發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及硫酸乙酰肝素，具體地但不僅限于，涉及結(jié)合tgfβ1的硫酸乙酰肝素。發(fā)明背景糖胺聚糖是復(fù)雜的，線(xiàn)性的，高電荷的碳水化合物，其與多種蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)其功能；它們通常被合成為與核心蛋白相連接。gag分為非硫酸化的(ha)和硫酸化的(cs，ds，ks，肝素和hs)。在gag中，由于基于其結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特定序列而與靶蛋白相互作用的能力，硫酸乙酰肝素(hs)家族是特別感興趣的。這一家族(肝素和hs)由重復(fù)的具有可變模式的n-和o-硫酸化的糖醛酸-(1→4)-d-葡糖胺二糖亞基組成。例如，肝素的抗凝血活性需要具有獨(dú)特五糖排列的葡糖胺殘基的3-o-硫酸化(lindahlu，backstromg，hookm，thunbergl，franssonla，linkera.structureoftheantithrombin-bindingsiteinheparinprocnatlacadsciusa.1979；76：3198-202.)。對(duì)于ecm蛋白，獨(dú)特的硫酸化模式也是顯而易見(jiàn)的；結(jié)合fn的強(qiáng)力的肝素結(jié)合變體具有特別高的電荷，需要7至8個(gè)n-硫酸化二糖，并且具有比通常更大的結(jié)構(gòu)域(>14個(gè)殘基)(falconedj，salisburybgj.fibronectinstimulatesmacrophageuptakeoflow-densitylipoprotein-heparin-collagencomplexesarteriosclerosis.1988；8:263-73.；mahalingamy,gallagherjt,couchmanjr.cellularadhesionresponsestotheheparin-binding(hepii)domainoffibronectinrequireheparansulfatewithspecificproperties.jbiolchem.2007；282:3221-30)。然而，hs通過(guò)具有由未硫酸化na結(jié)構(gòu)域分開(kāi)的高度硫酸化的ns結(jié)構(gòu)域與這樣的硫酸化肝素不同；這樣的配置提供了用于選擇性結(jié)合蛋白的獨(dú)特排列，而沒(méi)有肝素的副作用(gandhins，mancerarl.thestructureofglycosaminoglycansandtheirinteractionswithproteins.chembioldrugdes.2008；72:455-82.).hs的二糖組成可以使用肝素黃桿菌(flavobacteriumheparinium)酶類(lèi)肝素酶i、ii和iii切割糖苷鍵，通過(guò)一系列酶裂解來(lái)闡明(venkataramang,shriverz,ramanr,sasisekharanr.sequencingcomplexpolysaccharides.science.1999；286:537-42.；desaiur,wanghm,linhardtrj.specificitystudiesontheheparinlyasesfromflavobacterium-heparinumbiochemistry.1993；32:8140-5.；shriverz,sundaramm,venkataramang,fareedj,linhardtr,biemannk,等，cleavageoftheantithrombiniiibindingsiteinheparinbyheparinasesanditsimplicationinthegenerationoflowmolecularweightheparin.procnatlacadsciusa.2000；97:10365-70)。當(dāng)所有3種肝素酶組合使用時(shí)，可能使得超過(guò)90％的肝素或hs解聚(karamanosnk,vankyp,tzanakakisgn,tsegenidist,hjerpea.ion-pairhigh-performanceliquidchromatographyfordeterminingdisaccharidecompositioninheparinandheparansulphate.jchromatogra.1997；765:169-79.；vyniosdh,karamanosnk,tsiganoscp.advancesinanalysisofglycosaminoglycans:itsapplicationfortheassessmentofphysiologicalandpathologicalstatesofconnectivetissues.jchromatogrb.2002；781:21-38.)。所得的二糖混合物可以通過(guò)與已知的二糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較利用以下方式進(jìn)行分析：page(hampsonin,gallagherjt.separationofradiolabeledglycosaminoglycanoligosaccharidesbypolyacrylamide-gelelectrophoresisbiochemj.1984；221:697-705.),sax-hplc(skidmoremaa,yatese和turnbullje.labellingheparansulfatesaccharideswithchromophore,fluorescenceandmasstagforhplcandmsseparations.methodsinmolecularbiology.2009；534:157-69.)，或高度敏感的毛細(xì)管電泳(ce)(lamarif,militsopouloum,gioldassix,karamanosnk.capillaryelectrophoresis:asuperiorminiaturizedtoolforanalysisofthemono-,di-,andoligosaccharideconstituentsofglycanmoietiesinproteoglycans.freseniusjanalchem.2001；371:157-67.；karamanosnk,vankyp,tzanakakisgn,hjerpea.highperformancecapillaryelectrophoresismethodtocharacterizeheparinandheparansulfatedisaccharides.electrophoresis.1996；17:391-5.；sudhalterj,folkmanj,svahncm,bergendalk,damorepa.importanceofsize,sulfation,andanticoagulantactivityinthepotentiationofacidicfibroblastgrowth-factorbyheparinjbiolchem.1989；264:6892-7.；militsopouloum,lamarifn,hjerpea,karamanosnk.determinationoftwelveheparin-andheparansulfate-deriveddisaccharidesas2-aminoacridonederivativesbycapillaryzoneelectrophoresisusingultravioletandlaser-inducedfluorescencedetection.electrophoresis.2002；23:1104-9)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種硫酸乙酰肝素，以及由所述的硫酸乙酰肝素組成的硫酸乙酰肝素制劑。此種硫酸乙酰肝素稱(chēng)為hs16。hs16是指一類(lèi)新的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的分離的硫酸乙酰肝素。已發(fā)現(xiàn)hs16結(jié)合tgfβ1，增強(qiáng)tgfβ1的熱穩(wěn)定性并增強(qiáng)tgfβ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并因此促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成分化。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了硫酸乙酰肝素hs16。hs16可以以分離的形式或基本純化的形式提供。這可包括提供一種組合物，其中硫酸乙酰肝素成分為至少80％hs16，更優(yōu)選以下之一：至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在優(yōu)選實(shí)施方案中，hs16能夠與具有以下氨基酸序列的肽或多肽結(jié)合：rkdlgwkwihepkgyh(seqidno:1)。所述的肽可以在該序列的一端或兩端具有一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸。例如，肽可以在該序列的一端或兩端具有任意1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，所述的多肽是tgfβ1蛋白。在一些實(shí)施方案中，hs16與具有seqidno：1的氨基酸序列或由seqidno：1的氨基酸序列組成的肽結(jié)合，或以小于100μm，更優(yōu)選小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm或1nm的kd與tgfβ1蛋白結(jié)合。hs16可根據(jù)本文所述的發(fā)明人的方法獲得，鑒定，分離或富集，所述方法可包括以下步驟：(i)提供固體支持物，所述固體支持物具有附著于其上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸，從而形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與混合物的剩余部分分離；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(v)收集所述解離的糖胺聚糖。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括大小分級(jí)步驟，例如，在步驟(iv)或(v)之后。大小分級(jí)可用于除去小于選定閾值的硫酸乙酰肝素鏈，例如，dp4，dp6，dp8，dp10，dp12，dp14，dp16，dp18，dp20，dp22或dp24中之一。在本發(fā)明人的方法中，所述混合物可以包含從市售來(lái)源獲得的糖胺聚糖。一種合適的來(lái)源是硫酸乙酰肝素級(jí)分，例如，市售的硫酸肝素。一種合適的硫酸乙酰肝素級(jí)分可以在從豬腸粘膜分離肝素的過(guò)程中獲得，另一種是來(lái)自豬粘膜的硫酸乙酰肝素[hspm](例如來(lái)自celsuslaboratoriesinc.——有時(shí)稱(chēng)為“celsushs”)。其它合適的硫酸乙酰肝素來(lái)源包括來(lái)自任何哺乳動(dòng)物(人或非人)，特別是腎，肺或腸粘膜的硫酸乙酰肝素。在一些實(shí)施方案中，硫酸乙酰肝素來(lái)自豬(豬的)或牛(牛的)腸粘膜、腎或肺。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含根據(jù)上述任一方面的hs16和tgfβ1蛋白的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含根據(jù)上述方面的hs16的藥物組合物或藥物。所述的藥物組合物或藥物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，佐劑或稀釋劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物被用于治療方法中，所述方法包括組織的修復(fù)和/或再生，例如，結(jié)締組織(軟骨，骨，腱，韌帶，皮膚，角膜)或斷骨。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物或藥物可以進(jìn)一步包含tgfβ1蛋白。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物或藥物可以進(jìn)一步包含間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供hs16用于醫(yī)學(xué)治療的方法。醫(yī)學(xué)治療的方法可以包括體內(nèi)傷口愈合、組織的修復(fù)和/或再生的方法，例如，結(jié)締組織(軟骨，骨，腱，韌帶，皮膚，角膜)的修復(fù)和/或再生。這樣的修復(fù)和/或再生可以在哺乳動(dòng)物或人中進(jìn)行。在本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了hs16在制備用于醫(yī)學(xué)治療方法的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，醫(yī)學(xué)治療方法包括如上所述的組織的修復(fù)和/或再生。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含生物材料和hs16的生物相容性植入物或假體。在一些實(shí)施方案中，植入物或假體涂覆有hs16。在一些實(shí)施方案中，植入物或假體用hs16浸漬。植入物或假體可進(jìn)一步涂覆或浸漬有tgfβ1蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了形成生物相容性植入物或假體的方法，所述方法包括用hs16涂覆或浸漬生物材料的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括用tgfβ1蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或兩種涂覆或浸漬生物材料。在一些方面，方法可以包括向患者施用hs16和間充質(zhì)干細(xì)胞。在這樣的方法中，hs16、tgfβ1蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種可以配制在包含hs16、tgfβ1蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種以及藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物中。優(yōu)選地，hs16，tgfβ1蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞分別以治療有效量提供。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將治療有效量的hs16和/或tgfβ1蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞配制為藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含hs16和/或tgfβ1蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，其中所述藥物組合物施用于患者。在本發(fā)明的另一方面，提供了治療患者的方法，所述方法包括將生物相容性植入物或假體手術(shù)植入到位于或圍繞于骨折部位的患者組織中，所述植入物或假體包含生物材料和hs16。在一些實(shí)施方案中，植入物或假體涂覆有hs16。在一些實(shí)施方案中，植入物或假體用hs16浸漬。在一些實(shí)施方案中，所述的植入物或假體還用tgfβ1蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或兩種涂覆或浸漬。在本發(fā)明的另一方面中，提供了培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包含hs16。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了hs16在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，提供了hs16在體外結(jié)締組織生長(zhǎng)中的用途。在本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)方面，提供了一種體外生長(zhǎng)結(jié)締組織的方法，所述方法包括與外源添加的hs16接觸培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了在有需要的人或動(dòng)物病患中進(jìn)行組織例如結(jié)締組織的修復(fù)、替換或再生的方法，所述方法包括：(i)與hs16接觸體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞足以使所述細(xì)胞形成組織的一段時(shí)間；(ii)收集所述組織；(iii)將所述組織植入到患者體內(nèi)的損傷或疾病部位，以修復(fù)、替換或再生患者體內(nèi)的組織。所述的組織可以是結(jié)締組織，例如，骨，軟骨，腱，皮膚或脂肪。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使所述培養(yǎng)中的間充質(zhì)干細(xì)胞與外源tgfβ1蛋白接觸。在本發(fā)明的另一方面，提供了在hs16存在下通過(guò)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的組織。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了在hs16和tgfβ1蛋白存在下通過(guò)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的組織。在本發(fā)明的另外一方面，提供了培養(yǎng)干細(xì)胞例如間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括與hs16接觸培養(yǎng)干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面，提供了體外培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，所述方法包括與硫酸肝素hs16接觸體外培養(yǎng)干細(xì)胞。hs16優(yōu)選是外源的和分離的，并作為補(bǔ)充物添加到培養(yǎng)物中，例如，作為培養(yǎng)基的一部分。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種多部分的試劑盒(kitofparts)，所述試劑盒包括預(yù)定量的hs16和預(yù)定量的tgfβ1。所述的試劑盒可以包括含有預(yù)定量的hs16的第一容器和含有預(yù)定量的tgfβ1的第二容器。試劑盒可以進(jìn)一步包含預(yù)定量的間充質(zhì)干細(xì)胞。試劑盒可以被提供用于醫(yī)學(xué)治療方法。所述的醫(yī)學(xué)治療方法可以包括體內(nèi)傷口愈合的方法，組織諸如結(jié)締組織(例如軟骨，骨，腱，韌帶，皮膚，角膜)的修復(fù)和/或再生的方法。所述的修復(fù)和/或再生可以在哺乳動(dòng)物或人中。所述試劑盒可以與用于分別地、順序地或同時(shí)地施用hs16、tgfβ1蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞以提供醫(yī)學(xué)治療的說(shuō)明書(shū)一起提供。在本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有治療有效量的：(i)hs16；和以下的一種或兩種(ii)tgfβ1蛋白；(iii)間充質(zhì)干細(xì)胞，用于在醫(yī)學(xué)治療方法中同時(shí)、分別或順序使用。所述的醫(yī)學(xué)治療方法可以包括體內(nèi)傷口愈合的方法，結(jié)締組織的修復(fù)和/或再生的方法。所述的修復(fù)和/或再生可以在哺乳動(dòng)物或人中。所述的產(chǎn)品可以任選地配制為用于聯(lián)合用藥的聯(lián)合制劑。如本文所示，hs16具有穩(wěn)定tgfβ1，從而延長(zhǎng)其作用的性質(zhì)。hs16防止tgfβ1在培養(yǎng)基中降解。這可以有用地應(yīng)用于tgfβ1制品的儲(chǔ)存和含有tgfβ1的培養(yǎng)基的制備。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含生長(zhǎng)因子和分離的hs16的組合物。生長(zhǎng)因子可以是蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子，優(yōu)選tgfβ1。組合物可以包含分離的tgfβ1和分離的hs16。在一些實(shí)施方案中，所述的組合物可以是培養(yǎng)基。在其它實(shí)施方案中，組合物可以是含有tgfβ1的藥物組合物或藥物。組合物可以是在容器中的包含tgfβ1和分離的hs16的tgfβ1制劑。合適的容器可以是瓶，藥瓶，管或注射器。還提供了增加生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括使生長(zhǎng)因子與分離的hs16接觸。生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性可以根據(jù)其半衰期，即在給定組合物中一半生長(zhǎng)因子被降解和/或失去其活性所需的時(shí)間的量來(lái)測(cè)量。生長(zhǎng)因子優(yōu)選地為蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子，更優(yōu)選tgfβ1。hs16起到維持和延長(zhǎng)tgfβ1半衰期的作用。該方法可以包括在體外使分離的hs16與生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1)接觸，所述生長(zhǎng)因子例如作為生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1)組合物制劑、其儲(chǔ)存或運(yùn)輸?shù)囊徊糠??；蛘撸摲椒砂ㄔ隗w內(nèi)使分離的hs16與生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1)接觸，例如，通過(guò)將分離的hs16施用于其中存在[組織中天然存在，或外源加入組織]生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1)的組織。該方法還可以包括將外源性生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1)添加到組織的步驟?？