)的結(jié)果，證實(shí)了用以下刺激的按順序的ctl系中的ifn-gamma產(chǎn)生：cdca1-a11-9-123(seqidno:3)(a),cdca1-a11-9-105(seqidno:5)(b),cdca1-a11-9-419(seqidno:6)(c),cdca1-a11-9-219(seqidno:7)(d),cdca1-a11-9-439(seqidno:9)(e),cdca1-a11-9-157(seqidno:13)(f),cdca1-a11-9-25(seqidno:21)(g),cdca1-a11-10-339(seqidno:30)(h)或cdca1-a11-10-358(seqidno:58)(i)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激所建立的ctl系顯示出強(qiáng)的ifn-gamma產(chǎn)生。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖2-2顯示了圖2-1的延續(xù)。圖3由一系列的線型圖(a)至(c)組成，顯示了通過(guò)來(lái)自用以下刺激的ctl系的有限稀釋建立的ctl克隆中的ifn-gamma產(chǎn)生：cdca1-a11-9-105(seqidno:5)(a),cdca1-a11-9-419(seqidno:6)(b)或cdca1-a11-9-219(seqidno:7)(c)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激所建立的ctl克隆顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生產(chǎn)。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma生產(chǎn)；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma生產(chǎn)。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖4是線型圖，其顯示了針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*1101兩者的靶細(xì)胞的特異性ctl活性。制備了用hla-a*1101或全長(zhǎng)cdca1基因轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。使用cdca1-a11-9-219(seqidno:7)建立的ctl克隆表現(xiàn)出針對(duì)用cdca1和hla-a*1101兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞的特異性ctl活性(黑色菱形)。另一方面，未顯示出針對(duì)用hla-a*1101(三角形)或cdca1(白色圓圈)之一轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的顯著的特異性ctl活性。圖5由照片(a)至(h)組成，其顯示了使用衍生自cdca1的肽誘導(dǎo)的ctls中ifn-gammaelispot測(cè)定的結(jié)果。與對(duì)照相比，具有cdca1-a33-9-43(seqidno:27)的孔#2中(a)，具有cdca1-a33-9-123(seqidno:3)的孔#1中(b)，具有cdca1-a33-9-108(seqidno:60)的孔#3中(c)，具有cdca1-a33-9-261(seqidno:28)的孔#2中(d)，具有cdca1-a33-9-105(seqidno:5)的孔#6中(e)，具有cdca1-a33-10-10(seqidno:67)的孔#8中(f)，和具有cdca1-a33-10-260(seqidno:69)的孔#5中(g)的ctls顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生產(chǎn)。在圖的這些照片中，孔上的正方形顯示繁殖來(lái)自相應(yīng)孔的細(xì)胞用于建立ctl系。與此相反，cdca1-a33-10-122(seqidno:68)(h)作為其中沒(méi)有特異性ifn-gamma產(chǎn)生的典型陰性數(shù)據(jù)的實(shí)例顯示。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。圖6由一系列的線型圖(a)至(d)組成，顯示了ifn-gammaelisa的結(jié)果，證實(shí)了用以下刺激的按順序的ctl系中的ifn-gamma產(chǎn)生：cdca1-a33-9-43(seqidno:27)(a),cdca1-a33-9-123(seqidno:3)(b),cdca1-a33-10-10(seqidno:67)(c),或cdca1-a33-10-260(seqidno:69)(d)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激所建立的ctl系顯示出強(qiáng)的ifn-gamma產(chǎn)生。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖7由一系列的線型圖(a)至(b)組成，顯示了通過(guò)來(lái)自用以下刺激的ctl系的有限稀釋建立的ctl克隆中的ifn-gamma產(chǎn)生：cdca1-a33-9-43(seqidno:27)(a)或cdca1-a33-9-123(seqidno:3)(b)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激所建立的ctl克隆顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生產(chǎn)。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma生產(chǎn)；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma生產(chǎn)。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖8是線形圖，其顯示了針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*3303兩者的靶細(xì)胞的特異性ctl活性。制備用hla-a*3303或全長(zhǎng)cdca1基因轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。使用cdca1-a33-9-43(seqidno:27)建立的ctl克隆表明了針對(duì)用cdca1和hla-a*3303兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞的特異性ctl活性(黑色菱形)。另一方面，未顯示出針對(duì)用hla-a*3303(白色三角形)或cdca1(白色圓圈)之一轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的顯著的特異性ctl活性。圖9由照片(a)至(d)組成，顯示了用衍生自cdca1的肽誘導(dǎo)的ctls中ifn-gammaelispot測(cè)定的結(jié)果。與對(duì)照相比，在具有cdca1-a03-9-219(seqidno:7)的孔#3中(a),具有cdca1-a03-10-400(seqidno:38)的孔#1中(b),和具有cdca1-a03-10-257(seqidno:47)的孔#2中(c)的ctls顯示出強(qiáng)的inf-gamma產(chǎn)生。在這些照片中，孔上的正方形顯示繁殖來(lái)自相應(yīng)孔的細(xì)胞用于建立ctl系。與此相反，cdca1-a03-9-343(seqidno:10)(d)作為其中沒(méi)有特異性ifn-gamma產(chǎn)生的典型陰性據(jù)的實(shí)例顯示。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。圖10由一系列的線型圖(a)至(c)組成，顯示ifn-gammaelisa的結(jié)果，證實(shí)了用以下刺激的ctl系中ifn-gamma的產(chǎn)生：cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a),cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b),或cdca1-a03-10-257(seqidno:47)(c)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激建立的ctl系顯示強(qiáng)的ifn-gamma產(chǎn)生。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖11由一系列的線型圖(a)至(c)組成，顯示了通過(guò)來(lái)自用以下刺激的ctl系的有限稀釋建立的ctl克隆中的ifn-gamma產(chǎn)生：cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a),cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b),或cdca1-a03-10-257(seqidno:47)(c)。這些結(jié)果證實(shí)了與對(duì)照相比，通過(guò)用每種肽刺激建立的ctl克隆顯示強(qiáng)的ifn-gamma產(chǎn)生。圖中，“+”表示針對(duì)用合適的肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生；和“-”表示針對(duì)尚未用任何肽沖擊的靶細(xì)胞的ifn-gamma產(chǎn)生。r/s比率表示ctl系(響應(yīng)細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)與靶細(xì)胞(刺激細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)的比率。圖12由一系列的線型圖(a)和(b)組成，顯示了針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*0301兩者的靶細(xì)胞的特異性ctl活性。制備用hla-a*0301或全長(zhǎng)cdca1基因轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。使用cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a)或cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b)建立的ctl克隆顯示了針對(duì)用cdca1和hla-a*0301兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞的特異性ctl活性(黑色菱形)。另一方面，未顯示出針對(duì)用hla-a*0301(白色三角形)或cdca1(白色圓圈)之一轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的顯著的特異性ctl活性。發(fā)明詳述具體實(shí)施方式的說(shuō)明盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案中可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。然而，在描述本發(fā)明的材料和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文所描述的特定大小，形狀，尺度，材料，方法學(xué)，方案等，因?yàn)檫@些可以根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化改變。還應(yīng)當(dāng)理解，本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定版本或?qū)嵤┓桨傅哪康?，并且不旨在限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限定。i.定義除非另有明確說(shuō)明，如本文中使用的詞語(yǔ)“一個(gè)/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個(gè)/種”。術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”與物質(zhì)(例如肽、抗體、多核苷酸等)相關(guān)使用時(shí)，指該物質(zhì)基本上不含至少一種可以包括在天然來(lái)源中的物質(zhì)。因此，分離的或純化的肽指基本上不含另一種細(xì)胞材料，例如來(lái)自所述肽的細(xì)胞或組織來(lái)源的碳水化合物、脂質(zhì)或其它污染性蛋白質(zhì)。當(dāng)化學(xué)合成肽時(shí)，分離或純化的肽是指基本上不含有前體物質(zhì)或另一種化學(xué)物質(zhì)的肽。短語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括肽制備物，其中所述肽與分離出該肽的或重組產(chǎn)生該肽的細(xì)胞的細(xì)胞組分是分離的。如此，基本上不含細(xì)胞材料的肽包括肽制備物，其含有小于約30％,20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重計(jì))的其他細(xì)胞材料。當(dāng)肽以重組方式生成時(shí)，分離或純化的肽基本上不含有培養(yǎng)基，其包含肽制備物，所述肽制備物含有小于肽制備物體積的約20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重計(jì))的培養(yǎng)基。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生肽時(shí)，分離或純化的肽基本上不含有前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)，其含有肽制備物，所述肽制備物包含小于約30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重計(jì))肽制備物體積的前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。可以通過(guò)例如在十二烷基硫酸鈉(sds)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色或此類凝膠之后出現(xiàn)單一條帶來(lái)確認(rèn)肽制備物是分離的或純化的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽和多核苷酸是分離的或純化的。術(shù)語(yǔ)“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，并指氨基酸殘基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，這些術(shù)語(yǔ)也適用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一種或多種非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸類似物，氨基酸模擬物，以及此類。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在氨基酸是細(xì)胞中那些通過(guò)遺傳密碼編碼的，以及那些翻譯后修飾的(例如羥脯氨酸，gamma-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸等)。短語(yǔ)“氨基酸類似物”是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(與氫結(jié)合的alpha碳，羧基，氨基和r基團(tuán))但具有修飾的r基團(tuán)或修飾的骨架的化合物(如，高絲氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亞砜，甲硫氨酸甲基锍等)。短語(yǔ)“氨基酸模擬物”是指與一般氨基酸具有不同結(jié)構(gòu)但具有相似功能的化合物。氨基酸可以是l-氨基酸或d-氨基酸，并且本發(fā)明的肽優(yōu)選是l-氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，并且是指核苷酸的聚合物。本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“組合物”旨在包括包含指定量的指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接由指定量的指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。當(dāng)組合物是藥物組合物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“組合物”旨在包括活性成分和惰性成分的產(chǎn)品，以及從任何兩種或多種成分的組合，絡(luò)合或聚集，從一種或多種成分的離解，或從一種或多種成分的其它類型的反應(yīng)或相互作用直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的藥物組合物包括通過(guò)將本發(fā)明的化合物或細(xì)胞與藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體混合而制備的任何組合物。不限于此，本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”或“生理學(xué)上可接受的載體”包括液體或固體填充劑，稀釋劑，賦形劑，溶劑和包封材料；并且是指藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的材料，組合物，物質(zhì)或介質(zhì)。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指過(guò)表達(dá)cdca1基因的癌癥；且其實(shí)例包括膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性骨髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等,但不限于此。在示例性實(shí)施方案中，“癌癥”是表達(dá)cdca1和hla-a11，hla-a33，和/或hla-a03的癌癥。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞”和“細(xì)胞毒性t細(xì)胞”和“ctl”在本文中可互換使用。除非另有明確說(shuō)明，它們是指可識(shí)別非自身細(xì)胞(例如腫瘤/癌細(xì)胞，病毒感染的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞的死亡的t淋巴細(xì)胞亞群。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“hla-a11”是指包括諸如hla-a*1101,hla-a*1102,hla-a*1103,和hla-a*1104的亞型的hla-a11型。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“hla-a33”是指包括諸如hla-a*3303,hla-a*3301,和hla-a*3304亞型的hla-a33型。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“hla-a03”是指包括諸如hla-a*0301,hla-a*0302,和hla-a*0305亞型的hla-a03型。在受試者或患者的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“受試者(或患者)的hla抗原是hla-a11”是指受試者或患者具有純合或雜合的hla-a11抗原基因作為mhc(主要組織相容性復(fù)合物)i類分子,并且hla-a11抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為hla抗原表達(dá)。類似地，本文所用的短語(yǔ)“受試者(或患者)的hla抗原是hla-a33”，和“受試者(或患者)的hla抗原是hla-a03”分別指受試者或患者具有純合或雜合的hla-a33抗原基因作為mhc(主要組織相容性復(fù)合物)i類分子，且hla-a33抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為hla抗原表達(dá)；并且受試者或患者具有純合或雜合的hla-a03抗原基因作為mhc(主要組織相容性復(fù)合物)i類分子，且hla-a03抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為hla抗原表達(dá)。只要本發(fā)明的方法和組合物在癌癥“治療”的語(yǔ)境中是有用的，則當(dāng)其實(shí)現(xiàn)臨床優(yōu)勢(shì)時(shí)，該治療被認(rèn)為是“有效的”，例如，在受試者中減少癌癥的尺寸，擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移能力，延緩癌癥進(jìn)展，減輕癌癥的臨床癥狀，延長(zhǎng)存活期，抑制術(shù)后復(fù)發(fā)。當(dāng)預(yù)防性地施用治療時(shí)，“有效”是指治療延遲或防止癌癥形成，或防止或減輕癌癥的臨床癥狀。有效性是相對(duì)于任何公知的用于診斷或治療特定腫瘤類型的方法來(lái)確定的。只要本發(fā)明的方法和組合物用于癌癥“預(yù)防(防范)”的語(yǔ)境中，本文中術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(防范)”包括減輕與癌癥相關(guān)的死亡率或發(fā)病率的負(fù)擔(dān)的任何工作。預(yù)防(防范)可以在“初級(jí)，二級(jí)和三級(jí)預(yù)防(防范)水平”進(jìn)行。盡管一級(jí)預(yù)防(防范)避免疾病的發(fā)展，在二級(jí)和三級(jí)水平的預(yù)防(防范)包括預(yù)防(防范)疾病進(jìn)展和癥狀的出現(xiàn)，以及旨在通過(guò)恢復(fù)功能和減少疾病相關(guān)并發(fā)癥來(lái)降低現(xiàn)有疾病的不良影響。或者，預(yù)防(防范)可以包括減輕特定病癥的嚴(yán)重性，例如旨在減少腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的廣泛的預(yù)防性治療。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，癌癥的治療和/或預(yù)防(防范)和/或其手術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)防(防范)包括任一事件，例如抑制癌細(xì)胞增殖，腫瘤退化或消退，誘導(dǎo)癌癥發(fā)展的緩解和抑制，腫瘤消退，以及減少或抑制轉(zhuǎn)移，抑制癌癥的術(shù)后復(fù)發(fā)和延長(zhǎng)存活期。癌癥的有效治療和/或預(yù)防(防范)降低死亡率，改善患有癌癥的個(gè)體的預(yù)后，降低腫瘤標(biāo)志物的血液水平，并減輕與癌癥相關(guān)的可檢測(cè)的癥狀。例如，癥狀的緩解或改善構(gòu)成有效的治療和/或預(yù)防(防范)，并包括其中癥狀穩(wěn)定或減輕10％,20％,30％或更多的病患。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指與指定的蛋白質(zhì)或其肽特異性反應(yīng)的免疫球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體，靈長(zhǎng)類化抗體，嵌合抗體，雙特異性抗體，人源化抗體，與其他蛋白或放射性標(biāo)記融合的抗體，和抗體片段。此外，本文中的“抗體”以最廣泛的含義使用，并且具體涵蓋完整單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體，由兩個(gè)或多個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展示所需的生物學(xué)活性。“抗體”可以是所有類別的抗體(例如iga，igd，ige，igg和igm)。除非另有說(shuō)明，本文使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的術(shù)語(yǔ)相同的含義。ii.肽hla-a11和hla-a33是亞洲人常見(jiàn)的等位基因(settea,sidneyj.,immunogenetics1999,50:201-12)，且hla-a03是在高加索人中常見(jiàn)的等位基因(cao等人.,humimmunol2001；62(9):1009-30)。因此，對(duì)于亞洲人或高加索人的大量群體，治療表達(dá)cdca1的癌癥的有效方法可以通過(guò)提供限制于hla-a11，hla-a33，或hla-a03的cdca1衍生的ctl誘導(dǎo)肽來(lái)提供。因此本發(fā)明提供了cdca1衍生肽，其能夠以hla-a11-,hla-a33-,,或hla-a03限制性方式誘導(dǎo)ctls。本發(fā)明的肽是cdca1衍生肽，其能夠以hla-a11-,hla-a33-,或hla-a03限制性方式誘導(dǎo)ctls。能夠以hla-a11限制性方式誘導(dǎo)ctls的肽包括具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽。能夠以hla-a33限制性方式誘導(dǎo)ctls的肽包括具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽。能夠以hla-a03限制性方式誘導(dǎo)ctls的肽包括具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽。具有對(duì)這些肽特異的細(xì)胞毒性活性的ctls可以通過(guò)用這些肽沖擊(pulsed)的樹(shù)突細(xì)胞(dc)對(duì)t細(xì)胞體外刺激來(lái)建立。建立的ctls顯示出針對(duì)用每種肽沖擊的靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性活性。cdca1基因在癌癥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，例如在如膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性骨髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸癌，軟組織腫瘤，大腸癌等中的癌細(xì)胞中，但在大多數(shù)正常器官中不表達(dá)。因此它是免疫治療的極好的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的肽可以適當(dāng)?shù)赜糜诎┌Y免疫治療。優(yōu)選的肽是九肽(由9個(gè)氨基酸殘基組成的肽)或十肽(由10個(gè)氨基酸殘基組成的肽)，且更為優(yōu)選的是由選自以下氨基酸序列組成的組的肽：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47。例如具有seqidno:7的氨基酸序列的肽適于誘導(dǎo)顯示針對(duì)表達(dá)hla-a11和cdca1細(xì)胞的特異細(xì)胞毒性活性的ctl，并可以適合用于hla-a11陽(yáng)性患者的癌癥免疫治療。此外，例如，具有seqidno:27的氨基酸序列的肽適于誘導(dǎo)顯示針對(duì)表達(dá)hla-a33和cdca1細(xì)胞的特異細(xì)胞毒性活性的ctl，并且能夠適用于對(duì)于hla-a33陽(yáng)性患者的癌癥免疫療法。此外(例如)具有選自seqidnos:7和38之間的氨基酸序列的肽適于誘導(dǎo)顯示針對(duì)表達(dá)hla-a03和cdca1細(xì)胞的特異細(xì)胞毒性活性的ctl，并可以適合用于hla-a03陽(yáng)性患者的癌癥免疫治療。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是選自由以下的氨基酸序列組成的肽：seqidnos:7,27和38。對(duì)于本發(fā)明的肽，可以值得另外的氨基酸殘基以附加(adjoin)本發(fā)明的肽的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的ctl誘導(dǎo)能力即可。另外的氨基酸殘基可以由任何類型的氨基酸組成，只要它們不損害原始肽的ctl誘導(dǎo)能力即可。因此，本發(fā)明的肽包含具有ctl誘導(dǎo)能力的肽，其包含選自以下的氨基酸序列：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47。此類肽例如少于約40個(gè)氨基酸，在許多情況下少于約20個(gè)氨基酸，并通常少于約15個(gè)氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，則本發(fā)明的肽包含10個(gè)氨基酸長(zhǎng)或11-40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽，其通過(guò)將另外的氨基酸附加至所述肽產(chǎn)生。此外，如果原始肽是十肽，則本發(fā)明的肽包含11-40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽。此類肽可以是(例如)11-20個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽或11-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽。另外的氨基酸殘基的優(yōu)選實(shí)例為在cdca1的全長(zhǎng)氨基酸序列中鄰接本發(fā)明的肽的氨基酸序列的氨基酸殘基(例如seqidno:82或84)。因此，本發(fā)明的肽包括含有選自以下氨基酸序列的肽：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47,且其中所述肽是cdca1的肽片段并具有ctl誘導(dǎo)活性。