相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考

本申請(qǐng)案要求2014年5月15日提交并且名為“用于包括診斷應(yīng)用的細(xì)胞分離的多參數(shù)方法和系統(tǒng)(multiparametricmethodsandsystemsforcellseparationincludingdiagnosticapplications)”的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/993,431號(hào)的權(quán)利，所述申請(qǐng)案以全文引用的方式并入本文中以用于任何目的。

背景技術(shù)：

從生物流體(如血液、尿液、唾液)分離目標(biāo)細(xì)胞是一項(xiàng)重要的研究領(lǐng)域，其應(yīng)用于臨床診斷和基本研究領(lǐng)域中。對(duì)于許多應(yīng)用，通過向陽性洗脫份(相關(guān)細(xì)胞)施加與陰性洗脫份(背景細(xì)胞)相比不同的力來進(jìn)行分離。已描述其中使用多種物理性質(zhì)(包括尺寸、活動(dòng)性、電荷、電偶極矩、光學(xué)質(zhì)量和磁化率)從這些混合物分離特定細(xì)胞或分子的裝置。另一種方法是基于特定表面標(biāo)記物的結(jié)合來分離細(xì)胞。舉例來說，微流體通道的表面已用多種抗原分子圖案化；接著細(xì)胞群體的子集與表面相互作用并且通過結(jié)合表面抗原而被固定。所采用的另一種方法需要選擇性地使順磁材料的珠粒與相關(guān)細(xì)胞結(jié)合，通常經(jīng)由存在于細(xì)胞膜處的表面標(biāo)記物。接著，通過使經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)入具有增加的磁場梯度的區(qū)域(通過將磁體置放在細(xì)胞懸浮液或微流體通道附近，或通過使用外部磁體以使合并于微觀裝置中的結(jié)構(gòu)磁化并且增強(qiáng)相鄰空間區(qū)域中的場梯度)來分離陽性洗脫份。已提供多種大尺度和微觀裝置，其旨在分離經(jīng)磁性標(biāo)記的物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一種實(shí)例方法包括基于流體樣品中的抗體結(jié)合使珠粒與目標(biāo)細(xì)胞群體偶合，以形成目標(biāo)細(xì)胞-珠粒聚集體，其與流體樣品中的非目標(biāo)細(xì)胞群體相比具有更大的尺寸。所述方法還包括基于目標(biāo)細(xì)胞-珠粒聚集體與非目標(biāo)細(xì)胞之間的尺寸差來分離目標(biāo)細(xì)胞-珠粒聚集體與非目標(biāo)細(xì)胞。

另一種實(shí)例方法包括使磁珠與流體樣品中的細(xì)胞群體偶合以形成經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞，其中某些經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞是目標(biāo)細(xì)胞并且其它經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞是非目標(biāo)細(xì)胞。所述方法更包括磁性分離流體樣品中經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞與未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞。所述方法還包括基于經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞-珠粒聚集體與經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞之間的尺寸差來分離經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞中的目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞。

一種實(shí)例微流體裝置包括輸入端、輸出端和在輸入端與輸出端之間延伸的流體路徑。流體路徑穿越磁性隔離區(qū)和基于尺寸的隔離區(qū)。磁性隔離區(qū)包括磁體，其經(jīng)定位以分離磁性隔離區(qū)中經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞與未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞?；诔叽绲母綦x區(qū)位于磁性隔離區(qū)的下游并且包括分離器，其經(jīng)配置以分離小于閾值尺寸的細(xì)胞與大于閾值尺寸的細(xì)胞。閾值尺寸大于一些經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞的尺寸，但小于一些經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞的尺寸。在一些實(shí)例中，閾值尺寸大于大部分經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞的尺寸，但小于大部分經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞的尺寸。

提供本概述以幫助理解，并且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，公開內(nèi)容的各種方面和特征中的每一個(gè)在一些情況下宜單獨(dú)使用，或在其它情況下與公開內(nèi)容的其它方面和特征組合。因此，盡管作為實(shí)例呈現(xiàn)公開內(nèi)容，但應(yīng)了解，任何實(shí)例的個(gè)別方面可單獨(dú)要求或與所述實(shí)例或任何其它實(shí)例的方面和特征組合。

以引用的方式并入

本說明書中提及的所有公開案和專利申請(qǐng)案以其全文引用的方式并入本文中并且用于任何目的，其引用程度如同每一個(gè)別公開案或?qū)＠暾?qǐng)案是特定地并且個(gè)別地指示為以引用的方式并入一般。

附圖說明

可通過參考以下詳細(xì)描述(其闡述例示性實(shí)施例，其中使用方法原理、組合物、裝置和設(shè)備)和隨附圖式獲得對(duì)實(shí)例方法、系統(tǒng)和組合物的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，其中：

圖1呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的用于從流體樣品(如血液樣品)分離細(xì)胞的實(shí)例樣品工作流。在一些實(shí)例中，在從血液樣品分離白細(xì)胞血沉棕黃層之后，珠粒與裝置中或裝置外的相關(guān)細(xì)胞偶合?？墒褂梅蛛x器(如微流體裝置、過濾器襯底或其它裝置)基于偶合珠粒和細(xì)胞的有效尺寸來進(jìn)行基于尺寸的分離?？稍谑褂昧黧w沖洗或細(xì)胞溶解進(jìn)行的襯底的細(xì)胞內(nèi)含物回收之后進(jìn)行所述細(xì)胞的分子分布。

圖2呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例分離原理的示意圖。在本實(shí)例中，目標(biāo)細(xì)胞可與非目標(biāo)細(xì)胞具有相同尺寸。珠?？山Y(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞以增加目標(biāo)細(xì)胞相對(duì)于非目標(biāo)細(xì)胞的表觀尺寸(圖2a)。非目標(biāo)細(xì)胞可流動(dòng)通過基于尺寸的分離裝置，本文中稱為分離器，如過濾器，而可通過分離器捕獲目標(biāo)細(xì)胞和與其結(jié)合的珠粒，引起目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞分離(圖2b)。

圖3呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的用于組合磁性分離與珠粒增強(qiáng)型尺寸分離的實(shí)例樣品工作流。在從血液樣品分離白細(xì)胞血沉棕黃層之后，大型磁珠與裝置中或裝置外的相關(guān)細(xì)胞偶合?；诮Y(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞群體的磁珠使用磁力進(jìn)行第一分離。所得富集群體經(jīng)歷使用分離器(如(但不限于)微流體裝置、過濾器襯底或其它裝置)進(jìn)行的基于尺寸的第二分離，產(chǎn)生高純度水平的目標(biāo)細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞。接著可經(jīng)由分子分布來分析細(xì)胞。