梢詫⒑蟹蛛x的hs16(或已向其中加入分離的hs16)的給定組合物或組織中tgfβ1的穩(wěn)定性與不含hs16(或未加入分離的hs16)的對(duì)照組合物進(jìn)行比較。在上述組合物和方法中，hs16可以如本文所述進(jìn)行純化。tgfβ1可以是分離的和/或純化的，未分離的或部分分離的，例如，細(xì)胞外基質(zhì)材料的部分，或存在于細(xì)胞組合物中。分離或純化的tgfβ1可以是重組tgfβ1。重組tgfβ1可從許多商業(yè)制造商市售獲得。在一些方面，hs16在血液衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)期間用作保存劑和/或防腐劑。在一些實(shí)施方案中，血液衍生產(chǎn)品包括血小板，血小板產(chǎn)物(plateletproducts)，血小板裂解物和富血小板血漿(prp)。血液衍生產(chǎn)品可以從血液或血清中分離，并任選地富集或分離自血液和/或血清的其它組分。在一些方面，提供了血液衍生產(chǎn)品的制劑，所述制劑包含血液衍生產(chǎn)品和預(yù)定量的hs16。hs16優(yōu)選是分離的或純化的形式，并且優(yōu)選對(duì)于血液衍生產(chǎn)品是外源的，被加入到血液衍生產(chǎn)品中。所述的制劑可以是血小板制劑，例如，血小板，血小板產(chǎn)物，血小板裂解物或富血小板血漿(prp)，其中已加入hs16。如上文所述，提供了保存生物材料優(yōu)選包含tgfβ1的生物材料的方法，所述方法包括使生物材料與預(yù)定量的hs16接觸。在一些實(shí)施方案中，生物材料可以選自細(xì)胞材料，組織，血液衍生產(chǎn)品，細(xì)胞或干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了hs16用于干細(xì)胞分離和/或加工的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，hs16被提供作為在干細(xì)胞的培養(yǎng)和/或擴(kuò)增期間使用的試劑。從而，可以提供分離，處理，培養(yǎng)或擴(kuò)增干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干細(xì)胞與預(yù)定量的hs16接觸。干細(xì)胞可任選地表達(dá)tgfβ1。任選地，本發(fā)明的方面和實(shí)施方案不包括manton等(journalofcellularphysiology209：219-229(2006))中所述的hs。發(fā)明詳述發(fā)明人已經(jīng)使用基于序列的親和色譜平臺(tái)來(lái)開(kāi)發(fā)tgfβ1的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這使得能夠富集結(jié)合tgfb1的硫酸乙酰肝素(hs)部分。術(shù)語(yǔ)“硫酸(sulphate)”，“硫酸化的(sulphated)”和“硫酸化(sulphation)”分別與“硫酸(sulfate)”，“硫酸化的(sulfated)”和“硫酸化(sulfation)”互換使用。hs16本發(fā)明涉及一類(lèi)稱(chēng)為hs16的硫酸乙酰肝素分子。hs16分子可通過(guò)富集含有一種或多種糖胺聚糖(gag)的化合物的混合物的方法獲得，所述糖胺聚糖結(jié)合對(duì)應(yīng)于tgfβ1的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。特別地，hs16分子可以通過(guò)富集結(jié)合tgfβ1的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的硫酸乙酰肝素而獲得，該結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh或由該氨基酸序列組成。富集過(guò)程可用于分離hs16。本發(fā)明還涉及富含hs16的化合物的混合物，以及使用這些混合物的方法。除了可通過(guò)本文所述的方法獲得之外，hs16也可以在功能和結(jié)構(gòu)上被定義。功能方面，hs16能夠與具有氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh(seqidno:1)或由該氨基酸序列組成的肽結(jié)合。所述的肽可以在肽的一端或兩端包含一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸，或者在一些情況下，可以連接于短氨基酸接頭序列(例如長(zhǎng)度約1至5個(gè)氨基酸)和/或標(biāo)簽例如生物素。優(yōu)選地，hs16以小于100μm，更優(yōu)選小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm，1nm或100pm的kd與所述肽相結(jié)合。優(yōu)選地，hs16也以小于100μm，更優(yōu)選小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm，1nm或100pm的kd與tgfβ1蛋白相結(jié)合。hs16和tgfβ1蛋白之間的結(jié)合可以通過(guò)以下測(cè)定方法確定。將gag固定在每個(gè)孔中，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明，用tgf-β1激發(fā)。簡(jiǎn)言之，一式三份的孔首先用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定緩沖液(sab：100mmnacl，50mm乙酸鈉，0.2％v/v吐溫20，ph7.2)中的5μg/ml肝素、hspm、hs16+ve或hs16-ve預(yù)涂覆，然后在室溫下孵育過(guò)夜。然后用sab仔細(xì)洗滌平板三次，用250μl封閉溶液(0.4％w/v魚(yú)皮明膠，sigma-aldrich，sab溶液)封閉，并在37℃下孵育1小時(shí)。然后將tgf-β1以100，200或400ng/ml的濃度溶解于封閉溶液中。將平板用sab洗滌三次，將每種蛋白質(zhì)稀釋物(200μl)分配到一式三份的孔中，并在37℃下孵育2小時(shí)，用sab漂洗，并加入200μl的750ng/ml單克隆小鼠抗tgf-β1抗體(mab2401，r&d系統(tǒng))。然后將板在37℃下孵育1小時(shí)，用sab洗滌，并在封閉溶液中加入200μl的1μg/ml多克隆山羊抗小鼠生物素化抗體(ab6788，abcam)。再次，將平板在37℃下孵育1小時(shí)，用sab洗滌，并將200μl的220ng/mlextravidinap(sigma-aldrich)加入封閉溶液中，在37℃孵育30分鐘，然后用sab漂洗。最后，加入200μl顯影試劑(sigmafast對(duì)硝基苯磷酸酯，sigma-aldrich)，在37℃孵育40分鐘，并在405nm下在1小時(shí)內(nèi)讀數(shù)。在該測(cè)定中，可以通過(guò)測(cè)量吸光度來(lái)確定結(jié)合，并且可以相對(duì)于對(duì)照來(lái)確定，所述對(duì)照諸如不存在添加的硫酸乙酰肝素的tgfβ1蛋白,或添加了不結(jié)合tgfβ1蛋白的硫酸乙酰肝素的tgfβ1蛋白。hs16與tgfβ1的獨(dú)特相互作用可以通過(guò)表面等離子體共振(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)進(jìn)行分析，例如，在與肝素，hspm,hs16+ve或hs16-ve的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中。hs16的結(jié)合優(yōu)選是特異性的，與非特異性結(jié)合相反，并且背景是可以通過(guò)一種方法從其他硫酸乙酰肝素和/或gags中選擇hs16，所述方法包括選擇與包括rkdlgwkwihepkgyh的肽例如seqidno：1或者與tgfβ1蛋白顯示出高親和力結(jié)合相互作用的硫酸乙酰肝素。本發(fā)明的hs16優(yōu)選增強(qiáng)tgfβ1的熱穩(wěn)定性并且增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的tgfβ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和軟骨形成分化。hs16可用于期待tgfβ1的穩(wěn)定化和/或防止tgfβ1的降解和/或延長(zhǎng)tgfβ1的任何應(yīng)用。例如，hs16可用于穩(wěn)定血小板產(chǎn)物中的tgfβ1。下面顯示了用肝素裂解酶i，ii和iii消化完全然后將所得二糖片段進(jìn)行hplc分析之后的hs16二糖組成。本發(fā)明的hs16包括二糖組成在對(duì)于上文hs16保留種類(lèi)(hs16retainedspecies)(hs16+)的各二糖所示的歸一化百分比值±10％(更優(yōu)選±9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％)之內(nèi)的硫酸乙酰肝素，所述二糖組成是通過(guò)用肝素裂解酶i、ii和iii消化完全，然后將所得二糖片段進(jìn)行hplc分析來(lái)確定的。通過(guò)用肝素裂解酶i，ii和iii消化完全然后將所得二糖片段進(jìn)行hplc分析測(cè)定的hs16二糖組成可以具有如下所示的任一種二糖組成：或或或或或在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所列出的8種二糖的總重量百分比為100％(任選地±3.0％或更小，或±2.0％或更小，±1.0％或更小，±0.5％或更小)。在一些實(shí)施方案中，δua，2sglcnac，6s的歸一化重量百分比不同于上述情況。例如，hs16可以具有如上所述的歸一化重量百分比的二糖，除了δua，2sglcnac，6s，其可以以不同的歸一化重量百分比存在，或可以不存在。在一些實(shí)施方案中，hs16通過(guò)參考δua，2s-glcns，6s，δua，2s-glcns，δua-glcns，6s，δua-glcns，δua，2s-glcnac，δua-glcnac，6s和δua-glcnac的上述歸一化重量百分比進(jìn)行定義。用肝素裂解酶消化hs制劑可以如下進(jìn)行：將hs制劑(1mg)各自溶解于500μl乙酸鈉緩沖液(100mm，含有10mm乙酸鈣，ph7.0)中，加入三種酶各2.5mu；將樣品在37℃下孵育過(guò)夜(24小時(shí))，同時(shí)輕微顛倒(9rpm)樣品管；將三種酶另外各2.5mu加入到樣品中，在37℃下將樣品管輕微顛倒(9rpm)再孵育48小時(shí)；通過(guò)加熱(100℃，5分鐘)停止消化，然后凍干；將消化物重懸于500μl水中，取等分試樣(50μl)用于分析。具體來(lái)說(shuō)，hs16可以如下消化：hspm,hs16+ve和hs16-ve樣品溶解在水(1100μl)中并過(guò)濾(minisartrc15,0.2μm注射器過(guò)濾單元，sartoriusstedim，#17761)以除去任何顆粒物質(zhì)。作為進(jìn)一步的純化步驟，通過(guò)離心(4000rpm，1小時(shí)，15℃)將過(guò)濾的溶液通過(guò)2000mwco膜(vivaspin2，hydrosart，sartoriusstedim，#vs02h91,2000mwcohy膜，2ml超濾旋轉(zhuǎn)柱)。將滯留物用水(3×1ml)洗滌，從過(guò)濾器回收并凍干。將純化的hs樣品溶解在水(1mg/ml)中，并取每個(gè)冷凍干燥樣品的等分試樣(2x～1ml)用于分析。基于brickman等人的方法(brickman，y.g.，ford，m.d.，gallagher，j.t.，nurcombe，v.，bartlett，p.f.，和turnbull，j.e.(1998)jbiolchem273,4350-4359)，但有一些修改，通過(guò)順序加入肝素裂解酶(肝素裂解酶i，ii和iii，ibextechnologies)將hs樣品消化為二糖和寡糖。將干燥的hs樣品再溶解于消化緩沖液(500μl；50mm磷酸鈉緩沖液，ph7.0)中，并向每個(gè)樣品中加入肝素裂解酶i(5μl；5miu)。將樣品孵育(37℃，2小時(shí))，在旋轉(zhuǎn)輪(9rpm)上輕輕混合。將肝素裂解酶iii(5μl；5miu)加入消化物中，并再孵育1小時(shí)(如上所述)。加入肝素裂解酶ii(5μl：5miu)，將消化物如上孵育18小時(shí)。最后，同時(shí)加入所有三種肝素裂解酶的等分試樣(5μl；5miu)，并將消化物再孵育24小時(shí)。通過(guò)加熱(100℃，5分鐘)終止酶消化。所有三個(gè)hs樣品一式兩份消化。在一些實(shí)施方案中，hs16鏈包含約12至26個(gè)糖單元(聚合度，dp)。在一些實(shí)施方案中，dp數(shù)可以是至少12，至少14，至少16，至少18，至少20，至少22，至少24或至少26中的一個(gè)。任選地，其可以小于26。具有所需大小范圍(dp)的hs16鏈的組合物可以通過(guò)對(duì)hs16應(yīng)用尺寸分級(jí)步驟來(lái)制備。為了鑒定hs16，本發(fā)明人使用了涉及對(duì)顯示與具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定多肽結(jié)合的糖胺聚糖分子進(jìn)行富集的方法。然后可以鑒定分離的gag混合物和/或分子，并測(cè)試它們調(diào)節(jié)表達(dá)含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白的細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)和分化的能力。這使得在體外和體內(nèi)均能夠控制分析特定gag糖序列對(duì)細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)和分化的影響。該方法在pct/gb2009/000469(wo2010/030244)中描述，其通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明人將該方法應(yīng)用于tgfβ1以分離和表征與tgfβ1具有高結(jié)合性的gag。因此，為了鑒定hs16，本發(fā)明人提供了一種分離糖胺聚糖的方法，所述糖胺聚糖能夠結(jié)合具有肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/heparan)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，所述方法包括：(i)提供固體支持物，所述固體支持物具有附著于其上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸，從而形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與混合物的剩余部分分離；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(v)收集所述解離的糖胺聚糖。本發(fā)明人還提供了通過(guò)其調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化的能力來(lái)鑒定的分離的糖胺聚糖。為此，發(fā)明人提供了一種鑒定能夠刺激或抑制細(xì)胞和/或組織的生長(zhǎng)和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：(i)提供固體支持物，所述固體支持物具有附著于其上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸，從而形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與混合物的剩余部分分離；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(v)收集所述解離的糖胺聚糖；(vi)將收集的糖胺聚糖添加到細(xì)胞或組織中，所述細(xì)胞或組織中存在含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的蛋白；(vii)測(cè)量以下一種或多種：細(xì)胞的增殖，細(xì)胞的分化，一種或多種蛋白標(biāo)志物的表達(dá)。本發(fā)明人使用了這些方法鑒定能夠結(jié)合tgfβ1的gag(他們稱(chēng)之為hs16)，其中本發(fā)明人的方法中使用的多肽包含rkdlgwkwihepkgyh(seqidno：1)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明人的方法中，包含gag的混合物可以包含合成的糖胺聚糖。然而，從細(xì)胞或組織獲得的gag是優(yōu)選的。包含gag的混合物優(yōu)選為硫酸乙酰肝素制劑，例如hspm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，gag是硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素或gag組分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一系列常規(guī)分離步驟(例如陰離子交換色譜法)從組織或細(xì)胞樣品或提取物中提取。gag混合物可以包含不同類(lèi)型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括硫酸葡聚糖，硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素。優(yōu)選地，與固體支持物接觸的gag混合物是硫酸乙酰肝素富集的。可以通過(guò)對(duì)gag混合物進(jìn)行柱層析來(lái)獲得硫酸乙酰肝素富集的gag級(jí)分，例如，弱，中或強(qiáng)陰離子交換色譜，以及強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜(sax-hplc)，選擇適當(dāng)?shù)募?jí)分。收集的gag可進(jìn)行進(jìn)一步分析以鑒定gag，例如，確定gag組成或序列，或確定gag的結(jié)構(gòu)特征。gag結(jié)構(gòu)通常是高度復(fù)雜的，并且考慮到當(dāng)前可用的分析技術(shù)，在大多數(shù)情況下不可能精確測(cè)定gag序列結(jié)構(gòu)。然而，收集的gag分子可以進(jìn)行部分或完全糖消化(例如通過(guò)亞硝酸化學(xué)地，或用裂解酶例如肝素酶iii酶促地)以產(chǎn)生既是gag的特征性又是診斷性的糖片段。特別地，可以通過(guò)消化到二糖(或四糖)來(lái)測(cè)量所獲得的每種二糖的百分比，其將提供gag的特征性二糖“指紋”。還可以確定gag的硫酸化模式，并用于測(cè)定gag結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于硫酸乙酰肝素，在氨基糖和c2，c3和c6位置處的硫酸化模式可以用于表征硫酸乙酰肝素。二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可以與其它分析技術(shù)例如hplc、質(zhì)譜法和nmr結(jié)合使用，這些分析技術(shù)可以各自為gag提供獨(dú)特的譜圖。組合起來(lái)，這些技術(shù)可以提供gag的確定的結(jié)構(gòu)表征。例如，hs16的1hnmr譜與總hs制備物例如hspm(從其可能衍生出hs16)和hs16相比較顯示在圖7中。根據(jù)本發(fā)明的hs16可具有對(duì)應(yīng)于圖7的hs16譜圖的1hnmr譜。gag和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的高親和力結(jié)合相互作用表明gag含有有助于高親和力結(jié)合相互作用的特異性糖序列。另一步驟可以包括參與結(jié)合相互作用的gag完全或部分糖序列、或gag關(guān)鍵部分的測(cè)定。gag-多肽(例如hs-多肽)復(fù)合物可以用裂解糖胺聚糖鏈的試劑例如裂解酶進(jìn)行處理。裂解酶處理可切割結(jié)合的gag中未參與與多肽的結(jié)合相互作用的部分。參與與多肽結(jié)合相互作用的gag部分可以被保護(hù)免受裂解酶作用。除去裂解酶后，例如在洗滌步驟之后，保持與多肽結(jié)合的gag分子代表多肽的特異性結(jié)合配偶體(“gag配體”)。由于較短gag分子的較低復(fù)雜度，在gag配體解離和收集之后，可以預(yù)期gag配體的較高程度的結(jié)構(gòu)表征。例如，任何糖序列(即gag配體中包含的單糖的初級(jí)(線(xiàn)性)序列)、硫酸化模式、二糖和/或四糖消化分析、nmr譜、質(zhì)譜譜圖和hplc譜的組合可以提供高水平的gag配體結(jié)構(gòu)表征。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“富集”、“富含”、“富”(‘enriching’,‘enrichment’,‘enriched’)等描述了一種過(guò)程(或狀態(tài))，其中混合物的相對(duì)組成以(或者已經(jīng)以)這樣的方式改變：一個(gè)或多個(gè)所述實(shí)體在混合物中的分?jǐn)?shù)(fraction)增加，而一個(gè)或多個(gè)其他的實(shí)體在混合物中的分?jǐn)?shù)減小。通過(guò)富集分離的gag可以是純的，即基本上僅含有一種類(lèi)型的gag，或者可以仍然是不同類(lèi)型gag的混合物，該混合物相對(duì)于起始混合物具有更高比例的結(jié)合肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定gag。優(yōu)選地，當(dāng)與其中表達(dá)或包含含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白的細(xì)胞或組織接觸時(shí)，hs16表現(xiàn)出功能效應(yīng)。功能效應(yīng)可以是調(diào)節(jié)或增強(qiáng)效應(yīng)。功能效應(yīng)可以是促進(jìn)(刺激)某種類(lèi)型的細(xì)胞的增殖，或一種細(xì)胞類(lèi)型分化成另一種，或一種或多種蛋白標(biāo)志物的表達(dá)。例如，hs16可以促進(jìn)干細(xì)胞分化為專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞類(lèi)型(例如間充質(zhì)干細(xì)胞分化為結(jié)締組織)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)效應(yīng)”被理解為是指第一實(shí)體對(duì)第二實(shí)體具有的效果，其中，第二實(shí)體在另一個(gè)或多個(gè)過(guò)程中的正常功能由于第一實(shí)體的存在而被修改。調(diào)節(jié)作用可以是激動(dòng)的或拮抗的。