一般而言，某些肽中一個(gè)，兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響肽的功能，或在有些情況下甚至?xí)鰪?qiáng)原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知經(jīng)過(guò)修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基修飾(即取代、添加、缺失和/或插入)的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(mark等人.,procnatlacadsciusa1984,81:5662-6；zollerandsmith,nucleicacidsres1982,10:6487-500；dalbadie-mcfarland等人.,procnatlacadsciusa1982,79:6409-13)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是包含以下氨基酸序列的肽，其中選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47的氨基酸序列的一個(gè)，兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基被取代，缺失，插入和/或添加，并具有ctl誘導(dǎo)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到對(duì)氨基酸序列的個(gè)別取代(其改變了單個(gè)氨基酸或少數(shù)百分比的氨基酸)傾向于導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性的保留。因此，那些通常被稱作“保守取代”或“保守修飾”；且通過(guò)“保守取代”或“保守修飾”對(duì)蛋白質(zhì)的修飾可以導(dǎo)致修飾的蛋白具有與原蛋白相似的功能。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。功能上相似的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(a,i,l,m,f,p,w,y,v)、親水性氨基酸(r,d,n,c,e,q,g,h,k,s,t)、和具有以下共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈：脂肪族側(cè)鏈(g,a,v,l,i,p)；含羥基側(cè)鏈(s,t,y)；含硫原子側(cè)鏈(c,m)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(d,n,e,q)；含堿側(cè)鏈(r,k,h)；和含芳香側(cè)鏈(h,f,y,w)。另外，以下八組各自含有本領(lǐng)域認(rèn)可互為保守替代的氨基酸：1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)，賴氨酸(k)；5)異亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，甲硫氨酸(m)，纈氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)；7)絲氨酸(s)，蘇氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)，甲硫氨酸(m)(參見(jiàn)例如creighton,proteins1984)。此類保守修飾肽也被包含在本發(fā)明的肽中。然而，本發(fā)明的肽不限于此，并可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的ctl誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過(guò)修飾的肽不排除衍生自cdca1的多態(tài)性變體、種間同源物、和等位基因的可誘導(dǎo)ctl的肽。只要肽保留原始肽的ctl誘導(dǎo)能力，可以修飾(即取代，缺失，插入和/或添加)少數(shù)(例如，1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè))或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語(yǔ)“數(shù)個(gè)”意指5個(gè)以下的氨基酸，如4個(gè)或3個(gè)或更少。被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20％或更少，更優(yōu)選15％或更少，進(jìn)一步更優(yōu)選10％或更少，例如1至5％。當(dāng)在癌癥免疫療法的語(yǔ)境中使用時(shí)，本發(fā)明的肽呈遞在細(xì)胞或外來(lái)體的表面上，優(yōu)選作為與hla抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選的是本發(fā)明的肽擁有對(duì)hla抗原的高結(jié)合親和力。為此目的，可以對(duì)肽通過(guò)取代、缺失、插入和/或添加氨基酸殘基來(lái)修飾以產(chǎn)生具有改善結(jié)合親和力的修飾肽。由于通過(guò)結(jié)合hla抗原而被展示的肽的序列規(guī)律是已知的(falk,等人,immunogenetics199440232-41；chujoh,等人,tissueantigens1998:52:501-9；takiguchi,等人,tissueantigens2000:55:296-302.)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的肽。例如，在具有對(duì)hlai類分子具有結(jié)合親和力的肽中，自n端起的第二個(gè)氨基酸和c端氨基酸通常是參與結(jié)合至hlai類的錨定殘基(rammenseehg,等人,immunogenetics.1995；41(4):178-228.)。例如，對(duì)于hla-a11，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸作為n末端的第二個(gè)氨基酸，賴氨酸和精氨酸作為c端氨基酸被認(rèn)為是對(duì)hla-a11具有高結(jié)合親和力的錨定殘基(falk,等人,immunogenetics1994,40:232-41；chujoh,等人,tissueantigens1998:52:501-9)。此外，在hla-a11中，在n末端的3和7位有輔助錨定殘基；并且已知亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸和丙氨酸優(yōu)選作為從n末端開(kāi)始的第三個(gè)氨基酸，且亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸和苯丙氨酸優(yōu)選作為從n末端開(kāi)始的第七個(gè)氨基酸(falk,等人,immunogenetics1994,40:232-41；chujoh,等人,tissueantigens1998:52:501-9)。因此，為了維持或增強(qiáng)hla-a11結(jié)合親和力，有可能期望用蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸，和/或用賴氨酸或精氨酸取代c端的氨基酸。此外，還可能需要用亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸或丙氨酸取代自n端起的第三個(gè)氨基酸，和/或用亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸或苯丙氨酸取代自n端起的第七個(gè)氨基酸。因此，具有ctl誘導(dǎo)能力的包含選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽包括在本發(fā)明的肽中：在選自自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自n端起的第三個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸或丙氨酸；自n端起的第七個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸或苯丙氨酸；和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中在選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58中的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自n端起的第三個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸或丙氨酸；自n端起的第七個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸或苯丙氨酸；和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。即，本發(fā)明的肽包括具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列的肽，其中所述氨基酸序列在選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中具有選自以下(a)至(d)的一個(gè)或多個(gè)取代：(a)自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；(b)自n端起的第三個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸或丙氨酸；(c)自n端起的第七個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸或苯丙氨酸；和(d)c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸組成的肽，其中將選自以上(a)至(d)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中。在本發(fā)明中，優(yōu)選的取代數(shù)目是選自以上(a)至(d)的1,2,3或4個(gè)取代。本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列的肽，其中在選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中在選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。即，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列肽，其中將選自以下(a)和(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中：(a)自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；和(b)c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中將選自以上(a)至(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列中。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，或亮氨酸取代。在hla-a33中，對(duì)于自n端起的第二個(gè)氨基酸的苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸，以及對(duì)于c端氨基酸的賴氨酸和精氨酸已知是對(duì)hla-a33具有高結(jié)合親和力的錨定殘基(falk,等人,immunogenetics1994,40:232-41；takiguchi,等人,tissueantigens2000,55:296-302)。此外，在hla-a33中，還已知自n端起的第一個(gè)氨基酸殘基用作錨定殘基，并且已知天冬氨酸和谷氨酸優(yōu)選作為自n端起的第一個(gè)氨基酸(falk,等人,immunogenetics1994,40:232-41；takiguchi,等人,tissueantigens2000:55:296-302)。因此，為了維持或增強(qiáng)hla-a33結(jié)合親和力，有可能期望用天冬氨酸或谷氨酸取代自n端起的第一個(gè)氨基酸，用苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸，和/或用賴氨酸或精氨酸取代c端氨基酸。因此具有ctl誘導(dǎo)能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本發(fā)明的肽中：所述肽的氨基酸序列選自seqidno：27,3,60,28,5,67和69，自n端起的第一個(gè)氨基酸被取代為天冬氨酸或谷氨酸，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸，和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸組成的肽，其中在選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中，自n端起的第一個(gè)氨基酸被取代為天冬氨酸或谷氨酸，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸，和/或c端氨基酸被取代為賴氨酸或精氨酸。即，本發(fā)明的肽包括具有ctl誘導(dǎo)的能力的包含氨基酸序列的肽，其中將選自以下(a)至(c)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中：(a)自n端起的第一個(gè)氨基酸被取代為天冬氨酸或谷氨酸；(b)自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，或纈氨酸；和(c)c端氨基酸被取代為精氨酸或賴氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中將選自以上(a)至(c)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中。在本發(fā)明中，優(yōu)選的取代數(shù)目是選自以上(a)至(c)的1,2或3個(gè)取代。此外，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列的肽，其中在選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸，和/或c端氨基酸被取代為精氨酸或賴氨酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中在選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸，和/或c端氨基酸被取代為精氨酸或賴氨酸。即，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列的肽，其中將選自以下(a)和(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中：(a)自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸；和(b)c端氨基酸被取代為精氨酸或賴氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中將選自以上(a)和(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列中。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為苯丙氨酸或酪氨酸。在hla-a03中，對(duì)于自n端起的第二個(gè)氨基酸的丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸和蘇氨酸，對(duì)于c端氨基酸的精氨酸，賴氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸已知是對(duì)hla-a03具有高結(jié)合親和力的錨定殘基(kubort.等人,jimmunol.1994apr15；152(8):3913-24；sidneyj等人,humimmunol.1996feb；45(2):79-93；gambacorti-passerinic等人,clincancerres.1997may；3(5):675-83)。因此，為了維持或增強(qiáng)hla-a03結(jié)合親和力，有可能優(yōu)選用亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸，和/或用精氨酸，賴氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸取代c端氨基酸。因此，具有ctl誘導(dǎo)能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本發(fā)明的肽中：其中在選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸，和/或c-末端氨基酸被取代為精氨酸，賴氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸組成的肽，其中在選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸，和/或c-末端氨基酸被取代為精氨酸，賴氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。即，本發(fā)明的肽包括具有ctl誘導(dǎo)能力的包含氨基酸序列的肽，其中將選自以下(a)和(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列中：(a)自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸；和(b)c端氨基酸被取代為精氨酸，賴氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以是具有ctl誘導(dǎo)能力的由氨基酸序列組成的肽，其中將選自以上(a)和(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列中。在本發(fā)明中，優(yōu)選的取代數(shù)目是選自以上(a)和(b)的1個(gè)或2個(gè)取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，自n端起的第二個(gè)氨基酸被取代為亮氨酸，甲硫氨酸或纈氨酸。不僅可以在錨定位點(diǎn)處引入氨基酸取代，而且可以在肽的潛在t細(xì)胞受體(tcr)識(shí)別位置處引入取代。數(shù)項(xiàng)研究已證明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原來(lái)功能的功能，例如cap1、p53(264-272)、her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(zaremba等人.cancerres.57,4570-4577,1997,t.k.hoffmann等人.jimmunol.(2002)；168(3):1338-47.,s.o.dionne等人.cancerimmunolimmunother.(2003)52:199-206及s.o.dionne等人.cancerimmunology,immunotherapy(2004)53,307-314)。本發(fā)明還考慮也可以向本發(fā)明的肽(例如,由選自以下氨基酸序列組成的肽：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47)的n末端和/或c端添加1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。此類保留ctl誘導(dǎo)能力的修飾肽也包括在本發(fā)明中。例如，當(dāng)肽與apc接觸時(shí)(所述肽中一個(gè)，兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被添加到由seqidno：7氨基酸序列組成的肽的n末端和/或c端)，其摻入apc中并加工成由seqidno:7的氨基酸序列組成的肽。然后其可以通過(guò)經(jīng)由抗原呈遞途徑呈遞在apc的細(xì)胞表面上誘導(dǎo)ctl。更具體地，本發(fā)明的肽可以是其中在n末端和c端的任一個(gè)或兩者上添加一個(gè)，兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的肽。然而，當(dāng)肽的氨基酸序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時(shí)，可以誘導(dǎo)針對(duì)特定物質(zhì)的自身免疫性疾病和/或過(guò)敏性癥狀等副作用。因此，優(yōu)選使用可用的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，以避免肽的氨基酸序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了不存在與目標(biāo)肽相比僅有1個(gè)或2個(gè)氨基酸差異的肽時(shí)，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與hla抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其ctl誘導(dǎo)能力，而沒(méi)有任何發(fā)生此類副作用的危險(xiǎn)。預(yù)測(cè)其中本發(fā)明的肽的一個(gè)，兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被修飾的肽能夠保留原始肽的ctl誘導(dǎo)能力；然而優(yōu)選驗(yàn)證修飾肽的ctl誘導(dǎo)能力。這里，“具有ctl誘導(dǎo)能力(ctl可誘導(dǎo)性(ctlinducibility))的肽”指肽，其通過(guò)用肽刺激的apc誘導(dǎo)ctls?！癱tl誘導(dǎo)”包括誘導(dǎo)分化成ctl，誘導(dǎo)ctl激活，誘導(dǎo)ctl增殖，誘導(dǎo)ctl的細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)ctl介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解，和誘導(dǎo)ctl的ifn-gamma產(chǎn)生增加。ctl誘導(dǎo)能力的可通過(guò)如下來(lái)確認(rèn)：用肽誘導(dǎo)并刺激保留hla抗原的apcs(例如b淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞)并將其與cd8陽(yáng)性細(xì)胞混合；然后測(cè)量由ctl針對(duì)靶細(xì)胞所釋放的ifn-gamma。對(duì)于apcs，可以優(yōu)選使用人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成以表達(dá)hla抗原的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?；蛘?，例如可以用51cr或此類放射性標(biāo)記靶細(xì)胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算肽-誘導(dǎo)的ctls的細(xì)胞毒性活性?；蛘?，在肽刺激的apcs的存在下，可能通過(guò)以下評(píng)估ctl誘導(dǎo)能力：測(cè)量由ctls生成和釋放的ifn-gamma，并使用抗ifn-gamma單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。除上述的修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留ctl誘導(dǎo)能力。與本發(fā)明的肽連接的適當(dāng)肽的例子包括taa衍生的ctl誘導(dǎo)肽。此外，本發(fā)明的肽也可以彼此連接。用于連接肽的合適的接頭是本領(lǐng)域已知的，例如可以使用接頭，如aay(p.m.daftarian等人,jtransmed2007,5:26),aaa,nkrk(seqidno:85)(r.p.m.sutmuller等人,jimmunol.2000,165:7308-15)，或k(s.ota等人,canres.62,1471-6,k.s.kawamura等人,jimmunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各種排列連接(例如，鏈狀，重復(fù)等)，并且還可以連接三個(gè)或更多個(gè)肽。本發(fā)明的肽還可連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接肽保留ctl誘導(dǎo)能力。與本發(fā)明的肽連接的適當(dāng)物質(zhì)的例子包括，例如，肽、脂質(zhì)、糖或糖鏈、乙?；?，和天然的或合成的聚合物。本發(fā)明的肽可以進(jìn)行如下修飾：糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等等，只要不破壞它們的ctl誘導(dǎo)能力。還可以實(shí)施此種類型的修飾以賦予額外的功能(例如，靶向功能和遞送功能)或穩(wěn)定所述肽。例如，為了提高肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入d-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明的肽。肽的穩(wěn)定性可以以多種方式測(cè)定。例如，可以通過(guò)使用肽酶以及各種生物介質(zhì)例如人血漿和血清來(lái)測(cè)試穩(wěn)定性(參見(jiàn)例如verhoef等人,eurjdrugmetabpharmacokin1986,11:291-302)。此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入和/或添加了1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發(fā)明還提供由于篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。具體地，本發(fā)明提供了篩選具有ctl誘導(dǎo)能力的肽的方法，其中所述方法包括以下步驟：(a)產(chǎn)生由對(duì)原始氨基酸序列通過(guò)取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基而修飾得到的氨基酸序列組成的候選序列，其中所述原始氨基酸序列選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47的氨基酸序列組成；(b)從在(a)中產(chǎn)生的候選序列中選擇與cdca1之外的任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無(wú)顯著同源性(或序列同源性)的候選序列；(c)使由(b)中選擇的候選序列組成的肽與apcs接觸；(d)使(c)的apcs與cd8陽(yáng)性t細(xì)胞接觸；和(e)選擇具有與由原始氨基酸序列組成的肽相等或更高的ctl誘導(dǎo)能力的肽。本文中，本發(fā)明的肽也被描述為“cdca1肽”或“cdca1多肽”。iii.本發(fā)明的肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來(lái)制備。例如，可以使用重組dna技術(shù)或化學(xué)合成來(lái)制備本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽可獨(dú)立地合成，或合成為包括兩個(gè)或更多個(gè)肽的較長(zhǎng)多肽。本發(fā)明的肽可以在使用重組dna技術(shù)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生它們或者在化學(xué)合成它們之后從宿主細(xì)胞或合成反應(yīng)產(chǎn)物分離。即，可以純化或分離本發(fā)明的肽，以使其基本上不含其它宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段，或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。其他示例性的修飾包括摻入一種或多種d-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期。可以根據(jù)選定的氨基酸序列，通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得本發(fā)明的肽?？梢赃m合于合成的常規(guī)肽合成方法的例子包括以下文獻(xiàn)中描述的方法：(i)peptidesynthesis,interscience,newyork,1966；(ii)theproteins,vol.2,academicpress,newyork,1976；(iii)“peptidesynthesis”(日文),maruzenco.,1975；(iv)“basicsandexperimentofpeptidesynthesis”(injapanese),maruzenco.,1985；(v)“developmentofpharmaceuticals”(日文),continuedvol.14(peptidesynthesis),hirokawa,1991；(vi)wo99/67288；和(vii)baranyg.&merrifieldr.b.,peptidesvol.2,solidphasepeptidesynthesis,academicpress,newyork,1980,100-118?；蛘?，可適用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來(lái)獲得本發(fā)明的肽(例如morrisonj,jbacteriology1977,132:349-51；clark-curtiss&curtiss,methodsinenzymology(eds.wu等人)1983,101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了此類載體和宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)本發(fā)明的肽。iv.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括衍生自天然存在的cdca1基因(例如genbank登錄號(hào)nm_145697(seqidno:81)或genbank登錄號(hào)nm_031423(seqidno:83))以及具有它們的保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短語(yǔ)“保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量的功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子gca、gcc、gcg、和gcu都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每一個(gè)密碼子(aug和tgg除外，aug在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而tgg在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼肽的核酸的每一種沉默變異在每個(gè)公開(kāi)的序列中隱含地描述。本發(fā)明的多核苷酸可以由dna、rna、及其衍生物構(gòu)成。