圖4呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)的實(shí)例細(xì)胞特征和分離的示意性分布，其基于免疫-磁性分離和基于尺寸的分離的組合。在開始時(shí)，ctc具有大于白細(xì)胞(wbc)的平均尺寸，但仍存在顯著重疊，阻止有效的基于尺寸的分離(圖4a)。珠粒結(jié)合步驟，由此細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合ctc，引起兩個(gè)群體之間的尺寸重疊減少，并且能夠使用有效的基于尺寸的分離(圖4b)。任選地，可通過在基于尺寸的分離之前，使用相同的優(yōu)先結(jié)合于ctc的珠粒以磁免疫方式消耗wbc群體來獲得顯著更高的純度。在一些實(shí)例中，這產(chǎn)生顯著更小的wbc群體，但跨過相同尺寸譜圖進(jìn)入最終的基于尺寸的分離(圖4c)。

圖5呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)設(shè)計(jì)以進(jìn)行粒子分離的實(shí)例微流體裝置的示意圖。所述裝置通常包括兩個(gè)輸入端和兩個(gè)輸出端，以及在輸入端與輸出端之間延伸的流體路徑。所述裝置還可以包括兩個(gè)區(qū)域：第一分離區(qū)(其可稱為磁性細(xì)胞隔離區(qū))和第二分離區(qū)(其可稱為基于尺寸的細(xì)胞隔離區(qū))。在第一分離區(qū)中，陽性和陰性洗脫份由于例如結(jié)合于目標(biāo)(和一些非目標(biāo))細(xì)胞的磁珠而磁性分離。在第二分離區(qū)中，基于尺寸分離細(xì)胞。

圖6呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的用于進(jìn)行基于尺寸的分離的分離工作流的示意圖，其包括可拆卸式部分(其形成流體路徑(例如微流體通道)的壁的至少一部分)和分離器，如過濾器襯底。在這一垂直截面中，可拆卸式部分安置在磁體與分離腔室之間(圖6a)。歸因于作用于經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞的磁力，細(xì)胞固定在可拆卸式襯底的底部表面上并且與所述襯底一起從裝置移除(圖6b)。在分離之后，通過移除襯底回收細(xì)胞(圖6c)并且例如經(jīng)由移液置放在過濾器襯底的頂部上(圖6d)以用于進(jìn)一步移除非目標(biāo)群體。在本實(shí)例中，基于尺寸的分離器是過濾器襯底，并且分離是基于尺寸排阻。

圖7呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例工作流，其用于獲得癌癥患者血液樣品，并且使用免疫磁性和物理性質(zhì)(例如尺寸)富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。接著使細(xì)胞溶解并且接著從所述樣品中提取核酸，接著經(jīng)由ngs進(jìn)行處理?？蓪⑺胐na異常信息匯編到說明所述信息的報(bào)告中，所述報(bào)告用作診斷書或幫助癌癥患者的監(jiān)測和治療決策。

圖8呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例工作流，其用于獲得癌癥患者血液樣品，并且使用免疫磁性和物理性質(zhì)(例如尺寸)富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。接著使細(xì)胞溶解并且經(jīng)處理以用于rna提取。經(jīng)由qpcr、表達(dá)陣列、數(shù)字pcr和/或rna測序測定許多不同表達(dá)標(biāo)記物的存在。最終，信息可用于產(chǎn)生患者專用表達(dá)譜或評(píng)分，用作診斷和/或預(yù)后以幫助癌癥患者的監(jiān)測和治療決策。

圖9呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例工作流，其用于獲得癌癥患者血液樣品，并且使用免疫磁性和物理性質(zhì)(例如尺寸)富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。接著使細(xì)胞經(jīng)溶解處理以用于rna提取。使用許多不同的表達(dá)標(biāo)記物，經(jīng)由qpcr、表達(dá)陣列和/或數(shù)字pcr測定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在。如果測定樣品含有ctc(ctc陽性)，那么接著可經(jīng)由ngs分析樣品以進(jìn)一步表征任何dna異常。

具體實(shí)施方式

本文中所描述的實(shí)例包括從液態(tài)樣品(如液態(tài)活檢)分離目標(biāo)細(xì)胞(如罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞)和使用所述細(xì)胞測定患者(如癌癥患者)的分子概況的方法。還描述使用基于尺寸的分離與其它方法(具體來說，免疫磁性分離)的組合來分離選擇性結(jié)合于珠粒的生物材料的實(shí)例系統(tǒng)和方法。描述許多可分離目標(biāo)物質(zhì)與非目標(biāo)物質(zhì)的有利裝置設(shè)計(jì)和方法。一些實(shí)例方法使用以下力和細(xì)胞特性中的一或多個(gè)的組合：珠粒和細(xì)胞復(fù)合物的尺寸、目標(biāo)細(xì)胞尺寸或目標(biāo)細(xì)胞機(jī)械特性、磁力以及所結(jié)合的珠粒的尺寸。所述設(shè)計(jì)適用于標(biāo)記、分離、計(jì)數(shù)以及在高純度和高回收率下的目標(biāo)細(xì)胞從陰性背景的回收，包括足夠高以使得能夠經(jīng)由下一代測序來進(jìn)行有效分析的純度。實(shí)例還可以包括可將由液態(tài)活檢中的富集腫瘤細(xì)胞的分析產(chǎn)生的分子信息用作改良癌癥患者的治療決策的診斷的機(jī)制。

本文中所描述的實(shí)例涉及經(jīng)改良的用于從流體樣品(如生物流體)分離細(xì)胞的系統(tǒng)。一些實(shí)施例包括珠粒依賴性基于尺寸的分離，由此細(xì)胞的表觀尺寸經(jīng)由珠粒與目標(biāo)細(xì)胞(而非其它非目標(biāo)(例如背景)細(xì)胞)的特異性結(jié)合而增加?？赏ㄟ^使第二珠粒類型與第一珠粒類型(其已結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞)結(jié)合來進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞尺寸。可通過使用模式組合以實(shí)現(xiàn)分離生物材料來提高在捕獲功效、純度百分比和回收百分比方面的分離質(zhì)量。一些實(shí)例包括磁性分離與基于尺寸的分離的組合，從而通過存在特異性結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞的珠粒來增加表觀細(xì)胞尺寸。一些實(shí)例包括可拆卸式襯底，其可有助于細(xì)胞的回收，由此可從裝置(如分離腔室)提取細(xì)胞。所呈現(xiàn)的實(shí)例系統(tǒng)還具有經(jīng)由分子分析方法(包括qpcr、測序、數(shù)字pcr和/或表達(dá)譜)來表征細(xì)胞的能力。在一些實(shí)例中，可通過組合基于尺寸的分離與免疫磁性分離而獲得的高細(xì)胞純度使得經(jīng)由下一代測序(ngs)進(jìn)行來自液態(tài)活檢的腫瘤細(xì)胞的常規(guī)分析成為可能。在一些實(shí)例中，所提出的診斷方法還可以用于代替基于組織活檢的分子診斷，如其中難以或不可能獲得活檢的情況，或幫助即將開始新療程的患者的療法選擇。