調(diào)節(jié)效應(yīng)可以是增強(qiáng)效應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)效應(yīng)”被理解為意指增加效力的效果。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)效應(yīng)”是指第一實(shí)體對(duì)第二實(shí)體具有的效果，該效果可增加該第二實(shí)體在另一個(gè)或多個(gè)過(guò)程中的效力。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)效應(yīng)被理解為是指分離的gag對(duì)肝素結(jié)合因子的作用，其中所述作用增加所述肝素結(jié)合因子的效力。如本文所使用的，“接觸”的過(guò)程涉及使兩個(gè)或更多個(gè)離散的實(shí)體物理上親密接近?！敖佑|”的過(guò)程包括使兩個(gè)或更多個(gè)離散實(shí)體親密接近，接近的時(shí)間和條件足以允許這兩個(gè)或更多個(gè)離散實(shí)體的一部分在分子水平上相互作用。優(yōu)選地，如本文所使用的，“接觸”的過(guò)程包括使具有一種或多種gag的(多種)化合物的混合物和對(duì)應(yīng)于肝素結(jié)合因子的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽親密接近?！敖佑|”過(guò)程的實(shí)例包括混合，溶解，膨脹，洗滌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，gag混合物和多肽的“接觸”足以在彼此顯示高親和力的gag和多肽之間形成復(fù)合物，復(fù)合物可以是共價(jià)的但優(yōu)選非共價(jià)的。多肽可以包含具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選定蛋白的全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的一級(jí)氨基酸序列。由于可能發(fā)生在較長(zhǎng)多肽中的折疊，導(dǎo)致可能的來(lái)自gag混合物的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的掩蔽，因此優(yōu)選多肽是短的。優(yōu)選地，多肽具有包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域或由肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的氨基酸序列，并且任選地在肽的n-和c-末端中的一個(gè)或兩個(gè)末端包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸。這些額外的氨基酸可以使得能夠向多肽添加連接多肽到固體支持物所需的接頭或連接分子(例如標(biāo)簽如生物素)。在本發(fā)明人的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，除了肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸數(shù)目，多肽含有不超過(guò)1-20個(gè)，更優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1-5個(gè)額外氨基酸，例如在c-和/或n-末端的一個(gè)或兩個(gè)上的任意1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80％，更優(yōu)選至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。為了將多肽粘附到固體支持物的表面，優(yōu)選修飾多肽以使其包括分子標(biāo)簽，并且修飾固體支持物的表面以摻入對(duì)分子標(biāo)簽具有高親和力的相應(yīng)分子探針，即分子標(biāo)簽和探針形成結(jié)合對(duì)。標(biāo)簽和/或探針可以選自以下任一種：抗體，細(xì)胞受體，配體，生物素，這些結(jié)構(gòu)的任何片段或衍生物，前述的任何組合，或可以設(shè)計(jì)或構(gòu)造探針以與其結(jié)合或以其他方式特異性連接的任何其他結(jié)構(gòu)。適合用作標(biāo)簽和探針的優(yōu)選結(jié)合對(duì)是生物素和親和素。多肽衍生自目標(biāo)蛋白，在本申請(qǐng)中是tgfβ1?！把苌浴笔侵付嚯氖沁x擇、挑選或制備的，因?yàn)槠浜写嬖谟谀繕?biāo)蛋白中的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可以從出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中的氨基酸序列進(jìn)行修飾，例如，以研究肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列的變化對(duì)gag結(jié)合的影響。在本說(shuō)明書(shū)中，所述蛋白是tgfb1。優(yōu)選的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是rkdlgwkwihepkgyh(seqidno：1)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，特定多肽的氨基酸序列的微小變化可以允許該部分的固有功能保持。還理解，肽內(nèi)的某些氨基酸殘基用等排和/或等電子的其他氨基酸殘基取代可以保持或改善未取代的肽的某些性質(zhì)。這些變化也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，氨基酸丙氨酸有時(shí)可以替代氨基酸甘氨酸(反之亦然)同時(shí)仍然保持肽的一種或多種性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“等排的”是指兩個(gè)實(shí)體之間的空間相似性。在中等升高的溫度下為等排的部分的兩個(gè)實(shí)例是異丙基和叔丁基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“等電子”是指兩個(gè)實(shí)體之間的電子相似性，一個(gè)實(shí)例是其中兩個(gè)實(shí)體具有相同或相似pka的功能。對(duì)應(yīng)于肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以是合成的或重組的。固體支持物可以是具有分子可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵直接或間接連接的表面的任何基材。固體支持物可以包括能夠?yàn)檫B接到表面的探針提供物理支持的任何基底材料。它可以是基質(zhì)支持。該材料通常能夠耐受與探針與表面的附著以及在進(jìn)行測(cè)定期間遇到的任何后續(xù)處理、操作或加工相關(guān)的條件。材料可以是天然存在的，合成的或天然存在材料的改性。固體支持物可以是塑料材料(包括聚合物，例如聚氯乙烯，環(huán)烯烴共聚物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，聚四氟乙烯(ptfe或)，尼龍，聚(丁酸乙烯酯))等，其單獨(dú)使用，或與其它材料結(jié)合使用?？梢钥紤]附加的剛性材料，例如玻璃，包括二氧化硅，并且還包括例如，可作為bioglass獲得的玻璃?？梢允褂玫钠渌牧习ǘ嗫撞牧?，例如可控孔徑玻璃珠。還考慮了本領(lǐng)域已知的能夠具有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)例如任何氨基、羧基、硫醇或羥基官能團(tuán)(例如)摻入其表面的任何其它材料。優(yōu)選的固體支持物包括柱，所述柱具有固定在柱表面上的多肽。所述表面可以是柱的壁，和/或可以由填充到柱的中心空間中的玻璃珠提供。多肽可以固定在固體支持物上。固定方法的實(shí)例包括：吸附，共價(jià)結(jié)合，包埋和膜限制。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽和基質(zhì)之間的相互作用是基本上永久的。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽和基質(zhì)之間的相互作用是適當(dāng)?shù)貙?duì)離子交換色譜惰性的。在優(yōu)選的設(shè)置中，多肽附著于固體支持物的表面。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員將具有大量選項(xiàng)以從中選擇以將兩個(gè)實(shí)體彼此化學(xué)地和/或物理地附著。這些選擇均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的設(shè)置中，通過(guò)生物素與鏈霉親和素的相互作用，將多肽吸附到固體支持物上。在該設(shè)置的代表性實(shí)例中，生物素分子與多肽共價(jià)鍵合，從而生物素-多肽綴合物與鏈霉親和素結(jié)合，鏈霉親和素又已經(jīng)與固體支持物共價(jià)鍵合。在另一種設(shè)置中，間隔子或接頭部分可用于將生物素分子與多肽，和/或鏈霉親和素與基質(zhì)進(jìn)行連接。通過(guò)使gag混合物與固體支持物接觸，形成gag-多肽復(fù)合物。通過(guò)從固體載體上除去混合物的剩余部分，例如通過(guò)洗滌固體支持物以洗脫未結(jié)合的材料，將這些(復(fù)合物)與混合物的剩余部分分離。當(dāng)使用柱作為固體支持物時(shí)，可以從柱上洗脫gag混合物的非結(jié)合成分，留下與柱結(jié)合的gag-多肽復(fù)合物。應(yīng)當(dāng)理解，某些寡糖可以以非特異性方式與多肽相互作用。在某些實(shí)施方案中，以非特異性方式與多肽相互作用的寡糖可以包括在富含一種或多種gag(所述gag調(diào)節(jié)肝素結(jié)合因子的作用)的化合物的混合物中，或從中排除。非特異性相互作用的實(shí)例是臨時(shí)限制在適當(dāng)大小和/或形狀的分子囊中。此外，應(yīng)當(dāng)理解，這些寡糖可以比根本不顯示與肽的相互作用的那些寡糖更慢地洗脫。此外，應(yīng)當(dāng)理解，非特異性結(jié)合的化合物可以不需要輸入相同的外部刺激以使它們像以特異性方式(例如通過(guò)離子相互作用)結(jié)合的那些化合物那樣洗脫。本發(fā)明人的方法能夠?qū)⒐烟腔旌衔锓蛛x成該混合物的下列組分：以高親和力方式結(jié)合多肽；以低親和力方式結(jié)合多肽；和不結(jié)合多肽的組分。這些命名在操作上針對(duì)每個(gè)gag-肽對(duì)進(jìn)行定義。通過(guò)改變固體支持物表面上(gag和多肽的結(jié)合在這里發(fā)生)存在的條件(例如鹽濃度)，可以選擇對(duì)肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有最高親和力和/或特異性的gag。因此可以獲得對(duì)感興趣的蛋白和/或感興趣蛋白的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有高結(jié)合親和力的gag。結(jié)合親和力(kd)可以選自以下之一：小于10μm，小于1μm，小于100nm，小于10nm，小于1nm，小于100pm。通過(guò)所述方法獲得的hs16可以用于體外和/或體內(nèi)的一系列應(yīng)用中?？梢蕴峁﹉s16用于在體外的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中或在體內(nèi)的細(xì)胞或組織中刺激或抑制細(xì)胞或組織生長(zhǎng)和/或增殖和/或分化。hs16可以作為用于這種目的的制劑提供。例如，可以提供包含hs16的培養(yǎng)基?？梢允占趆s16存在下從體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中獲得的細(xì)胞或組織并植入需要治療的人或動(dòng)物患者中。因此可以提供細(xì)胞和/或組織的植入方法，該方法包括以下步驟：(a)與hs16接觸體外培養(yǎng)細(xì)胞和/或組織；(b)收集所述細(xì)胞和/或組織；(c)將所述細(xì)胞和/或組織植入需要治療的人或動(dòng)物對(duì)象中。細(xì)胞可以與hs16接觸在(a)步驟中培養(yǎng)足以允許細(xì)胞或組織生長(zhǎng)、增殖或分化的一段時(shí)間。例如，所述時(shí)間段可以選自：至少5天，至少10天，至少20天，至少30天或至少40天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hs16可以配制用于醫(yī)學(xué)治療方法中，包括預(yù)防或治療損傷或疾病?？梢蕴峁┌琱s16和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或佐劑的藥物組合物或藥物?？梢蕴峁┻@樣的藥物組合物或藥物用于預(yù)防或治療損傷或疾病。還提供了hs16在制備用于預(yù)防或治療損傷或疾病的藥物中的用途。任選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和藥物還可以含有具有結(jié)合gag的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的感興趣蛋白(即tgfβ1)。在另外的實(shí)施方案中，藥物組合物和藥物可以進(jìn)一步包含干細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞。損傷或疾病的預(yù)防或治療可包括增強(qiáng)，修復(fù)，再生或替換細(xì)胞或組織，例如結(jié)締組織(例如骨，軟骨，肌肉，脂肪，腱，韌帶)，包括皮膚。對(duì)于組織的修復(fù)，包含hs16的藥物組合物或藥物可以直接施用于損傷或疾病部位，從而刺激新組織的生長(zhǎng)，增殖和/或分化，以實(shí)現(xiàn)損傷的修復(fù)或治愈或緩解(例如緩解癥狀)疾病狀況。可以通過(guò)在藥物組合物或藥物中組合干細(xì)胞來(lái)改善組織的修復(fù)或再生。一些用途可包括將hs16應(yīng)用于皮膚作為皮膚修復(fù)或復(fù)原的一部分。這可以是治療和/或美容應(yīng)用，涉及皮膚屏障的修復(fù)和/或復(fù)原，和/或改善皮膚的外觀(guān)。例如，hs16可以施用于皮膚以修復(fù)、復(fù)原和/或改善燒傷或其它瘢痕的外觀(guān)。對(duì)于組織的替換，hs16可以在細(xì)胞和/或組織的體外培養(yǎng)期間與細(xì)胞和/或組織接觸，以便產(chǎn)生細(xì)胞和/或組織用于在患者的損傷或疾病部位植入。細(xì)胞或組織的植入可用于通過(guò)替換損傷或患病組織來(lái)實(shí)現(xiàn)患者中損傷或患病組織的修復(fù)。這可能涉及切除損傷/患病組織和植入通過(guò)培養(yǎng)與hs16接觸的細(xì)胞和/或組織而制備的新組織。因此，根據(jù)本發(fā)明的藥物和化妝品組合物和藥物可以包含以下之一：(a)hs16；(b)hs16與干細(xì)胞的組合；(c)hs16與含有被hs16結(jié)合的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，rkdlgwkwihepkgyh)的蛋白的組合；(d)hs16與干細(xì)胞和含有被hs16結(jié)合的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如rkdlgwkwihepkgyh)的蛋白的組合；(e)從與hs16接觸培養(yǎng)的細(xì)胞或組織的獲得的組織或細(xì)胞。hs16可以用于身體組織，特別是結(jié)締組織的修復(fù)或再生。因此，hs16可用于預(yù)防或治療結(jié)締組織中的或者對(duì)于結(jié)締組織的多種疾病和損傷。hs16在組織的修復(fù)、再生或替換中的使用可涉及在傷口愈合中的用途，例如，加速傷口愈合，瘢痕或骨組織的愈合和組織移植。在一些方面，本發(fā)明涉及包括施用hs16的美容治療。此處所述的“美容”是非治療性的。所述的美容治療可以用于改善皮膚的外觀(guān)和/或質(zhì)地。在一些方面，本發(fā)明涉及美容治療的方法，其包括施用hs16。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“美容方法”不包括通過(guò)手術(shù)或治療在人體或動(dòng)物體上進(jìn)行處理的方法，或根據(jù)epc第53(c)條的在人或動(dòng)物體上實(shí)施的診斷方法。在美容方法中，對(duì)象不需要治療性地施用hs16。本發(fā)明還提供了包含hs16的化妝品組合物。該組合物可用于改善皮膚的外觀(guān)?；瘖y品組合物可以類(lèi)似于藥物組合物配制，如下所述?？梢韵?qū)ο笫┯妹廊萦行Я康膆s16。也就是說(shuō)，有效誘導(dǎo)美容有益效果的hs16的量。這在相關(guān)從業(yè)者的合理判斷范圍內(nèi)，相關(guān)從業(yè)者將理解，活性化合物或含有活性化合物的組合物的合適劑量可根據(jù)對(duì)象而不同。在另一方面，本發(fā)明提供了包含hs16的生物支架。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物支架可用于矯形，血管，假體，皮膚和角膜應(yīng)用。本發(fā)明提供的生物支架包括延長(zhǎng)釋放藥物遞送裝置，組織瓣膜，組織瓣膜小葉，藥物洗脫支架，人造血管，傷口愈合或皮膚移植物以及矯形假體如骨，韌帶，腱和軟骨。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于組織修復(fù)或再生的試劑盒，所述試劑盒包含(i)預(yù)定量的hs16和(ii)預(yù)定量的tgfβ1。hs16可以以其藥學(xué)上可接受的鹽施用于對(duì)象。例如，本發(fā)明的富集混合物的化合物的堿式鹽包括但不限于與藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，例如鈉，鉀，鋰，鈣，鎂，銨和烷基銨形成的那些。本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括陽(yáng)離子鹽，例如鈉鹽或鉀鹽。應(yīng)當(dāng)理解，帶有羧酸基團(tuán)的本發(fā)明化合物可以以可給藥的前藥的形式遞送，其中酸部分被酯化(從而具有-co2r’的形式)。術(shù)語(yǔ)“前藥”特別涉及-or’基團(tuán)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為-oh基團(tuán)或由其得來(lái)的羧酸根陰離子。因此，本發(fā)明的前藥可以起到增強(qiáng)藥物吸附和/或藥物遞送到細(xì)胞中的作用。前藥的體內(nèi)轉(zhuǎn)化可以通過(guò)細(xì)胞酶例如脂肪酶和酯酶或通過(guò)化學(xué)裂解例如體內(nèi)酯水解來(lái)促進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明方面的藥物以及藥物和化妝品組合物可以配制用于通過(guò)多種途徑施用，包括但不限于在疾病或損傷部位注射。藥物和組合物可以配制成流體或固體形式。流體制劑可以配制用于通過(guò)注射施用到人或動(dòng)物體的選定區(qū)域。施用可以是“治療有效量”，這足以顯示對(duì)個(gè)體的益處。實(shí)際施用的量，施用的速率和時(shí)間過(guò)程將取決于所治療的損傷或疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方，例如，劑量的決定等，在一般醫(yī)師和其他醫(yī)療人員的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通?？紤]待治療的疾病，個(gè)體患者的狀況，遞送部位，施用方法和醫(yī)師已知的其它因素。上述技術(shù)和方案的實(shí)例可以在以下文獻(xiàn)找到：remington’spharmaceuticalsciences，第20版，2000，lippincott,williams&wilkins出版。干細(xì)胞與hs16接觸的細(xì)胞包括干細(xì)胞。hs16可用于干細(xì)胞的增殖和/或分化，和/或干細(xì)胞的譜系提交(lineage-commitment)。本文培養(yǎng)和描述的干細(xì)胞可以是任何種類(lèi)的干細(xì)胞。它們可以是全能的，多能的或?qū)Ｄ艿?。它們可以是胚胎干?xì)胞或來(lái)自任何組織的成體干細(xì)胞，并且可以是造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，其為成體干細(xì)胞。在本說(shuō)明書(shū)中，干細(xì)胞是指具有以下能力的任何細(xì)胞類(lèi)型：分裂(即自我更新)并保持全能、多能或?qū)Ｄ懿a(chǎn)生特化的細(xì)胞。在本發(fā)明中培養(yǎng)的干細(xì)胞可以從現(xiàn)有培養(yǎng)物或直接從任何成體、胚胎或胎兒組織(包括血液，骨髓，皮膚，上皮細(xì)胞或臍帶(一種通常被丟棄的組織))獲得或衍生。干細(xì)胞的專(zhuān)能性可以通過(guò)使用合適的測(cè)定法來(lái)確定。這樣的測(cè)定可以包括檢測(cè)一種或多種多能性標(biāo)記，例如，堿性磷酸酶活性，檢測(cè)runx2，osterix，膠原i，ii，iv，vii，x，骨橋蛋白，骨鈣蛋白，bspii，聚集蛋白聚糖，albp，ccaat/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α(c/ebpα)，脂肪細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白(albp)，堿性磷酸酶(alp)，骨涎蛋白2，(bspii)，膠原蛋白2a1(col2a1)和sox9。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)，即，能夠分化成結(jié)締組織和/或骨細(xì)胞，例如軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)微創(chuàng)技術(shù)容易地從骨髓獲得，并且可以在培養(yǎng)中擴(kuò)增并允許分化成期望的譜系。分化可以通過(guò)應(yīng)用特定的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgf-β)超家族成員蛋白例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)是間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成和成骨分化的重要因素。間充質(zhì)干細(xì)胞可以使用來(lái)自cd34+級(jí)分的選擇性標(biāo)記例如stro-1(表明它們的骨髓再生潛力)來(lái)分離和檢測(cè)。