dna由諸如a，t，c和g的堿基適當(dāng)?shù)亟M成，并且在rna中t被u取代。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個(gè)本發(fā)明肽，其中有或無(wú)居間氨基酸序列(interveningaminoacidsequence)。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識(shí)別序列)。此外，多核苷酸可以包括編碼本發(fā)明的肽的編碼序列的任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(如質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過(guò)常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來(lái)制備，例如通過(guò)使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來(lái)生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過(guò)插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來(lái)生成本發(fā)明的多核苷酸?；蛘?，可使用pcr技術(shù)或在合適宿主中表達(dá)來(lái)擴(kuò)增多核苷酸(參見(jiàn)例如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork,1989)?；蛘?，可使用固相技術(shù)來(lái)合成多核苷酸，如beaucagesl&iyerrp,tetrahedron1992,48:2223-311；matthes等人,emboj1984,3:801-5中記載的。v.外來(lái)體(exosomes)本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來(lái)體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來(lái)體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與hla抗原之間形成的復(fù)合體。外來(lái)體可以通過(guò)，例如在jph11-510507和wo99/03499中詳細(xì)描述的方法來(lái)制備，并可以用從作為治療和/或預(yù)防(防范)對(duì)象的患者獲得的apc制備。本發(fā)明的外來(lái)體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進(jìn)行接種。上述復(fù)合體中包含的hla抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防(防范)的受試者的類型匹配。例如，hla-a11(例如hla-a*1101)和hla-a33(例如hla-a*3303)是在亞洲人群中廣泛和普遍見(jiàn)到的等位基因，并且認(rèn)為這些hla抗原類型適合在亞洲患者中治療。此外，hla-a03(例如hla-a*0301)是在白種人群體中廣泛和普遍見(jiàn)到的等位基因，并且被認(rèn)為適合在白種人患者中治療。典型地，在臨床上，通過(guò)預(yù)先研究需要治療的患者的hla抗原類型，可以選擇合適的肽，其對(duì)特定hla抗原具有高水平的結(jié)合親和力，或者通過(guò)由特異性hla抗原介導(dǎo)的抗原呈遞的ctl誘導(dǎo)能力。本發(fā)明的外來(lái)體在其表面上呈遞本發(fā)明的肽與hla-a11，hla-a33，或hla-a03的復(fù)合物。當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a11時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選為具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列組成的肽或其修飾的肽。此外，當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a33時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列組成的肽或其修飾的肽。此外，當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a03時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選為具有選自seqidno：7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列組成的肽或其修飾肽。vi.抗原呈遞細(xì)胞(apc)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在hla抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的apcs?；蛘弑景l(fā)明提供了在其表面上具有在hla抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的apcs。本發(fā)明的apcs可以是分離的apcs。當(dāng)在細(xì)胞(apcs，ctls等)的語(yǔ)境中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”意指細(xì)胞與另一類型的細(xì)胞分離。本發(fā)明的apcs可以是從衍生自待經(jīng)受治療和/或預(yù)防(防范)的患者的apcs誘導(dǎo)的apcs，并且可以作為疫苗自身或與其他藥物(包括本發(fā)明的肽，外來(lái)體或ctl)組合施用。本發(fā)明的apcs不限于特定種類的細(xì)胞，并且包括抑制在其細(xì)胞表面呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原的細(xì)胞以通過(guò)淋巴細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞(dc)、langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞、和活化的t細(xì)胞)識(shí)別。由于dc是apcs中具有最強(qiáng)ctl誘導(dǎo)活性的代表性apc，可以優(yōu)選使用dc作為本發(fā)明的apcs。本發(fā)明中，優(yōu)選的dc是源自人的分離的dc。此外，本發(fā)明的apcs可以是具有抗原呈遞功能的多種類型細(xì)胞的混合物，且可以是apcs的混合物，其中每種apc呈遞不同類型的本發(fā)明的肽。例如，可以通過(guò)從外周血單核細(xì)胞分離dc，然后在體外用本發(fā)明的肽刺激它們來(lái)獲得本發(fā)明的apcs。當(dāng)對(duì)受試者施用本發(fā)明的肽時(shí)，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的apcs。因此在將本發(fā)明的肽施用至受試者后，可以通過(guò)從受試者收集apcs來(lái)獲得本發(fā)明的apcs?；蛘?，可以通過(guò)使從受試者收集而來(lái)的apcs與本發(fā)明的肽接觸來(lái)獲得本發(fā)明的apcs。為了在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，本發(fā)明的apc可以單獨(dú)或者與其他藥物(包括本發(fā)明的肽、外來(lái)體或ctl)組合施用給受試者。例如，離體施用可包括下述步驟：(a)自第一受試者收集apcs；(b)使步驟(a)的apcs接觸本發(fā)明的肽；和(c)對(duì)第二受試者施用步驟(b)的apcs。第一受試者和第二受試者可以是同一個(gè)體，或者可以是不同個(gè)體。當(dāng)?shù)谝皇茉囌吆偷诙茉囌呤遣煌瑐€(gè)體時(shí)，優(yōu)選第一受試者和第二受試者的hla是相同類型。獲得自上述步驟(b)中的apc可以是用于癌癥治療和/或預(yù)防(防范)的疫苗。獲得自如上描述方法的本發(fā)明的apcs具有ctl誘導(dǎo)能力。用于apc的語(yǔ)境中的術(shù)語(yǔ)“ctl誘導(dǎo)能力(ctl可誘導(dǎo)性)”指apc與cd8陽(yáng)性細(xì)胞接觸時(shí)誘導(dǎo)ctl的能力。此外，“ctl誘導(dǎo)能力(ctl可誘導(dǎo)性)”包括apc誘導(dǎo)ctl活化的能力，apc誘導(dǎo)ctl增殖的能力，apc促進(jìn)ctl介導(dǎo)的溶解靶細(xì)胞的能力，和apc提高ctl介導(dǎo)的ifn-gamma生成的能力。由本發(fā)明的apc所誘導(dǎo)的ctl是對(duì)cdca1特異性的ctl，并表現(xiàn)出對(duì)表達(dá)cdca1的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性。除了上述方法之外，可以通過(guò)在體外將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入至apcs來(lái)制備本發(fā)明的apcs。待導(dǎo)入的多核苷酸可以是dna或rna的形式。導(dǎo)入的方法并不特別限制，且其例子包括本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的各種方法，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和磷酸鈣法。更具體的說(shuō)，可以使用描述于cancerres1996,56:5672-7；jimmunol1998,161:5607-13；jexpmed1996,184:465-72,和jp2000-509281中的方法。通過(guò)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸引入apc，多核苷酸在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯，然后產(chǎn)生的肽被mhci類加工并通過(guò)呈遞途徑以將本發(fā)明的肽呈遞在apc的細(xì)胞表面上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的apc在其細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明的肽和以下形成的復(fù)合物：hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303)或hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)。當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a11時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選為具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列組成的肽。當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a33時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列組成的肽。當(dāng)與本發(fā)明的肽形成復(fù)合物的hla是hla-a03時(shí)，本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列組成的肽。本發(fā)明的apc優(yōu)選是通過(guò)包括下述(a)或(b)的步驟的方法誘導(dǎo)的apc：(a)將apc與本發(fā)明的肽接觸，所述apc表達(dá)至少一種選自hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303),和hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)；或(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸引入apc，所述apc表達(dá)至少一種選自hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303)和hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)。與表達(dá)hla-a11的apc接觸的本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列組成的肽。與表達(dá)hla-a33的apc接觸的本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列組成的肽。與表達(dá)hla-a03的apc接觸的本發(fā)明的肽優(yōu)選是具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾的肽，并且更優(yōu)選由選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列組成的肽。本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽用于制備誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的藥物組合物的用途。另外，本發(fā)明提供了制備誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的藥物組合物的方法或過(guò)程。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的本發(fā)明的肽。vii.細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)由本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的ctl可以與本發(fā)明的肽相似的方式用作疫苗用于在體內(nèi)增強(qiáng)靶向表達(dá)cdca1的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明提供了ctls，其通過(guò)本發(fā)明的肽誘導(dǎo)或活化。本發(fā)明的ctls是靶向本發(fā)明肽的ctls，并且能夠結(jié)合至本發(fā)明的肽和hla抗原的復(fù)合物。ctl與所述復(fù)合物的結(jié)合是經(jīng)由存在于ctl的細(xì)胞表面的t細(xì)胞受體(tcr)介導(dǎo)的。本發(fā)明的ctls可以是分離的ctls。優(yōu)選的ctls是分離的人源ctls。本發(fā)明的ctls可以是ctls的混合物，其各自靶向不同類型的本發(fā)明肽。本發(fā)明的ctls可以獲得自(1)向受試者施用本發(fā)明的肽，(2)體外用本發(fā)明的肽刺激衍生自受試者的apcs和cd8陽(yáng)性t細(xì)胞，或外周血單核細(xì)胞(pbmcs)，(3)體外將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞或pbmcs與apcs或外來(lái)體接觸，所述apcs或外來(lái)體在它們的表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明的肽的復(fù)合物，或(4)將包含編碼每種t細(xì)胞受體(tcr)亞基的多核苷酸的載體導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞，所述tcr能夠結(jié)合由細(xì)胞表面上hla抗原所呈遞的本發(fā)明的肽。用于上文(2)或(3)方法的外來(lái)體和apcs可以分別通過(guò)“v.外來(lái)體”和“vi.抗原呈遞細(xì)胞(apcs)”部分中描述的方法制備，且上文(4)的方法的詳情將在“viii.t細(xì)胞受體(tcr)”部分中描述。本發(fā)明的ctls可以單獨(dú)施用至經(jīng)受治療和/或預(yù)防(防范)的患者，或與其他藥物(包括本發(fā)明的肽、apc或外來(lái)體)組合施用以用于調(diào)節(jié)效果的目的。進(jìn)一步地，本發(fā)明的ctls可以是誘導(dǎo)自cd8陽(yáng)性t細(xì)胞的ctls，所述cd8陽(yáng)性t細(xì)胞衍生自經(jīng)受施用ctls的患者。本發(fā)明的ctls特異性作用于呈遞本發(fā)明肽的靶細(xì)胞，例如，用于誘導(dǎo)本發(fā)明ctls的相同的肽。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)cdca1的細(xì)胞，如癌細(xì)胞，或用cdca1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可成為本發(fā)明ctls的攻擊靶標(biāo)。本發(fā)明的ctl靶向的細(xì)胞優(yōu)選為對(duì)于hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303),和hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ctls特異性靶向表達(dá)cdca1和選自hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303),和hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)中至少一種的hla的細(xì)胞。在本發(fā)明中，被ctls靶向的細(xì)胞可以是純合或雜合地具有hla-a11，hla-a33，和hla-a03的等位基因的任一種的細(xì)胞。本文中，ctl“靶向”細(xì)胞指ctl對(duì)在其細(xì)胞表面上呈遞hla和本發(fā)明肽的復(fù)合物的細(xì)胞的識(shí)別，和表現(xiàn)出對(duì)該細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。進(jìn)一步地，“特異性靶向”指ctls表現(xiàn)出對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，但未顯示對(duì)其他細(xì)胞的破壞活性。在ctl的語(yǔ)境中使用的表述“識(shí)別細(xì)胞”指經(jīng)由其tcr結(jié)合至呈遞在細(xì)胞表面的hla和本發(fā)明的肽的復(fù)合物，并表現(xiàn)出對(duì)該細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性活性。因此，本發(fā)明的ctls優(yōu)選為能夠經(jīng)由tcr結(jié)合至呈遞在細(xì)胞表面上的復(fù)合物的ctls，所述復(fù)合物在本發(fā)明的肽和hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303)或hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)之間形成。此外，本發(fā)明的ctls優(yōu)選是通過(guò)包括以下(a)或(b)中所述步驟的方法誘導(dǎo)的ctls：(a)體外將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與在其表面上呈遞復(fù)合物的apcs或外來(lái)體接觸，所述復(fù)合物為本發(fā)明的肽和hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303)或hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)的復(fù)合物；或(b)將包含編碼每種tcr的亞基的多核苷酸導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞，所述tcr能夠結(jié)合通過(guò)hla-a11(更優(yōu)選地hla-a*1101),hla-a33(更優(yōu)選地hla-a*3303)或hla-a03(更優(yōu)選地hla-a*0301)呈遞在細(xì)胞表面的本發(fā)明的肽。viii.t細(xì)胞受體(tcr)本發(fā)明還提供組合物以及使用該組合物的方法，所述組合物包含編碼每種tcr亞基的多核苷酸，所述tcr能夠結(jié)合通過(guò)hla抗原呈遞在細(xì)胞表面的本發(fā)明的肽。所述多核苷酸賦予cd8陽(yáng)性t細(xì)胞針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的特異性，這是通過(guò)表達(dá)在細(xì)胞表面能夠結(jié)合通過(guò)hla抗原呈遞在細(xì)胞表面的本發(fā)明的肽的tcr實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出通過(guò)本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的ctl中編碼tcr亞基的alpha和beta鏈的多核苷酸(wo2007/032255及morgan等人,jimmunol,171,3288(2003))。例如，優(yōu)選pcr方法用于tcr分析。不限于此，用于分析的pcr引物可以是(例如)通過(guò)組合以下5'側(cè)引物和3'側(cè)引物的用于擴(kuò)增的引物組：5’側(cè)引物:5’-r引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(seqidno:77)3’側(cè)引物tcr-alpha-鏈c-區(qū)-特異性3-tra-c引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(seqidno:78)tcr-beta-鏈c1-區(qū)-特異性3-trb-c1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(seqidno:79)或tcr-beta-鏈c2-區(qū)-特異性3-tr-beta-c2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(seqidno:80)通過(guò)將鑒定的多核苷酸導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞而形成的tcrs能夠以高親合力結(jié)合呈遞本發(fā)明的肽的靶細(xì)胞，并在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對(duì)呈遞本發(fā)明的肽的靶細(xì)胞的高效殺傷?？梢詫⒕幋a每種tcr亞基的多核苷酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些載體是本領(lǐng)域公知的?？梢詫⑺龆嗪塑账峄蛘甙鼈兊妮d體導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞，例如衍生自患者的cd8陽(yáng)性t細(xì)胞。本發(fā)明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的t細(xì)胞(或衍生自其他受試者的t細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型t細(xì)胞。本文中，特異性tcr是當(dāng)tcr呈遞于cd8陽(yáng)性t細(xì)胞的表面上時(shí)，能夠通過(guò)特異性識(shí)別呈遞在靶細(xì)胞表面上的本發(fā)明的肽和hla抗原的復(fù)合物,賦予針對(duì)靶細(xì)胞特異性細(xì)胞毒活性的tcr。上述復(fù)合物的特異性識(shí)別可以通過(guò)任何已知方法來(lái)確認(rèn)，并且其優(yōu)選的例子包括使用hla分子和本發(fā)明的肽的hla多聚體染色分析，和elispot測(cè)定方法。通過(guò)實(shí)施elispot測(cè)定法，可以確認(rèn)由導(dǎo)入有上述多核苷酸的t細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞的特異的tcr介導(dǎo)的識(shí)別。當(dāng)上述tcr呈遞于cd8陽(yáng)性t細(xì)胞表面上時(shí)，也可以通過(guò)已知方法確認(rèn)tcr是否能夠賦予針對(duì)cd8陽(yáng)性t細(xì)胞的靶細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性活性。優(yōu)選的方法包括例如通過(guò)鉻釋放測(cè)定法等測(cè)定針對(duì)hla陽(yáng)性靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。在hla-a11的背景下，本發(fā)明提供了通過(guò)用編碼每種tcr亞基的多核苷酸轉(zhuǎn)化cd8陽(yáng)性t細(xì)胞制備的ctl，所述tcr結(jié)合例如具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽。在hla-a33的背景下，本發(fā)明提供了通過(guò)用編碼每種tcr亞基的多核苷酸轉(zhuǎn)化cd8陽(yáng)性t細(xì)胞制備的ctl，所述tcr結(jié)合例如具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽。在hla-a03的背景下，本發(fā)明提供了通過(guò)用編碼每種tcr亞基的多核苷酸轉(zhuǎn)化cd8陽(yáng)性t細(xì)胞制備的ctl，所述tcr結(jié)合例如具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽。經(jīng)轉(zhuǎn)化的ctls在體內(nèi)能夠歸巢(homing)，并且可以利用公知的體外培養(yǎng)方法擴(kuò)增(例如kawakami等人,jimmunol.,142,3452-3461(1989))?？梢岳帽景l(fā)明的ctls來(lái)形成免疫原性組合物，所述組合物有用于在需要治療和/或預(yù)防(防范)的患者中的疾病治療或預(yù)防(防范)(對(duì)于參考文獻(xiàn)wo2006/031221，其內(nèi)容通過(guò)提述并入本文)。ix.藥物組合物本發(fā)明還提供了組合物或藥物組合物，包含選自以下的至少一種活性成分：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)本發(fā)明的apc；(d)本發(fā)明的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。除了上述活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要包含載體，賦形劑或通常用于藥物中的此類而沒(méi)有特別限制?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物中的載體的例子包括無(wú)菌水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，培養(yǎng)液等。因此，本發(fā)明還提供了藥物組合物，包含選自以下(a)至(e)的至少一種活性成分和藥學(xué)上可接受的載體：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)本發(fā)明的apc；(d)本發(fā)明的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑，混懸劑，防腐劑，表面活性劑，增溶劑，ph調(diào)節(jié)劑，聚集抑制劑等。與正常組織相比，癌細(xì)胞中cdca1表達(dá)顯著上調(diào)。因此本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可以用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)。因此本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其包含作為活性成分的一種或多種類型的本發(fā)明的肽或多核苷酸?；蛘?，可以制備本發(fā)明的肽以呈遞在外來(lái)體或apcs的表面上用作為藥物組合物的用途。此外，靶向任一種本發(fā)明肽的本發(fā)明的ctls也可用作本發(fā)明藥物組合物的活性成分。本發(fā)明的藥物組合物可包含治療有效量或藥學(xué)有效量的上述活性成分。本發(fā)明的藥物組合物還可以用作疫苗。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“疫苗”(也稱為“免疫原性組合物”)指當(dāng)接種到動(dòng)物時(shí)具有誘導(dǎo)導(dǎo)致抗腫瘤作用的免疫應(yīng)答的功能的組合物。因此本發(fā)明的藥物組合物可用于誘導(dǎo)導(dǎo)致抗腫瘤作用的免疫應(yīng)答。由本發(fā)明的肽，多肽，apc，ctl和藥物組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答沒(méi)有特別限制，只要其是導(dǎo)致抗腫瘤作用的免疫應(yīng)答，并且例子包括誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異的ctl和誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異的細(xì)胞毒性活性。本發(fā)明的藥物組合物可用于在人類受試者或患者中治療和/或預(yù)防的癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥物組合物可以優(yōu)選用于對(duì)選自hla-a11，hla-a33，和hla-a03中的至少一種hla陽(yáng)性的受試者。此外，本發(fā)明的藥物組合物可優(yōu)選用于治療和/或預(yù)防表達(dá)cdca1和選自hla-a11，hla-a33，和hla-a03的至少一種hla的癌癥和/或預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自以下的活性成分在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物中的用途：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一步提供選自以下的活性成分，用于治療或預(yù)防癌癥：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl?；蛘撸景l(fā)明還提供制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中所述方法或過(guò)程包括用藥學(xué)上或生理上可接受的載體配制至少一種選自以下活性成分的步驟：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中所述方法或過(guò)程包括將選自以下的活性成分與藥學(xué)上或生理上可接受的載體混合的步驟：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括向受試者施用至少一種選自以下的活性成分的步驟：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。