先前已呈現(xiàn)許多裝置和方法用于從非均質(zhì)混合物分離細(xì)胞或其它相關(guān)生物材料。此外，已呈現(xiàn)許多潛在用途，尤其在分析來自癌癥患者的罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)以預(yù)測預(yù)后和評(píng)估癌癥患者的治療功效方面。已設(shè)想宏觀和微觀裝置，以及用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的陽性洗脫份從更大的群體的分離的許多粒子特性。多種細(xì)胞特性已用于分離群體，包括：熒光、結(jié)合于襯底的細(xì)胞、磁特性、結(jié)合于磁珠/磁力的細(xì)胞、與聲波偶合的慣性特性、細(xì)胞的光學(xué)和電特性。先前呈現(xiàn)的系統(tǒng)仍可能不滿足許多應(yīng)用，尤其在陽性洗脫份代表極小百分比(<0.1％)的總?cè)后w時(shí)。先前呈現(xiàn)的參考方法具有許多缺陷，其可通過本文中所描述的實(shí)例完全或部分解決。呈現(xiàn)常規(guī)系統(tǒng)的缺陷和本文中所描述的系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)作為實(shí)例并且?guī)椭鷮?duì)本文中所描述的實(shí)例的各方面的理解。缺陷和優(yōu)點(diǎn)的說明并不意圖是限制性的，應(yīng)理解，本文中所描述的每個(gè)實(shí)例可解決常規(guī)系統(tǒng)的所有或甚至任何缺陷，但并且本文中所描述的每個(gè)實(shí)例都具有所有或甚至任何所描述的優(yōu)點(diǎn)。注意到常規(guī)系統(tǒng)中的缺點(diǎn)如下：

1.低捕獲功效。舉例來說，許多細(xì)胞在沿流動(dòng)路徑進(jìn)行的轉(zhuǎn)移步驟期間損失，或在下游與樣品的陰性洗脫份一起洗脫。一些來自常規(guī)系統(tǒng)的實(shí)例包括：其中不同的細(xì)胞樣品部分由于幾何形狀而經(jīng)歷顯著不同的力的宏觀系統(tǒng)。微觀流系統(tǒng)，其中細(xì)胞結(jié)合于通道壁，其需要相關(guān)細(xì)胞與通道壁緊密接觸；這一要求引起許多細(xì)胞不結(jié)合于官能化壁并且在下游與陰性洗脫份一起洗脫。

2.低純度。對(duì)于許多下游分析模式，在具體的下一代測序(ngs)中，重要的是存在陽性洗脫細(xì)胞的高度濃縮樣品，其未受陰性洗脫細(xì)胞污染。優(yōu)化其中陽性洗脫份占全部樣品的極小百分比(如低于1/1000或低于1/10e6個(gè)細(xì)胞)的樣品是極具有挑戰(zhàn)性的參數(shù)。舉例來說，宏觀系統(tǒng)無法在分離區(qū)中施加恒定的分離力，引起在所分離的樣品中包含陰性細(xì)胞。一個(gè)實(shí)例是其中沉積和磁力引起將樣品細(xì)胞拉拽到容器底部的系統(tǒng)，在這種情況下存在從流動(dòng)物料流拉出陰性洗脫細(xì)胞的非零機(jī)率。對(duì)于免疫磁性分離，小部分磁珠將非特異性結(jié)合于背景細(xì)胞(其不是目標(biāo)群體的一部分)，引起存在顯著受污染的洗脫份，尤其當(dāng)陰性洗脫份群體相對(duì)于陽性洗脫份明顯更高時(shí)。低純度樣品妨礙許多合乎需要的分子分析模式，包括下一代測序。

3.不能回收陽性洗脫份以用于分子分析。舉例來說，通過使陽性洗脫份結(jié)合于流道壁來分離細(xì)胞的系統(tǒng)無法容易地移除所結(jié)合的細(xì)胞以用于下游分析。如果需要回收細(xì)胞，那么需要細(xì)胞溶解或苛性洗脫步驟。這降低純度、降低活的陽性洗脫細(xì)胞的可得性、降低所回收的樣品中細(xì)胞的最終密度并且增加裝置操作的復(fù)雜度。

4.不能回收活細(xì)胞。舉例來說，在如分選流式細(xì)胞儀的系統(tǒng)中，需要高流動(dòng)速度，從而剪切力顯著影響所分離的細(xì)胞的活力。其它系統(tǒng)需要使用固定細(xì)胞或溶解緩沖液以洗脫細(xì)胞內(nèi)含物。在兩種情況下，所回收的細(xì)胞不再是活的，使蛋白質(zhì)分析變復(fù)雜并且排除進(jìn)行基于mrna的分析(其需要活細(xì)胞)的選擇方案，以及消除隨后在晶片外培養(yǎng)所分離的細(xì)胞的能力。另外，對(duì)于某些類別的細(xì)胞，如ctc，陽性洗脫細(xì)胞是唯一在較短時(shí)間量程內(nèi)分裂的細(xì)胞；因此，細(xì)胞培養(yǎng)物將天然地產(chǎn)生明顯更高純度的樣品并且使蛋白質(zhì)組發(fā)揮作用。

5.用戶不能定制捕獲方法。來自陽性洗脫細(xì)胞的分離和分析的資料可適用于修改或改良捕獲準(zhǔn)則；因此，對(duì)于用戶來說，重要的是具有定制用于捕獲陽性洗脫細(xì)胞的表面標(biāo)記物(或標(biāo)記物集合)和捕獲方法的其它方面的能力。對(duì)于許多先前存在的系統(tǒng)，捕獲方法由裝置制造商決定(例如捕獲到實(shí)體襯底上)。此外，對(duì)于其中細(xì)胞的內(nèi)源性物理性質(zhì)決定捕獲力的系統(tǒng)(例如基于沉積的捕獲、光學(xué)捕獲、聲學(xué)聚焦、電泳現(xiàn)象等)，這類力無法由用戶調(diào)諧以符合所需應(yīng)用，例如對(duì)于基于尺寸的分離(過濾)，細(xì)胞尺寸具有天然分布，包括不同細(xì)胞亞群之間的重疊。所提出的免疫磁性分離，或免疫磁性分離與其它分離模式的組合通過允許自定義用于基于珠粒的分離的標(biāo)記物面板來解決這一問題。