這些細(xì)胞表面標(biāo)記物僅存在于間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面上，并且是細(xì)胞多能性的指示。合適的間充質(zhì)干細(xì)胞可以從骨髓抽吸物收集的骨髓單核細(xì)胞(bmmnc)獲得或衍生(例如wexler等，adultbonemarrowisarichsourceofhumanmesenchymal‘stem’cellsbutumbilicalcordandmobilizedadultbloodarenot.haemopoiesisandleucocytesbritishjournalofhaematology121(2):368-374,april2003.)，或從臍帶的沃頓膠質(zhì)(wharton’sjelly)(例如ta等，long-termexpansionandpluripotentmarkerarrayanalysisofwharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcells.stemcellsdev.2009july20(epub))獲得或衍生。間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)多能干細(xì)胞(例如人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)的分化而獲得，所述分化通過(guò)應(yīng)用合適的分化因子進(jìn)行，如本領(lǐng)域熟知的。間充質(zhì)干細(xì)胞是專(zhuān)能祖細(xì)胞，具有產(chǎn)生軟骨、骨、肌肉、腱、韌帶和脂肪組分的能力。這些原始的祖細(xì)胞在出生后存在并表現(xiàn)出干細(xì)胞特征，即低發(fā)生率和廣泛的更新潛力。這些性質(zhì)與它們的發(fā)育可塑性結(jié)合已經(jīng)引發(fā)了對(duì)將它們用于替換受損組織的潛在用途的極大興趣。本質(zhì)上，可以培養(yǎng)這些干細(xì)胞以擴(kuò)增它們的數(shù)量，然后移植到損傷部位或接種在支架中/上之后產(chǎn)生適當(dāng)?shù)慕M織構(gòu)建體。因此，用于骨骼、肌肉、腱、韌帶和血液修復(fù)/再生的替代方法是合適的祖細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞，軟骨細(xì)胞)的選擇、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)，組合以傳導(dǎo)或誘導(dǎo)性支架以支持和引導(dǎo)再生，以及合適的選擇特定的組織生長(zhǎng)因子。干細(xì)胞可以從任何動(dòng)物或人獲得，例如，非人動(dòng)物如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他嚙齒動(dòng)物(包括來(lái)自任何嚙齒目的動(dòng)物的細(xì)胞)，貓，狗，豬，綿羊，山羊，牛，馬，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或其他非人脊椎動(dòng)物生物；和/或非人哺乳動(dòng)物；和/或人。優(yōu)選地，它們是人的。可選地，它們是非人的。任選地，它們是非胚胎干細(xì)胞。任選地，它們不是全能的。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含通過(guò)本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的干細(xì)胞或其它細(xì)胞、或其片段或產(chǎn)物的藥物組合物。該藥物組合物可用于醫(yī)療方法。合適的藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，佐劑或稀釋劑。在本發(fā)明的另一方面，通過(guò)本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的干細(xì)胞或其它細(xì)胞可用于醫(yī)學(xué)治療的方法中，優(yōu)選地，提供了醫(yī)學(xué)治療的方法，所述方法包括向需要治療的個(gè)體施用治療有效量的所述藥物或藥物組合物。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法和技術(shù)獲得的干細(xì)胞和其它細(xì)胞可以用于分化成為用于醫(yī)學(xué)治療方法的另一種細(xì)胞類(lèi)型。因此，分化的細(xì)胞類(lèi)型可以衍生自通過(guò)所述培養(yǎng)方法和技術(shù)獲得的干細(xì)胞(所述干細(xì)胞隨后被允許分化)并且可以被認(rèn)為是其產(chǎn)物?？梢蕴峁┌@樣的分化細(xì)胞，任選地與藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑一起的藥物組合物。該藥物組合物可用于醫(yī)療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)最初從骨髓中分離，并且在104-105個(gè)總骨髓單核細(xì)胞(bmmnc)中僅存在1個(gè)(friedenstein等人，1966)。這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生源自單細(xì)胞前體的克隆，被稱(chēng)為cfu-f(集落形成單位成纖維細(xì)胞)群。現(xiàn)在已經(jīng)在許多其它組織中鑒定了msc，包括脂肪組織(gimble和guilak2003；zuk等2001)，臍帶血(bieback等，2004；erices等，2000；goodwin等，2001；kogler等，2004；wagner等，2005)和肌肉(jiang等，2002)。專(zhuān)能人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(msc)的最低標(biāo)準(zhǔn)已由國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(dominici等，cytotherapy(2006)vol.8，no.4,315-317)闡述。他們提出三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義人msc：對(duì)塑料的粘附性，特異性表面抗原表達(dá)和專(zhuān)能分化潛力。特別地，他們指出“首先，當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下使用組織培養(yǎng)瓶維持時(shí)，msc必須是塑料粘附的。第二，≥95％的msc群體必須表達(dá)cd105，cd73和cd90，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)量的。此外，這些細(xì)胞必須缺少cd45，cd34，cd14或cd11b，cd79α或cd19和hlaii類(lèi)(hla-dr)的表達(dá)(≤2％陽(yáng)性)。第三，細(xì)胞必須能夠在標(biāo)準(zhǔn)體外分化條件下分化成成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。dominici等人還指出，最獨(dú)特地鑒定msc的生物學(xué)特性是它們使用標(biāo)準(zhǔn)的體外組織培養(yǎng)-分化條件三系間充質(zhì)分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的能力。他們證實(shí)，通過(guò)用茜素紅染色或vonkossa染色可以證明分化成骨細(xì)胞，通過(guò)用油紅o染色可以最容易地證明脂肪細(xì)胞分化，并且可以通過(guò)用阿爾新藍(lán)染色或用于ii型膠原的免疫組織化學(xué)染色來(lái)證明成軟骨細(xì)胞分化。dominici等人指出用于這種測(cè)定的試劑盒是可商購(gòu)的，并且證明分化對(duì)于所有研究者都是可行的。dominici等人還認(rèn)識(shí)到，未來(lái)可能可以鑒定新的表面標(biāo)志物，其也可以用于定義人類(lèi)msc?，F(xiàn)在已知三種這樣的標(biāo)記：cd49a,ssea-4和stro-1。rider等報(bào)道與未分選的細(xì)胞相比，cd49a+克隆具有增強(qiáng)的cd90和cd105的表達(dá)，并且證明與未分選的細(xì)胞相比，cd49a+克隆容易多系分化成脂肪、骨和軟骨，支持使用α-1整聯(lián)蛋白(cd49a)選擇用于富集間充質(zhì)干細(xì)胞，并提供了從骨髓單核干細(xì)胞的異質(zhì)池中選擇最專(zhuān)能細(xì)胞的策略(rider等人，j.mol.hist(2007)38：449-458)。rider等人還報(bào)道了cfu-f細(xì)胞與cd49a的表達(dá)相關(guān)，表達(dá)cd49a的cfu-f細(xì)胞也共表達(dá)stro-1，并且除了人以外，cd49a可用于從大鼠和小鼠中分離msc，表明它可以是用于富集的保守標(biāo)記。gang等人報(bào)道，階段特異性胚胎抗原ssea-4(通常用作未分化的多能人胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物)以及分裂到胚泡期胚胎也鑒定了成年人間充質(zhì)干細(xì)胞群體并且可以用于分離msc(gang等，blood2007；109：1743-1751)。gang等人還描述了用結(jié)合表面標(biāo)志物stro-1的單克隆抗體來(lái)富集促克隆形成基質(zhì)細(xì)胞(cfu-f)——所謂的stro-1+bright。糖胺聚糖如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糖胺聚糖”和“gag”可互換使用，并且被理解為指包含寡糖的分子的大集合，其中這些結(jié)合糖中的一個(gè)或多個(gè)具有氨基取代基或其衍生物。gag的實(shí)例是硫酸軟骨素，硫酸角質(zhì)素，肝素，硫酸皮膚素，透明質(zhì)酸鹽和硫酸乙酰肝素。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“gag”也延伸到涵蓋作為gag綴合物的那些分子。gag綴合物的實(shí)例是蛋白糖胺聚糖(pgag，蛋白多糖)，其中肽組分與寡糖組分共價(jià)結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，gag是硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素(hs)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)代表一高度多樣化的蛋白聚糖亞組，由共價(jià)連接到蛋白質(zhì)主鏈的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖側(cè)鏈組成。核心蛋白以三種主要形式存在：被稱(chēng)為基底膜聚糖的分泌形式，錨定在質(zhì)膜中被稱(chēng)為磷脂酰肌醇聚糖的形式，和被稱(chēng)為粘結(jié)蛋白聚糖的跨膜形式。它們是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面和大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的普遍存在的成分。還存在其他蛋白例如集聚蛋白或淀粉樣蛋白前體蛋白，其中hs鏈可以連接到較不常見(jiàn)的核上。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及與其核心蛋白分離的hs鏈。hs鏈可以容易地與核心蛋白分開(kāi)和分離，例如，通過(guò)神經(jīng)酰胺酶處理?！傲蛩嵋阴８嗡亍?“硫酸乙酰肝素”或“hs”)最初在高爾基體中合成為由d-葡萄糖醛酸(glca)和n-乙酰基-d-葡糖胺(glcnac)的串聯(lián)重復(fù)組成的多糖。新生多糖可以隨后在一系列步驟中進(jìn)行修飾：glcnac的n-脫乙酰化/n-硫酸化，glca至艾杜糖醛酸(idoa)的c5差向異構(gòu)化，idoa和glca的c2上的o-硫酸化，n-磺基葡萄糖胺(glcns)的c6上的o-硫酸化和glcns的c3偶然o-硫酸化。hs的n-脫乙?；?n-硫酸化，2-o-，6-o-和3-o-硫酸化分別由hsn-脫乙酰酶/n-磺基轉(zhuǎn)移酶(hsndst)，hs2-o-磺基轉(zhuǎn)移酶(hs2st)，hs6-o-磺基轉(zhuǎn)移酶(hs6st)和hs3-o-磺基轉(zhuǎn)移酶的特異作用介導(dǎo)。在每個(gè)修飾步驟中，僅修飾一部分潛在底物，導(dǎo)致相當(dāng)大的序列多樣性。hs的這種結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得難以確定其序列并理解hs結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。乙酰肝素硫酸鹽側(cè)鏈由通過(guò)(1→4)糖苷鍵連接的交替排列的d-葡糖醛酸或l-艾杜糖醛酸和d-葡糖胺組成。葡糖胺通常是n-乙?；騨-硫酸化的，并且糖醛酸和葡萄糖胺都可以另外o-硫酸化。特定hspg對(duì)特定結(jié)合配偶體的特異性是通過(guò)連接到葡糖胺和糖醛酸的羧基、乙酰基和硫酸酯基團(tuán)的特定模式產(chǎn)生的。與肝素相反，硫酸乙酰肝素含有較少的n-和o-硫酸基團(tuán)和更多的n-乙酰基。硫酸乙酰肝素側(cè)鏈通過(guò)四糖鍵連接子(-葡萄糖醛酸基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→4)-木糖基-β-1-o-(絲氨酸))區(qū)域連接到核心蛋白的絲氨酸殘基。硫酸乙酰肝素鏈和核心蛋白均可能經(jīng)歷一系列可能最終影響其生物活性的修飾。已經(jīng)認(rèn)為hs的復(fù)雜性超過(guò)核酸的復(fù)雜性(lindahl等人，1998，j.biol.chem.273,24979；sugahara和kitagawa，2000，curr.opin.struct.biol.10,518)。hs種類(lèi)的變化來(lái)自糖殘基的非隨機(jī)、高度硫酸化序列的合成，所述糖殘基被含有n-乙?；咸前返亩堑姆橇蛩峄瘏^(qū)域分割。n-乙酰葡糖胺最初轉(zhuǎn)化為n-磺基葡糖胺產(chǎn)生了其它修飾的焦點(diǎn)，包括葡糖醛酸至艾杜糖醛酸的差向異構(gòu)化作用和在葡糖胺或艾杜糖醛酸上的o-硫酸化的復(fù)雜模式。此外，在未修飾的低硫酸化n-乙酰化序列中，己糖醛酸殘基保留為葡糖醛酸，而在高度硫酸化的n-硫酸化區(qū)域中，c-5差向異構(gòu)體艾杜糖醛酸酯占優(yōu)勢(shì)。這限制了在任何給定鏈中可能的二糖變體的數(shù)目，但不限制每一個(gè)的豐度。大多數(shù)修飾發(fā)生在n-硫酸化結(jié)構(gòu)域中或直接與它們相鄰，使得在成熟鏈中存在被低硫酸化結(jié)構(gòu)域分割的高度硫酸化的區(qū)域(brickman等，(1998)，j.biol.chem.273(8)，4350-4359，其通過(guò)引用整體并入本文)。假設(shè)高度可變的硫酸乙酰肝素鏈在調(diào)節(jié)大量細(xì)胞外配體的作用中起關(guān)鍵作用，包括通過(guò)自分泌、并分泌和旁分泌反饋回路的復(fù)雜組合來(lái)調(diào)節(jié)和呈遞生長(zhǎng)和粘附因子至細(xì)胞，從而控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并因而控制干細(xì)胞的分化。例如，即使可以在遺傳上描述硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(alberts等人(1989)garlandpublishing，inc，newyork&london，第804和805頁(yè))，從單一來(lái)源分離的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖類(lèi)可能在生物活性上是不同的。如brickman等人，1998，glycobiology8,463所示，從神經(jīng)上皮細(xì)胞獲得的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的兩個(gè)單獨(dú)的庫(kù)可以特異性激活fgf-1或fgf-2，這取決于促有絲分裂狀態(tài)。類(lèi)似地，硫酸乙酰肝素(hs)與fgf-1或fgf-2相互作用的能力描述于wo96/23003中。根據(jù)該專(zhuān)利申請(qǐng)，能夠與fgf-1相互作用的相應(yīng)的hs可以在胚胎天數(shù)約11至約13天時(shí)從鼠細(xì)胞獲得，而能夠與fgf-2相互作用的hs可在胚胎天數(shù)從約8至約10天獲得。如上所述，hs結(jié)構(gòu)在hs之間是高度復(fù)雜和可變的。實(shí)際上，hs結(jié)構(gòu)的變化被認(rèn)為在促進(jìn)每種hs在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和指導(dǎo)細(xì)胞分化中的不同活性中起重要作用。結(jié)構(gòu)復(fù)雜性被認(rèn)為超過(guò)核酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，并且盡管hs結(jié)構(gòu)可以表征為具有具體和獨(dú)特的硫酸化模式的重復(fù)二糖單元的序列，但是當(dāng)前沒(méi)有相當(dāng)于那些核酸測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序技術(shù)可用于確定hs序列結(jié)構(gòu)。在不存在用于測(cè)定明確的hs序列結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單方法的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)許多分析技術(shù)確認(rèn)和結(jié)構(gòu)表征hs分子。這些包括二糖分析，四糖分析，hplc和分子量測(cè)定中的一種或組合。這些分析技術(shù)是為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和使用的。從hs生產(chǎn)二糖和四糖的兩種技術(shù)包括亞硝酸消化和裂解酶消化。下面僅僅作為示例提供了執(zhí)行這些消化技術(shù)的一種方式的描述，這種描述不限制本發(fā)明的范圍。亞硝酸消化當(dāng)完成時(shí)，硫酸乙酰肝素基于亞硝酸的解聚導(dǎo)致碳水化合物鏈最終降解成其單獨(dú)的二糖組分。例如，亞硝酸可以通過(guò)以下方法制備：分別在冰上冷卻250μl的0.5mh2so4和0.5mba(no2)215min。冷卻后，ba(no2)2與h2so4合并，并漩渦振蕩，然后離心從而除去硫酸鋇沉淀。125μl的hno2加入到在20μl的h2o中重懸的gag樣品中，漩渦振蕩后在25℃下孵育15min，偶爾混合。孵育后，1mna2co3加入到樣品中，將樣品調(diào)節(jié)至ph6。然后，100μl的0.25mnabh4的0.1mnaoh溶液加入到樣品中，混合物加熱到50℃20min。然后冷卻混合物至25℃并加入酸化的冰醋酸調(diào)節(jié)ph至3。然后將混合物用10mnaoh中和，并通過(guò)冷凍干燥減小體積。最終樣品在bio-gelp-2柱上運(yùn)行以分離二糖和四糖，以驗(yàn)證降解程度。裂解酶消化肝素酶iii在葡糖苷酸鍵上切割糖鏈。一系列肝素酶(i，ii和iii)各自通過(guò)在特定的硫酸化識(shí)別位點(diǎn)解聚某些硫酸乙酰肝素序列而顯示相對(duì)特異性的活性。肝素酶i沿著hs鏈切割具有ns區(qū)的hs鏈。這導(dǎo)致硫酸化結(jié)構(gòu)域的破壞。肝素酶iii解聚具有na結(jié)構(gòu)域的hs，導(dǎo)致碳水化合物鏈分離成單獨(dú)的硫酸化結(jié)構(gòu)域。肝素酶ii主要在hs鏈的na/ns“肩”結(jié)構(gòu)域(其中發(fā)現(xiàn)不同的硫酸化模式)中切割。注意：乙酰肝素聚合物的重復(fù)二糖骨架是與氨基糖葡糖胺連接的糖醛酸。“ns”表示氨基糖在氨基上攜帶硫酸酯，使得能夠在c2、c6和c3處的其他基團(tuán)硫酸化?！皀a”表示氨基未被硫酸化并保持乙?；＠?，對(duì)于使用肝素酶iii的na區(qū)中的解聚，在含有20mmtris-hcl，0.1mg/mlbsa和4mmcacl2的ph7.5的緩沖液中制備酶和凍干的hs樣品。純粹作為例子，肝素酶iii可以以5mu/1μghs的劑量加入，在37℃下孵育16h，然后通過(guò)加熱到70℃5min停止反應(yīng)。二糖和四糖可以通過(guò)柱色譜法例如hplc洗脫?；蛘?，它們可以通過(guò)毛細(xì)管電泳分析。軟骨和結(jié)締組織的形成在本發(fā)明的另一方面，提供了促進(jìn)軟骨組織形成(軟骨形成)的方法，包括向軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞施用hs16。刺激或抑制骨形成或軟骨組織形成的方法可以在體外通過(guò)使骨或軟骨前體或干細(xì)胞與hs16接觸而進(jìn)行，任選地在外源添加的tgfβ1蛋白的存在下。前體細(xì)胞或干細(xì)胞可以是間充質(zhì)干細(xì)胞。在促進(jìn)組織形成的情況下，可以收集形成的組織并用于植入人或動(dòng)物患者體內(nèi)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供結(jié)締組織，其中結(jié)締組織通過(guò)在hs16(即外源hs16)存在下、任選地在tgfβ1(即外源性tgfβ1)存在下體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞而獲得。結(jié)締組織可以是骨，軟骨，肌肉，脂肪，韌帶或腱。使用hs16預(yù)防或治療疾病可涉及組織，特別是結(jié)締組織例如骨，軟骨，肌肉，脂肪，韌帶或腱的修復(fù)，再生或替換。在這些組織之一惡化的患者中，將hs16給予惡化部位可以用于刺激該部位處組織的生長(zhǎng)，增殖和/或分化。例如，存在于或接近施用部位的間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激可以導(dǎo)致，優(yōu)選當(dāng)tgfβ1也存在于該部位時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化為合適的結(jié)締組織，從而提供損傷組織的替換/再生和損傷的治療?；蛘?，可以收集從與hs16接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得的結(jié)締組織，并將其植入損傷或疾病部位以替換受損或惡化的組織。受損或惡化的組織可任選地首先從損傷或疾病部位切除。