在本發(fā)明中，具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽被鑒定為可以誘導(dǎo)強(qiáng)效和特異性免疫應(yīng)答的hla-a11限制性表位肽。因此，包含至少一種具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽的本發(fā)明的藥物組合物特別適用于施用至具有hla-a11(例如,hla-a*1101)作為hla抗原的受試者。這同樣適用于包含以下的藥物組合物：編碼這些肽中任一種的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)，呈遞這些肽的apc或外來(lái)體(即本發(fā)明的apc或外來(lái)體)，或靶向這些肽的ctl(即本發(fā)明的ctl)。也就是說(shuō)，包含與具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽相關(guān)聯(lián)的活性成分的藥物組合物適合施用于具有hla-a11的受試者(即hla-a11陽(yáng)性受試者)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是包含具有seqidno:7的氨基酸序列的肽的藥物組合物。類似地，在本發(fā)明中，具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽被鑒定為可以誘導(dǎo)強(qiáng)效和特異性免疫應(yīng)答的hla-a33限制性表位肽。因此，包含至少一種具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽的本發(fā)明的藥物組合物特別適用于施用至具有hla-a33(例如,hla-a*3303)作為hla抗原的受試者。這同樣適用于包含以下的藥物組合物：編碼這些肽中任一種的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)，呈遞這些肽的apc或外來(lái)體(即本發(fā)明的apc或外來(lái)體)，或靶向這些肽的ctl(即本發(fā)明的ctl)。也就是說(shuō)，包含與具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽相關(guān)聯(lián)的活性成分的藥物組合物適合施用于具有hla-a33的受試者(即hla-a33陽(yáng)性受試者)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是包含具有seqidno:27的氨基酸序列的肽的藥物組合物。類似地，在本發(fā)明中，具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽被鑒定為可以誘導(dǎo)強(qiáng)效和特異性免疫應(yīng)答的hla-a03限制性表位肽。因此，包含至少一種具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽的本發(fā)明的藥物組合物特別適用于施用至具有hla-a03(例如,hla-a*0301)作為hla抗原的受試者。這同樣適用于包含以下的藥物組合物：編碼這些肽中任一種的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)。呈遞這些肽的apc或外來(lái)體(即本發(fā)明的apc或外來(lái)體)，或靶向這些肽的ctl(即本發(fā)明的ctl)。也就是說(shuō)，包含與具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽相關(guān)聯(lián)的活性成分的藥物組合物適合施用于具有hla-a03的受試者(即hla-a03陽(yáng)性受試者)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是包含具有seqidno:7或38的氨基酸序列的肽的藥物組合物。通過(guò)本發(fā)明的藥物組合物治療和/或預(yù)防的癌癥沒(méi)有特別限制，只要它們是表達(dá)cdca1的癌癥，并包括各種癌癥，膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia)(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸癌，軟組織腫瘤，大腸癌等。優(yōu)選在純合或雜合地具有選自hla-a11，hla-a33，和hla-a03的hla等位基因的受試者中使用本發(fā)明的藥物組合物。除了上述活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含具有誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞的ctl的能力的其他肽(例如，其它taa衍生的ctl誘導(dǎo)肽)，編碼其他肽的其他多核苷酸，呈遞其他肽的其他細(xì)胞等。本發(fā)明的藥物組合物還可以任選地包含其它治療物質(zhì)作為活性成分，只要它們不抑制上述活性成分(例如本發(fā)明的肽)的抗腫瘤作用即可。例如，本發(fā)明的藥物組合物可任選地包含抗炎組合物，鎮(zhèn)痛藥，化學(xué)治療劑等。除了將其它治療物質(zhì)包括在本發(fā)明的藥物組合物本身以外，還可以與一種或多種其它藥物組合物順序或同時(shí)施用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物和其它藥物組合物的劑量取決于例如所使用的藥物組合物的類型和所治療的疾病，以及施用時(shí)間安排(scheduling)和施用途徑。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到制劑類型，除了本文明確提及的成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含本領(lǐng)域常規(guī)的其它組分。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的藥物組合物的制品或試劑盒。本發(fā)明的制品或試劑盒可以包括容納本發(fā)明的藥物組合物的容器。適當(dāng)?shù)娜萜鞯睦影ㄆ浚∑炕蛟嚬?，但不限于此。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。標(biāo)簽可以附著于容器，并且可以在標(biāo)簽中描述本發(fā)明的藥物組合物所應(yīng)用的疾病或疾病狀態(tài)。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。除了容納本發(fā)明的藥物組合物的容器之外，優(yōu)選地本發(fā)明的制品或試劑盒還可以任選包含容納藥學(xué)上可接受的稀釋劑的第二容器。本發(fā)明的制品或試劑盒還可包括從商業(yè)立場(chǎng)和用戶角度所需的其它材料，例如其它緩沖液，稀釋劑，過(guò)濾器，注射針，注射器，具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。根據(jù)需要，本發(fā)明的藥物組合物可包裝在藥包或分配裝置中提供，該藥包或分配裝置可裝有一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括例如金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配裝置可附有施用說(shuō)明書(shū)。(1)包含肽作為活性成分的藥物組合物包含本發(fā)明的肽的藥物組合物可以根據(jù)需要通過(guò)常規(guī)制劑方法配制。除了本發(fā)明的肽之外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含通常用于藥物中的載體，賦形劑等，而沒(méi)有特別限制。可用于本發(fā)明的藥物組合物中的載體的例子包括滅菌水(例如注射用水)，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖鹽水，tris緩沖鹽水，0.3％甘氨酸，培養(yǎng)液，等等。此外，本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要含有穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑、增溶劑、ph調(diào)節(jié)劑、聚集抑制劑，等等。本發(fā)明的藥物組合物可以誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的特異性免疫，因此可以用于癌癥治療或預(yù)防(防范)的目的。例如，可以通過(guò)以下制備本發(fā)明的藥物組合物：在藥學(xué)上或生理上可接受的水溶性載體中溶解，所述水溶性載體例如滅菌水(例如注射用水)，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖鹽水，和tris緩沖鹽水，并根據(jù)需要加入穩(wěn)定劑，懸浮劑，防腐劑，表面活性劑，增溶劑，ph調(diào)節(jié)劑，聚集抑制劑等，然后滅菌肽溶液。對(duì)肽溶液進(jìn)行滅菌的方法沒(méi)有特別限定，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾滅菌進(jìn)行。過(guò)濾滅菌可以使用(例如)孔徑為0.22μm或以下的過(guò)濾滅菌過(guò)濾器進(jìn)行。過(guò)濾滅菌的肽溶液可以例如作為注射劑施用至受試者，但不限于此。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)冷凍干燥上述肽溶液制備為冷凍干燥制劑。冷凍干燥制劑可以通過(guò)以下制備：將如上所述制備的肽溶液裝入適當(dāng)?shù)娜萜?，如安瓿、小瓶或塑料容器中，隨后冷凍干燥并用洗滌滅菌的橡膠塞等在壓力回收之后包封入容器中。冷凍干燥制劑可以在其再溶解于藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的水溶性載體后施用至受試者，所述水溶性載體例如滅菌水(例如注射用水)，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖鹽水，和tris緩沖鹽水等。本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選實(shí)例包括此類過(guò)濾滅菌的肽溶液的注射物和由凍干該肽溶液所產(chǎn)生的冷凍干燥制劑。本發(fā)明還包括含有此類冷凍干燥制劑和再溶解溶液的試劑盒。本發(fā)明還包括容納冷凍干燥制劑(其是本發(fā)明的藥物組合物)的容器和容納再溶解溶液的容器的試劑盒。本發(fā)明的藥物組合物可以包含兩種或更多種類型的本發(fā)明肽的組合。肽的組合可以采取混合的肽的雞尾酒形式，或可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將肽化學(xué)連接或表達(dá)成為單一融合多肽。通過(guò)施用本發(fā)明的肽，肽被hla抗原以高密度展示在apc上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與hla抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的ctl?；蛘?，可以從受試者分離apcs(例如dcs)，然后用本發(fā)明的肽刺激它們，來(lái)獲得在其細(xì)胞表面上展示任何所述本發(fā)明肽的apc。將這些apc重新施用給受試者以在受試者中誘導(dǎo)ctls，結(jié)果，可提高針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的攻擊性。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含已知用于有效建立細(xì)胞免疫的佐劑。佐劑是指當(dāng)與抗原一起(或連續(xù))施用時(shí)增強(qiáng)針對(duì)具有免疫學(xué)活性的抗原的免疫應(yīng)答的化合物?？梢允褂妹枋鲇谖墨I(xiàn)中的已知佐劑，例如clinmicrobiolrev1994,7:277-89。合適佐劑的例子包括鋁鹽(磷酸鋁，氫氧化鋁，羥基氧化鋁等),明礬,霍亂毒素,沙門氏菌毒素,ifa(不完全弗氏佐劑),cfa(完全弗氏佐劑),iscomatrix,gm-csf和其他免疫刺激細(xì)胞因子，含有cpg基序的寡脫氧核苷酸(cpg7909等)，水包油乳液，皂苷或其衍生物(qs21等)，脂多糖例如脂質(zhì)a或其衍生物(mpl,rc529,gla,e6020等)，脂肽，乳鐵蛋白，鞭毛蛋白，雙鏈rna或其衍生物(poliic等)，細(xì)菌dna，咪唑并喹啉(imiquimod,r848等)，c型凝集素配體(海藻糖-6,6’-二山崳酸/酯(tdb)等)，cd1d配體(alpha-半乳糖神經(jīng)酰胺等)，角鯊烯乳液(mf59,as03,af03等),plga等，但不限于此。在包含本發(fā)明的藥物組合物的試劑盒中，佐劑可以包含在與包含本發(fā)明的肽的藥物組合物分開(kāi)的另一容器中。在這種情況下，佐劑和藥物組合物可以連續(xù)地施用于受試者，或者在施用給受試者之前立即混合在一起。本發(fā)明還提供了包含含有本發(fā)明的肽藥物組合物和佐劑的此類試劑盒。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物是冷凍干燥制劑時(shí)，試劑盒還可以包含再溶解溶液。此外，本發(fā)明提供試劑盒，其包括容納本發(fā)明的藥物組合物的容器和存儲(chǔ)佐劑的容器。試劑盒可以根據(jù)需要進(jìn)一步包含儲(chǔ)存再溶解溶液的容器。當(dāng)油佐劑用作佐劑時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物可以制備為乳液。例如，可以通過(guò)混合并攪拌如上所述制備的肽溶液和油佐劑來(lái)制備乳液。肽溶液可以是在冷凍干燥后再溶解的溶液。乳液可以是w/o型乳液和o/w型乳液，且w/o型乳液優(yōu)選用于獲得高免疫應(yīng)答增強(qiáng)效果。ifa可優(yōu)選用作油佐劑，但不限于此。乳劑的制備可以在施用受試者之前立即進(jìn)行，且在這種情況下，本發(fā)明的藥物組合物可以作為包含本發(fā)明的肽溶液和油性佐劑的試劑盒提供。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物是冷凍干燥制劑時(shí)，試劑盒可以進(jìn)一步包含再溶解溶液。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以是其中包封了本發(fā)明肽的脂質(zhì)體制劑、其中肽結(jié)合至具有幾微米直徑的珠子的顆粒配制劑，或其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽還可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式施用。優(yōu)選的鹽的實(shí)例包括與堿金屬(鋰，鉀，鈉等)的鹽，與堿土金屬(鈣，鎂等)的鹽，與其他金屬(銅，鐵，鋅，錳等)的鹽,與有機(jī)堿的鹽,與胺的鹽,與有機(jī)酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的鹽,和與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸、硝酸等等)的鹽。本文中所用的短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指保留所述化合物的生物學(xué)，生理學(xué)，藥理學(xué)和藥學(xué)上的有效性和性質(zhì)的鹽。因此，包含本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物也包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，除了游離肽之外，“本發(fā)明的肽”還包括其藥學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包括引發(fā)(prime)ctls的成分。已經(jīng)確認(rèn)脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對(duì)病毒抗原的ctl的組分。例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)ctl響應(yīng)的其他例子，大腸桿菌脂蛋白，諸如三棕櫚?；?s-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(p3css)，當(dāng)與適宜的肽共價(jià)連接時(shí)，可用來(lái)引發(fā)ctl(參見(jiàn)例如deres等人,nature1989,342:561-4)。用于施用本發(fā)明的肽或藥物組合物的合適方法的實(shí)例包括口服、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)注射，以及全身施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近，但不限于此。優(yōu)選的施用方法包括皮下注射到諸如腋窩或腹股溝的淋巴結(jié)附近。施用可以通過(guò)單次施用進(jìn)行或通過(guò)多次施用來(lái)強(qiáng)化。本發(fā)明的肽可以以治療或藥學(xué)有效量施用于受試者以治療癌癥，或以治療或藥學(xué)有效量以誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫(更具體地為ctls)。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整。對(duì)于本發(fā)明的每種肽，劑量通常是0.001mg-1000mg,例如0.01mg-100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。給藥間隔可以是每幾天至幾個(gè)月一次，且例如，可以每周一次的間隔進(jìn)行給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇合適的劑量(dose)(劑量(dosage))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的肽和藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的肽，藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體和佐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以包含0.001mg-1000mg,優(yōu)選0.01mg-100mg,更優(yōu)選0.1mg-30mg，甚至更優(yōu)選0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本發(fā)明的肽。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物是注射劑時(shí)，其可以包含以下濃度的本發(fā)明的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml,優(yōu)選0.01mg/ml-100mg/ml,更優(yōu)選0.1mg/ml-30mg/ml,甚至更優(yōu)選0.1mg/ml-10mg/ml,例如0.5mg/ml-5mg/ml。在這種情況下，例如，可以通過(guò)注射向受試者施用0.1至5ml,優(yōu)選0.5ml至2ml的本發(fā)明的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，其包括向受試者施用治療有效量的本發(fā)明的肽或本發(fā)明的藥物組合物。如上所述，本發(fā)明的肽可以以通常為以下量的單一劑量施用于受試者：0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如,0.5mg-5mg。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽與佐劑一起施用于受試者。此外，給藥間隔可以是每幾天至幾個(gè)月一次，優(yōu)選每幾天至每月一次，例如每周一次或每?jī)芍芤淮巍?2)含有多核苷酸作為活性成分的藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物也可含有以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明公開(kāi)的肽的多核苷酸。在本文中，短語(yǔ)“以可表達(dá)的形式”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)會(huì)表達(dá)作為本發(fā)明的肽。在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸的序列包括用于本發(fā)明的肽的表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的多核苷酸可具有為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組所需的序列(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見(jiàn)例如thomaskr&capecchimr,cell1987,51:503-12)。參見(jiàn)例如wolff等人,science1990,247:1465-8；美國(guó)專利號(hào)5,580,859,5,589,466,5,804,566,5,739,118,5,736,524,5,679,647；和wo98/04720。基于dna的投遞技術(shù)的例子包括“裸dna”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,922,687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來(lái)表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作為表達(dá)本發(fā)明的肽的載體。在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答。可用于免疫接種方案的牛痘載體和方法記載于例如美國(guó)專利號(hào)4,722,848。另一種載體是bcg(bacillecalmetteguerin)。bcg載體描述于stover等人,nature1991,351:456-60。各種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見(jiàn)的，例如腺病毒和腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)載體、去毒炭疽毒素載體等等。參見(jiàn)例如shata等人,molmedtoday2000,6:66-71；shedlock等人.,jleukocbiol2000,68:793-806；hipp等人.,invivo2000,14:571-85。本發(fā)明的多核苷酸投遞至患者中可以是直接的，在這種情況下患者可以直接暴露于攜帶本發(fā)明多核苷酸的載體，或者是間接的，在這種情況下首先在體外用攜帶本發(fā)明多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入患者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見(jiàn)goldspiel等人,clinicalpharmacy1993,12:488-505；wu和wu,biotherapy1991,3:87-95；tolstoshev,annrevpharmacoltoxicol1993,33:573-96；mulligan,science1993,260:926-32；morgan&anderson,annrevbiochem1993,62:191-217；trendsinbiotechnology1993,11(5):155-215。在ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny,1993；及krieger,genetransferandexpression,alaboratorymanual,stocktonpress,ny,1990中描述了可應(yīng)用于本發(fā)明的重組dna
技術(shù)領(lǐng)域：
的公知方法。與肽的施用類似，多核苷酸的施用可以通過(guò)口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、骨內(nèi)、或腹膜內(nèi)注射等等進(jìn)行。施用可以是系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過(guò)單次施用來(lái)實(shí)施，或者通過(guò)多次施用來(lái)強(qiáng)化。本發(fā)明的多核苷酸可以以治療或藥學(xué)有效量施用于受試者，用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫(更具體地，ctl)，或以治療或藥學(xué)有效量用于治療癌癥。合適載體中的多核苷酸的劑量或使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，且通常是0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如0.5mg-5mg。給藥間隔可以是每幾天至幾個(gè)月一次，例如，給藥可以每周一次的間隔進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇合適的劑量(dose)(劑量(dosage))。x.使用肽、外來(lái)體、apc和ctl的方法本發(fā)明的肽和多核苷酸可用于誘導(dǎo)apcs和ctls。也可以使用本發(fā)明的的外來(lái)體和apcs來(lái)誘導(dǎo)ctls。肽、多核苷酸、外來(lái)體和apcs可以與任何其它化合物組合使用，只要其ctl誘導(dǎo)能力不被抑制。因此，可以使用包含本發(fā)明的任何肽，多核苷酸，apc和外來(lái)體的藥物組合物來(lái)誘導(dǎo)本發(fā)明的ctl。此外，可以使用包含本發(fā)明的肽或多核苷酸的藥物組合物來(lái)誘導(dǎo)本發(fā)明的apc。(1)誘導(dǎo)apcs的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apcs的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或體內(nèi)使apc與本發(fā)明的肽接觸的步驟。例如，使apc與肽離體接觸的方法可以包括以下步驟：(a)從受試者收集apcs；和(b)使步驟(a)的apcs與本發(fā)明的肽接觸。上述apcs不限于特定種類的細(xì)胞，并且可以使用已知在其細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)抗原以被淋巴細(xì)胞識(shí)別的dc，langerhans細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，b細(xì)胞，和活化的t細(xì)胞。dcs在apcs中具有最強(qiáng)的ctl誘導(dǎo)能力，因此優(yōu)選使用dcs。本發(fā)明的任何肽均可以單獨(dú)或與本發(fā)明的其它肽組合使用。此外，本發(fā)明的肽可以與其它c(diǎn)tl誘導(dǎo)肽(例如，其它taa衍生的ctl誘導(dǎo)肽)組合使用。同時(shí)，當(dāng)將本發(fā)明的肽施用給受試者時(shí)，apcs在體內(nèi)接觸到所述肽，結(jié)果，在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高ctl誘導(dǎo)能力的apcs。因此，本發(fā)明的方法可包向受試者施用本發(fā)明的肽的步驟。類似地，當(dāng)將可表達(dá)形式的本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者時(shí)，本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的肽在體內(nèi)與apcs接觸，結(jié)果，在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高ctl誘導(dǎo)能力的apcs。因此，本發(fā)明還可以包括向受試者施用本發(fā)明的多核苷酸的步驟。為了誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apcs，本發(fā)明還包括將本發(fā)明的多核苷酸引入apcs的步驟。例如，所述方法可以包括以下步驟：(a)自受試者收集apcs；并(b)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入步驟(a)的apcs。步驟(b)可如上文“vi.抗原呈遞細(xì)胞(apc)”部分中所述來(lái)實(shí)施。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apcs的方法，其包含以下步驟(a)或(b)：(a)使apcs與本發(fā)明的肽接觸；并(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸引入apcs中。此外，本發(fā)明提供了制備具有ctl誘導(dǎo)能力的apcs的方法，其包含以下步驟(a)或(b)：(a)使apcs與本發(fā)明的肽接觸；或(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸引入apcs中。上述方法可以在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施，并優(yōu)選在體外或離體實(shí)施它們。在上述方法中使用的apcs可以衍生自計(jì)劃施用誘導(dǎo)的apcs的受試者，或者它們可以衍生自不同的受試者。當(dāng)使用來(lái)自與計(jì)劃施用的受試者不同的受試者(供體)的apcs時(shí)，施用受試者和供體必須具有相同的hla類型。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾肽用作本發(fā)明的肽時(shí)，在施用受試者和供體中hla類型優(yōu)選為hla-a11(更優(yōu)選hla-a*1101)。或者，在上述方法中使用的apcs優(yōu)選是表達(dá)hla-a11(更優(yōu)選hla-a*1101)的apcs。類似地，當(dāng)具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾肽用作本發(fā)明的肽時(shí)，在施用受試者和供體中hla類型優(yōu)選為hla-a33(更優(yōu)選hla-a*3303)。