6.長運(yùn)行時(shí)間。出于多種原因(細(xì)胞存活率、細(xì)胞沉降、工作流程考慮因素等)，重要的是在合理的時(shí)間段內(nèi)、優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)并且更優(yōu)選在15分鐘內(nèi)完成分離反應(yīng)。對(duì)于許多現(xiàn)有系統(tǒng)，完全分離方案持續(xù)顯著更長的時(shí)間。舉例來說，一些所提出的微流體系統(tǒng)迫使全部血液樣品(7.5ml)通過小尺寸(<1mm)微尺度通道。因此，處理整個(gè)血液樣品通常耗費(fèi)>1小時(shí)。本文中所描述的實(shí)例可顯著縮短所需時(shí)間。

7.方法不能自動(dòng)進(jìn)行。許多當(dāng)前正在研發(fā)的系統(tǒng)不與標(biāo)準(zhǔn)流體處置設(shè)備相容，并且在其它情況下，不具有平行處理多份樣品的能力。最后，輸送量和樣品對(duì)樣品的污染物是限制分離反應(yīng)的總輸送量的重要問題。本文中所描述的實(shí)例提供一種系統(tǒng)，其中流體路徑是可完全拋棄式(例如存在極少或不存在樣品與樣品的交叉污染)，可平行運(yùn)行多份樣品以及使用與現(xiàn)有流體處置設(shè)備相容的標(biāo)準(zhǔn)可消耗性型式。舉例來說，共用移液步驟的方法始終具有交叉污染的可能。

8.所分離的洗脫份的大流體體積/大稀釋度。另一項(xiàng)重要考慮因素是在分離后，陽性樣品中每個(gè)細(xì)胞的流體體積。對(duì)于某些分析模式，如經(jīng)由pcr進(jìn)行的基因分型，重要的是將細(xì)胞分成低流體體積。然而，對(duì)于流通分離方法，如facs(熒光激活細(xì)胞分選術(shù))，極難以將相關(guān)細(xì)胞分離成小于每個(gè)細(xì)胞數(shù)微升的體積。對(duì)于大型背景中的低細(xì)胞數(shù)目，陽性洗脫份的總體積通常在毫升范圍內(nèi)。本文中所描述的實(shí)例裝置和方法使得能夠?qū)⒓?xì)胞分離成數(shù)微升(對(duì)于所有陽性洗脫細(xì)胞)，或下降到0.01微升/孔(對(duì)于100個(gè)所分離的細(xì)胞)。

本文中所描述的實(shí)例可通過新穎的裝置設(shè)計(jì)、方法和系統(tǒng)解決以上缺點(diǎn)中的一或多者。

提供實(shí)例方法，其可以用于基于珠?；罨叽缗抛鑿妮^大的混合物分離細(xì)胞的亞群。一組官能化珠粒與整個(gè)群體混合，引起選擇性結(jié)合于目標(biāo)群體，提供表達(dá)已知表面標(biāo)記物的所述目標(biāo)群體。如果需要進(jìn)一步尺寸擴(kuò)大，可向混合物中添加結(jié)合第一珠粒類型的第二組珠粒，其結(jié)合于已裝飾目標(biāo)細(xì)胞的珠粒。在珠粒偶合步驟之后，進(jìn)行使用分離器裝置(如(但不限于)過濾器或微流體元件)進(jìn)行的基于尺寸的分離。在稱為珠?；罨叽缗抛璧姆椒ㄖ?，基于所結(jié)合的珠粒和細(xì)胞的組合尺寸保留目標(biāo)亞群。一種使用這種方法的樣品工作流程呈現(xiàn)于圖1中，其中示意圖呈現(xiàn)于圖2中。這一所提出的分離模式的引人注目的應(yīng)用包括溶解目標(biāo)細(xì)胞群體、提取核酸以及細(xì)胞群體的分子分析。一些實(shí)例方法的一種特征是對(duì)相同細(xì)胞群體的基于磁珠親和力的分離與尺寸分離的組合使用。另一種特征是使用相同磁珠進(jìn)行二者的磁性分離以及珠粒結(jié)合細(xì)胞的表達(dá)尺寸的選擇性增加；接著，這一尺寸增加用于增強(qiáng)基于尺寸的分離。

尤其引人注目的工作流可組合正交分離模式，如磁性分離和基于尺寸的分離。基于結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞群體的磁珠使用磁力進(jìn)行第一分離。所得富集群體經(jīng)歷使用分離器(如微流體裝置、過濾器襯底或其它分離機(jī)制)進(jìn)行的第二基于尺寸的分離，產(chǎn)生高純度腫瘤細(xì)胞。接著可經(jīng)由分子分布來分析細(xì)胞(參見例如圖3)。

提供實(shí)例系統(tǒng)以用于從懸浮液中細(xì)胞的較大混合樣品分離細(xì)胞亞群(例如罕見的細(xì)胞群體)，所述系統(tǒng)可包括：官能化珠粒，其結(jié)合由目標(biāo)群體特異性表達(dá)的抗原(從而增加表觀細(xì)胞尺寸)，和基于尺寸的分離裝置。所述系統(tǒng)還可以含有：分離腔室、磁場源和官能化磁珠，其結(jié)合由目標(biāo)群體特異性表達(dá)的抗原(從而增加表觀細(xì)胞尺寸)。這類所提出的系統(tǒng)的一般操作模式可包括以下步驟中的一或多個(gè)：

1.官能化珠粒選擇性結(jié)合于表達(dá)相關(guān)抗原(或相關(guān)抗原集合)的細(xì)胞的亞群。這一步驟可在晶片上或在晶片外進(jìn)行，并且應(yīng)注意最小化珠粒與陰性洗脫細(xì)胞的非特異性結(jié)合。當(dāng)珠粒結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，表觀細(xì)胞尺寸的分布改變，使得目標(biāo)細(xì)胞形成與背景(非目標(biāo))群體相比具有更高的表觀尺寸的群體。

2.基于總體表觀尺寸分離細(xì)胞，所述總體表觀尺寸是固有細(xì)胞尺寸與結(jié)合珠粒尺寸的組合。基于尺寸的分離可使用過濾器薄膜型設(shè)置或經(jīng)設(shè)計(jì)以基于尺寸來分離細(xì)胞的微流體通道進(jìn)行。實(shí)例微流體通道可含有障礙物(參見例如圖4和5)，或彎曲/螺旋形狀，其使用迪恩流分離(deanflowfractionation)、慣性分離和其它現(xiàn)象以適合的流動(dòng)速率基于尺寸、密度和變形性來分離粒子?；诔叽绲姆蛛x可使用分離器(如過濾器薄膜型設(shè)置，或含有可基于尺寸來分離粒子的障礙物的微流體通道)進(jìn)行(參見例如圖4和5)?；诔叽绲姆蛛x還可以在不存在結(jié)合珠粒的情況下進(jìn)行，并且僅基于細(xì)胞尺寸的實(shí)際差異。