因此，hs16可用于通過(guò)向需要治療的患者直接施用hs16(任選地與tgfβ1和/或干細(xì)胞組合)來(lái)實(shí)現(xiàn)的體內(nèi)傷口愈合，包括組織修復(fù)，再生和/或替換(例如瘢痕組織或斷骨的愈合)。hs16也可用于體外產(chǎn)生適合植入需要組織修復(fù)、再生和/或替換的患者的組織。軟骨組織的修復(fù)和/或再生在一些方面，本發(fā)明涉及hs16的治療用途(人和/或獸醫(yī)的)，以治療或預(yù)防關(guān)節(jié)破壞，軟骨降解，對(duì)軟骨組織的損傷或軟骨組織的損失或退化。在一些實(shí)施方案中，如本文所述通過(guò)施用hs16治療的疾病或病癥可以是與關(guān)節(jié)破壞、軟骨降解、軟骨組織損傷和軟骨組織損失或退化中的一種或多種相關(guān)的疾病或病癥。軟骨退化、損傷或損失可涉及軟骨厚度或體積的減小。作為疾病過(guò)程、生理過(guò)程和/或作為損傷或創(chuàng)傷的結(jié)果，可能發(fā)生關(guān)節(jié)破壞，軟骨降解，軟骨組織損傷和/或軟骨組織的損失或退化。例如，可能由于損傷或創(chuàng)傷而引發(fā)關(guān)節(jié)破壞，軟骨降解，軟骨組織損傷和/或軟骨組織的損失或退化，然后這些過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)可以通過(guò)疾病和/或生理過(guò)程而進(jìn)展。疾病或病癥可以是關(guān)節(jié)炎，任選的創(chuàng)傷或損傷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，年齡相關(guān)的關(guān)節(jié)炎或非年齡相關(guān)的關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎可以是骨關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)疼痛的臨床綜合征，并且關(guān)節(jié)功能降低(例如，僵硬和/或活動(dòng)范圍減小)。癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛，僵硬和移動(dòng)關(guān)節(jié)有問(wèn)題。其可以通過(guò)軟骨局部缺失，骨重塑和/或炎癥在病理學(xué)上表征。最常受關(guān)節(jié)炎影響的關(guān)節(jié)是膝關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)和手和腳中的關(guān)節(jié)，但是其他關(guān)節(jié)也可能受影響。根據(jù)本發(fā)明的方法治療的對(duì)象可能易受關(guān)節(jié)破壞、軟骨降解、軟骨組織損傷和軟骨組織的損失或退化中的一種或多種的影響，即使這些過(guò)程尚未開(kāi)始。對(duì)象可能由于患有與關(guān)節(jié)破壞、軟骨降解、軟骨組織損傷和軟骨組織損失或退化中的一種或多種相關(guān)的疾病或病癥而易受影響。軟骨可能由于物理過(guò)程(例如損傷或創(chuàng)傷)、或機(jī)械磨損和/或生物過(guò)程(例如疾病和生理過(guò)程)而被損壞或降解。物理過(guò)程和生物過(guò)程相互作用以引起軟骨的損失，退化，降解或損傷。例如，損傷或創(chuàng)傷或機(jī)械磨損可引發(fā)軟骨損傷并例如通過(guò)炎癥參與那些影響和加速軟骨的損失、退化、降解或損傷的生物過(guò)程。損傷或創(chuàng)傷可能是跌倒或運(yùn)動(dòng)相關(guān)的損傷或創(chuàng)傷的后果。機(jī)械磨損可能與肥胖和/或重復(fù)動(dòng)作相關(guān)。例如，機(jī)械磨損可以是特定活動(dòng)的結(jié)果，或者與特定職業(yè)相關(guān)聯(lián)。導(dǎo)致軟骨損失，退化，降解或損傷的生物過(guò)程的效應(yīng)子包括蛋白酶，金屬蛋白酶，響應(yīng)于炎癥介質(zhì)上調(diào)的軟骨降解酶，聚集蛋白聚糖酶，膠原酶，adamts-4，adamts-5，mmp3和mmp13。軟骨細(xì)胞的增加的分解代謝活性與導(dǎo)致軟骨的損失，退化，退化或損傷的生物過(guò)程相關(guān)。軟骨細(xì)胞的代謝活性可以通過(guò)例如分析軟骨基因如sox-9，colii，aggrecan，col1和tsg-6的表達(dá)或放射性標(biāo)記的摻入來(lái)測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)隨時(shí)間對(duì)軟骨成像和/或測(cè)量軟骨來(lái)確定軟骨的損失，退化，降解，損傷或維持。軟骨的成像和/或測(cè)量可以在感興趣的部位，例如損傷或創(chuàng)傷部位，或患關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)。軟骨損失，退化，降解或損傷可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法測(cè)定。例如，可以通過(guò)磁共振成像(mri)或通過(guò)關(guān)節(jié)鏡檢查來(lái)確定軟骨中的缺陷(即損傷)或軟骨損失。軟骨損失、退化或降解可以通過(guò)觀(guān)察關(guān)節(jié)中或某位置處減少的軟骨量(相對(duì)于該關(guān)節(jié)中或該位置處先前測(cè)量的軟骨量)來(lái)確定?；蛘?，可以通過(guò)觀(guān)察關(guān)節(jié)中或某位置處軟骨減少的量、厚度或體積(相對(duì)于不經(jīng)歷軟骨損失、退化或降解的同等關(guān)節(jié)或位置)來(lái)確定軟骨損失、退化或降解。關(guān)節(jié)鏡觀(guān)察到的軟骨損傷可根據(jù)國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(icrs)分級(jí)系統(tǒng)分級(jí)，如下：0＝(正常)健康軟骨；1＝軟骨具有軟斑點(diǎn)或水泡2＝在軟骨中可見(jiàn)小的磨損3＝損傷具有深縫隙(超過(guò)軟骨層的50％)4＝軟骨磨損暴露了下面的(軟骨下)骨。2/3級(jí)缺損的軟骨可能具有原纖化或破碎的外觀(guān)。軟骨損傷也可以通過(guò)根據(jù)pritzker等人，osteoarthritiscartilage200614(1)：13-29中描述的骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)國(guó)際(oarsi)分級(jí)系統(tǒng)的組織病理學(xué)進(jìn)行評(píng)估。與軟骨降解相關(guān)的酶或已知在響應(yīng)于軟骨降解時(shí)上調(diào)的基因或酶的表達(dá)和/或活性也可用于確定軟骨的損失，退化，降解，損傷或維持。類(lèi)似地，可以測(cè)定軟骨細(xì)胞的分解代謝活性以研究軟骨的損失，退化，降解，損傷或維持?？梢酝ㄟ^(guò)在關(guān)節(jié)中或某位置處未發(fā)現(xiàn)或僅發(fā)現(xiàn)極小的軟骨損失、退化、退化或損傷(相對(duì)于該關(guān)節(jié)中或該位置處先前測(cè)量的軟骨量)，來(lái)確定由于施用治療有效量的本發(fā)明多肽或多核苷酸而抑制了關(guān)節(jié)破壞或軟骨降解，或預(yù)防或延遲了軟骨組織的降解或損傷或損失，或維持了有效的軟骨組織?；蛘?，可通過(guò)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)中或某位置處軟骨的損失、退化、降解或損傷減少或減慢(相對(duì)于未治療的對(duì)照關(guān)節(jié)或位置)，來(lái)確定抑制關(guān)節(jié)破壞或軟骨降解，或預(yù)防或延遲軟骨組織的降解或損傷或損失，或有效軟骨組織的維持?；虮磉_(dá)，例如，與軟骨損失，退化，降解或損傷相關(guān)的基因的表達(dá)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法來(lái)測(cè)定。例如，可以通過(guò)定量實(shí)時(shí)pcr在樣品中，例如活檢或組織樣品，測(cè)定基因的表達(dá)水平。與軟骨損失相關(guān)的基因包括但不限于編碼蛋白酶，金屬蛋白酶，響應(yīng)于炎癥介質(zhì)上調(diào)的軟骨降解酶，聚集蛋白聚糖酶，膠原酶，adamts-4，adamts-5，mmp3和mmp13。蛋白質(zhì)或酶的表達(dá)或活性水平(例如與軟骨損失，退化，降解或損傷相關(guān)的)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法測(cè)定。例如，可以通過(guò)免疫印跡或elisa在樣品中，例如活檢或組織樣品，測(cè)定蛋白的表達(dá)水平。酶的活性水平可以通過(guò)使用該酶的活性的報(bào)告子測(cè)定在樣品中例如活檢或組織樣品中確定。類(lèi)似地，可以測(cè)定樣品例如活檢或組織樣品中軟骨細(xì)胞的代謝活性。軟骨降解/破壞/損失/損傷和/或關(guān)節(jié)破壞可與與軟骨組織的損失、退化、降解或損傷或者關(guān)節(jié)破壞相關(guān)的疾病或病癥的臨床癥狀相關(guān)聯(lián)，因此這些也可用于研究或估計(jì)軟骨退化/破壞/損失/損傷或關(guān)節(jié)破壞、軟骨細(xì)胞的代謝活性、或軟骨降解酶的表達(dá)和/或活性。骨折在一些方面，本發(fā)明涉及hs16治療骨折的治療用途(人和/或獸醫(yī)的)。骨折是一種醫(yī)學(xué)狀況。在本申請(qǐng)中，“骨折”包括骨骼的損傷或傷害，其中骨骼破裂、斷裂或碎裂。斷裂是指骨骼的不連續(xù)。骨折可以由物理沖擊、或機(jī)械應(yīng)力或由諸如骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎的醫(yī)學(xué)病癥引起。骨折的骨科分類(lèi)包括閉合或開(kāi)放和簡(jiǎn)單或多碎片骨折。在閉合性骨折中，皮膚保持完整，而在開(kāi)放骨折中，骨可通過(guò)傷口部位暴露，這帶來(lái)更高的感染風(fēng)險(xiǎn)。簡(jiǎn)單的骨折沿著單線(xiàn)發(fā)生，傾向于將骨分為兩部分。多碎片骨折將骨分割成多片。其他骨折類(lèi)型包括壓縮性骨折，壓實(shí)骨折，螺旋骨折，完全和不完全骨折，橫向，線(xiàn)性和斜形骨折以及粉碎性骨折。在大多數(shù)對(duì)象中，骨愈合(骨折愈合)自然發(fā)生并且在損傷后開(kāi)始。出血通常導(dǎo)致白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的凝固和吸引，隨后產(chǎn)生膠原纖維。這之后是骨基質(zhì)(鈣羥基磷灰石)沉積(礦化)將膠原基質(zhì)轉(zhuǎn)化成骨。不成熟的再生骨通常比成熟骨弱，隨著時(shí)間的推移，未成熟骨經(jīng)歷重塑過(guò)程以產(chǎn)生成熟的“層狀”骨。完整的骨愈合過(guò)程需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，通常多個(gè)月。其中發(fā)生骨折并且可能受益于使用hs16的治療的骨包括所有骨類(lèi)型，特別是所有哺乳動(dòng)物骨骼，包括但不限于長(zhǎng)骨(例如股骨，肱骨，趾骨)，短骨(例如腕骨，跗骨)扁骨(例如顱骨，肋骨，肩胛骨，胸骨，骨盆帶)，不規(guī)則骨(例如椎骨)，籽骨(例如髕骨)。其中骨折發(fā)生并且可以從使用hs16的治療中受益的骨包括骨架骨(即骨架的任何骨)，顱-面部區(qū)域的骨，軸向骨架的骨(例如椎骨，肋骨)，附肢骨(例如四肢的)，骨盆骨骼(例如骨盆)的骨。其中發(fā)生骨折并且可以從使用hs16的治療中獲益的骨還包括頭部(顱骨)和頸部的骨，包括面部的那些，例如顎，鼻和頰。hs16可以用于在牙齒或面部或顱骨手術(shù)期間輔助骨的修復(fù)或再生，這可以包括重建面部和/或口腔的骨骼(與牙齒不同)，例如，包括顎骨。骨折還包括病理性多孔，例如具有骨質(zhì)疏松癥的對(duì)象所顯示的。盡管不限于本發(fā)明，hs16的主要作用可以在傷口部位內(nèi)、鄰近傷口部位或被引起遷移到傷口部位中的細(xì)胞上，并且可以在傷口床內(nèi)發(fā)現(xiàn)或被引起遷移到傷口床中的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨干細(xì)胞、前成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞上，或在任何輔助細(xì)胞或血管生成細(xì)胞上。提供了hs16和包含hs16的藥物組合物和藥物用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象骨折的方法。治療可以包括在骨中的傷口愈合。治療可涉及骨的修復(fù)，再生和生長(zhǎng)。hs16通過(guò)促進(jìn)新骨生長(zhǎng)而促進(jìn)骨折修復(fù)。hs16提高骨折修復(fù)的速度，使得骨愈合更快地發(fā)生，導(dǎo)致改善的損傷恢復(fù)時(shí)間。治療可以導(dǎo)致改善的骨強(qiáng)度。治療還可包括治療骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎。hs16優(yōu)選施用于骨折周?chē)慕M織。這可以包括直接給予已發(fā)生骨折的骨組織。施用可以是對(duì)圍繞骨或骨折的結(jié)締組織或?qū)拷遣⒐?yīng)骨的脈管系統(tǒng)(例如血管)。可以直接施用到損傷部位，并且可以施用到通過(guò)傷口的初始愈合形成的愈傷組織。根據(jù)本發(fā)明的藥物和藥物組合物可以配制用于通過(guò)多種途徑施用。最優(yōu)選地，hs16配制成用于注射的流體或液體形式。在一些實(shí)施方案中，hs16配制為控釋制劑，例如，在用于植入傷口部位的藥物膠囊中。hs16可以附著、浸漬或浸入載體材料(例如生物材料)，例如納米纖維或可生物降解的紙或織物。包含hs16的藥物組合物，藥物，植入物和假體還可以包含tgf-β1。由于hs16結(jié)合tgf-β1的能力，hs16可以作為tgf-β1的載體，協(xié)助將tgf-β1遞送至傷口部位。施用優(yōu)選以“治療有效量”施用，其與對(duì)應(yīng)的未治療骨折相比足以改善骨折的愈合。實(shí)際施用的量，施用的速率和時(shí)間過(guò)程將取決于骨折的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方，例如，劑量的決定等在一般醫(yī)師和其他醫(yī)療人員的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通?？紤]骨折的性質(zhì)，個(gè)體患者的狀況，遞送部位，施用方法和醫(yī)師已知的其它因素。hs16劑量的單次或多次施用可以根據(jù)開(kāi)處方醫(yī)生的指導(dǎo)施用。純粹作為實(shí)例，hs16可以以至少1ng/ml，更優(yōu)選至少5ng/ml和任選10ng/ml或更多的劑量遞送。個(gè)體hs16劑量可以是小于1mg且大于1μg的級(jí)別，例如約5μg，約10μg，約25μg，約30μg，約50μg，約100μg，約0.5mg或約1mg中的一種。上述技術(shù)和方案的實(shí)例可以在remington’spharmaceuticalsciences，20thedition，2000，pub.lippincott，williams&wilkins中找到。hs16可以用于在其他治療時(shí)治療骨折，例如施用疼痛緩解或抗炎藥物，骨的固定和設(shè)置，例如將損傷的肢體固定在石膏模型中，手術(shù)介入，例如，以重置骨骼或移動(dòng)骨骼以校正位移、角度或脫位。如果需要手術(shù)，hs16可以在外科手術(shù)期間直接施用于(例如施涂于)骨折。生物材料本發(fā)明的藥物組合物和藥物可以采用用hs16涂覆和/或浸漬的生物材料的形式。植入物或假體可以由生物材料形成。這種植入物或假體可以通過(guò)手術(shù)植入以幫助組織再生，組織重構(gòu)和/或組織重塑。hs16可以應(yīng)用于植入物或假體以加速在期望位置處的新組織形成。應(yīng)當(dāng)理解，與蛋白質(zhì)不同，硫酸乙酰肝素是特別強(qiáng)的并且具有好的多的承受制造合成生物支架和應(yīng)用于植入物和假體所需溶劑的能力。生物材料可以用hs16涂覆或浸漬。浸漬可以包括通過(guò)將hs16與生物材料的組成成分混合來(lái)形成生物材料，例如在聚合反應(yīng)中，或者將hs16吸收到生物材料中。涂覆可以包括將hs16吸附到生物材料的表面上。當(dāng)施用或植入對(duì)象時(shí)，生物材料應(yīng)允許涂覆或浸漬的hs16從生物材料中釋放。生物材料釋放動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)改變生物材料的結(jié)構(gòu)例如孔隙率來(lái)改變。除了用hs16涂覆或浸漬生物材料之外，一種或多種生物活性分子可以浸漬或涂覆在生物材料上。例如，選自下組的至少一種：bmp-2，bmp-4，op-1，fgf-1，fgf-2，tgf-β1，tgf-β2，tgf-vegf；膠原；層粘連蛋白；纖連蛋白；玻連蛋白。優(yōu)選可用tgf-β1進(jìn)行浸漬或涂覆。用hs16涂覆或浸漬的生物材料可用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)目的。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可以改善患者的生活質(zhì)量或潛在地延長(zhǎng)動(dòng)物的生命，例如用于育種的有價(jià)值的賽馬。生物材料提供支架或基質(zhì)支持物。生物材料可適于植入組織中，或可適于施用(例如作為溶液中的微膠囊)。植入物或假體應(yīng)是生物相容的，例如，無(wú)毒和低免疫原性(最優(yōu)選非免疫原性的)。生物材料可以是生物可降解的，使得生物材料在傷口愈合發(fā)生時(shí)降解，最終在對(duì)象中僅原位留下再生組織?；蛘?，可以使用不可生物降解的生物材料，例如，以在大的中斷上引導(dǎo)組織再生和/或在愈合期間用作結(jié)構(gòu)支撐，在成功的傷口愈合之后，生物材料的手術(shù)切除是任選的要求。生物材料可以是軟的和/或柔性的，例如，水凝膠，纖維蛋白網(wǎng)或篩，或膠原海綿?！八z”是當(dāng)有機(jī)聚合物(可以是天然或合成的)凝固或固化以形成捕獲水分子或其它溶液并形成凝膠的三維開(kāi)放晶格結(jié)構(gòu)時(shí)形成的物質(zhì)。凝固可以通過(guò)聚集，凝結(jié)，疏水相互作用或交聯(lián)發(fā)生?；蛘撸锊牧峡梢允窍鄬?duì)剛性的結(jié)構(gòu)，例如，由諸如塑料的固體材料或諸如鈦的生物惰性金屬形成。生物材料可以具有可以由交聯(lián)聚合物提供的多孔基質(zhì)結(jié)構(gòu)?；|(zhì)優(yōu)選地對(duì)骨生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子而言是可滲透的。基質(zhì)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)交聯(lián)纖維例如纖維蛋白或膠原而形成，或由藻酸鈉、殼聚糖或其它具有合適交聯(lián)劑的多糖(例如鈣鹽，聚丙烯酸，肝素)的液體膜形成?；蛘?，支架可以形成為凝膠，由膠原或藻酸鹽制備，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的熟知的方法交聯(lián)。用于基質(zhì)形成的合適的聚合物材料包括但不限于可生物降解/生物再吸收的聚合物，其可以選自：瓊脂糖，膠原，纖維蛋白，殼聚糖，聚己內(nèi)酯，(dl-丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物，(l-丙交酯-己內(nèi)酯-乙交酯)共聚物，聚乙交酯，聚丙交酯，聚羥基脂肪酸酯，其共聚物，或不可生物降解的聚合物，其可選自：纖維素乙酸酯，纖維素丁酸酯，藻酸鹽，聚砜，聚氨酯，聚丙烯腈，磺化聚砜，聚酰胺，聚丙烯腈，聚甲基丙烯酸甲酯，其共聚物。由于其生物相容性和支持細(xì)胞附著和功能的有利性質(zhì)，膠原是用于基質(zhì)構(gòu)建的有希望的材料(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)no.5,019,087；tanaka,s.；takigawa,t.；ichihara,s.&nakamura,t.mechanicalpropertiesofthebioabsorbablepolyglycolicacid-collagennerveguidetubepolymerengineering&science2006,46,1461-1467)。臨床可接受的膠原海綿是基質(zhì)的一個(gè)實(shí)例，并且是本領(lǐng)域公知的(例如來(lái)自integralifesciences)。纖維蛋白支架(例如纖維蛋白膠)提供了替代的基質(zhì)材料。纖維蛋白膠具有廣泛的臨床應(yīng)用，作為傷口密封劑，遞送生長(zhǎng)因子的儲(chǔ)庫(kù)，以及作為生物植入物的放置和固定的輔助(rajeshvasita,dhirendraskatti.growthfactordeliverysystemsfortissueengineering:amaterialsperspective.expertreviewsinmedicaldevices.2006；3(1):29-47；wongc,inmane,spaether,helgersons.thromb.haemost.200389(3):573-582；panditas,wilsondj,feldmands.fibrinscaffoldasaneffectivevehicleforthedeliveryofacidicgrowthfactor(fgf-1).j.biomaterialsapplications.2000；14(3)；229-242；debloiscotemf.doilloncj.heparin-fibroblastgrowthfactorfibrincomplex:invitroandinvivoapplicationstocollagenbasedmaterials.biomaterials.1994；15(9):665-672.)。luong-van等人(invitrobiocompatibilityandbioactivityofmicroencapsulatedheparansulphatebiomaterials28(2007)2127-2136)，通過(guò)引用并入本文，描述了hs從聚己內(nèi)酯微膠囊的延長(zhǎng)的局部遞送。生物材料的另一個(gè)實(shí)例是摻入羥基磷灰石或透明質(zhì)酸的聚合物。生物材料可以補(bǔ)充以另外的細(xì)胞。例如，人們可以用干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì)胞)“接種”生物材料(或共同合成)。待治療的對(duì)象可以是任何動(dòng)物或人。