或者，在上述方法中使用的apcs優(yōu)選是表達(dá)hla-a33(更優(yōu)選hla-a*3303)的apcs。類似地，當(dāng)具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾肽用作本發(fā)明的肽時(shí)，在施用受試者和供體中hla類型優(yōu)選為hla-a03(更優(yōu)選hla-a*0301)?；蛘?，在上述方法中使用的apcs優(yōu)選是表達(dá)hla-a03(更優(yōu)選hla-a*0301)的apcs。在通過(guò)重力離心法等從供體收集的血液中分離pbmc之后，可以使用已知方法從pbmc制備apc。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的肽或編碼該肽的多核苷酸用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的藥物組合物?；蛘撸景l(fā)明還提供了本發(fā)明的肽或編碼該肽的多核苷酸在制備用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的藥物組合物中的用途?；蛘撸景l(fā)明還提供本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸，用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一步提供制備用于誘導(dǎo)apc的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中所述方法或過(guò)程包括將本發(fā)明的肽或本發(fā)明的多核苷酸與藥學(xué)上或生理上可接受的載體進(jìn)行配制的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備用于誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中所述方法或過(guò)程包括將本發(fā)明的肽或本發(fā)明的多核苷酸與藥學(xué)上或生理上可接受的載體相混合的步驟。通過(guò)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的apcs可誘導(dǎo)對(duì)cdca1特異性的ctls(即本發(fā)明的ctls)。(2)誘導(dǎo)ctl的方法本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽，多核苷酸，外來(lái)體或apc來(lái)誘導(dǎo)ctl的方法。本發(fā)明還提供了使用一種或多種編碼能夠形成t細(xì)胞受體(tcr)的多肽(即tcr亞基)的多核苷酸來(lái)誘導(dǎo)ctls的方法，所述tcr能夠識(shí)別本發(fā)明的肽和hla抗原的復(fù)合物。優(yōu)選地，誘導(dǎo)ctls的方法包含選自以下至少一個(gè)步驟：(a)使cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞接觸，所述抗原呈遞細(xì)胞在其表面上呈遞有hla抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物；(b)使cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與外來(lái)體接觸，所述外來(lái)體在其表面上呈遞有hla抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物；和(c)向cd8陽(yáng)性t細(xì)胞導(dǎo)入一種或多種編碼能夠形成tcr的多肽的多核苷酸，所述tcr能夠識(shí)別本發(fā)明的肽和hla抗原的復(fù)合物。當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、apc或外來(lái)體施用至受試者后，在受試者的身體中誘導(dǎo)ctls，而且靶向表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的方法可包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、apc或外來(lái)體施用于受試者的步驟。或者，也可在體外或離體使用它們來(lái)誘導(dǎo)ctls。例如，本發(fā)明的方法可以包括以下步驟：(a)自受試者收集apcs；(b)將步驟(a)的apcs與本發(fā)明的肽接觸；和(c)將步驟(b)的apcs與cd8陽(yáng)性t細(xì)胞共培養(yǎng)。誘導(dǎo)的ctl可以隨后返回到受試者。上文步驟(c)中要與cd8陽(yáng)性t細(xì)胞共培養(yǎng)的apc也可通過(guò)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸引入apc來(lái)制備，如上文“vi.抗原呈遞細(xì)胞(apc)”部分所述。然而，用于本發(fā)明的方法中的apc不限于此，并且可以使用在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的任何apc。在本發(fā)明的方法中，除了此類apcs，也可以使用在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來(lái)體。即，本發(fā)明的方法可以包括與在其表面上呈遞hla抗原和本發(fā)明肽的復(fù)合物的外來(lái)體共培養(yǎng)的步驟。此類外來(lái)體可通過(guò)上文“v.外來(lái)體”部分中描述的方法來(lái)制備。此外，可通過(guò)將包含編碼tcr的每種亞基的多核苷酸的載體導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)ctls，所述tcr能夠結(jié)合通過(guò)細(xì)胞表面上的hla抗原呈遞的本發(fā)明的肽。此類轉(zhuǎn)化可如上文“viii.t細(xì)胞受體(tcr)”部分中所述來(lái)實(shí)施。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)ctls的方法，包括選自以下的步驟：(a)將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與apcs共培養(yǎng)，所述apcs在其表面呈遞hla抗原和本發(fā)明肽的復(fù)合物；(b)將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與外來(lái)體共培養(yǎng)，所述外來(lái)體在其表面呈遞hla抗原和本發(fā)明肽的復(fù)合物；和(c)向cd8陽(yáng)性t細(xì)胞導(dǎo)入包含編碼tcr的每種亞基的多核苷酸的載體，所述tcr能夠結(jié)合通過(guò)細(xì)胞表面上的hla抗原呈遞的本發(fā)明的肽。上述方法可以在體外，離體或體內(nèi)實(shí)施，并且優(yōu)選在體外或離體實(shí)施它們。在上述方法中使用的apcs或外來(lái)體和cd8陽(yáng)性t細(xì)胞可以衍生自計(jì)劃施用誘導(dǎo)的ctl的受試者，或者它們可以衍生自不同的受試者。當(dāng)使用來(lái)自與計(jì)劃施用的受試者不同的受試者(供體)的apc或外來(lái)體和cd8陽(yáng)性t細(xì)胞時(shí)，施用對(duì)象和供體必須具有相同的hla類型。例如，當(dāng)具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾肽用作為本發(fā)明的肽時(shí)，在施用對(duì)象和供體中hla類型優(yōu)選為hla-a11(更優(yōu)選hla-a*1101)?；蛘?，上述方法中使用的apc或外來(lái)體優(yōu)選是在其表面上呈遞hla-a11(更優(yōu)選hla-a*1101)和本發(fā)明的肽(具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽或其修飾肽)的復(fù)合物的apc或外來(lái)體。在這種情況下，誘導(dǎo)的ctls顯示出針對(duì)呈遞hla-a11和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的細(xì)胞(例如，表達(dá)cdca1的hla-a11陽(yáng)性細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。或者，例如當(dāng)具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾的肽作為本發(fā)明的肽時(shí)，施用對(duì)象中的hla和供體優(yōu)選都是hla-a33(更優(yōu)選hla-a*3303)?；蛘呱鲜龇椒ㄖ惺褂玫腶pc或外來(lái)體優(yōu)選是在其表面上呈遞hla-a33(更優(yōu)選hla-a*3303)和本發(fā)明的肽(具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽或其修飾肽)的復(fù)合物的apc或外來(lái)體。在這種情況下，誘導(dǎo)的ctls顯示出針對(duì)呈遞hla-a33和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的細(xì)胞(例如，表達(dá)cdca1的hla-a33陽(yáng)性細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。或者，例如當(dāng)具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾的肽作為本發(fā)明的肽時(shí)，施用對(duì)象中的hla和供體優(yōu)選都是hla-a03(更優(yōu)選hla-a*0301)?；蛘呱鲜龇椒ㄖ惺褂玫腶pc或外來(lái)體優(yōu)選是在其表面上呈遞hla-a03(更優(yōu)選hla-a*0301)和本發(fā)明的肽(具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽或其修飾肽)的復(fù)合物的apc或外來(lái)體。在這種情況下，誘導(dǎo)的ctls顯示出針對(duì)呈遞hla-a03和本發(fā)明的肽的復(fù)合物的細(xì)胞(例如，表達(dá)cdca1的hla-a03陽(yáng)性細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)ctl的組合物或藥物組合物，其包含至少一種選自以下的活性成分：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；和(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供選自以下的活性成分在制備用于誘導(dǎo)ctl的組合物或藥物組合物中的用途：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；和(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一步提供選自以下的活性成分用于誘導(dǎo)ctls：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；和(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一步提供了制備用于誘導(dǎo)ctls的組合物或藥物組合物的方法或過(guò)程，其是包括將選自以下的活性成分與藥學(xué)上或生理上可接受的載體進(jìn)行配制的步驟的方法或過(guò)程：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；和(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備用于誘導(dǎo)ctls的組合物或藥物組合物的方法或過(guò)程，其實(shí)包括將選自以下的活性成分與藥學(xué)上或生理上可接受的載體混合的步驟的方法或過(guò)程：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；和(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體。xi.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答的方法。適用的癌癥包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓細(xì)胞性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等。優(yōu)選的是癌癥表達(dá)選自hla-a11,hla-a33,和hla-a03中至少一種hla。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的方法。cdca1被認(rèn)為在上述各種類型的癌癥中過(guò)表達(dá)。因此，當(dāng)誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答時(shí)，結(jié)果抑制了癌細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明還提供了抑制表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞增殖的方法。本發(fā)明的方法特別適用于抑制表達(dá)cdca1和選自hla-a11,hla-a33,和hla-a03中至少一種hla的癌細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的方法可以包括施用包含本發(fā)明的任何肽或編碼所述肽的多核苷酸的組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明的肽的apc或外來(lái)體。關(guān)于詳情參見(jiàn)“ix.藥物組合物”部分，特別是描述本發(fā)明的藥物組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于本發(fā)明的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的外來(lái)體和apc詳細(xì)描述于上文“v.外來(lái)體”、“vi.抗原呈遞細(xì)胞(apc)”、和“x.使用肽、外來(lái)體、apc和ctl的方法”的項(xiàng)(1)和(2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答的藥物組合物或疫苗，其中所述藥物組合物或疫苗包含選自以下的活性成分：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl?；蛘撸景l(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物或疫苗，其中所述藥物組合物或疫苗包含選自以下的活性成分：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl?；蛘撸景l(fā)明還提供了用于抑制表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞增殖的藥物組合物或疫苗，其中所述藥物組合物或疫苗包含選自以下的活性成分：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選自以下的活性成分在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答的藥物組合物或疫苗中的用途：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl?；蛘?，本發(fā)明還提供選自以下的活性成分在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的藥物組合物或疫苗中的用途：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供選自以下的活性成分在制備用于抑制表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞的增殖的藥物組合物或疫苗中的用途：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。本發(fā)明還提供了用于制備誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中所述方法可以包括將本發(fā)明的肽或多核苷酸與藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行混合或配制的步驟。或者，本發(fā)明提供了抑制表達(dá)cdca1的癌細(xì)胞增殖的方法或誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答的方法，其包括向受試者施用包含選自以下的活性成分的疫苗或藥物組合物的步驟：(a)本發(fā)明的肽；(b)以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的apc；(d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來(lái)體；和(e)本發(fā)明的ctl。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，可以通過(guò)施用本發(fā)明的肽，多肽，apc，外來(lái)體和/或ctl來(lái)治療表達(dá)cdca1的癌癥?；蛘咄ㄟ^(guò)施用本發(fā)明的肽，多肽，apc，外來(lái)體和/或ctl可以誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答。此類癌癥的例子包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓細(xì)胞性白血病(cml),食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等，但不限于此。此外，通過(guò)施用本發(fā)明的肽，多肽，apc，外來(lái)體和/或ctl可以誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的癌癥的免疫應(yīng)答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認(rèn)待治療的受試者中患病部位的cdca1表達(dá)水平是否增加。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要癌癥治療的患者中治療表達(dá)cdca1的癌癥的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)測(cè)量從患有癌癥的受試者的患病部位收集的生物樣品中cdca1表達(dá)的水平；(ii)基于(i)中測(cè)量的cdca1表達(dá)水平鑒定具有表達(dá)cdca1的癌癥的受試者；和(iii)向與正常對(duì)照相比過(guò)表達(dá)cdca1的癌癥患者施用至少一種選自上述(a)至(e)組成的組的成分?；蛘?，本發(fā)明進(jìn)一步提供了疫苗和藥物組合物，其包含至少一種選自由以上(a)至(e)組成的組的活性成分，用于向具有表達(dá)cdca1的癌癥患者施用。本發(fā)明還提供鑒定或選擇要用至少一種選自上述(a)至(e)的活性成分治療的受試者的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)測(cè)量從患有癌癥的受試者的患病部位收集的生物樣品中cdca1表達(dá)的水平；(ii)基于(i)中測(cè)量的cdca1表達(dá)水平鑒定具有表達(dá)cdca1的癌癥的受試者；和(iii)鑒定或選擇(ii)中鑒定的受試者作為可以用至少一種選自由(a)至(e)組成的組的活性成分治療的受試者。在上述方法中從受試者收集的用于測(cè)量cdca1表達(dá)水平的生物樣品沒(méi)有特別限制，并且例如，可以優(yōu)選使用通過(guò)活組織檢查等收集的含有癌細(xì)胞的組織樣品。生物樣品中的cdca1表達(dá)水平可以通過(guò)已知方法測(cè)量，例如，可以使用通過(guò)探針或pcr方法檢測(cè)cdca1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法(例如cdna微陣列法，northern印跡法，rt-pcr法等)、通過(guò)抗體等檢測(cè)cdca1基因的翻譯產(chǎn)物的方法(例如，western印跡法，免疫染色法等)，等等。此外，生物樣品可以是血液樣品，在這種情況下，測(cè)量針對(duì)cdca1或其片段的抗體的血液水平，并且可以基于血液水平來(lái)評(píng)估患病部位的cdca1表達(dá)水平?？梢允褂靡阎椒y(cè)量針對(duì)cdca1的抗體的血液水平，并且例如，可以使用使用cdca1蛋白或本發(fā)明的肽作為抗原的酶免疫測(cè)定(eia)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)，放射免疫測(cè)定(ria)等。通常，在不表達(dá)cdca1的組織和細(xì)胞中，幾乎沒(méi)有檢測(cè)到cdca1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物。因此，當(dāng)在從受試者收集的癌細(xì)胞或含有癌細(xì)胞的組織樣品中檢測(cè)到cdca1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物時(shí)，可以確定受試者的癌癥表達(dá)cdca1。在沒(méi)有表達(dá)cdca1的癌癥的受試者的血液樣品中，幾乎沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)cca1或其片段的抗體。因此，當(dāng)在從受試者收集的血液樣品中檢測(cè)到針對(duì)cdca1或其片段的抗體時(shí)，可以確定受試者的癌癥表達(dá)cdca1。受試者的癌癥是否表達(dá)cdca1也可以通過(guò)與收集自受試者的非癌癥部位的相同類型的生物材料的測(cè)量結(jié)果相比較或與收集自未患有癌癥的受試者的相同類型的生物材料(正常對(duì)照樣品)相比較。即，在與正常對(duì)照樣品中的測(cè)量的靶水平(正常對(duì)照水平)進(jìn)行比較中，當(dāng)測(cè)試受試者的生物樣品中的水平升高時(shí)，受試者的癌癥被評(píng)估為表達(dá)cdca1。例如，當(dāng)檢測(cè)到的測(cè)量對(duì)象的量與正常對(duì)照水平相比增加至少10％或更高時(shí)，可以評(píng)估受試者的癌癥表達(dá)cdca1。期望的是，檢測(cè)到的測(cè)量目標(biāo)的量?jī)?yōu)選地比正常對(duì)照水平高25％或更高，更優(yōu)選50％或更高。此外，檢測(cè)到的cdca1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物的量可以通過(guò)相對(duì)于檢測(cè)到的已知持家基因(例如β-肌動(dòng)蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶或核糖體蛋白p1)的量標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)評(píng)價(jià)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選在施用至少一種選自由上述(a)至(e)組成的組的活性成分之前確認(rèn)受試者的hla類型。例如，對(duì)于要施用與具有選自seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58的氨基酸序列的肽相關(guān)的活性成分的受試者，優(yōu)選選擇hla-a11陽(yáng)性受試者。對(duì)于要施用與具有選自seqidnos:27,3,60,28,5,67和69的氨基酸序列的肽相關(guān)的活性成分的受試者，優(yōu)選選擇hla-a33陽(yáng)性受試者。對(duì)于要施用與具有選自seqidnos:7,38和47的氨基酸序列的肽相關(guān)的活性成分的受試者，優(yōu)選選擇hla-a03陽(yáng)性受試者。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的肽與hla的復(fù)合物。上述本發(fā)明的復(fù)合物可以是單體或多聚體。當(dāng)本發(fā)明的復(fù)合物為多聚體時(shí)，聚合的數(shù)目沒(méi)有特別限制，且可以是任何聚合數(shù)目的多聚體。例子包括但不限于四聚體，五聚體，六聚體等。本發(fā)明的多聚體還包括dextramers(wo2002/072631)和streptamers(knabelm等人,natmed.2002jun；8(6):631-7.)。本發(fā)明的肽和hla的復(fù)合物可以根據(jù)已知方法制備(例如,altmanjd等人,science.1996,274(5284):94-6；wo2002/072631；wo2009/003492；knabelm,natmed.2002jun；8(6):631-7等)。例如，本發(fā)明的復(fù)合物可用于定量對(duì)本發(fā)明的肽特異的ctls。例如，從施用本發(fā)明的藥物組合物的受試者收集血液樣品，并且在分離pbmc之后制備cd4陰性細(xì)胞并與本發(fā)明的熒光染料-綴合的復(fù)合物接觸。然后，可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)量對(duì)本發(fā)明的肽特異性的ctls的百分比。例如，可以通過(guò)在施用本發(fā)明的藥物組合物之前，期間和/或之后測(cè)量針對(duì)本發(fā)明的肽的特異性ctls來(lái)監(jiān)測(cè)本發(fā)明的藥物組合物的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)作用。xii.抗體本發(fā)明進(jìn)一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會(huì)結(jié)合(或會(huì)微弱結(jié)合)不是本發(fā)明的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類抗體可以包括在hla分子的背景下識(shí)別肽的抗體，即結(jié)合肽-mhc復(fù)合物的抗體。抗體的結(jié)合特異性可以通過(guò)抑制測(cè)定來(lái)確認(rèn)。也就是說(shuō)，如果在本發(fā)明的肽的存在下，待分析的抗體與全長(zhǎng)cdca1多肽之間的結(jié)合被抑制，則該抗體顯示出特異性結(jié)合本發(fā)明的肽。針對(duì)本發(fā)明的肽的抗體可用于疾病診斷和預(yù)后的測(cè)定，以及用于選擇施用本發(fā)明的藥物組合物的受試者選擇和監(jiān)測(cè)本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)和/或定量本發(fā)明的肽或其片段的各種免疫測(cè)定。此類免疫測(cè)定包括但不限于放射免疫測(cè)定，免疫色譜，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)，酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定(elifa)等，并且在本領(lǐng)域熟知的各種免疫測(cè)定形式的范圍內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的抗體可以用于可以檢測(cè)表達(dá)cdca1疾病的免疫學(xué)成像方法，且其實(shí)例包括但不限于使用本發(fā)明的標(biāo)記抗體的放射性閃爍照相成像。此類測(cè)定方法在臨床上用于檢測(cè)，監(jiān)測(cè)和預(yù)后表達(dá)cdca1的癌癥；且此類癌癥的例子包括但不限于膀胱癌,乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓細(xì)胞性白血病(cml),食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等。本發(fā)明的抗體可以以任何任意形式使用，例如單克隆或多克隆抗體，而且還可包括通過(guò)用本發(fā)明的肽免疫動(dòng)物(諸如家兔)而獲得的抗血清，所有種類的多克隆和單克隆抗體，人抗體，及通過(guò)遺傳重組生成的嵌合抗體和人源化抗體。用作獲得抗體的抗原的本發(fā)明的肽或其片段可以通過(guò)基于本文公開(kāi)的氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成或基因工程技術(shù)獲得。用作免疫抗原的肽可以是本發(fā)明的肽或本發(fā)明的肽的片段。此外，該肽可以與載體結(jié)合或與載體綴合以增加免疫原性。匙孔血藍(lán)蛋白(klh)作為載體是公知的。用于將klh結(jié)合至肽的方法也是本領(lǐng)域公知的?？梢杂蒙鲜隹乖庖呷魏尾溉閯?dòng)物，且當(dāng)產(chǎn)生單克隆抗體時(shí)優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常，可使用嚙齒目(rodentia)、兔形目(lagomorpha)或靈長(zhǎng)目(primate)的動(dòng)物。嚙齒目動(dòng)物包括例如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。兔形目動(dòng)物包括例如家兔。靈長(zhǎng)目動(dòng)物包括例如狹鼻猿(舊大陸猴(oldworldmonkey))諸如食蟹猴(macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。用抗原免疫動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射和皮下注射抗原是免疫哺乳動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體的說(shuō)，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑諸如弗氏(freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動(dòng)物。然后，優(yōu)選的是使用每4至21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原?？墒褂眠m宜的載體進(jìn)行免疫。如上所述進(jìn)行免疫后，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)血清中所需抗體的量的增加?？梢匀缦轮苽溽槍?duì)本發(fā)明肽的多克隆抗體：從哺乳動(dòng)物中收集血液(其已經(jīng)在免疫后確認(rèn)了所需抗體血清水平的增)，并通過(guò)任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體可以是包括含有多克隆抗體的血清，或可以從所述血清中分離的，含有該多克隆抗體的級(jí)分?？