3.任選地，可對(duì)相同起始細(xì)胞群體進(jìn)行免疫磁性分離?？稍诨诔叽绲姆蛛x之前或之后進(jìn)行免疫磁性分離。用于尺寸增強(qiáng)的相同珠?？梢杂糜诖判苑蛛x，或可使用不同的磁珠群體(參見例如圖4、5、6)。

4.接著使用一或多種分析模式分析所分離的細(xì)胞，包括：成像(經(jīng)由顯微鏡或其它裝置)；測量來自所分離的細(xì)胞的熒光信號(hào)；fish；經(jīng)由pcr、rt-pcr、基于陣列或基于珠粒的測序方案進(jìn)行基因分析；rna或dna分析；表達(dá)分析；蛋白質(zhì)組分析。任選地，在最終分析步驟之前進(jìn)行其它樣品制備步驟，其可包括：移除陰性洗脫細(xì)胞、分別進(jìn)行單一細(xì)胞的分隔和分析、細(xì)胞溶解和/或在晶片上或在晶片外培養(yǎng)活的經(jīng)分離的細(xì)胞。

5.優(yōu)選分析方法包括下一代測序(ngs)，通過由使用2種或2種以上正交選擇標(biāo)準(zhǔn)(例如尺寸和磁力)產(chǎn)生的較高純度實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^基于rna的分析法來擴(kuò)增ngs工作流，以便測定經(jīng)分離的樣品中是否存在ctc(例如圖7、8和9)。

6.由所述細(xì)胞的分析產(chǎn)生的資料可以多種方式用于診斷，包括：用于微小殘留病或復(fù)發(fā)的患者監(jiān)測、基于已知抗性突變或已知敏感突變的治療選擇、針對(duì)新引入的藥物化合物的伴隨診斷、基于與療法反應(yīng)相關(guān)的表達(dá)概況進(jìn)行的治療選擇。

參考圖1-9，提供一種方法，其通常包括使磁珠與流體樣品中的細(xì)胞群體偶合以形成經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞，其中某些經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞是目標(biāo)細(xì)胞并且其它經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞是非目標(biāo)細(xì)胞。流體樣品通?？砂ㄈ魏瘟黧w(例如氣體或液體)。實(shí)例液體包括生物流體，如(但不限于)血液、尿液、汗水、間質(zhì)液或由人類或其它動(dòng)物衍生或獲得的其它體液。流體樣品可包括與所述生物流體在一起的其它流體或添加劑，如(但不限于)緩沖液流體、粘度調(diào)節(jié)流體或其它試劑。在一些實(shí)例中，生物流體可含有多個(gè)細(xì)胞，其中一些與所意圖的分析有關(guān)(例如目標(biāo)細(xì)胞)并且其中一些與所意圖的分析無關(guān)(例如背景細(xì)胞)。目標(biāo)細(xì)胞可包括例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)、循環(huán)胚胎細(xì)胞(cfc)或其它相關(guān)細(xì)胞。非目標(biāo)細(xì)胞可包括例如白細(xì)胞，或流體樣品中與進(jìn)行的技術(shù)(例如測序)無關(guān)的其它細(xì)胞。

在圖2a、2b和5b-6d中，目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞通常可具有相同尺寸，或在一些實(shí)例中，在其群體中具有明顯尺寸重疊?？梢氪胖橐杂糜诮Y(jié)合于流體樣品中的細(xì)胞。通常，可使用任何磁珠，并且可使用多種尺寸的珠粒，包括尺寸是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm的珠粒?？蓪⒋胖橐肓黧w樣品并且使其與樣品中的細(xì)胞結(jié)合。在一些實(shí)例中，可使用經(jīng)官能化或以其它方式經(jīng)設(shè)計(jì)以優(yōu)先結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞(例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的磁珠。盡管經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞，但一定量的磁珠仍可結(jié)合于非目標(biāo)細(xì)胞。在圖2a、2b和5b-6d中，目標(biāo)細(xì)胞202、502、602包括連接到其周邊的許多磁珠204、504、604，舉例來說，三個(gè)或三個(gè)以上珠粒連接到其周邊，而非目標(biāo)細(xì)胞206、506、606通常不包括任何連接到其周邊的磁珠。一部分磁珠204、504、604可非特異性結(jié)合于非目標(biāo)細(xì)胞206、506、606。因此，在圖2a、2b和5b-6d中，一些非目標(biāo)細(xì)胞206、506、606包括一個(gè)連接到其邊緣的磁珠204、504、604，以表示磁珠與一些非目標(biāo)細(xì)胞的非特異性結(jié)合。包括連接到其邊緣的磁珠204、504、604的目標(biāo)細(xì)胞202、502、602和非目標(biāo)細(xì)胞206、506、606通常形成可通過磁場操縱的經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞。不包括連接到其邊緣的磁珠204、504、604的非目標(biāo)細(xì)胞206、506、606通常形成未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞并且通常不可通過磁場操縱。一些用于粒子從流體的磁性分離的方法、微流體裝置和儀器描述于美國專利公開案第2013/0017538a1號(hào)中，其以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

繼續(xù)參考圖1-9，提供一種方法，其通常包括磁性分離流體樣品中經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞與未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞。具體地參考圖5b和6a，經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞在流體樣品流經(jīng)微流體裝置的流體路徑期間固定在微流體裝置的內(nèi)表面上。在圖5b和6a中，磁體508、608與微流體裝置的流體路徑相鄰安置并且將經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞沿流體路徑的內(nèi)表面吸引到磁體。

在一些實(shí)施例中，未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞不由磁體固定并且流向安置在固定的經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞下游的分離器510(參見圖5a-5c)。在適合的時(shí)間段之后，通常具有足以允許未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞離開磁性分離區(qū)的時(shí)間，經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞從微流體裝置的內(nèi)表面釋放，例如通過移除磁體508或磁場，并且經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞流向分離器510。可將經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞固定某一時(shí)間段，使得未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞充分地位于經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞的下游，以便確保未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞在經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞遇到分離器之前遇到分離器。