對(duì)象優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。對(duì)象可以是非人哺乳動(dòng)物(例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物(包括來(lái)自任何嚙齒目動(dòng)物的細(xì)胞)，貓，狗，豬，綿羊，山羊，牛(包括母牛，如奶牛，或任何牛(bos)目動(dòng)物)，馬(包括任何馬(equidae)目動(dòng)物)，驢，和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)。非人哺乳動(dòng)物可以是家養(yǎng)寵物，或?yàn)樯虡I(yè)目的而飼養(yǎng)的動(dòng)物，例如，賽馬，或養(yǎng)殖家畜如豬，綿羊或牛。對(duì)象可以是雄性或雌性。對(duì)象可以是患者。如所指出的，根據(jù)本發(fā)明的方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“體外”旨在包括具有培養(yǎng)物中的細(xì)胞的程序，而術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”意圖包括具有完整的多細(xì)胞生物體的程序。培養(yǎng)基包含hs16(優(yōu)選分離的hs16)的培養(yǎng)基可以是任何種類(lèi)，但優(yōu)選是液體或凝膠，并且可以含有其它營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子(例如tgfβ1，fgf-2)。培養(yǎng)基可以干燥形式制備，例如粉末或凍干形式，用于重構(gòu)成液體或凝膠。hs16優(yōu)選以非痕量存在。例如，培養(yǎng)基中hs16的濃度可以在約1ng/ml培養(yǎng)基至約1000ng/ml培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，培養(yǎng)基中hs16的濃度為約500ng/ml或更低，更優(yōu)選為250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低，80ng/ml或更低70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，或5ng/ml或更低。硫酸乙酰肝素的劑量在體外和體內(nèi)用途中，hs16可以以約500ng/ml或更低，更優(yōu)選250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低的濃度或劑量使用80ng/ml或更低，70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，5ng/ml或更低；或約100mg或更低，50mg或更低，40mg或更地，30mg或更低，20mg或更地，10mg或更低，5mg或更低，4mg或更低，3mg或更低，2mg或更低，或1mg或更低；或約0.3-5μg/ml,0.3-4,0.3-3,0.3-2.5,0.3-2,0.3-1.5,0.3-1.0,0.3-0.9,0.3-0.8,0.3-0.7,0.3-0.6,0.3-0.5,0.3-0.4,1-2,1-1.75,1-1.5,1-1.25,1.25-2,1.5-2,或1.75-2μg/ml的濃度或劑量使用。在一些實(shí)施方案中，可以在施用治療劑量之前施用引發(fā)劑量的hs16。引發(fā)劑量可以起預(yù)先結(jié)合活化的tgfβ1的作用。引發(fā)劑量和治療劑量可以各自獨(dú)立地選自上面給出的值或范圍之一。劑型雖然hs16可以單獨(dú)給藥，但優(yōu)選將其作為醫(yī)藥或化妝品制劑(例如組合物，制劑，藥物)，所述醫(yī)藥或化妝品制劑包含hsx以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種或多種其他藥學(xué)上或化妝品可接受的成分的，包括但不限于藥學(xué)上或化妝品可接受的載體，佐劑，賦形劑，稀釋劑，填充劑，緩沖劑，防腐劑，抗氧化劑，潤(rùn)滑劑，穩(wěn)定劑，增溶劑，表面活性劑(例如潤(rùn)濕劑)，掩蔽劑，著色劑，調(diào)味劑和甜味劑。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供如上定義的藥物或化妝品組合物，以及制備藥物或化妝品組合物的方法，包括將至少一種如上定義的活性化合物與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種或多種其它藥學(xué)上或化妝品可接受的成分(例如載體，佐劑，賦形劑等)混合。如果配制為離散單位(例如片劑等)，每個(gè)單位含有預(yù)定量(劑量)的活性化合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”涉及在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，化合物、成分、材料、組合物、劑型等，適用于與所討論的對(duì)象(例如人)的組織接觸，沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)或其它問(wèn)題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)。每種載體，佐劑，賦形劑等在與制劑的其它成分相容的意義上也必須是“可接受的”。合適的載體，佐劑，賦形劑等可以在標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)教科書(shū)中找到，例如remington’spharmaceuticalsciences，第18版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1990；和handbookofpharmaceuticalexcipients，第2版，1994。制劑可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備。這些方法包括使活性化合物與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體結(jié)合的步驟。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)均勻和緊密地使活性化合物與載體(例如液體載體，細(xì)碎的固體載體等)結(jié)合，然后使產(chǎn)物成形(如果需要)，來(lái)制備制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┛梢詾橐后w，溶液(例如水性，非水性)，任選的鹽水溶液，懸浮液(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，酏劑，糖漿劑，糖餌劑，漱口劑，滴劑，片劑(包括例如包衣片劑)，顆粒劑，粉劑，錠劑，軟糖劑，膠囊(包括例如硬和軟明膠膠囊)，扁囊劑，藥丸，安瓿，大丸劑，栓劑，陰道栓劑，酊劑，凝膠劑，糊劑，軟膏劑，霜?jiǎng)磩?，油劑，泡沫劑，噴霧劑，霧劑或氣溶膠。制劑可適當(dāng)?shù)靥峁橛靡环N或多種活性化合物和任選的一種或多種其它藥學(xué)上可接受的成分(包括例如滲入、滲透和吸收增強(qiáng)劑)浸漬的貼劑，膠布，繃帶，敷料，或類(lèi)似物。制劑也可適當(dāng)?shù)匾再A庫(kù)(depot)或貯池(reservoir)的形式提供?；钚曰衔锟梢匀芙庥冢瑧腋∮诨蚺c一種或多種其它藥學(xué)或化妝品可接受的成分混合。適于口服給藥(例如通過(guò)攝取)的制劑包括液體，溶液(例如水性，非水性)，懸浮劑(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，酏劑，糖漿劑，糖餌劑，片劑，顆粒劑，粉劑，膠囊，扁囊劑，藥丸，安瓿，大丸劑。適于非口腔經(jīng)粘膜給藥的制劑包括液體，溶液(例如水性，非水性)，懸浮劑(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，栓劑，陰道栓劑，凝膠劑，糊劑，軟膏劑，霜?jiǎng)?，洗劑，油劑以及貼劑，膠布，貯庫(kù)，和貯池。適于透皮給藥的制劑包括凝膠，糊劑，軟膏，霜?jiǎng)?，洗劑和油劑，以及貼劑，膠布，繃帶，敷料，貯庫(kù)，和貯池。片劑可以通過(guò)常規(guī)方法制備，例如任選地與一種或多種輔助成分共同壓制或模制。軟膏通常由活性化合物和石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)制備。霜?jiǎng)┩ǔＳ苫钚曰衔锖退腿楦嗷|(zhì)制備。如果需要，乳膏基質(zhì)的水相可以包括例如至少約30％w/w的多元醇，即具有兩個(gè)或更多個(gè)羥基的醇，例如丙二醇，丁-1,3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制劑可期望地包括增強(qiáng)活性化合物通過(guò)皮膚或其它受影響區(qū)域的吸收或滲透的化合物。這種皮膚滲透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括二甲亞砜和相關(guān)的類(lèi)似物。乳劑通常由活性化合物和油相制備，所述油相可以任選地僅包含乳化劑(或者稱(chēng)為乳化劑(emulgent))，或者其可以包含至少一種乳化劑與脂肪或油或者脂肪和油二者的混合物。優(yōu)選地，親水性乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑共同包含。還優(yōu)選包括油和脂肪。具有或不具有穩(wěn)定劑的乳化劑一起構(gòu)成所謂的乳化蠟，并且蠟與油和/或脂肪一起構(gòu)成所謂的乳化軟膏基質(zhì)，其形成霜?jiǎng)┡浞降挠托苑稚⑾唷：线m的乳化劑和乳液穩(wěn)定劑包括吐溫60，span80，鯨蠟硬脂醇，肉豆蔻醇，單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。用于制劑的合適的油或脂肪的選擇是基于實(shí)現(xiàn)所需的化妝品性質(zhì)，因?yàn)榛钚曰衔镌诳赡苡糜谒幬锶橐褐苿┑拇蠖鄶?shù)油中的溶解度可能非常低。因此，霜?jiǎng)?yīng)優(yōu)選是具有合適均勻性的非油膩、不沾染和可洗滌的產(chǎn)品，以避免從管或其它容器中泄漏?？墒褂弥辨溁蛑ф湹囊辉蚨榛ト缍?異己二酸酯，硬脂酸異鯨蠟酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸丁酯，棕櫚酸2-乙基己酯或稱(chēng)為crodamolcap的支鏈酯混合物，后三種是優(yōu)選的酯。這些可以單獨(dú)使用或組合使用，這取決于所需的性能?；蛘?，可以使用高熔點(diǎn)脂質(zhì)如白軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。適于鼻內(nèi)給藥的制劑，其中載體是液體，包括例如鼻噴霧劑，滴鼻劑或通過(guò)噴霧器的氣霧劑給藥，包括活性化合物的水性或油性溶液。適合于腸胃外施用(例如通過(guò)注射)的制劑包括其中溶解，懸浮或以其它方式提供(例如，在脂質(zhì)體或其他微粒中)有活性化合物的水性或非水性，等滲，無(wú)熱原，無(wú)菌液體(例如溶液，懸浮液，鹽溶液)。這樣的液體可另外含有其它藥學(xué)上可接受的成分，例如抗氧化劑，緩沖劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，抑菌劑，懸浮劑，增稠劑和使制劑與預(yù)期的接受者的血液(或其它相關(guān)體液)等滲的溶質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括例如水，鹽水，醇，多元醇，甘油，植物油，或其類(lèi)似物。用于這種制劑的合適的等滲載體的實(shí)例包括氯化鈉注射液，林格氏溶液或乳酸林格注射液。通常，活性化合物在液體中的濃度為約1ng/ml至約10μg/ml，例如約10ng/ml至約1μg/ml。制劑可以存在于單位劑量或多劑量密封容器中，例如安瓿和小瓶中，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，只需要使用前立即加入無(wú)菌液體載體例如用于注射的水。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以由無(wú)菌粉末，顆粒和片劑制備。tgfβ1在本說(shuō)明書(shū)中，tgfβ1是指轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1，其是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員。來(lái)自智人的tgfβ1的氨基酸序列可以從genbank登錄號(hào)np_000651.3(gi：63025222)[seqidno：2]獲取。tgfβ1作為前原蛋白合成，其隨后經(jīng)歷蛋白水解切割。單體通過(guò)二硫鍵橋二聚化以形成前tgfβ1二聚體。然后切割tgfβ1二聚體，得到小的休眠tgfβ復(fù)合物(slc)，其中休眠相關(guān)肽(lap)和成熟肽通過(guò)非共價(jià)鍵締合。大的休眠性tgfβ1復(fù)合物(llc)通過(guò)大的休眠性tgfβ1結(jié)合蛋白(ltbp)與slc的共價(jià)連接形成。如本文所用，“tgfβ1”或“tgfβ1蛋白”包括前原tgfβ1，前tgfβ1，成熟tgfβ1和休眠性tgfβ1。前原tgfβ1，前tgfβ1，成熟tgfβ1和休眠性tgfβ1形式可以包含在蛋白復(fù)合物中，例如小的休眠tgfβ1復(fù)合物或大的休眠tgfβ1復(fù)合物。在本說(shuō)明書(shū)中，“tgfβ1”包括與tgfb1的氨基酸序列具有至少70％，更優(yōu)選至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％之一的同一性的蛋白或多肽。tgfβ1蛋白或多肽優(yōu)選還包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有seqidno：1的氨基酸序列或與seqidno：1的氨基酸序列具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。tgfβ1蛋白或多肽可以是全長(zhǎng)tgfβ1蛋白或多肽的片段或截短物。例如，tgfβ1可以是前原tgfβ1，前tgfβ1或成熟tgfβ1多肽。tgfβ1蛋白可以是源于，或衍生自，任何動(dòng)物或人類(lèi)，例如非人哺乳動(dòng)物，例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物(包括來(lái)自任何嚙齒目動(dòng)物的細(xì)胞)，貓，狗，豬，綿羊，山羊，牛(包括母牛，如奶牛，或任何牛目動(dòng)物)，馬(包括任何馬目的動(dòng)物)，驢，和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，或其他非人脊椎動(dòng)物生物；和/或非人哺乳動(dòng)物；和/或人。tgfβ1的用量在體外和體內(nèi)用途中，tgfβ1可以與hs16組合使用。在本發(fā)明的一些細(xì)胞培養(yǎng)方法中，將外源hs16加入培養(yǎng)物中。tgfβ1合適的濃度或劑量包括約500ng/ml或更低，更優(yōu)選250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低的濃度或劑量使用80ng/ml或更低，70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，5ng/ml或更低；或約100mg或更低，50mg或更低，40mg或更地，30mg或更低，20mg或更地，10mg或更低，5mg或更低，4mg或更低，3mg或更低，2mg或更低，或1mg或更低；或約0.1-5ng/ml,0.1-0.2,0.1-0.3,0.1-0.4,0.1-0.5,0.1-0.6,0.1-0.7,0.1-0.8,0.1-0.9,0.1-1.0,0.1-1.5,0.1-0.2.0,0.1-2.5,0.1-3.0,0.1-3.5,0.1-4.0,0.1-4.5,0.1-5.0ng/ml的范圍。在一些實(shí)施方案中，hs16的體外和體內(nèi)用途不包括外源性tgfβ1的加入。例如，在本發(fā)明的一些細(xì)胞培養(yǎng)方法中，不向培養(yǎng)物中加入外源性tgfβ1。本發(fā)明包括所描述的方面和優(yōu)選特征的組合，除非這樣的組合是明顯不允許或明確避免的。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的，并且不應(yīng)被解釋為限制所描述的主題?，F(xiàn)在將參考附圖通過(guò)示例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的方面和實(shí)施方案。其它方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。本文中提及的所有文件通過(guò)引用并入本文。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)(包括所附權(quán)利要求書(shū))中，除非上下文另有要求，否則詞語(yǔ)“包括”及其變體例如“包含(comprises)”和“含有(comprises)”將被理解為表示包括所述整數(shù)或步驟或多個(gè)整數(shù)或步驟的集合，但不排除任何其它整數(shù)或步驟，或整數(shù)或步驟的集合。必須指出，如說(shuō)明書(shū)所使用的，除非上下文清楚地指出，否則在所附的權(quán)利要求書(shū)中，單數(shù)形式“一”，“一個(gè)”，和“該”包括復(fù)數(shù)形式。本發(fā)明的范圍可以用從“約”一個(gè)特定值，和/或至“約”另一個(gè)特定值來(lái)表示。表示這樣的范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從一個(gè)特定值和/或至另一個(gè)特定值。同樣，當(dāng)值表示為近似值時(shí)，通過(guò)使用先行詞“約”，理解為該特定值形成另一個(gè)實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明現(xiàn)在將參考附圖來(lái)討論說(shuō)明本發(fā)明的原理的實(shí)施方案和實(shí)驗(yàn)，其中：圖1a和1b.顯示肝素與tgf-β1結(jié)合的圖表。(a)顯示gag結(jié)合平板測(cè)定結(jié)果以確定tgf-β1結(jié)合肝素的能力的圖表。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。(b)spr傳感圖，其顯示對(duì)各種濃度注射的tgf-β1(50至800nm)的結(jié)合響應(yīng)的變化。通過(guò)繪制結(jié)合響應(yīng)(ru)作為注射蛋白的函數(shù)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。tgf-β1與肝素結(jié)合的kd估測(cè)為～0.475μm。圖2a至2d.肝素結(jié)合增強(qiáng)tgf-β1活性。(a)該圖顯示tgf-β1(2.5μm)和dtt(10mm)含有(tgf-β1+hep)或不含肝素(tgf-β1)(25μm)的dsf獲得的熔解曲線(xiàn)的一階導(dǎo)數(shù)。在每個(gè)條件下的tgf-β1的熔解溫度取在每個(gè)圖的峰值。(b)蛋白質(zhì)印跡和顯示相對(duì)蛋白水平的圖：細(xì)胞用在室溫下用不同量(0,10或40μg/ml)的肝素(hep)預(yù)孵育10分鐘的tgf-β1(1或5ng/ml)處理，并在6小時(shí)后裂解。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，總smad2/3和肌動(dòng)蛋白水平，并通過(guò)相對(duì)于肌動(dòng)蛋白的光密度測(cè)定法來(lái)定量。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。(c)該圖顯示在軟骨形成培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)或具有肝素(10μg/ml)的軟骨形成培養(yǎng)基(培養(yǎng)基+hep)中培養(yǎng)3天的軟骨形成微細(xì)胞團(tuán)中sox9和comp的定量pcr結(jié)果。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。(d)該圖顯示在用dmso或sb431542(10μm)處理后通過(guò)qpcr測(cè)量的在第3天軟骨形成微細(xì)胞團(tuán)中sox9和comp表達(dá)的抑制。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。圖3a至3c.tgf-β1結(jié)合和活性的肝素長(zhǎng)度要求。(a)代表性spr傳感圖，顯示在注射前用5或10μg肝素(hep)或尺寸分級(jí)的肝素(dp4至24)預(yù)孵育時(shí)200nmtgf-β1的結(jié)合響應(yīng)的變化。代表性條形圖顯示各種gag針對(duì)肝素涂覆的芯片競(jìng)爭(zhēng)tgf-β1結(jié)合的能力。將數(shù)據(jù)歸一化為單獨(dú)的200nmtgf-β1。(b)該圖顯示gag結(jié)合板測(cè)定的結(jié)果以確定tgf-β1結(jié)合各種肝素片段(dp14-24)或未分級(jí)肝素(hep)的能力。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。(c)蛋白質(zhì)印跡：細(xì)胞用在室溫下用10μg/ml的各種肝素片段(dp14-24)或未分級(jí)肝素(hep)預(yù)孵育10分鐘的tgf-β1(1ng/ml)處理，并在6小時(shí)裂解。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，總smad2/3和肌動(dòng)蛋白水平。圖4a至4c.tgf-β1結(jié)合和活性的肝素硫酸化要求。(a)代表性spr傳感圖，顯示當(dāng)用5或10μg肝素(hep)，2-o-脫硫肝素(2-o-de)，6-o-脫硫酸肝素(6-o-de)或n-脫硫酸肝素(n-de)預(yù)孵育時(shí)200nmtgf-β1的結(jié)合響應(yīng)的變化。代表性條形圖顯示各種gag針對(duì)肝素涂覆的芯片競(jìng)爭(zhēng)tgf-β1結(jié)合的能力。將數(shù)據(jù)歸一化為單獨(dú)的200nmtgf-β1。(b)該圖顯示gag結(jié)合板測(cè)定以確定tgf-β1結(jié)合選擇性脫硫的(2-o-de,6-o-de或n-de)或完全硫酸化的肝素(hep)的能力。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。(c)蛋白質(zhì)印跡：細(xì)胞用在室溫下用10μg/ml的各種選擇性脫硫的(2-o-de,6-o-de或n-de)和完全硫酸化的的肝素(hep)預(yù)孵育10分鐘的tgf-β1(1ng/ml)處理，并在6小時(shí)裂解。