梢允褂美缗悸?lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識(shí)別本發(fā)明肽的級(jí)分中制備免疫球蛋白g或m，并進(jìn)一步使用蛋白a或蛋白g柱純化該級(jí)分。為了制備單克隆抗體，在確認(rèn)免疫后所需抗體的血清水平增加時(shí)，從哺乳動(dòng)物收集免疫細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞可優(yōu)選獲自脾。對(duì)于其他與上述免疫細(xì)胞融合的親本細(xì)胞，例如，可以使用哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選已獲得融合細(xì)胞的藥物選擇性質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞?？筛鶕?jù)已知的方法，例如milstein等人(galfre和milstein,methodsenzymol73:3-46(1981))的方法，將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。對(duì)于由細(xì)胞融合得到的雜交瘤，可在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基諸如hat培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以進(jìn)行選擇。通常，在hat培養(yǎng)基中繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間(例如，數(shù)天至數(shù)周)，以允許除了所需的雜交瘤之外的所有其他細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡。然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋(standardlimitingdilution)來(lái)篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。除了上述用抗原免疫非人動(dòng)物來(lái)制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達(dá)肽的細(xì)胞或其溶胞物免疫人淋巴細(xì)胞，諸如那些感染了eb病毒的人淋巴細(xì)胞。然后，可以使經(jīng)過(guò)免疫的淋巴細(xì)胞與永生化的衍生自人的骨髓瘤細(xì)胞諸如u266融合，以產(chǎn)生期望的生成能夠與所述肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤(jps63-17688)。然后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過(guò)例如硫酸銨沉淀、蛋白a或蛋白g柱、deae離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進(jìn)行純化?；蛘?，可以通過(guò)癌基因永生化抗體產(chǎn)生免疫細(xì)胞(如免疫的淋巴細(xì)胞)，并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來(lái)重組制備(參見(jiàn)例如borrebaeckandlarrick,therapeuticmonoclonalantibodies,由macmillanpublishersltd在英國(guó)出版(1990))。例如，可以從免疫細(xì)胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細(xì)胞克隆編碼抗體的dna，將該dna插入合適的載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過(guò)修飾的抗體，只要它結(jié)合本發(fā)明的肽。例如，期望抗體片段含有抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，抗體片段可以是fab、f(ab’)2、fv或?qū)?lái)自h鏈和l鏈的fv片段通過(guò)合適的接頭連接而成的單鏈fv(scfv)(huston等人.,procnatlacadsciusa85:5879-83(1988))。更具體的說(shuō)，可以通過(guò)用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來(lái)生成抗體片段。或者，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)例如co等人,jimmunol152:2968-76(1994)；better和horwitz,methodsenzymol178:476-96(1989)；pluckthun和skerra,methodsenzymol178:497-515(1989)；lamoyi,methodsenzymol121:652-63(1986)；rousseaux等人,methodsenzymol121:663-9(1986)；bird和walker,trendsbiotechnol9:132-7(1991))?？贵w可以通過(guò)與多種分子諸如聚乙二醇(peg)綴合來(lái)修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過(guò)此類修飾的抗體?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)修飾抗體來(lái)獲得經(jīng)過(guò)修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?；蛘?，可以以衍生自非人抗體的可變區(qū)與衍生自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含衍生自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)、衍生自人抗體的框架區(qū)(fr)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來(lái)獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來(lái)制備。人源化可通過(guò)用非人抗體cdr序列取代人抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如verhoeyen等人,science239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的一小部分已被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所取代。也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)制備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(kù)(例如hoogenboom&winter,j.mol.biol.227:381(1991))。類似的，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來(lái)生成人抗體。該方法記載于例如美國(guó)專利號(hào)6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，可以通過(guò)適當(dāng)選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過(guò)濾、超濾、鹽析、透析、sds聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來(lái)分離和純化抗體(antibodies:alaboratorymanual.edharlow和davidlane,coldspringharborlaboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白a柱和蛋白g柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白a柱包括例如hyperd、poros和sepharosef.f.(pharmacia)。除了親和色譜，示例性的色譜包括，例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾、反相層析、吸附層析、等等(strategiesforproteinpurification和characterization:alaboratorycoursemanual.eddanielr.marshak等人,coldspringharborlaboratorypress(1996))?？梢酝ㄟ^(guò)液相層析來(lái)進(jìn)行層析程序，諸如hplc和fplc。例如，可通過(guò)使用吸光度測(cè)量、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)、酶免疫測(cè)定法(eia)、放射免疫測(cè)定法(ria)和/或免疫熒光(if)來(lái)測(cè)量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在elisa中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，然后施加含有所需抗體的樣品，諸如生成抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標(biāo)記的、識(shí)別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對(duì)硝基苯酯，并通過(guò)測(cè)量吸光度以評(píng)估樣品的抗原結(jié)合活性。為了評(píng)估抗體的結(jié)合活性，可以使用肽片段如c-末端或n-末端片段作為抗原?？梢允褂胋iacore(pharmacia)來(lái)評(píng)估本發(fā)明抗體的活性。通過(guò)將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明的肽的樣品，并檢測(cè)或測(cè)量在抗體和肽之間形成的免疫復(fù)合物，可以檢測(cè)或測(cè)量使用以上方法的本發(fā)明的肽。例如，本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)受試者的血液樣品(例如，血清樣品)中存在的本發(fā)明的肽。或者，也可以使用本發(fā)明的肽來(lái)檢測(cè)受試者血液樣品(例如，血清樣品)中存在的本發(fā)明的抗體。在受試者的血液樣品中測(cè)量本發(fā)明的肽或本發(fā)明的抗體的結(jié)果可以用于受試者選擇用于施用本發(fā)明的藥物組合物或監(jiān)測(cè)藥物組合物的功效。此外，已報(bào)道具有抗體(其針對(duì)作為疫苗施用的肽)的患者可能對(duì)疫苗具有高的應(yīng)答性。因此，當(dāng)使用患者的抗體作為指標(biāo)(index)施用作為疫苗的本發(fā)明的肽時(shí)，本發(fā)明的肽可用作免疫測(cè)定抗原用于選擇具有高應(yīng)答性的患者。xii.載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸的載體和導(dǎo)入有所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可以用于將本發(fā)明的多核苷酸保持在宿主細(xì)胞中，以在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的肽，或者以施用本發(fā)明的多核苷酸用于基因療法。當(dāng)大腸桿菌為宿主細(xì)胞且在大腸桿菌(例如jm109、dh5-alpha、hb101或xl1-blue)中大量擴(kuò)增和生成載體時(shí)，載體需要具有用于在大腸桿菌中擴(kuò)增的“復(fù)制起點(diǎn)”和用于選擇經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)志基因(例如通過(guò)藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用m13系列載體、puc系列載體、pbr322、pbluescript、pcr-script等。另外，pgem-t，pdirect和pt7可用于克隆以及以上載體。當(dāng)載體用于生產(chǎn)本發(fā)明的肽時(shí)，可以使用表達(dá)載體。例如，要在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具備上述在大腸桿菌中擴(kuò)增的特征。當(dāng)使用大腸桿菌諸如jm109、dh5-alpha、hb101或xl1-blue作為宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中高效表達(dá)所需基因的啟動(dòng)子，例如lacz啟動(dòng)子(ward等人,nature341:544-6(1989)；fasebj6:2422-7(1989))、arab啟動(dòng)子(better等人,science240:1041-3(1988))、t7啟動(dòng)子等。在這方面，可以使用例如pgex-5x-1(pharmacia)、“qiaexpress系統(tǒng)”(qiagen)、pegfp和pet(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達(dá)t7rna聚合酶的bl21)來(lái)取代上述載體。另外，載體還可以包含用于肽分泌的信號(hào)序列。指導(dǎo)肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號(hào)序列有pelb信號(hào)序列(lei等人,jbacteriol169:4379(1987))。用于將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。除了大腸桿菌外，還可以使用例如衍生自哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(例如pcdna3(invitrogen)和pegf-bos(nucleicacidsres18(17):5322(1990))、pef、pcdm8)、衍生自昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體(例如“bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(gibcobrl)、pbacpak8)、衍生自植物的表達(dá)載體(例如pmh1、pmh2)、衍生自動(dòng)物病毒的表達(dá)載體(例如phsv、pmv、padexlcw)、衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pzipneo)、衍生自酵母的表達(dá)載體(例如“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(invitrogen)、pnv11、sp-q01)及衍生自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(例如ppl608、pkth50)來(lái)生成本發(fā)明的多肽。為了在動(dòng)物細(xì)胞諸如cho、cos或nih3t3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動(dòng)子，例如sv40啟動(dòng)子(mulligan等人,nature277:108(1979))、mmlv-ltr啟動(dòng)子、ef1-alpha啟動(dòng)子(mizushima等人,nucleicacidsres18:5322(1990))、cmv啟動(dòng)子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志基因(例如通過(guò)藥物(例如新霉素、g418)進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pmam、pdr2、pbk-rsv、pbk-cmv、poprsv和pop13。下面基于上述說(shuō)明例示本發(fā)明的實(shí)施方案；然而本發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。[1]具有細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)誘導(dǎo)能力的少于15個(gè)氨基酸的肽，其包含選自以下組的氨基酸序列：(a)選自下組的氨基酸序列：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47；以及(b)選自下組的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47。[2][1]的肽，其選自以下組(i)至(iv)的氨基酸序列：(i)包含氨基酸序列的肽，其中將選自下組(a)至(d)的一個(gè)或多個(gè)取代引入到選自下組的氨基酸序列中：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56和58：(a)用選自由蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸；(b)用選自由亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸和丙氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第三個(gè)氨基酸；(c)用選自由亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，纈氨酸和苯丙氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第七個(gè)氨基酸；和(d)用選自由賴氨酸和精氨酸組成的組的氨基酸取代c端的氨基酸；(ii)包含氨基酸序列的肽，其中將選自下組(a)至(c)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自下組的氨基酸序列中：seqidnos:27,3,60,28,5,67和69：(a)用選自由天冬氨酸和谷氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第一個(gè)氨基酸；(b)用選自由苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸；(c)用選自由精氨酸和賴氨酸組成的組的氨基酸取代c端的氨基酸；和(iii)包含氨基酸序列的肽，其中將選自下組(a)至(b)的一個(gè)或多個(gè)取代引入選自下組的氨基酸序列中：seqidnos:7,38和47：(a)用選自由亮氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，絲氨酸和蘇氨酸組成的組的氨基酸取代自n端起的第二個(gè)氨基酸；和(b)用選自由精氨酸，賴氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸組成的組的氨基酸取代c端的氨基酸；[3][1]的肽，其由選自下組的氨基酸序列組成：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47。[4]多核苷酸，其編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[5]組合物，包含藥學(xué)上可接受的載體和選自下組(a)至(e)的至少一種成分：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[6][5]的組合物，其是用于誘導(dǎo)ctl的組合物，其中所述成分是選自下組(a)至(d)的至少一種成分：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物。[7][5]的組合物，其是藥物組合物。[8][7]的組合物，其是用于選自下組的一種或多種用途的藥物組合物：(i)癌癥治療,(ii)癌癥預(yù)防(防范(prophylaxis))和(iii)術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)防(防范)。[9][7]的組合物，其用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。[10][8]或[9]的組合物，其中所述癌癥選自由以下組成的組：膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤和大腸癌。[11][5]至[10]中任一項(xiàng)的組合物，其配制為用于對(duì)至少一種選自下組的hla陽(yáng)性的受試者施用：hla-a11,hla-a33,和hla-a03。[12]誘導(dǎo)具有ctl誘導(dǎo)能力的apc的方法，其包含選自下組的步驟：(a)體外，離體或體內(nèi)將apc與[1]至[3]中任一項(xiàng)所述的肽接觸；和(b)將編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸引入apc。[13]誘導(dǎo)ctl的方法，其包含選自下組的步驟：(a)將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與apc共培養(yǎng)，所述apc在其表面呈遞hla抗原與[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物；(b)將cd8陽(yáng)性t細(xì)胞與外來(lái)體共培養(yǎng)，所述外來(lái)體在其表面呈遞hla抗原與[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物；(c)將多核苷酸導(dǎo)入cd8陽(yáng)性t細(xì)胞，所述多核苷酸編碼t細(xì)胞受體(tcr)的每個(gè)亞基，所述t細(xì)胞受體能夠結(jié)合細(xì)胞表面上由hla抗原呈遞的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[14]apc，其在其表面呈遞hla抗原與[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物。[15][14]的apc，其通過(guò)[12]的方法誘導(dǎo)。[16]ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[17][16]的ctl，其通過(guò)[13]的方法誘導(dǎo)。[18]誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答方法，其包含向受試者施用選自下組(a)至(e)的至少一種成分：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[19]治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，包括向受試者施用選自下組(a)至(e)的至少一種成分：(a)一種或多種類型的權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在其細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[20]抗體，其結(jié)合[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[21]篩選具有ctl誘導(dǎo)能力的肽的方法，其包含以下步驟：(a)產(chǎn)生由氨基酸序列組成的候選序列，其中對(duì)由選自下組的氨基酸序列組成的原始氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基：seqidnos:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47；(b)從在(a)中產(chǎn)生的候選序列中選擇除cdca1外與任何已知的人基因產(chǎn)物不具有顯著同源性(序列同一性)的候選序列；(c)將apc與由在(b)中選擇的候選序列組成的肽接觸；(d)將(c)的apc與cd8陽(yáng)性t細(xì)胞接觸；和(e)選擇與原始氨基酸序列組成的肽相比，具有相等或更高的ctl誘導(dǎo)能力的肽。[22]選自下組(a)至(e)中的至少一種活性成分在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的組合物中的用途：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[23]選自下組(a)至(e)中的至少一種成分在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物中的用途：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[24]選自下組(a)至(e)中的至少一種成分在誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答中的用途：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[25]選自下組(a)至(e)中的至少一種成分，其用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[4]中任一項(xiàng)的肽。[26]誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)cdca1的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的方法，其包含向受試者施用選自下組(a)至(e)中的至少一種成分的步驟：(a)一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(b)一種或多種類型的多核苷酸，其以可表達(dá)的形式編碼[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽；(c)抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；(d)外來(lái)體，其在細(xì)胞表面上呈遞[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽與hla抗原的復(fù)合物；和(e)ctl，其靶向[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[27]冷凍干燥制劑，其包含一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽。[28]藥物組合物，其通過(guò)包含如下的方法制備：將一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽溶解在水溶性載體中，并進(jìn)行過(guò)濾滅菌。[29]過(guò)濾滅菌水溶液，其是包含一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽和水溶性載體的水溶液。[30]乳劑，其包含一種或多種類型的[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽，水溶性載體和油佐劑。[31]試劑盒，其包含容納[5]至[11]中任一項(xiàng)的組合物的容器和容納佐劑的容器。[32]試劑盒，其包含儲(chǔ)存包含[1]至[3]中任一項(xiàng)的肽的冷凍干燥制劑的容器，儲(chǔ)存佐劑的容器，和儲(chǔ)存在溶解液冷凍干燥制劑的容器。本文參考其具體實(shí)施方案在此詳細(xì)解釋本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，上述解釋實(shí)際上是說(shuō)明性和解釋性解釋，并且旨在解釋本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方式。通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以在其中進(jìn)行各種改變和修改。因此，本發(fā)明不限于上述說(shuō)明，而是旨在由所附權(quán)利要求及其等同物限定。在下文中，參照實(shí)施例更為詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，雖然下述材料、方法和實(shí)施例可以用來(lái)幫助普通技術(shù)人員進(jìn)行和使用本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但是這些僅意圖例示本發(fā)明的各方面，如此絕不限制本發(fā)明的范圍。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)容易認(rèn)可與本文中描述的那些類似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試。本文引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例[實(shí)施例1]材料和方法細(xì)胞系c1r，hla-a陰性和hla-b陰性人類b淋巴母細(xì)胞系，和cos7，非洲綠猴腎細(xì)胞系購(gòu)自atcc。具有穩(wěn)定的hla-a*1101表達(dá)的刺激細(xì)胞的生成使用穩(wěn)定表達(dá)hla-a*1101的c1r(c1r-a11)作為刺激細(xì)胞。通過(guò)pcr擴(kuò)增編碼hla-a*1101的開(kāi)放閱讀框的cdna，并克隆到表達(dá)載體中。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染c1r細(xì)胞，然后使用g418(invitrogen)選擇兩周。將用g418選擇的細(xì)胞接種到含有添加有g(shù)418的培養(yǎng)基的96孔板的孔中，并進(jìn)一步培養(yǎng)30天。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)c1r細(xì)胞中外源的hla-a*1101表達(dá)。候選cdca1衍生肽的選擇使用結(jié)合預(yù)測(cè)服務(wù)器"netmhc3.2"(www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/)(buus等人,tissueantigens.2003nov,62(5):378-84；nielsen等人,proteinsci.2003may,12(5):1007-17,bioinformatics.2004jun12；20(9):1388-97)預(yù)測(cè)了結(jié)合hla-a*1101分子的cdca1衍生的9聚體和10聚體肽。肽合成通過(guò)biosynthesis(lewisville,texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成這些肽，并通過(guò)反相高效液相色譜(hplc)純化。