繼續(xù)參考圖1-9，提供一種方法，其通常包括基于經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞與經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞之間的尺寸差來分離經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞中的目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞。因此，可提供分離器210、510、610。可使用多種分離器中的任一種，包括(但不限于)具有閾值尺寸的開口或孔的襯底，使得大于閾值尺寸的細(xì)胞不可通過，而小于閾值尺寸的細(xì)胞可通過。其它可分離小于閾值尺寸的細(xì)胞與大于閾值尺寸的細(xì)胞的分離器包括螺旋形流體通道。分離器210、510、610通常包括孔口212、512、612或其它特征，其經(jīng)設(shè)定大小以允許未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞和經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞通過孔口212、512、612并且繼續(xù)向下流出分離器210、510、610，以及阻止經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞通過孔口。

因此，實(shí)例分離器210、510、610通常在分離器210、510、610的上游側(cè)捕獲經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞。為了從分離器210、510、610的上游側(cè)移除經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞，可顛倒通過分離器的流體流量q的方向以使經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞流向微流體裝置的入口，到達(dá)其中可從微流體裝置移除細(xì)胞的位置?？蓪⑺东@的經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞測序，如在本申請(qǐng)案的其它部分中更全面地描述。

參考圖6a和6b，在一些實(shí)施例中，流體路徑包括可拆卸式部分614。如圖6a和6b中所示，可拆卸式部分614可覆蓋在微流體裝置的壁形成的界定流體路徑的開口。磁體608可沿可拆卸式部分614的頂部表面安置，以吸引經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞。如圖6a和6b中示意性表示，經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞可固定在微流體裝置的流體路徑的可拆卸式部分614的底部表面上。可從微流體裝置移除可拆卸式部分614和經(jīng)固定的細(xì)胞(參見圖6b)并且安置于流體容器內(nèi)(參見圖6c)。如圖6b和6c中表示，一或多個(gè)未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞可固定在可拆卸式部分614的底部表面上，例如通過在一或多個(gè)經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞與可拆卸式部分614的底部表面之間捕獲。由圖6c中示意性描繪的流體容器，細(xì)胞可置放于分離器610的頂部(參見圖6d)。如圖6d中表示，在經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞和未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞通過分離器610時(shí)，通常在分離器610的頂部表面上捕獲經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞。可將所捕獲的經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞測序，如在本申請(qǐng)案的其它部分中更全面地描述。

參考圖5a-6b，提供實(shí)例微流體裝置516。裝置516通常包括一或多個(gè)輸入端518、一或多個(gè)輸出端520以及在一或多個(gè)輸入端518與一或多個(gè)輸出端520之間延伸的流體路徑522。如圖5a中示意性表示，流體路徑522通?？缭酱判愿綦x區(qū)524和基于尺寸的隔離區(qū)526。參考圖5a、5b和6a，磁性隔離區(qū)524通常包括經(jīng)定位以分離磁性隔離區(qū)524中經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞與未經(jīng)磁性標(biāo)記的細(xì)胞的磁體508。參考圖6b，磁性隔離區(qū)524可包括微流體裝置的可拆卸式壁部分614。參考圖5a和5c，基于尺寸的隔離區(qū)526可安置在磁性隔離區(qū)524的下游。參考圖5c，基于尺寸的隔離區(qū)526可包括分離器510。分離器510可延伸越過微流體裝置516的流體路徑522的整個(gè)橫截面并且可界定多個(gè)延伸穿過分離器510的孔口512(參見圖5c)。孔口512可平行于流體路徑522中的流體流量q的方向縱向延伸(參見圖5c)。

繼續(xù)參考圖5c，分離器510可經(jīng)配置以分離小于閾值尺寸的細(xì)胞與大于閾值尺寸的細(xì)胞。閾值尺寸通常大于一些經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞的尺寸，但小于一些經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞的尺寸。在一些實(shí)施例中，閾值尺寸大于大部分經(jīng)磁性標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞的尺寸，但小于大部分經(jīng)磁性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞的尺寸。參考圖4a-4c，提供實(shí)例目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞的相對(duì)尺寸的示意圖。在圖4a-4c中，目標(biāo)細(xì)胞由循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)表示，并且非目標(biāo)細(xì)胞由白細(xì)胞(wbc)表示。

圖4a通常表示不存在結(jié)合于ctc或wbc的磁珠情況下，ctc和wbc的相對(duì)尺寸。如圖4a所示，ctc的平均尺寸通常大于wbc。然而，存在阻止有效的基于尺寸的分離的實(shí)質(zhì)性尺寸重疊。在圖4a中，過濾器捕獲的洗脫份由矩形、交叉影線區(qū)域表示，其示意性指示分離器中經(jīng)設(shè)定大小以捕獲最小量的wbc，從而增加相對(duì)于全部捕獲的細(xì)胞的ctc純度水準(zhǔn)的孔口將捕獲小于一半的ctc。圖4b通常表示在磁珠與細(xì)胞偶合之后，ctc和wbc的相對(duì)尺寸。如圖4b中示意性表示，珠粒主要連接到ctc，由此增加ctc相對(duì)于wbc的表觀或有效尺寸。通過使珠粒與ctc結(jié)合，減少ctc與wbc之間的尺寸重疊，實(shí)現(xiàn)有效的基于尺寸的分離(參見圖4b)。如圖4b中表示，通過用珠粒增加ctc的有效尺寸，相同閾值尺寸的分離器捕獲大部分ctc和僅最小量的wbc。如圖4c中示意性表示，可通過進(jìn)行磁性分離步驟來進(jìn)一步降低所捕獲的細(xì)胞中wbc的濃度，例如通過使用相同的結(jié)合于ctc的珠粒以增加其有效尺寸、在基于尺寸的分離之前以磁免疫方式消耗wbc群體。這在所捕獲的樣品中產(chǎn)生更高純度的ctc，其使得可對(duì)所捕獲的樣品進(jìn)行測序。在一些實(shí)例中，使用與ctc偶合的磁珠進(jìn)行磁性分離和基于尺寸的分離可使wbc數(shù)目減少約10e7到約10e2，并且樣品中ctc的數(shù)目是約50到約100，引起所捕獲的樣品中ctc的濃度的顯著增加。

實(shí)例實(shí)施例：

實(shí)例1：使用珠粒改良基于尺寸的分離

在本實(shí)例中，與單獨(dú)的基于尺寸的分離相比，使用珠粒輔助的基于尺寸的分離可提供重要改良。我們假設(shè)試圖分離兩個(gè)細(xì)胞群體(圖4)，所述兩個(gè)細(xì)胞群體在一組標(biāo)記物a(例如epcam、egfr、her2)的表達(dá)以及平均尺寸差方面不同。因?yàn)橄嗤后w內(nèi)的細(xì)胞尺寸顯著不同，兩個(gè)洗脫份將具有顯著重疊，意味著如果大部分背景群體(b)待移除，那么任何僅選擇超過y0線的細(xì)胞的過濾將僅含有小部分目標(biāo)細(xì)胞群體(a)。