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，總smad2/3和肌動(dòng)蛋白水平。圖5a和5b.鑒定tgf-β1肝素結(jié)合位點(diǎn)。(a)通過(guò)保護(hù)-和-標(biāo)記策略[seqidno：3]鑒定的tgf-β1氨基酸序列和賴(lài)氨酸的位置。公開(kāi)的tgf-β1的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hbd)加下劃線(xiàn)。標(biāo)識(shí)了以高置信度(*)和中等置信度(^)鑒定的賴(lài)氨酸。(b)定位到預(yù)測(cè)的tgf-β13維結(jié)構(gòu)上的鑒定的賴(lài)氨酸的位置(pdb：1klc[51])。頂部，條帶圖。底部，相應(yīng)的分子表面。左列和右列，tgf-β1圍繞水平軸旋轉(zhuǎn)180°。圖6a至6f.分離親和力選擇的tgf-β1結(jié)合hs(hs16+ve)。(a)成熟tgf-β1的氨基酸序列，顯示用于從市售hspm[seqidno：3]分離tgf-β1-結(jié)合性hs群的肽。(b)該圖顯示3h-肝素結(jié)合測(cè)定結(jié)果以確定肽結(jié)合3h-肝素的能力。將肽吸附到硝酸纖維素膜上，然后使其與3h-肝素結(jié)合。用閃爍計(jì)數(shù)器定量結(jié)合肽的肝素的量。pbs用作陰性對(duì)照。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝2。(c)用tgf-β1肽親和選擇后獲得的hs級(jí)分的色譜圖。不結(jié)合肽的hs(hs16-ve)首先洗脫，而結(jié)合肽的hs(hs16+ve)用1.5mnacl洗脫。(d)成熟tgf-β1的氨基酸序列，顯示用于從市售hspm(p4)和測(cè)試的三種其他肽(p1，p2p3)分離tgf-β1-結(jié)合性hs群的肽。(e)該圖顯示hspm與pbs和p1，p2，p3，p4中的每一種的相對(duì)結(jié)合。(f)說(shuō)明hs16的色譜分離。圖7a至7c.hs16+ve的表征。(a)hs16+ve(上),hs16-ve(中)和hspm(下)的質(zhì)子nmr譜。箭頭表示三種糖的譜圖之間的差異。(b)hs16+ve,hs16-ve和hspm的尺寸排阻色譜。肝素尺寸標(biāo)準(zhǔn)物(dp8,12,20和26)的洗脫時(shí)間在圖上表明。(c)該圖顯示肝素裂解酶消化的hs16+ve,hs16-ve和hspm的二糖組成。圖8a至8h.hs16+ve結(jié)合并加強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(a)代表性spr傳感圖，顯示在注射前用5或10μg的hs16+ve,hs16-ve或hspm預(yù)孵育時(shí)200nmtgf-β1的結(jié)合響應(yīng)的變化。代表性條形圖顯示各種gag針對(duì)肝素涂覆的芯片競(jìng)爭(zhēng)tgf-β1結(jié)合的能力。將數(shù)據(jù)歸一化為單獨(dú)的200nmtgf-β1。(b)顯示凝膠電泳：纖溶酶消化單獨(dú)孵育或與指定的gag一起孵育的tgf-β1。將樣品消化1.5小時(shí)，在4-12％sds-page上顯示并通過(guò)銀染顯色。(c)蛋白質(zhì)印跡：細(xì)胞用在室溫下用10μg/ml的肝素(hep),hspm,hs16+ve或hs16-ve預(yù)孵育10分鐘的tgf-β1(1ng/ml)處理，并在6小時(shí)裂解。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，總smad2/3和肌動(dòng)蛋白水平。代表性spr傳感圖，顯示在注射前用5或10μg的(d)hspm,(e)hs16+ve,(f)hs16-ve或(g)肝素(hep)預(yù)孵育時(shí)200nmtgf-β1的結(jié)合響應(yīng)的變化。(h)該條形圖顯示各種gag針對(duì)肝素涂覆的表面競(jìng)爭(zhēng)tgf-β1結(jié)合的能力。為了清楚起見(jiàn)，僅對(duì)于肝素顯示了沒(méi)有任何gag(即0μg)的tgf-β1的結(jié)合響應(yīng)。將數(shù)據(jù)歸一化為單獨(dú)的200nmtgf-β1。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。圖9.肝素/hs與tgf-β1相互作用的示意圖。根據(jù)lyon等人提出的模型(2),肝素/hs鏈(實(shí)線(xiàn))通過(guò)任一單體上的k26殘基與tgf-β1相互作用。根據(jù)該模型，肝素/hs鏈必須通過(guò)(navigate)兩個(gè)蛋白單體的界面之間的凹槽。k13的位置將有助于糖鏈獲得結(jié)合tgf-β1所需的這種空間取向。預(yù)測(cè)的tgf-β1結(jié)構(gòu)與khan(57)等最近發(fā)表的肝素結(jié)構(gòu)的比較還表明dp22肝素片段足以橋接任一單體上的k26殘基之間的距離。圖10a至10c.hs16+ve加強(qiáng)ltgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(a)蛋白質(zhì)印跡：細(xì)胞用在室溫下用10μg/ml的肝素(hep),hspm,hs16+ve或hs16-ve預(yù)孵育10分鐘的ltgf-β1(3.3ng/ml)處理，并在6小時(shí)裂解。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，總smad2/3和肌動(dòng)蛋白水平。(b)肝素/hs與ltgf-β1的相互作用的示意圖。將與圖9相同的肝素結(jié)合模型應(yīng)用于ltgf-β1結(jié)構(gòu)(pdb：3rjr(60))中，k13殘基可有助于肝素/hs鏈(紅線(xiàn))的取向，以干擾休眠相關(guān)肽(lap，顏色顯示為米色)與成熟tgf-β1的結(jié)合。(c)ltgf-β1的帶狀圖，說(shuō)明lap如何包繞tgf-β1同源二聚體。圖11.顯示tgf-β1合成過(guò)程的圖。tgf-β1被合成為含有信號(hào)肽(s)，休眠相關(guān)肽(lap)和tgf-β1本身的390個(gè)氨基酸的前原蛋白。翻譯后，信號(hào)肽被切割，在兩個(gè)單體之間形成二硫鍵，然后lap從tgf-β1切割。lap和tgf-β1然后非共價(jià)重新締合以形成休眠型tgf-β1(ltgf-β1)，也稱(chēng)為小休眠復(fù)合物(slc)。二硫鍵顯示為黃色。圖12.hspm，hs16+ve和hs3+ve的組成的比較。條形圖顯示hspm、hs16+ve、和hs3+ve(hspm的bmp-2結(jié)合部分)之間的組成差異。hspm和hs16+ve的組成通過(guò)hplc測(cè)定，其不能檢測(cè)稀有ua，2s-glcnac，6s二糖，而hs3+ve的組成通過(guò)毛細(xì)管電泳測(cè)定。誤差棒表示誤差間隔，其使用斯氏t-分布確定，置信限度設(shè)置為95。hs3+ve的數(shù)據(jù)取自[murali,s.,等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605]并用作比較。圖13a至13e.hs16+ve和hs3+ve與bmp-2結(jié)合的比較。代表性spr傳感圖，顯示在注射前用5或10μg的(a)hspm,(b)hs3+ve,(c)hs16+ve或(d)肝素(hep)預(yù)孵育時(shí)25nmbmp-2的結(jié)合響應(yīng)的變化。(e)各種gag針對(duì)肝素涂覆表面競(jìng)爭(zhēng)bmp-2結(jié)合的能力的條形圖。為了清楚起見(jiàn)，僅顯示了肝素的沒(méi)有任何gag(即0μg)的bmp-2的結(jié)合響應(yīng)。將數(shù)據(jù)歸一化為單獨(dú)的25nmbmp-2。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3。圖14.hs16+ve的bmp-2增強(qiáng)能力。該條形圖描繪了hspm，hs16+ve和hs3+ve加強(qiáng)c2c12細(xì)胞中bmp-2驅(qū)動(dòng)的堿性磷酸酶(alp)表達(dá)的能力。誤差棒代表sd，n＝4。*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001.圖15.分化中的hmscs的濕重變化。該圖顯示用(tgf-β1)或不用tgf-β1(對(duì)照)處理的軟骨形成分化的細(xì)胞團(tuán)的重量隨時(shí)間的變化。誤差棒代表sd，n＝3。***p<0.001與對(duì)照組相比較。圖16a至16e.分化中的hmscs中的軟骨形成基因表達(dá)。在用10ng/mltgf-β1處理(tgf-β1)或不處理(對(duì)照組)的細(xì)胞團(tuán)中顯示(a)sox9，(b)comp，(c)聚集蛋白聚糖，(d)膠原蛋白2α1型和(e)膠原蛋白10α1型的mrna表達(dá)。在對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)中沒(méi)有檢測(cè)到2α1型膠原蛋白mrna。誤差棒代表sd，n＝3。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，與對(duì)照組相比。圖17a和17b.肝素對(duì)早期軟骨形成基因表達(dá)的影響。條形圖顯示在具有所指示的處理的軟骨形成培養(yǎng)基中分化3天后，hmsc中(a)sox9和(b)compmrna表達(dá)水平。ctrl-對(duì)照組；5hep-5μg/ml肝素；10hep-10μg/ml肝素；1tgf-β1-1ng/mltgf-β1；10tgf-β1-10ng/mltgf-β1。誤差棒代表sd，n＝3。*p<0.05,***p<與對(duì)照組相比。#p<0.05,###p<0.001，與1tgf-β1相比。圖18a至18d.分離的hs級(jí)分對(duì)hmsc的軟骨形成基因表達(dá)的影響。散點(diǎn)圖顯示在含有1或10ng/mltgf-β1(分別為1tgf-β1和10tgf-β1)和10μg/ml的所示gag的軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的細(xì)胞團(tuán)中的(a)sox9，(b)comp，(c)聚集蛋白聚糖和(d)膠原蛋白10α1型mrna表達(dá)水平。僅在用10ng/mltgf-β1處理的沉淀中檢測(cè)到2α1型膠原mrna。中線(xiàn)表示平均值，而誤差棒表示sd，n＝3。*p<0.05,***p<0.001，與1tgf-β1相比。注意1tgf-β1+hs16+ve數(shù)據(jù)集中存在的異常值。圖19.成熟人[seqidno：3]和兔tgf-β1[seqidno：4]的序列比對(duì)。成熟人tgf-β1的預(yù)測(cè)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基加下劃線(xiàn)，并且通過(guò)“保護(hù)和標(biāo)記”技術(shù)鑒定的賴(lài)氨酸(k)以粗體顯示。圖20a和20b.治療組的肉眼評(píng)分。每個(gè)治療組的icrsi評(píng)分的散點(diǎn)圖。(a)中線(xiàn)表示平均得分，誤差棒表示se。(b)線(xiàn)代表中值得分。實(shí)施例實(shí)施例1：肝素/硫酸乙酰肝素-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1相互作用和信號(hào)增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)要求背景：肝素能夠結(jié)合并加強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果：鑒定了肝素/硫酸乙酰肝素(hs)和tgf-β1的相互作用的分子決定因素。結(jié)論：對(duì)于tgf-β1與肝素/hs的相互作用存在確定的結(jié)構(gòu)要求，其影響tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)。意義：對(duì)hs-tgf-β1相互作用的理解可指導(dǎo)tgf-β1治療的發(fā)展。摘要轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)是肝素結(jié)合蛋白，其涉及許多生理過(guò)程，包括人間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)引起的軟骨形成。在這里我們顯示肝素能夠結(jié)合并加強(qiáng)hmscs中tgf-β1信號(hào)。這種增強(qiáng)通過(guò)經(jīng)由tgf-β受體調(diào)節(jié)tgf-β1途徑而發(fā)生，并導(dǎo)致早期軟骨形成基因的上調(diào)。分子相互作用和基于細(xì)胞的測(cè)定還證明，長(zhǎng)度為18-22個(gè)糖(dp18-22)并且缺乏2-o-硫酸化的肝素鏈對(duì)于結(jié)合tgf-β1是最佳的。通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)探討tgf-β1和肝素之間的相互作用，使得鑒定了參與肝素結(jié)合的tgf-β1上的新的賴(lài)氨酸殘基。有了這些信息，我們分離了一種對(duì)tgf-β1親和力增強(qiáng)的豬黏膜硫酸乙酰肝素(hs)亞部分。與原始的起始hs相比，該tgf-β1-結(jié)合性hs能夠更好地結(jié)合于并且增強(qiáng)tgf-β1和休眠性tgf-β1的活性。本研究首次報(bào)告了肝素與tgf-β1相互作用的結(jié)構(gòu)要求。它還為發(fā)展基于hs的策略以調(diào)節(jié)用于軟骨修復(fù)的tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)，其中外源蛋白質(zhì)劑量可以減少或免除。介紹糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)1和肝素是結(jié)構(gòu)相關(guān)的、線(xiàn)性多糖，已知結(jié)合許多細(xì)胞外蛋白和生長(zhǎng)因子并調(diào)節(jié)它們的功能(1)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)是一種已經(jīng)被證明在纖維化(6,7)，皮膚愈合(8)，癌癥轉(zhuǎn)移(9,10)和軟骨形成(11-15)中起作用的強(qiáng)效肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(2-5)。tgf-β1驅(qū)動(dòng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)的軟骨形成分化并維持軟骨形成表型的這種能力，使得在軟骨修復(fù)策略的發(fā)展中對(duì)其產(chǎn)生了特別的興趣(13,15-18)。雖然最初看起來(lái)成功，但是這些方法在其轉(zhuǎn)移到臨床中面臨顯著的障礙，因?yàn)榻?jīng)常使用超生理劑量的tgf-β1來(lái)克服清除，并且甚至中等劑量已經(jīng)顯示產(chǎn)生不期望的結(jié)果，例如滑膜炎癥(19,20)。除了非生理劑量的問(wèn)題之外，還存在持續(xù)的將生長(zhǎng)因子定位于治療部位以防止其引起全身性副作用(包括纖維化和腫瘤形成)的需要(9,10,21)。此外，對(duì)tgf-β1的敏感性隨著年齡而降低(22)，因此足夠的tgf-β1給藥對(duì)老年患者呈現(xiàn)更多的風(fēng)險(xiǎn)。響應(yīng)于這些挑戰(zhàn)，正在開(kāi)發(fā)新的策略，其減少或完全消除對(duì)外源性生長(zhǎng)因子的需要，更好地定位和控制生長(zhǎng)因子在治療部位的遞送，并且提高對(duì)生長(zhǎng)因子的細(xì)胞敏感性或因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。一些研究組已經(jīng)通過(guò)使用自組裝肽兩親物解決了前兩個(gè)障礙(23,24)，并且已經(jīng)證明tgf-β1的內(nèi)源水平足以驅(qū)動(dòng)局部msc分化(25)。然而，合成的肽兩親物具有顯著的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，并且未能解決在期望的細(xì)胞靶標(biāo)內(nèi)增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的需要。理想的治療將增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而無(wú)外源性tgf-β1應(yīng)用。我們的小組已經(jīng)揭示了hsgag能夠調(diào)節(jié)許多臨床相關(guān)生長(zhǎng)因子的作用(26-29)。在這里我們研究了肝素和hs與tgf-β1結(jié)合作用的機(jī)制，以及它們?cè)趆mscs內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)。我們證明，肝素與tgf-β1的結(jié)合通過(guò)tgf-βi型受體-smad2/3途徑增強(qiáng)其活性，并且對(duì)這種結(jié)合的結(jié)構(gòu)要求存在具體約束。此外，我們利用這些信息來(lái)分離hs的tgf-β1結(jié)合群，其在組成上不同于豬粘膜hs(hspm)，并且在增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中比豬粘膜hs(hspm)更有效。這項(xiàng)工作為進(jìn)一步研究tgf-β1-hs相互作用鋪平了道路，并有助于基于hs來(lái)調(diào)節(jié)組織修復(fù)的hmsc行為的策略發(fā)展。實(shí)驗(yàn)程序人msc分離和細(xì)胞培養(yǎng)原代hmsc(lonza)通過(guò)塑料貼附從年輕健康成年人供體的骨髓單核細(xì)胞中分離，并如前所述進(jìn)行表征(30,31)。將貼壁細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和2mml-谷氨酰胺的dmem-低葡萄糖(1000mg/l，dmem-lg)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下在37℃和5％co2下在濕潤(rùn)氣氛中培養(yǎng)。每三天更換培養(yǎng)基。在達(dá)到75-80％匯合時(shí)，用0.125％胰蛋白酶/versene(ph7.0)分離細(xì)胞，并在相同培養(yǎng)條件下以3,000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重新鋪板。所有實(shí)驗(yàn)都用第5代細(xì)胞進(jìn)行。軟骨形成分化軟骨形成分化使用改良的微團(tuán)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行，如zhang等人所述(32)。簡(jiǎn)言之，收獲第4代hmsc，并以2×107個(gè)細(xì)胞/ml重懸于化學(xué)成分確定的軟骨形成培養(yǎng)基(pt-3003，lonza)中。然后將12.5μl的液滴接種在24孔板的每個(gè)孔的中間，并在37℃下使其貼壁2小時(shí)，之后，將500μl的補(bǔ)充有單獨(dú)的10ng/mltgf-β1(100-2c，peprotech)(培養(yǎng)基)或tgf-β1和10μg/ml肝素(sigma-aldrich))(培養(yǎng)基+hep)的軟骨形成培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中。細(xì)胞小滴在24小時(shí)后聚結(jié)成球形團(tuán)塊，并且在第3天收集微團(tuán)?；诒砻娴入x子共振(spr)的tgf-β1-gag相互作用的分析基于hernaiz等報(bào)道的方案制備生物素化肝素(33)。簡(jiǎn)言之，將20mg肝素在1ml水中過(guò)濾滅菌(0.22μm)，并與8.6μmol的n-羥基琥珀酰亞胺-生物素(nhs-生物素)(pierce)在20μl二甲基亞砜(dmso)中的溶液在4℃下共同孵育2小時(shí)。然后將生物素化的肝素廣泛透析(7000mwco)以除去未反應(yīng)的生物素。使用固定化向?qū)г赽iacoret100(gehealthcare)上以約40個(gè)響應(yīng)單位(ru)的靶向固定水平進(jìn)行生物素化肝素在鏈霉親和素(sa)傳感器芯片(gehealthcare)上的固定化。使用hbs-ep運(yùn)行緩沖液(10mmhepes，150mmnacl，3.0mmedta，0.05％(v/v)吐溫20，ph7.4)固定。tgf-β1-肝素相互作用通過(guò)制備在hbs-ep-0.1運(yùn)行緩沖液(0.1％而不是0.05％(v/v)吐溫20)中稀釋的一系列tgf-β1蛋白樣品(50-800nm最終濃度)來(lái)影響。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將終濃度為200nmtgf-β1的hbs-ep-0.1溶液與5或10μg的以下gag之一混合：-肝素(hep)；大小分級(jí)肝素(聚合度dp4,6,8,10,12,14,16,18,20,22和24)(iduron)；選擇性脫硫肝素(2-o-脫硫，6-o-脫硫和n-脫硫)(iduron)；hspm(ho-03103，celsus實(shí)驗(yàn)室)；親和分離的tgf-β1-結(jié)合性hs(hs16+ve)；或tgf-β1-非結(jié)合性hs(hs16-ve)。然后將樣品溶液以30μl/min的流速注射到肝素涂覆的芯片上120s，隨后使hbs-ep-0.1在芯片上通過(guò)另外1200s以監(jiān)測(cè)tgf-β1解離。解離后，芯片上的傳感器表面通過(guò)2次以30μl/min注射的2mnacl洗滌60s來(lái)再生。在25℃下以其對(duì)時(shí)間的函數(shù)形式測(cè)量響應(yīng)(傳感圖)。將每種條件的最大結(jié)合響應(yīng)相對(duì)于從單獨(dú)的tgf-β1獲得的響應(yīng)歸一化。gag結(jié)合板檢測(cè)為了確定tgf-β1結(jié)合肝素的能力，我們使用帶正電荷的gag-結(jié)合板(iduron)作為捕獲基材。將gag固定在每個(gè)孔中，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)用tgf-β1激發(fā)。簡(jiǎn)言之，一式三份的孔首先用5μg/ml的在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定緩沖液(sab:100mmnacl,50mm乙酸鈉,0.2％v/v吐溫20,ph7.2)中制備的全長(zhǎng)肝素、大小分級(jí)的肝素(dp14,16,18,20,22和24)或選擇性脫硫肝素預(yù)涂覆，然后在室溫下孵育過(guò)夜。