分別通過(guò)分析型hplc和質(zhì)譜分析法來(lái)分析肽的純度(>90％)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜中并保存于-80℃。體外ctl誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞(dc)作為抗原呈遞細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)呈遞在人白細(xì)胞抗原(hla)上的肽的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答。如在其他部分所述，體外制備dc(nakaharas等人,cancerres2003,63(14):4112-8)。具體地說(shuō)，用ficoll-paqueplus(pharmacia)溶液從健康志愿者(hla-a*1101陽(yáng)性)分離的外周血單核細(xì)胞，通過(guò)粘附塑料組織培養(yǎng)盤(bectondickinson)加以分離，并作為單核細(xì)胞級(jí)分加以濃縮。將單核細(xì)胞富集的群體在含2％熱滅活的自體血清(as)的aim-v培養(yǎng)基(invitrogen)中，在1000iu/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(r&dsystem)和1000iu/ml白介素(il)-4(r&dsystem)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的dc在aim-v培養(yǎng)基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37℃沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表現(xiàn)出在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)dc相關(guān)分子，諸如cd80、cd83、cd86和hlaii類(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，將這些經(jīng)肽沖激的dc用x射線放射(20gy)滅活，并以1:20比例與使用cd8陽(yáng)性分離試劑盒(dynal)通過(guò)陽(yáng)性選擇獲得的自體cd8+t細(xì)胞混合。將這些培養(yǎng)產(chǎn)物接種于48孔板(corning)中。制備每個(gè)孔，以在0.5mlaim-v/2％as培養(yǎng)基中含有1.5x104個(gè)經(jīng)肽沖激的dc、3x105個(gè)cd8+t細(xì)胞和10ng/mlil-7(r&dsystem)。3天后，向這些培養(yǎng)物添加終濃度為20iu/ml的il-2(chiron)。在第7天和第14天，將這些t細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體dc進(jìn)一步刺激。dc每次通過(guò)與上文所述相同的方式來(lái)制備。在第21天在第三次肽刺激后，通過(guò)人干擾素(ifn)-gamma酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)針對(duì)經(jīng)肽沖激的c1r-a11細(xì)胞的ctls(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl擴(kuò)增程序使用與riddell等人(walterea等人,nengljmed1995oct19,333(16):1038-44；riddellsr等人,natmed1996feb,2(2):216-23)公開(kāi)的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增ctls。將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系在總共25ml的aim-v培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(5x106細(xì)胞/燒瓶)，所述培養(yǎng)基含有含5％as(aim-v/5％as)和40ng/ml抗-cd3抗體。開(kāi)始培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120iu/mlil-2。在第5天、第8天和第11天，向培養(yǎng)物中添加含有30iu/mlil-2的新鮮aim-v/5％as培養(yǎng)基(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl克隆的建立在96圓底微量滴定板(nalgenuncinternational)中進(jìn)行ctls稀釋以制成0.3、1和3個(gè)細(xì)胞/孔。在含有30ng/ml的抗cd3抗體和125iu/ml的il-2的總共150微升/孔的aim-v/5％as培養(yǎng)基中，將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系共培養(yǎng)(1x104細(xì)胞/孔)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的il-2以達(dá)到125iu/ml的終濃度。在第14天測(cè)試ctl活性，并使用如上所述的相同方法擴(kuò)增ctl克隆(uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。特異性ctl活性為了檢查特異性ctl活性，實(shí)施了ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gamma酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)。具體地，制備經(jīng)肽沖激的c1r-a11(1x104細(xì)胞/孔)作為刺激細(xì)胞。使用誘導(dǎo)的ctls(即ctl系和ctl克隆)用作應(yīng)答細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明實(shí)施ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gammaelisa。強(qiáng)迫表達(dá)靶基因和hla-a*1101的靶細(xì)胞的建立通過(guò)pcr來(lái)擴(kuò)增編碼靶基因或hla-a*1101的開(kāi)放閱讀框的cdna。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體。使用lipofectamine2000(invitrogen)依照制造商的說(shuō)明將表達(dá)靶基因的載體和表達(dá)hla-a*1101的載體之一或兩者轉(zhuǎn)染入cos7(其是靶基因和hla陰性的細(xì)胞系)。轉(zhuǎn)染兩天后，用versene(invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作ctl活性測(cè)定法的靶細(xì)胞(5x104細(xì)胞/孔)。結(jié)果cdca1衍生的hla-a*1101結(jié)合肽的預(yù)測(cè)表1a和1b以結(jié)合親和力的降序顯示了已預(yù)測(cè)結(jié)合hla-a*1101的cdca1衍生的9聚體肽和10聚體肽。選擇并檢查了總共58種潛在具有hla-a*1101結(jié)合能力的肽以確定表位肽。[表1a]衍生自cdca1的hla-a11結(jié)合9聚體肽[表1b]衍生自cdca1的hla-a11結(jié)合10聚體肽起始位置氨基酸序列kd(nm)seqidno353ataqfkinkk2729339nsfkrlmivk5030423flnlktalek5331418ksqeiflnlk5632391vttinqeiqk5733192qslnqdfhqk7934452taelkrkmfk8735241ktkivdspek11036352lataqfkink13137400kiklgiqqlk14638289cqlevqlyqk17239203ivlqegnsqk20140136etymeflwqy23741137tymeflwqyk25442243kivdspeklk31743447kidektaelk36044156naahqealmk38645333klkteensfk42046257kmkdtvqklk43847323qiesdeselk46548232slkeiqeslk51849393tinqeiqkik55550210sqkksnisek59951204vlqegnsqkk62952340sfkrlmivkk81153225elklsvvslk96954246dspeklknyk135455106tadilcpkak147656290qlevqlyqkk156657358kinkkhedvk345258起始位置指示從cdca1的n端起的氨基酸殘基的數(shù)目，解離常數(shù)[kd(nm)]來(lái)源于″netmhc3.2″。通過(guò)預(yù)測(cè)的cdca1衍生的hla-a*1101限制性肽來(lái)誘導(dǎo)ctls依照如“材料和方法”中描述的方案生成針對(duì)cdca1衍生的肽的ctls。通過(guò)ifn-gammaelispot測(cè)定法測(cè)量肽特異性ctl活性(圖1)。與對(duì)照孔相比，具有cdca1-a11-9-123(seqidno:3)的孔#7(a)，具有cdca1-a11-9-105(seqidno:5)的孔#8(b)，具有cdca1-a11-9-419(seqidno:6)的孔#1(c)，具有cdca1-a11-9-219(seqidno:7)的孔#4(d)，具有cdca1-a11-9-439(seqidno:9)的孔#2(e)，具有cdca1-a11-9-343(seqidno:10)的孔#2(f)，具有cdca1-a11-9-21(seqidno:12)的孔#8(g)，具有cdca1-a11-9-157(seqidno:13)的孔#3(h)，具有cdca1-a11-9-244(seqidno:14)的孔#7(i)，具有cdca1-a11-9-213(seqidno:17)的孔#6(j)，具有cdca1-a11-9-335(seqidno:19)的孔#7(k)，具有cdca1-a11-9-25(seqidno:21)的孔#4(l)，具有cdca1-a11-10-339(seqidno:30)的孔#3(m)，具有cdca1-a11-10-452(seqidno:35)的孔#2(n)，具有cdca1-a11-10-400(seqidno:38)的孔#7(o)，具有cdca1-a11-10-289(seqidno:39)的孔#6(p)，具有cdca1-a11-10-203(seqidno:40)的孔#5(q)，具有cdca1-a11-10-156(seqidno:45)的孔#2(r)，具有cdca1-a11-10-340(seqidno:53)的孔#2(s)，具有cdca1-a11-10-106(seqidno:56)的孔#4(t)，和具有cdca1-a11-10-358(seqidno:58)的孔#2(u)中的ctls顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生成。與此同時(shí)，盡管示于表1a和1b中的其他肽潛在具有hla-a*1101結(jié)合活性，未檢測(cè)到作為這些肽的刺激結(jié)果的特異性ctl活性。典型陰性數(shù)據(jù)的實(shí)例是從用cdca1-a11-10-391(seqidno:33)刺激的ctls中未觀察到特異性ifn-gamma產(chǎn)生(v)。結(jié)果，示出了選擇21種類型的cdca1衍生肽作為能夠誘導(dǎo)有效ctls的肽。針對(duì)cdca1衍生的hla-a*1101限制性肽的ctl系和克隆的建立通過(guò)增殖具有cdca1-a11-9-123(seqidno:3)的孔#7(a)，具有cdca1-a11-9-105(seqidno:5)的孔#8(b)，具有cdca1-a11-9-419(seqidno:6)的孔#1(c)，具有cdca1-a11-9-219(seqidno:7)的孔#4(d)，具有cdca1-a11-9-439(seqidno:9)的孔#4(e)，具有cdca1-a11-9-157(seqidno:13)的孔#3(f)，具有cdca1-a11-9-25(seqidno:21)的孔#4(g)，具有cdca1-a11-10-339(seqidno:30)的孔#3(h)，具有cdca1-a11-10-358(seqidno:58)的孔#2(i)中的ctls來(lái)建立ctl系，其在ifn-gammaelispot測(cè)定法中顯示出肽特異性ctl活性。通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量這些ctl系的ctl活性(圖2)。與沒(méi)有用肽沖擊的靶細(xì)胞相比，這些ctl系表現(xiàn)出針對(duì)用相應(yīng)肽沖擊的靶細(xì)胞的強(qiáng)的ifn-gamma生成。此外，通過(guò)從如以上“材料和方法”部分中描述的ctl系的有限稀釋建立ctl克隆，并通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量針對(duì)肽沖擊的c1r-a11的來(lái)自ctl克隆的ifn-gamma生成。在用cdca1-a11-9-105(seqidno:5)(a),cdca1-a11-9-419(seqidno:6)(b)或cdca1-a11-9-219(seqidno:7)(c)刺激的ctl克隆中觀察到強(qiáng)的ifn-gamma生成(圖3)。針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*1101的靶細(xì)胞的特異性ctl活性建立針對(duì)cdca1-a11-9-219(seqidno:7)的ctl克隆來(lái)研究識(shí)別表達(dá)cdca1和hla-a*1101分子的靶細(xì)胞的能力。制備用全長(zhǎng)的cdca1和hla-a*1101基因兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞(表達(dá)cdca1和hla-a*1101基因的靶細(xì)胞的特定模型)作為靶細(xì)胞。制備用全長(zhǎng)cdca1或hla-a*1101轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。cdca1-a11-9-219(seqidno:7)刺激的ctl克隆顯示針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*1101兩者的cos7細(xì)胞的強(qiáng)的ctl活性(圖4)。另一方面，針對(duì)對(duì)照沒(méi)有檢出顯著的特異性ctl活性。這些數(shù)據(jù)清楚證明cdca1-a11-9-219(seqidno:7)是產(chǎn)生自cdca1內(nèi)源性加工的肽，并與hla-a*1101分子呈遞在靶細(xì)胞上，并被ctls識(shí)別。這些結(jié)果表明了以下可能性，即cdca1-a11-9-219(seqidno:7)作為癌癥疫苗用于患有表達(dá)cdca1的癌癥的患者可以是合適的。抗原肽的同源性分析用cdca1-a11-9-123(seqidno:3),cdca1-a11-9-105(seqidno:5),cdca1-a11-9-419(seqidno:6),cdca1-a11-9-219(seqidno:7),cdca1-a11-9-439(seqidno:9),cdca1-a11-9-343(seqidno:10),cdca1-a11-9-21(seqidno:12),cdca1-a11-9-157(seqidno:13),cdca1-a11-9-244(seqidno:14),cdca1-a11-9-213(seqidno:17),cdca1-a11-9-335(seqidno:19),cdca1-a11-9-25(seqidno:21),cdca1-a11-10-339(seqidno:30),cdca1-a11-10-452(seqidno:35),cdca1-a11-10-400(seqidno:38),cdca1-a11-10-289(seqidno:39),cdca1-a11-10-203(seqidno:40),cdca1-a11-10-156(seqidno:45),cdca1-a11-10-340(seqidno:53),cdca1-a11-10-106(seqidno:56),或cdca1-a11-10-358(seqidno:58)刺激的ctls顯示出顯著的特異性ctl活性。這些結(jié)果可能是因?yàn)閏dca1-a11-9-123(seqidno:3),cdca1-a11-9-105(seqidno:5),cdca1-a11-9-419(seqidno:6),cdca1-a11-9-219(seqidno:7),cdca1-a11-9-439(seqidno:9),cdca1-a11-9-343(seqidno:10),cdca1-a11-9-21(seqidno:12),cdca1-a11-9-157(seqidno:13),cdca1-a11-9-244(seqidno:14),cdca1-a11-9-213(seqidno:17),cdca1-a11-9-335(seqidno:19),cdca1-a11-9-25(seqidno:21),cdca1-a11-10-339(seqidno:30),cdca1-a11-10-452(seqidno:35),cdca1-a11-10-400(seqidno:38),cdca1-a11-10-289(seqidno:39),cdca1-a11-10-203(seqidno:40),cdca1-a11-10-156(seqidno:45),cdca1-a11-10-340(seqidno:53),cdca1-a11-10-106(seqidno:56),和cdca1-a11-10-358(seqidno:58)序列與衍生自已知敏化人免疫系統(tǒng)的其它分子的肽同源。為了排除此可能性，通過(guò)使用blast算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)查詢這些肽的序列來(lái)進(jìn)行同源性分析。這一結(jié)果顯示沒(méi)有與cdca1-a11-9-123(seqidno:3),cdca1-a11-9-105(seqidno:5),cdca1-a11-9-419(seqidno:6),cdca1-a11-9-219(seqidno:7),cdca1-a11-9-439(seqidno:9),cdca1-a11-9-343(seqidno:10),cdca1-a11-9-21(seqidno:12),cdca1-a11-9-157(seqidno:13),cdca1-a11-9-244(seqidno:14),cdca1-a11-9-213(seqidno:17),cdca1-a11-9-335(seqidno:19),cdca1-a11-9-25(seqidno:21),cdca1-a11-10-339(seqidno:30),cdca1-a11-10-452(seqidno:35),cdca1-a11-10-400(seqidno:38),cdca1-a11-10-289(seqidno:39),cdca1-a11-10-203(seqidno:40),cdca1-a11-10-156(seqidno:45),cdca1-a11-10-340(seqidno:53),cdca1-a11-10-106(seqidno:56),和cdca1-a11-10-358(seqidno:58)序列具有顯著同源性的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明人的知識(shí)，這些肽幾乎不可能引發(fā)針對(duì)其他不相關(guān)分子的非預(yù)期免疫應(yīng)答?？傊?，鑒定了新的cdca1衍生的hla-a11限制性表位肽。證明了cdca1衍生的表位肽適用于癌癥免疫治療。[實(shí)施例2]材料和方法細(xì)胞系c1r，hla-a陰性和hla-b陰性人類b淋巴母細(xì)胞系，和cos7，非洲綠猴腎細(xì)胞系購(gòu)自atcc。具有穩(wěn)定的hla-a*3303表達(dá)的刺激細(xì)胞的生成使用穩(wěn)定表達(dá)hla-a*3303的c1r(c1r-a33)作為刺激細(xì)胞。通過(guò)pcr擴(kuò)增編碼hla-a*3303的開(kāi)放閱讀框的cdna，并克隆到表達(dá)載體中。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染c1r細(xì)胞，然后使用g418(invitrogen)選擇兩周。將用g418選擇的細(xì)胞接種到含有添加有g(shù)418的培養(yǎng)基的96孔板的孔中，并進(jìn)一步培養(yǎng)30天。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)c1r細(xì)胞中外源的hla-a*3303表達(dá)。候選cdca1衍生肽的選擇使用結(jié)合預(yù)測(cè)服務(wù)器“netmhcpan2.8”(www.cbs.dtu.dk/services/netmhcpan/)(nielsen等人.,plosone.2007；29；2(8):e796；hoof等人.,immunogenetics.2009；61(1):1-13)預(yù)測(cè)了結(jié)合hla-a*3303分子的cdca1衍生的9聚體和10聚體肽。肽合成通過(guò)biosynthesis(lewisville,texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成這些肽，并通過(guò)反相高效液相色譜(hplc)純化。分別通過(guò)分析型hplc和質(zhì)譜分析法來(lái)分析肽的純度(>90％)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜中并保存于-80℃。體外ctl誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞(dc)作為抗原呈遞細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)呈遞在人白細(xì)胞抗原(hla)上的肽的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答。如在其他部分所述，體外制備dc(nakaharas等人,cancerres2003,63(14):4112-8)。具體地說(shuō)，用ficoll-paqueplus(pharmacia)溶液從健康志愿者(hla-a*3303陽(yáng)性)分離的外周血單核細(xì)胞，通過(guò)粘附塑料組織培養(yǎng)盤(bectondickinson)加以分離，并作為單核細(xì)胞級(jí)分加以濃縮。將單核細(xì)胞富集的群體在含2％熱滅活的自體血清(as)的aim-v培養(yǎng)基(invitrogen)中，在1000iu/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(r&dsystem)和1000iu/ml白介素(il)-4(r&dsystem)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的dc在aim-v培養(yǎng)基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37℃沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)dc相關(guān)分子，諸如cd80、cd83、cd86和hlaii類(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，將這些經(jīng)肽沖激的dc用x射線放射(20gy)滅活，并以1:20比例與用cd8陽(yáng)性分離試劑盒(dynal)通過(guò)陽(yáng)性選擇獲得的自體cd8+t細(xì)胞混合。將這些培養(yǎng)產(chǎn)物接種于48孔板(corning)中。制備每個(gè)孔，以在0.5mlaim-v/2％as培養(yǎng)基中含有1.5x104個(gè)經(jīng)肽沖激的dc、3x105個(gè)cd8+t細(xì)胞和10ng/mlil-7(r&dsystem)。3天后，向這些培養(yǎng)物添加終濃度為20iu/ml的il-2(chiron)。在第7天和第14天，將這些t細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體dc進(jìn)一步刺激。dc每次通過(guò)與上文所述相同的方式來(lái)制備。在第21天在第三次肽刺激后，通過(guò)人干擾素(ifn)-gamma酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)針對(duì)經(jīng)肽沖激的c1r-a33細(xì)胞的ctls(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl擴(kuò)增程序使用與riddell等人(walterea等人,nengljmed1995oct19,333(16):1038-44；riddellsr等人,natmed1996feb,2(2):216-23)公開(kāi)的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增ctl。將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系在總共25ml的aim-v培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(5x106細(xì)胞/燒瓶)，所述培養(yǎng)基含有含5％as(aim-v/5％as)和40ng/ml抗-cd3抗體。開(kāi)始培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120iu/mlil-2。在第5天、第8天和第11天，向培養(yǎng)物中添加含有30iu/mlil-2的新鮮aim-v/5％as培養(yǎng)基(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl克隆的建立在96圓底微量滴定板(nalgenuncinternational)中進(jìn)行ctls稀釋以制成0.3、1和3個(gè)細(xì)胞/孔。在含有30ng/ml的抗cd3抗體和125iu/ml的il-2的總共150微升/孔的aim-v/5％as培養(yǎng)基中，將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系共培養(yǎng)(1x104細(xì)胞/孔)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的il-2以達(dá)到125iu/ml的終濃度。在第14天測(cè)試ctl活性，并使用如上所述的相同方法擴(kuò)增ctl克隆(uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。特異性ctl活性為了檢查特異性ctl活性，實(shí)施了ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gamma酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)。具體地，制備經(jīng)肽沖激的c1r-a33(1x104細(xì)胞/孔)作為刺激細(xì)胞。使用誘導(dǎo)的ctls(即ctl系和ctl克隆)用作應(yīng)答細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明實(shí)施ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gammaelisa。強(qiáng)迫表達(dá)靶基因和hla-a*3303的靶細(xì)胞的建立通過(guò)pcr來(lái)擴(kuò)增編碼靶基因或hla-a*3303的開(kāi)放閱讀框的cdna。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體。使用lipofectamine2000(invitrogen)依照制造商的說(shuō)明將表達(dá)靶基因的載體和表達(dá)hla-a*3303的載體之一或兩者轉(zhuǎn)染入cos7(其是靶基因和hla陰性的細(xì)胞系)。轉(zhuǎn)染兩天后，用versene(invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作ctl活性測(cè)定法的靶細(xì)胞(5x104細(xì)胞/孔)。結(jié)果cdca1衍生的hla-a*3303結(jié)合肽的預(yù)測(cè)表2a和2b以結(jié)合親和力的降序顯示了已預(yù)測(cè)結(jié)合hla-a*3303的cdca1衍生的9聚體肽和10聚體肽。選擇并檢查了總共37種潛在具有hla-a*3303結(jié)合能力的肽以確定表位肽。[表2a]衍生自cdca1的hla-a33結(jié)合9聚體肽起始位置氨基酸序列kd(nm)seqidno43evlhmiymr27.1127127fihfreacr54.7859123giinfihfr63.053108dilcpkakr68.7560261tvqklknar190.1128105etadilcpk218.825138ymeflwqyk688.9311335kteensfkr1318.6119137tymeflwqy1567.8320443dsyakidek1746.9925340sfkrlmivk1864.162311vaeivihir1904.9461382ekrgavyer2145.762111cpkakrtsr2635.4263354taqfkinkk2664.098376dcnkvqekr2751.986452alqivygir3000.8165299kiqdlsdnr3099.8118[表2b]衍生自cdca1的hla-a33結(jié)合10聚體肽起始位置氨基酸序列kd(nm)seqidno126nfihfreacr39.666137tymeflwqyk74.974210nvaeivihir101.567122sgiinfihfr228.568260dtvqklknar375.876991hldsflpicr514.417051ralqivygir819.1571339nsfkrlmivk855.3830225elklsvvslk984.5654340sfkrlmivkk1039.29532etlsfprynv1362.1172232slkeiqeslk2077.1749452taelkrkmfk2314.5335159hqealmkler2904.9673起始位置指示從cdca1的n端起的氨基酸殘基的數(shù)目，解離常數(shù)[kd(nm)]來(lái)源于″netmhcpan2.8″。通過(guò)預(yù)測(cè)的cdca1衍生的hla-a*3303限制性肽來(lái)誘導(dǎo)ctls依照如“材料和方法”中描述的方案生成針對(duì)cdca1衍生的肽的ctls。通過(guò)ifn-gammaelispot測(cè)定法測(cè)量肽特異性ctl活性(圖5)。