向混合群體中添加直徑是dy的珠粒將引起珠粒優(yōu)先結(jié)合于表達(dá)標(biāo)記物a的細(xì)胞，并且作為目標(biāo)群體的一部分的細(xì)胞的表觀尺寸增加(參見圖2)。在珠粒結(jié)合之后，過濾操作將明顯更有效；目標(biāo)群體中的大部分細(xì)胞超過尺寸分離截止值(圖4)。

由此獲得的細(xì)胞(例如通過過濾器保留)可用于許多基于基因dna、rna-堿基或基于蛋白質(zhì)的測試，以便幫助患者治療決策。

實(shí)例2：整合磁性和珠粒增強(qiáng)型尺寸分離的微流體裝置

第二實(shí)例例示微流體裝置中磁性分離與基于尺寸的分離的整合(參見圖5)。我們假設(shè)試圖分離兩個(gè)細(xì)胞群體，所述兩個(gè)細(xì)胞群體在一組標(biāo)記物a(例如epcam、egfr、her2)的表達(dá)以及平均尺寸差方面不同。因?yàn)橄嗤后w內(nèi)的細(xì)胞尺寸顯著不同，兩個(gè)洗脫份將具有顯著重疊，意味著任何基于尺寸的分離將含有目標(biāo)細(xì)胞群體(a)的成員以及大量背景群體(b)的成員。類似地，對(duì)于單獨(dú)的基于磁性珠粒的分離，一些非特異性結(jié)合將意味著拉出的珠粒將又含有群體(a)以及來自群體(b)的顯著背景的富集。向混合群體中添加直徑是dy的珠粒將引起珠粒優(yōu)先結(jié)合于表達(dá)標(biāo)記物a的細(xì)胞，并且作為目標(biāo)群體的一部分的細(xì)胞的表觀尺寸增加(參見圖4c)。珠粒-細(xì)胞混合和結(jié)合可在微流體裝置的第一區(qū)域內(nèi)發(fā)生。

隨后可進(jìn)行基于尺寸的分離，從而允許群體b中的許多細(xì)胞在微流體裝置中流動(dòng)通過(例如步進(jìn)或柱狀或分支/彎曲通道)，同時(shí)保留大部分細(xì)胞a以及結(jié)合的珠粒。分離可經(jīng)由尺寸排阻(參見圖5)或流動(dòng)驅(qū)使的慣性分離或迪恩流分離實(shí)現(xiàn)。所結(jié)合的珠粒將用語增加細(xì)胞a的表觀尺寸。接著，可經(jīng)由逆流或壓力增加(其將施加更大的拖曳力和/或增加柔性襯底中捕獲結(jié)構(gòu)的尺寸)從基于尺寸的分離結(jié)構(gòu)釋放細(xì)胞。接著，細(xì)胞(仍由磁珠結(jié)合)將流動(dòng)通過靠近磁體的第二分離區(qū)，從而向珠粒施加磁力。群體(a)的細(xì)胞保留在這一區(qū)域中，而允許群體b的細(xì)胞(其不具有由于滿足基于尺寸的分離要求而結(jié)合的珠粒)流動(dòng)通過。在固定目標(biāo)細(xì)胞(a)并且徹底洗滌其它細(xì)胞之后，可通過降低磁場使目標(biāo)細(xì)胞再次流動(dòng)?；蛘?，可使相關(guān)細(xì)胞溶解并且在下游收集溶解物?？深嵉挂陨喜僮鳎渲性诨诔叽绲姆诌x操作之前進(jìn)行使用磁場的分離。

由此獲得的細(xì)胞可以用于許多基于dna、rna或蛋白質(zhì)(或其組合)的測試，以便幫助患者治療決策。

實(shí)例3：使用可拆卸式通道壁部分和過濾器裝置增強(qiáng)分離捕獲功效、純度以及細(xì)胞回收(參見圖6)。

本實(shí)例提供實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群體的基于磁珠和基于尺寸的分離的機(jī)制的改良。我們再次假設(shè)樣品呈現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞群體a與背景細(xì)胞群體b的混合物。細(xì)胞用珠粒預(yù)先標(biāo)記，所述珠粒提供尺寸增強(qiáng)和/或在磁場存在下的磁矩，并且優(yōu)先結(jié)合屬于群體a的細(xì)胞。本文中，將細(xì)胞引入合并有分離腔室的微流體裝置中。

將陽性洗脫份固定在分離腔室中的襯底上；因此可僅需要一個(gè)出口用于接收陰性細(xì)胞洗脫份和洗滌緩沖液。將磁場源置放在分離腔室附近(參見例如圖2)，其中腔室可簡單地成為微流體通道的一部分。所述分離腔室包括可拆卸式襯底，其形成腔室壁的至少一部分，但可形成分離腔室的多個(gè)壁。隨著樣品流動(dòng)通過分離腔室，將經(jīng)磁珠標(biāo)記的陽性洗脫細(xì)胞從流動(dòng)物料流抽出并且優(yōu)先固定在分離襯底上。在洗滌步驟之后，襯底從分離腔室解耦合并且與任何結(jié)合細(xì)胞一起置放于包括過濾器襯底(具有受控尺寸的孔的薄膜)的容器中。接著，樣品通過基于尺寸的分離裝置，例如過濾器襯底或彎曲流動(dòng)通道，其選擇性分離具有大于設(shè)定尺寸截止值的尺寸(如通過固有細(xì)胞尺寸和任何結(jié)合珠粒尺寸測定)的細(xì)胞?？苫诩?xì)胞-珠粒復(fù)合物的尺寸或在不存在珠粒的情況下僅基于細(xì)胞尺寸分離細(xì)胞。

由此獲得的細(xì)胞可用于許多基于基因dna、rna-堿基或基于蛋白質(zhì)的測試，以便幫助患者治療決策。

實(shí)例4：將來自循環(huán)細(xì)胞的遺傳異常和表達(dá)數(shù)據(jù)用于癌癥治療決策

在本實(shí)例中，使用經(jīng)分離的罕見的細(xì)胞樣品以更好地確定患者癌癥治療的過程?？蓮乃媒?jīng)純化的細(xì)胞樣品分離dna和rna以確定患者對(duì)特定類型的療法起反應(yīng)的可能性、由特定療法類型帶來的優(yōu)勢或血流中是否存在腫瘤物質(zhì)，和/或所述患者的疾病將發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞可經(jīng)純化(例如使用本文中所描述的基于尺寸和/或磁性的方法收集)?？煞治鰜碜运占募?xì)胞的dna和/或rna以發(fā)展或改變療程。舉例來說，可通過下一代測序(ngs)方法分析dna以確定是否存在體細(xì)胞突變或如拷貝數(shù)變化或重排等變化。所呈現(xiàn)的使用基于磁性和尺寸的分離的方法可獲得更高純度的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，其是ngs所需的。存在已知體細(xì)胞突變可單獨(dú)或與其它生物標(biāo)記(如腫瘤活檢數(shù)據(jù))一起用于測定所引導(dǎo)的療法的功效。(參見圖7和9)。在一個(gè)實(shí)例中，存在kras或braf突變可指示對(duì)抗egfr試劑的抗性。下一代測序技術(shù)的使用是特定針對(duì)所描述的經(jīng)組合的基于親和力/尺寸的分離模式，因?yàn)樾枰辽?％腫瘤物質(zhì)的純度以有效地測定是否存在基因異常。在另一個(gè)實(shí)例中，體細(xì)胞突變的存在可用作包含在正在進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)中的依據(jù)。在另一個(gè)實(shí)例中，體細(xì)胞突變的存在可用于規(guī)定最初經(jīng)研發(fā)以按路徑依賴性方法用于不同來源組織的化合物。與由多參數(shù)富集引起的腫瘤和其它罕見的細(xì)胞樣品的經(jīng)改良純度無關(guān)，使用低錯(cuò)誤測序方法(如單分子條碼(在擴(kuò)增和測序步驟之前用獨(dú)特的條碼標(biāo)記每個(gè)dna分子)和單細(xì)胞測序)觀察所得樣品作為富集樣品的最終讀數(shù)可能是有利的。

在未檢測到體細(xì)胞突變的情況下，腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)資料可用于測定腫瘤細(xì)胞是否從血液樣品分離以及最終樣品中存在腫瘤衍生；以下基于rna的標(biāo)記物中的一或多種可用于這一目的：細(xì)胞角蛋白、ep-cam、her2、egfr、存活素(survivin)、htert、ck-7、ttf-1、tsa-9、pre-progrp、hsfib1、uchl1、muc-1。可通過計(jì)算‘腫瘤分?jǐn)?shù)’來測定是否存在腫瘤細(xì)胞，所述計(jì)算包括將一或多種標(biāo)記物的表達(dá)量乘以個(gè)別系數(shù)并且比較腫瘤分?jǐn)?shù)與預(yù)定臨界值。舉例來說，可根據(jù)下式計(jì)算腫瘤分?jǐn)?shù)：分?jǐn)?shù)＝(表達(dá)基因1)×系數(shù)1+(表達(dá)基因2)×系數(shù)2+……+(表達(dá)基因n)×系數(shù)n。如果分?jǐn)?shù)大于腫瘤臨界值，那么確認(rèn)存在ctc。(參見例如圖9)

實(shí)例5：將來自循環(huán)細(xì)胞的基因表達(dá)資料用于癌癥治療決策。

在本實(shí)例中，使用許多指定基因(基因圖)的mrna復(fù)本的豐度進(jìn)行治療決策(參見圖8)。舉例來說，對(duì)于乳癌，可使用以下標(biāo)記物的組合：ck19、ck20、ck8、scgb2a2、muc1、epcam、birc5、erbb2、mrp1、2、4、5、7；dck、aldh1、mbg1、magea3、hmam、ccne2、dkfzp762e1312、emp2、mal2、ppic、slc6a、b305d-c、b726p、gabaap、scgb2、tff1、tff3。

對(duì)于肺癌，可使用以下標(biāo)記物的組合：birc5、htert、ttf-1、fn1、pgp9.5、tsa-9(fam83a)、pre-progrp、hmth1(nudt1)、sp-d、itga11、col11a1、lck、rnd3、wnt3a、erbb3、bag1、brca1、cdc6、cdk2ap1、fut3、il11、sh3bgr、egfr、c-met、mage-a3、ck-19、ck-20、ck-7、epcam、cd45。

對(duì)于u前列腺癌，可使用以下標(biāo)記物的組合：ck-19、-20、ck-7、epcam、cd45、egfr、psma、psa、ar、hpn、hk2、psgr、mgb1、mgb2、azgp1、klk2、srd5a2、fam13c、flnc、gsn、tpm2、gstm2、tpx2。

可通過計(jì)算‘腫瘤分?jǐn)?shù)’來測定進(jìn)程和/或預(yù)后的患者風(fēng)險(xiǎn)，所述計(jì)算包括將一或多種標(biāo)記物的表達(dá)量乘以個(gè)別系數(shù)并且比較腫瘤分?jǐn)?shù)與預(yù)定臨界值。舉例來說，可根據(jù)下式計(jì)算腫瘤分?jǐn)?shù)：分?jǐn)?shù)＝(表達(dá)基因1)×系數(shù)1+(表達(dá)基因2)×系數(shù)2+……+(表達(dá)基因n)×系數(shù)n。接著基于總分來評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。

此外，可通過計(jì)算‘腫瘤分?jǐn)?shù)’來評(píng)估患者從特定全身治療(例如化學(xué)療法)或局部治療(例如手術(shù))獲得的益處，所述計(jì)算包括將一或多種標(biāo)記物的表達(dá)量乘以個(gè)別系數(shù)并且比較腫瘤分?jǐn)?shù)與預(yù)定臨界值。舉例來說，可根據(jù)下式計(jì)算腫瘤分?jǐn)?shù)：分?jǐn)?shù)＝(表達(dá)基因1)×系數(shù)1+(表達(dá)基因2)×系數(shù)2+……+(表達(dá)基因n)×系數(shù)n。視結(jié)果而定，可向患者指定特定輔助療法，或可測定局部治療的時(shí)間表。

罕見的細(xì)胞表達(dá)概況可用作單獨(dú)測試，或與基于組織的測試結(jié)果或其它生物標(biāo)記(如psa分?jǐn)?shù))一起。

以上實(shí)例詳細(xì)說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例。視應(yīng)用要求而定，也可以設(shè)想以上內(nèi)容的許多組合或變化。出于說明和描述的目的呈現(xiàn)先前論述并且并不意圖將公開內(nèi)容限于本文中所公開的形式。舉例來說，出于簡化公開內(nèi)容的目的，公開內(nèi)容的多種特征在一或多個(gè)方面、實(shí)施例或配置中集合在一起。然而，應(yīng)理解，公開內(nèi)容的某些方面、實(shí)施例或配置的多種特征可在替代性方面、實(shí)施例或配置中組合。此外，以下權(quán)利要求書以引用的方式并入本具體實(shí)施方式中，其中每個(gè)權(quán)利要求本身作為本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施例。