與對(duì)照相比，具有cdca1-a33-9-43(seqidno：27)的孔#2(a)，具有cdca1-a33-9-123(seqidno：3)的孔#1(b)，具有cdca1-a33-9-108(seqidno：60)的孔#3(c)，具有cdca1-a33-9-261(seqidno：28)的孔#2(d)，具有cdca1-a33-9-105(seqidno：5)的孔#6(e)，具有cdca1-a33-10-10(seqidno：67)的孔#8(f)和具有cdca1-a33-10-260(seqidno：69)的孔#5(g)中的ctls顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生成。與此同時(shí)，盡管示于表2a和2b中的其他肽潛在具有hla-a*3303結(jié)合活性，未檢測(cè)到作為這些肽的刺激的結(jié)果的特異性ctl活性。典型陰性數(shù)據(jù)的實(shí)例是從用cdca1-a33-10-122(seqidno：68)刺激的ctls中未觀察到特異性ifn-gamma產(chǎn)生(h)。結(jié)果，選擇7種類型的cdca1衍生肽作為能夠誘導(dǎo)有效ctl的肽。針對(duì)cdca1衍生的hla-a*3303限制性肽的ctl系和克隆的建立通過(guò)增殖具有cdca1-a33-9-43(seqidno:27)的孔#2中(a),具有cdca1-a33-9-123(seqidno:3)的孔#1中(b),具有cdca1-a33-10-10(seqidno:67)的孔#8中(c)和具有cdca1-a33-10-260(seqidno:69)的孔#5中(d)中的ctls來(lái)建立ctl系，其在ifn-gammaelispot測(cè)定法中顯示出肽特異性ctl活性。通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量這些ctl系的ctl活性(圖6)。與沒(méi)有用肽沖擊的靶細(xì)胞相比，這些ctl系表現(xiàn)出針對(duì)用相應(yīng)肽沖擊的靶細(xì)胞的強(qiáng)的ifn-gamma生成。此外，通過(guò)從如以上“材料和方法”部分中描述的ctl系的有限稀釋建立ctl克隆，并通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量針對(duì)肽沖擊的c1r-a33的來(lái)自ctl克隆的ifn-gamma生成。在用cdca1-a33-9-43(seqidno:27)(a)或cdca1-a33-9-123(seqidno:3)(b)刺激的ctl克隆中觀察到強(qiáng)的ifn-gamma生成(圖7)。針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*3303的靶細(xì)胞的特異性ctl活性研究針對(duì)cdca1-a33-9-43(seqidno:27)建立的ctl克隆其識(shí)別表達(dá)cdca1和hla-a*3303分子的靶細(xì)胞的能力。制備用全長(zhǎng)的cdca1和hla-a*3303基因兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞(表達(dá)cdca1和hla-a*3303基因的靶細(xì)胞的特定模型)作為靶細(xì)胞。制備用全長(zhǎng)cdca1或hla-a*3303轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。用cdca1-a33-9-43(seqidno:27)刺激的ctl克隆顯示針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*3303兩者的cos7細(xì)胞的強(qiáng)的ctl活性(圖8)。另一方面，針對(duì)對(duì)照沒(méi)有檢出顯著的特異性ctl活性。這些數(shù)據(jù)清楚證明cdca1-a33-9-43(seqidno:27)是產(chǎn)生自cdca1內(nèi)源性加工的肽，并與hla-a*3303分子呈遞在靶細(xì)胞上，并被ctls識(shí)別。這些結(jié)果表明了以下可能性，即cdca1-a33-9-43(seqidno:27)作為癌癥疫苗用于患有表達(dá)cdca1的癌癥的患者可以是合適的?？乖牡耐葱苑治隹赡苁怯捎谶@樣的事實(shí)，即cdca1-a33-9-43(seqidno:27),cdca1-a33-9-123(seqidno:3),cdca1-a33-9-108(seqidno:60),cdca1-a33-9-261(seqidno:28),cdca1-a33-9-105(seqidno:5),cdca1-a33-10-10(seqidno:67),和cdca1-a33-10-260(seqidno:69)序列與衍生自已知敏化人免疫系統(tǒng)的其它分子的肽同源。為了排除此可能性，通過(guò)使用blast算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)查詢這些肽的序列來(lái)進(jìn)行同源性分析。該結(jié)果顯示出沒(méi)有與cdca1-a33-9-43(seqidno:27),cdca1-a33-9-123(seqidno:3),cdca1-a33-9-108(seqidno:60),cdca1-a33-9-261(seqidno:28),cdca1-a33-9-105(seqidno:5),cdca1-a33-10-10(seqidno:67),和cdca1-a33-10-260(seqidno:69)序列顯著同源性的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明人的知識(shí)，這些肽幾乎不可能引發(fā)針對(duì)其他不相關(guān)分子的非預(yù)期免疫應(yīng)答?？傊?，鑒定了新的cdca1衍生的hla-a33限制性表位肽。證明了cdca1衍生的表位肽適用于癌癥免疫治療。[實(shí)施例3]材料和方法細(xì)胞系c1r，hla-a陰性和hla-b陰性人類b淋巴母細(xì)胞系，和cos7，非洲綠猴腎細(xì)胞系購(gòu)自atcc。具有穩(wěn)定的hla-a*0301表達(dá)的刺激細(xì)胞的生成使用穩(wěn)定表達(dá)hla-a*0301的c1r(c1r-a03)作為刺激細(xì)胞。通過(guò)pcr擴(kuò)增編碼hla-a*0301的開(kāi)放閱讀框的cdna，并克隆到表達(dá)載體中。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染c1r細(xì)胞，然后使用g418(invitrogen)選擇兩周。將用g418選擇的細(xì)胞接種到含有添加有g(shù)418的培養(yǎng)基的96孔板的孔中，并進(jìn)一步培養(yǎng)30天。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)c1r細(xì)胞中外源的hla-a*0301表達(dá)。衍生的cdca1肽候選者的選擇使用結(jié)合預(yù)測(cè)服務(wù)器“netmhc3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/)(buus等人,tissueantigens.2003nov,62(5):378-84；nielsen等人,proteinsci.2003may,12(5):1007-17；bioinformatics.2004jun12:20(9):1388-97)預(yù)測(cè)了結(jié)合hla-a*0301分子的cdca1衍生的9聚體和10聚體肽。肽合成通過(guò)biosynthesis(lewisville,texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成這些肽，并通過(guò)反相高效液相色譜(hplc)純化。分別通過(guò)分析型hplc和質(zhì)譜分析法來(lái)分析肽的純度(>90％)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜中并保存于-80℃。體外ctl誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞(dc)作為抗原呈遞細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)呈遞在人白細(xì)胞抗原(hla)上的肽的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答。如在其他部分所述，體外制備dc(nakaharas等人,cancerres2003,63(14):4112-8)。具體地說(shuō)，用ficoll-paqueplus(pharmacia)溶液從健康志愿者(hla-a*0301陽(yáng)性)分離的外周血單核細(xì)胞，通過(guò)粘附塑料組織培養(yǎng)盤(bectondickinson)加以分離，并作為單核細(xì)胞級(jí)分加以濃縮。將單核細(xì)胞富集的群體在含2％熱滅活的自體血清(as)的aim-v培養(yǎng)基(invitrogen)中，在1000iu/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(r&dsystem)和1000iu/ml白介素(il)-4(r&dsystem)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的dc在aim-v培養(yǎng)基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37℃沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)dc相關(guān)分子，諸如cd80、cd83、cd86和hlaii類(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，將這些經(jīng)肽沖激的dc用x射線放射(20gy)滅活，并以1:20比例與用cd8陽(yáng)性分離試劑盒(dynal)通過(guò)陽(yáng)性選擇獲得的自體cd8+t細(xì)胞混合。將這些培養(yǎng)產(chǎn)物接種于48孔板(corning)中。制備每個(gè)孔，以在0.5mlaim-v/2％as培養(yǎng)基中含有1.5x104個(gè)經(jīng)肽沖激的dc、3x105個(gè)cd8+t細(xì)胞和10ng/mlil-7(r&dsystem)。3天后，向這些培養(yǎng)物添加終濃度為20iu/ml的il-2(chiron)。在第7天和第14天，將這些t細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體dc進(jìn)一步刺激。dc每次通過(guò)與上文所述相同的方式來(lái)制備。在第21天在第三次肽刺激后，通過(guò)人干擾素(ifn)-gamma酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)針對(duì)經(jīng)肽沖激的c1r-a03細(xì)胞的ctls(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl擴(kuò)增程序使用與riddell等人(walterea等人,nengljmed1995oct19,333(16):1038-44；riddellsr等人,natmed1996feb,2(2):216-23)公開(kāi)的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增ctl。將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系在總共25ml的aim-v培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(5x106細(xì)胞/燒瓶)，所述培養(yǎng)基含有含5％as(aim-v/5％as)和40ng/ml抗-cd3抗體。開(kāi)始培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120iu/mlil-2。在第5天、第8天和第11天，向培養(yǎng)物中添加含有30iu/mlil-2的新鮮aim-v/5％as培養(yǎng)基(tanakah等人,brjcancer2001,84(1):94-9；umanoy等人,brjcancer2001,84(8):1052-7；uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。ctl克隆的建立在96圓底微量滴定板(nalgenuncinternational)中進(jìn)行ctls稀釋以制成0.3、1和3個(gè)細(xì)胞/孔。在含有30ng/ml的抗cd3抗體和125iu/ml的il-2的總共150微升/孔的aim-v/5％as培養(yǎng)基中，將ctls與兩種類型的經(jīng)絲裂霉素c處理的人b淋巴母細(xì)胞系共培養(yǎng)(1x104細(xì)胞/孔)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的il-2以達(dá)到125iu/ml的終濃度。在第14天測(cè)試ctl活性，并使用如上所述的相同方法擴(kuò)增ctl克隆(uchidan等人,clincancerres2004,10(24):8577-86；sudat等人,cancersci2006,97(5):411-9；watanabet等人,cancersci2005,96(8):498-506)。特異性ctl活性為了檢查特異性ctl活性，實(shí)施了ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gamma酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)。具體地，制備經(jīng)肽沖激的c1r-a03(1x104細(xì)胞/孔)作為刺激細(xì)胞。使用誘導(dǎo)的ctls(即ctl系和ctl克隆)用作應(yīng)答細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明實(shí)施ifn-gammaelispot測(cè)定法和ifn-gammaelisa。強(qiáng)迫表達(dá)靶基因和hla-a*0301的靶細(xì)胞的建立通過(guò)pcr來(lái)擴(kuò)增編碼靶基因或hla-a*0301的開(kāi)放閱讀框的cdna。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體。使用lipofectamine2000(invitrogen)依照制造商的說(shuō)明將表達(dá)靶基因的載體和表達(dá)hla-a*0301的載體之一或兩者轉(zhuǎn)染入cos7(其是靶基因和hla陰性的細(xì)胞系)。轉(zhuǎn)染兩天后，用versene(invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作ctl活性測(cè)定法的靶細(xì)胞(5x104細(xì)胞/孔)。結(jié)果cdca1衍生的hla-a*0301結(jié)合肽的預(yù)測(cè)表3a和3b以結(jié)合親和力的降序顯示了已預(yù)測(cè)結(jié)合hla-a*0301的cdca1衍生的9聚體肽和10聚體肽。選擇并檢查了總共24種潛在具有hla-a*0301結(jié)合能力的肽以確定表位肽。[表3a]衍生自cdca1的hla-a03結(jié)合9聚體肽起始位置氨基酸序列kd(nm)seqidno343rlmivkkek5610353ataqfkink112155ivygirleh13922193slnqdfhqk1604204vlqegnsqk2061621kiltgadgk26312219ktkrlnelk303749ymralqivy39974143wqykssadk43275[表3b]衍生自cdca1的hla-a03結(jié)合10聚體肽起始位置氨基酸序列kd(nm)seqidno423flnlktalek4131333klkteensfk5246400kiklgiqqlk5538257kmkdtvqklk6747250klknykekmk13276203ivlqegnsqk15540339nsfkrlmivk16030353ataqfkinkk20529243kivdspeklk26143447kidektaelk27444232slkeiqeslk37349418ksqeiflnlk38632452taelkrkmfk38735225elklsvvslk38954289cqlevqlyqk48839起始位置指示從cdca1的n端起的氨基酸殘基的數(shù)目，解離常數(shù)[kd(nm)]來(lái)源于″netmhc3.2″。通過(guò)預(yù)測(cè)的cdca1衍生的hla-a*0301限制性肽來(lái)誘導(dǎo)ctls依照如“材料和方法”中描述的方案生成針對(duì)cdca1衍生的肽的ctls。通過(guò)ifn-gammaelispot測(cè)定法測(cè)量肽特異性ctl活性(圖9)。與對(duì)照相比，具有cdca1-a03-9-219(seqidno：7)的孔#3(a)，具有cdca1-a03-10-400(seqidno：38)的孔#1(b)，和具有cdca1-a03-10-257(seqidno：47)的孔#2(c)顯示出強(qiáng)的ifn-gamma生成。與此同時(shí)，盡管示于表3a和3b中的其他肽潛在具有hla-a*0301結(jié)合活性，未檢測(cè)到作為這些肽的刺激的結(jié)果的特異性ctl活性。典型陰性數(shù)據(jù)的實(shí)例是從用cdca1-a03-9-343(seqidno：10)刺激的ctls中未觀察到特異性ifn-gamma產(chǎn)生(d)。結(jié)果，選擇三種類型的cdca1衍生肽作為能夠誘導(dǎo)有效ctl的肽。針對(duì)cdca1衍生的hla-a*0301限制性肽的ctl系和克隆的建立通過(guò)增殖具有cdca1-a03-9-219(seqidno:7)的孔#3(a)，具有cdca1-a03-10-400(seqidno:38)的孔#1(b)，具有cdca1-a03-10-257(seqidno:47)的孔#2(c)中的ctls來(lái)建立ctl系，其在ifn-gammaelispot測(cè)定法中顯示出肽特異性ctl活性。通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量這些ctl系的ctl活性(圖10)。與沒(méi)有用肽沖擊的靶細(xì)胞相比，這些ctl系表現(xiàn)出針對(duì)用相應(yīng)肽沖擊的靶細(xì)胞的強(qiáng)的ifn-gamma生成。此外，通過(guò)從如以上“材料和方法”部分中描述的ctl系的有限稀釋建立ctl克隆，并通過(guò)ifn-gammaelisa測(cè)量針對(duì)肽沖擊的c1r-a03的來(lái)自ctl克隆的ifn-gamma生成。在用cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a),cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b),和cdca1-a03-10-257(seqidno:47)(c)刺激的ctl克隆中觀察到強(qiáng)的ifn-gamma生成(圖11)。針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*0301的靶細(xì)胞的特異性ctl活性研究針對(duì)cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a)和cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b)建立的ctl克隆識(shí)別表達(dá)cdca1和hla-a*0301分子的靶細(xì)胞的能力。制備用全長(zhǎng)的cdca1和hla-a*0301基因兩者轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞(表達(dá)cdca1和hla-a*0301基因的靶細(xì)胞的特定模型)作為靶細(xì)胞。制備用全長(zhǎng)cdca1或hla-a*0301轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞作為對(duì)照。cdca1-a03-9-219(seqidno:7)(a)或cdca1-a03-10-400(seqidno:38)(b)刺激的ctl克隆顯示針對(duì)表達(dá)cdca1和hla-a*0301兩者的cos7細(xì)胞的強(qiáng)的ctl活性(圖12)。另一方面，針對(duì)對(duì)照沒(méi)有檢出顯著的特異性ctl活性。這些數(shù)據(jù)清楚證明cdca1-a03-9-219(seqidno:7)和cdca1-a03-10-400(seqidno:38)是產(chǎn)生自cdca1內(nèi)源性加工的肽，并與hla-a*0301分子呈遞在靶細(xì)胞上，并被ctls識(shí)別。這些結(jié)果表明了以下可能性，即cdca1-a03-9-219(seqidno:7)和cdca1-a03-10-400(seqidno:38)作為癌癥疫苗用于患有表達(dá)cdca1的癌癥的患者可以是合適?？乖牡耐葱苑治鲇胏dca1-a03-9-219(seqidno:7),cdca1-a03-10-400(seqidno:38),或cdca1-a03-10-257(seqidno:47)刺激的ctls顯示出顯著的特異性ctl活性。這些結(jié)果可能是因?yàn)閏dca1-a03-9-219(seqidno:7),cdca1-a03-10-400(seqidno:38)和cdca1-a03-10-257(seqidno:47)序列與衍生自已知敏化人免疫系統(tǒng)的其它分子的肽同源。為了排除此可能性，通過(guò)使用blast算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)查詢這些肽的序列來(lái)進(jìn)行同源性分析。這一結(jié)果顯示出沒(méi)有與cdca1-a03-9-219(seqidno:7),cdca1-a03-10-400(seqidno:38)和cdca1-a03-10-257(seqidno:47)序列具有顯著同源性的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明人的知識(shí)，這些肽幾乎不可能引發(fā)針對(duì)其他不相關(guān)分子的非預(yù)期免疫應(yīng)答?？傊?，鑒定了新的cdca1衍生的hla-a03限制性表位肽。證明了cdca1衍生的表位肽適用于癌癥免疫治療。[實(shí)施例4]乳液制劑的制備將肽溶解在注射用溶劑或無(wú)菌生理鹽水中，使其為1.0mg/ml至10.0mg/ml，并收集到注射器中。這經(jīng)由連接器連接至裝有與注射溶劑或無(wú)菌生理鹽水等量的ifa的注射器，然后通過(guò)交替地推動(dòng)兩個(gè)連接的注射器的注射器柱塞來(lái)混合?；旌蠋追昼姾?，通過(guò)滴落試驗(yàn)法(droptestmethod)評(píng)價(jià)乳液的完成。滴落試驗(yàn)法可以通過(guò)將一滴混合樣品滴在水上進(jìn)行。當(dāng)?shù)卧谒系臉悠凡涣⒓丛谒袛U(kuò)散時(shí)，評(píng)估乳液完成；并且當(dāng)?shù)卧谒系臉悠妨⒓丛谒袛U(kuò)散時(shí)，該乳液被評(píng)估為未完成。當(dāng)乳液被評(píng)估為不完全時(shí)，進(jìn)行進(jìn)一步混合以完成乳液。可以通過(guò)皮下注射將完成的乳劑施用于癌癥患者。經(jīng)受施用的癌癥患者可以選自受以下癌癥影響的患者：膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等。冷凍干燥制劑的制備將肽溶解在注射用溶劑中，使其為1.0mg/ml至10.0mg/ml，并過(guò)濾滅菌。將其裝入滅菌的小瓶中，并用無(wú)菌橡膠塞半封閉。將該小瓶冷凍干燥后，將其完全封閉并用鋁蓋縫合以產(chǎn)生冷凍干燥的制劑。當(dāng)使用時(shí)，將注射溶劑或無(wú)菌生理鹽水注入小瓶中以重新溶解冷凍干燥的粉末。使用注射器收集小瓶中的再溶解溶液，并且通過(guò)連接器將注射器與填充有與收集的再溶解溶液的量相同量的ifa的注射器連接。通過(guò)交替地推動(dòng)兩個(gè)連接的注射器的注射器柱塞來(lái)混合重新溶解的溶液和ifa?；旌蠋追昼姾?，通過(guò)滴落試驗(yàn)法(droptestmethod)評(píng)價(jià)乳液的完成。可以通過(guò)皮下注射將完成的乳劑施用于癌癥患者。經(jīng)受施用的癌癥患者可以選自受以下癌癥影響的患者：膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌等。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了cdca1衍生的新型hla-a11限制性，hla-a33限制性，和hla-a03限制性表位肽，其誘導(dǎo)強(qiáng)而特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且因此具有廣泛的癌癥類型的可用性。本發(fā)明的肽，組合物，apcs和ctls可用作針對(duì)表達(dá)cdca1癌癥的肽疫苗，例如膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，膽管細(xì)胞癌，慢性髓性白血病(cml)，食管癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，腎癌，小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，軟組織腫瘤，大腸癌。盡管本文詳細(xì)地并且關(guān)于其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，前述描述本質(zhì)上是示例性和解釋性的，而且意圖例示本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。經(jīng)由常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，本發(fā)明的邊界和范圍由所附權(quán)利要求來(lái)限定。序列表<110>腫瘤療法科學(xué)股份有限公司<120>cdca1衍生的肽和含有它們的疫苗<130>onc-a1502p<150>jp2014-158922<151>2014-08-04<150>jp2014-158923<151>2014-08-04<150>jp2014-158924<151>2014-08-04<160>85<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>1alathralaglnphelysileasnlys15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>2thrthrileasnglngluileglnlys15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>3glyileileasnpheilehisphearg15<210>4<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>4serleuasnglnaspphehisglnlys15<210>5<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>5gluthralaaspileleucysprolys15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>6serglngluilepheleuasnleulys15<210>7<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>7lysthrlysargleuasngluleulys15<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>8thralaglnphelysileasnlyslys15<210>9<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>9lysalaalagluaspsertyralalys15<210>10<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>10argleumetilevallyslysglulys15<210>11<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>11tyrmetglupheleutrpglntyrlys15<210>12<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>12lysileleuthrglyalaaspglylys15<210>13<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>13alaalahisglnglualaleumetlys15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>14ilevalaspserproglulysleulys15<210>15<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>15argthrvalilegluaspcysasnlys15<210>16<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>16valleuglngluglyasnserglnlys15<210>17<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>17lysserasnileserglulysthrlys15<210>18<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>18lysileglnaspleuseraspasnarg15<210>19<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>19lysthrglugluasnserphelysarg15<210>20<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>20thrtyrmetglupheleutrpglntyr15<210>21<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>21glyalaaspglylysasnleuthrlys15<210>22<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>22ilevaltyrglyileargleugluhis15<210>23<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>23serphelysargleumetilevallys15<210>24<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自cdca1的肽<400>24glnleugluvalglnleuty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