然后用sab仔細(xì)洗滌平板三次，用250μl封閉溶液(0.4％w/v魚(yú)皮明膠，sigma-aldrich，sab溶液)封閉，并在37℃下孵育1小時(shí)。然后將tgf-β1以100，200或400ng/ml的濃度溶解于封閉溶液中。將平板用sab洗滌三次，將每種蛋白稀釋物(200μl)分配到一式三份的孔中，并在37℃下孵育2小時(shí)，用sab漂洗，并加入200μl的750ng/ml單克隆小鼠抗tgf-β1抗體(mab2401，r&d系統(tǒng))。然后將板在37℃下孵育1小時(shí)，用sab洗滌，并在封閉溶液中加入200μl的1μg/ml多克隆山羊抗小鼠生物素化抗體(ab6788，abcam)。再次，將平板在37℃下孵育1小時(shí)，用sab洗滌，并將200μl的220ng/mlextravidinap(sigma-aldrich)加入封閉溶液中，在37℃孵育30分鐘，然后用sab漂洗。最后，加入200μl顯影試劑(sigmafast對(duì)硝基苯磷酸酯，sigma-aldrich)，在37℃孵育40分鐘，并在405nm下在1小時(shí)內(nèi)讀數(shù)。差示掃描量熱法(dsf)如前所述，在7500fastrealpcrsystem(軟件版本1.4，appliedbiosystems)上進(jìn)行dsf(34,35)。使用或不使用肝素(25μm)測(cè)試tgf-β1(2.5μm)。為了促進(jìn)tgf-β1的熔解，將10mm的二硫蘇糖醇(dtt)加入到反應(yīng)混合物中。通過(guò)前述方法(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用origin7(originlabcorp.)計(jì)算熔解曲線(xiàn)的一階導(dǎo)數(shù)，以確定tgf-β1在各種條件下的熔解溫度。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，但是為了清楚起見(jiàn)，本文給出的數(shù)據(jù)僅顯示多個(gè)重復(fù)的平均值。細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)印跡將人msc在6孔板中在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以10,000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)24小時(shí)。然后單獨(dú)或在10μg/ml或40μg/ml全長(zhǎng)肝素存在下以1ng/ml或5ng/ml劑量的tgf-β1進(jìn)行tgf-β1處理，或1ng/ml劑量tgf-β1與10μg/ml大小分級(jí)或選擇性脫硫的肝素，hspm，hs16+或hs16-進(jìn)行tgf-β1處理，并在加入細(xì)胞之前在室溫孵育10分鐘。休眠tgf-β1(ltgf-β1)處理類(lèi)似地用3.3ng/ml單獨(dú)或者與10μg/ml的上述各種gag組合來(lái)制備。對(duì)于抑制劑研究，在用tgf-β1處理之前，用10μm的sb431542(sigma-aldrich)或dmso預(yù)處理細(xì)胞30分鐘。然后將細(xì)胞進(jìn)行各種tgf-β1處理1，6或24小時(shí)，并在2xlaemmli緩沖液中裂解，然后在4-12％sds-page凝膠上分離。然后用抗smad2/3(#3102，cellsignaling)，磷酸化smad2(psmad2，#3108，cellsignaling)，磷酸化smad3(psmad3，#9520，cellsignaling)和肌動(dòng)蛋白(mab1501r，millipore)的抗體對(duì)樣品進(jìn)行免疫印跡。使用quantityone軟件(版本4.6.6，bio-rad)進(jìn)行光密度測(cè)定。逆轉(zhuǎn)錄和定量pcr(qpcr)使用trizol試劑(invitrogen，lifetechnologies)根據(jù)制造商的方案從軟骨形成微細(xì)胞團(tuán)中分離總rna。使用vilotmcdna分析試劑盒(invitrogen，lifetechnologies)，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，在1μgrna上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在42℃下孵育2小時(shí)而不是1小時(shí)。每個(gè)qpcr含有40ngcdna，每個(gè)基因1μl引物-探針混合物和10μl快速通用pcr主混合物(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，lifetechnologies)，終體積為20μl。熱循環(huán)條件為95℃，20秒，然后在95℃下進(jìn)行3秒，60℃下進(jìn)行30秒，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)qpcr一式兩份進(jìn)行，基因表達(dá)相對(duì)于hprt1表達(dá)歸一化以獲得δct值。取生物學(xué)三份的平均值。在不含肝素的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的軟骨形成性微細(xì)胞團(tuán)用作對(duì)照(δδct)。各個(gè)引物集的相關(guān)表達(dá)水平通過(guò)2-δδct方法(36)表示為倍數(shù)變化。使用以下引物-探針測(cè)定(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，lifetechnologies)：hprt1(測(cè)定id:hs01003267_m1),sox9(測(cè)定id:hs00165814_m1)和comp(測(cè)定id:hs00164359_m1)。保護(hù)和標(biāo)記tgf-β1上的肝素結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)“保護(hù)和標(biāo)記”方法鑒定，如ori等人對(duì)于fgf-2所描述的(37)，除了使用1nmol的tgf-β1蛋白和0.1％(w/v)rapigesttmsf表面活性劑(waters公司)從小柱中洗脫蛋白質(zhì)。消化和生物素化的肽在c18ziptip(millipore)上純化，然后通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法(ms)分析。使用easy-nlc(proxeon)將高達(dá)2μg的生物素化肽注射到ltqvelos儀器(thermo)中。在picofrittm柱(halo,c18,2.7μm,75μm(id)x100mm長(zhǎng)度)(newobjectives)上，采用60分鐘線(xiàn)性梯度(2-40％(v/v)乙腈溶于0.1％甲酸)分離多肽。使用top-10策略進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，其中在雙重壓力線(xiàn)性離子阱中獲得調(diào)查ms掃描。ms掃描范圍從310到1400m/z，agc目標(biāo)3e4，最大注射時(shí)間10ms。離子強(qiáng)度高于1000和電荷狀態(tài)不包括1的10個(gè)最強(qiáng)的離子被順序分離到4e4的最大agc目標(biāo)值達(dá)最大100ms，并且使用30％的歸一化碰撞能量通過(guò)碰撞誘導(dǎo)的解離(cid)來(lái)片段化。使用排除列表大小500，一個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)，重復(fù)持續(xù)時(shí)間45秒，排除持續(xù)時(shí)間30秒以及質(zhì)量寬度1.0低和1.5高應(yīng)用動(dòng)態(tài)排除列表。到期被停用(expirationwasdisabled)。使用mascotsearch(版本2.3，matrixscience)用ipi.human.v3.86.decoy數(shù)據(jù)庫(kù)(183,568個(gè)序列)并應(yīng)用以下參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：消化物，胰凝乳蛋白酶(fwyl/p)；最大確實(shí)斷裂,2；固定修飾，脲甲基(cys)；可能的修飾，乙?；?lys)，乙?；?蛋白n端)，生物素(lys)，氧化(met)；親本離子耐受性，2da；片段離子耐受性，0.8da。手工驗(yàn)證mascot評(píng)分高于20的生物素化肽。3h-肝素結(jié)合測(cè)定為了測(cè)定tgf-β1衍生肽(序列-rkdlgwkwihepkgyh-ahx-k(生物素)[ahx＝6-氨基己酸]；[seqidno：7])的肝素結(jié)合能力，將0.5mg的肽在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中重構(gòu)。然后通過(guò)在室溫下將硝酸纖維素盤(pán)在1ml重構(gòu)肽中孵育1小時(shí)并持續(xù)搖動(dòng)將肽吸附在硝酸纖維素盤(pán)(6mm直徑)上。在單獨(dú)的pbs中孵育的盤(pán)作為陰性對(duì)照。吸附后，將盤(pán)在80℃和-10hg的真空烘箱中干燥45分鐘，用pbs洗滌3次，然后與1ml0.1μci/ml3h-肝素在室溫下孵育16小時(shí)不斷搖動(dòng)。然后將盤(pán)用pbs洗滌4次，用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定3h-肝素的結(jié)合量。hs16+ve的親和分離hs16+ve的分離通過(guò)之前所述方法(29)進(jìn)行，使用上述的tgf-β1肽序列。簡(jiǎn)言之，將3mg肽偶聯(lián)至hitraptm鏈霉親和素hp柱(gehealthcare，buckinghamshire，uk)，然后將其用于與市售豬粘膜hs(hspm，celsuslaboratoriesinc，ohio，usa)的親和層析。將hspm以1mg/ml溶解于低鹽緩沖液(20mm磷酸鹽，150mmnacl，ph7.2)中，以0.2ml/min的流速加載，并將柱在相同緩沖液中洗滌直到在232nm的基線(xiàn)吸光度(a232)達(dá)到零。用高鹽緩沖液(20mm磷酸鹽，1.5mnacl，ph7.2)在單一步驟中洗脫結(jié)合的hs，在a232監(jiān)測(cè)峰級(jí)分，收集，并用低鹽緩沖液重新平衡柱。分別收集洗脫(hs16+ve)和流通(hs16-ve)峰，冷凍干燥，在hipreptm26/10脫鹽柱(gehealthcare，buckinghamshire，uk)上以10ml/min流速脫鹽，再次冷凍干燥并儲(chǔ)存在-20℃下。質(zhì)子nmr譜合并hspm,hs16+ve和hs16-ve樣品，并在d2o中交換三次(干燥粉末在d2o(0.5至1ml)中溶解三次，并冷凍干燥直至完全凍干)并測(cè)定干重。nmr分析在30℃下，在5mm管中作為d2o溶液進(jìn)行，包括tbuoh(0.2mg/ml)作為內(nèi)標(biāo)。綜合數(shù)據(jù)集的最佳濃度為約15mg/ml(1h)，雖然hs制劑為約3mg/ml。在三通道brukeravanceiii500上記錄質(zhì)子(500mhz)nmr譜圖。探針是裝備有主動(dòng)屏蔽的50g/cmz軸脈沖場(chǎng)梯度的bruker雙通道5mm寬度核探針(31p-109ag)。nmr譜圖根據(jù)需要進(jìn)行相位校正并參照tbuoh(1hδ1.24ppm；13c(甲基)δ30.29ppm)。信號(hào)的分配基于guerrini等人報(bào)道的內(nèi)容(38)。原始page中的gag阿爾辛藍(lán)染色/銀染為了檢查hspm，hs16+ve和hs16-ve樣品中多糖鏈的大小分布，將2μg的每種gag在已經(jīng)在80v預(yù)運(yùn)行30分鐘以去除殘余過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺(temed)的12％原始page凝膠上運(yùn)行。用4x電泳遷移率變動(dòng)分析(emsa)緩沖液(40mmtris-hcl，ph8.0,40％(v/v)超純甘油，0.4％(v/v)np40和400mmkcl)配制終體積為25μl的樣品，用tris-甘氨酸緩沖液(25mmtris，192mm甘氨酸)稀釋至1倍。分子量梯度和bsa用作分子量標(biāo)記，而肝素用作阿爾辛藍(lán)染色的陽(yáng)性對(duì)照。然后將凝膠用0.5％(w/v)阿爾辛藍(lán)的2％(v/v)乙酸溶液染色45分鐘，在2％(v/v)乙酸中脫色15分鐘，并在milliq水中過(guò)夜洗滌去除多余的染色。隨后，凝膠被銀染以顯現(xiàn)蛋白質(zhì)標(biāo)記物并增強(qiáng)阿爾辛藍(lán)染色的gag的對(duì)比度。親和分離的hs的hplc-尺寸排阻色譜-折射率(hplc-sec-ri)在具有waters2410折射率監(jiān)測(cè)器(范圍64)的waters2690alliance系統(tǒng)上使用串聯(lián)的tsk凝膠g4000pwxl(7.8mm×30cm)和tsk凝膠g3000pwxl(7.8mm×30cm)(tosohcorp.)獲得hplc-sec-ri色譜圖。用于ri定量的dn/dc設(shè)定為0.129(39)。注射樣品(50μg)，并在室溫下用50mm乙酸銨以0.5ml/min的流速洗脫。使用dawnastra軟件(版本4.73.04，wyatttechnologycorp.)收集和分析數(shù)據(jù)。分子量(mw)標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積基于在相同條件下運(yùn)行的肝素寡糖(iduron和dextralaboratories)的洗脫體積。在這兩種情況下，這些色譜柱的運(yùn)行時(shí)間均為100min。所有g(shù)ag樣品在水中的濃度為1mg/ml。用肝素裂解酶消化hs樣品hspm,hs16+ve和hs16-ve樣品溶解在水(1100μl)中并過(guò)濾(minisartrc15,0.2μm注射器過(guò)濾單元，sartoriusstedim，#17761)以除去任何顆粒物質(zhì)。作為進(jìn)一步的純化步驟，通過(guò)離心(4000rpm，1小時(shí)，15℃)將過(guò)濾的溶液通過(guò)2000mwco膜(vivaspin2，hydrosart，sartoriusstedim，#vs02h91,2000mwcohy膜，2ml超濾旋轉(zhuǎn)柱)。將滯留物用水(3×1ml)洗滌，從過(guò)濾器回收并凍干。將純化的hs樣品溶解在水(1mg/ml)中，并取每個(gè)冷凍干燥樣品的等分試樣(2x-1ml)用于分析?；赽rickman等人的方法(40)，但進(jìn)行了某些改動(dòng)，通過(guò)依次加入肝素裂解酶(肝素裂解酶i，ii和iii，ibextechnologies)將hs樣品消化為二糖和寡糖。將干燥的hs樣品再溶解于消化緩沖液(500μl；50mm磷酸鈉緩沖液，ph7.0)中，并向每個(gè)樣品中加入肝素裂解酶i(5μl；5miu)。將樣品孵育(37℃，2小時(shí))，在旋轉(zhuǎn)輪(9rpm)上輕輕混合。將肝素裂解酶iii(5μl；5miu)加入消化物中，并再孵育1小時(shí)(如上所述)。加入肝素裂解酶ii(5μl：5miu)，將消化物如上孵育18小時(shí)。最后，同時(shí)加入所有三種肝素裂解酶的等分試樣(5μl；5miu)，并將消化物再孵育24小時(shí)。通過(guò)加熱(100℃，5分鐘)終止酶消化。所有三個(gè)hs樣品一式兩份消化并通過(guò)具有uv檢測(cè)(232nm)的hplc分析。消化的hs樣品的hplc-sec-ri在具有waters2410折射率檢測(cè)器(范圍64)的waters2690聯(lián)盟系統(tǒng)上，使用兩個(gè)串聯(lián)的superdextm肽10/300gl柱(300×10mm，gehealthcare)獲得hplc-sec色譜圖。用于ri定量的dn/dc設(shè)定為0.129(39)。注射樣品(2mg/ml)(50μl；100μg)，并用50mm乙酸銨(0.5ml/min)在室溫下洗脫。在相同條件下運(yùn)行肝素寡糖標(biāo)準(zhǔn)品(iduron和dextralaboratories)。這些柱的運(yùn)行時(shí)間為120分鐘。使用dawnastra軟件(版本4.73.04，wyatttechnologycorp)收集和分析數(shù)據(jù)。通過(guò)hplc進(jìn)行二糖組成分析通過(guò)細(xì)菌肝素酶從高級(jí)豬肝素消化得到的十二種二糖標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自iduron。通過(guò)將二糖溶解在水(1mg/ml)中制備每種二糖標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備溶液。為了確定二糖標(biāo)準(zhǔn)物的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，從儲(chǔ)備溶液制備含有20μg/ml的每種二糖的標(biāo)準(zhǔn)混合物。用這十二個(gè)二糖標(biāo)準(zhǔn)混合物制備含有20,10,5,2.5,1.25,0.625和0.3125μg/ml的每種二糖的系列稀釋物。用水稀釋hspm,hs16+ve和hs16-ve消化物(2mg/ml)，得到100μg/ml溶液，然后使用親水性ptfe一次性注射器過(guò)濾器單元(0.2μm，13mm，advantec)過(guò)濾。hplc分離條件基于skidmore等人的文章。(41)。在agilent1260infinity液相色譜系統(tǒng)(agilenttechnologies)上進(jìn)行分析，在232nm處用agilent1260mwdvl檢測(cè)器監(jiān)測(cè)。hs衍生的二糖在具有保護(hù)柱的propactmpa1柱(thermoscientific，4mm×250mm)上分離。使用二元溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液a是ph3.5的水(用hcl調(diào)節(jié))，洗脫液b是ph3.5的2mnacl(用hcl調(diào)節(jié))。梯度程序如下：100％a從0-1分鐘，然后0-35％b從1-32分鐘，然后35-65％b從32-47分鐘，然后100％b從47-57分鐘，然后100％a從57-60分鐘。注射體積為50μl。該柱以1.0ml/min的流速洗脫并保持在40℃。通過(guò)與12種二糖標(biāo)準(zhǔn)混合物中的二糖的洗脫時(shí)間進(jìn)行比較，通過(guò)它們的洗脫時(shí)間鑒定hs消化物中存在的二糖。hs16+和hs16-消化物每個(gè)重復(fù)消化注射兩次(總共4次注射)，而hspm樣品每個(gè)重復(fù)消化注射一次(總共2次注射)。纖溶酶消化為了測(cè)定各種gag保護(hù)tgf-β1免受蛋白水解消化的能力，將tgf-β1(100ng)與10μghep，hspm，hs16+ve或hs16-ve或單獨(dú)在pbs中，在室溫下預(yù)孵育10分鐘。通過(guò)向tgf-β1樣品中加入0.5mu纖溶酶并在37℃孵育1.5小時(shí)進(jìn)行纖溶酶消化。隨后將樣品在4-12％sds-page凝膠上電泳并通過(guò)銀染色顯色。將所有樣品制備成在pbs中的10μl的最終體積。堿性磷酸酶(alp)測(cè)定為了測(cè)定hs16+ve對(duì)bmp-2活性的影響，將c2c12小鼠成肌細(xì)胞以20,000細(xì)胞/cm2接種在完全c2c12培養(yǎng)基(dmem-lg，10％(v/v)fcs，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，并允許貼壁24小時(shí)。然后用具有或不具有100ng/mlbmp-2和/或5μg/mlhs16+ve，hs3+ve或hspm的處理培養(yǎng)基(dmem-lg，5％(v/v)fcs，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)替換完全培養(yǎng)基，并將細(xì)胞孵育3天。然后將總細(xì)胞裂解物收集在含有蛋白酶抑制劑混合物(calbiochem，merckmillipore，ma，usa)的ripa緩沖液中，并使用bca蛋白測(cè)定試劑盒(thermofisherscientific)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過(guò)在37℃下將5μg蛋白質(zhì)與對(duì)硝基苯磷酸酯(sigma-aldrich)孵育1小時(shí)并讀取405nm處的吸光度變化來(lái)測(cè)量alp活性。單獨(dú)的ripa緩沖液和1μl(10,000u/ml)的小牛腸磷酸酶(newenglandbiolabsltd，ontario，canada)分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品一式兩份讀取，得到每個(gè)處理組總共4個(gè)讀數(shù)。hmscs的肝素酶處理為了評(píng)估內(nèi)源性hs對(duì)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，將hmsc以7,500個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的12孔板中，并使其貼壁過(guò)夜。然后將肝素酶i，ii和iii(每種為1.2miu/ml)的組合加入到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中并孵育24小時(shí)。然后將細(xì)胞暴露于tgf-β1處理(所述tgf-β1處理以1ng/ml或5ng/ml的劑量單獨(dú)制備或在室溫下與10μg/ml或40μg/ml完全長(zhǎng)度肝素共同預(yù)孵育)6小時(shí)，然后裂解用于在2xlaemmli緩沖液中的免疫印跡。處理在無(wú)血清培養(yǎng)基(補(bǔ)充有100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和2mml-谷氨酰胺的dmem-lg)中制備，以避免當(dāng)將新鮮血清加入細(xì)胞時(shí)觀(guān)察到的psmad本底水平增加。肝素酶消化的細(xì)胞的免疫熒光染色為了確保肝素酶處理有效地從hmsc中去除了內(nèi)源性hs鏈，將細(xì)胞以3,500個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的8孔腔室載玻片中。使細(xì)胞附著過(guò)夜，然后用直接加入每個(gè)孔的肝素酶i，ii和iii(每種1.2miu/ml)的組合處理24小時(shí)。隨后，將細(xì)胞在室溫下在pbs中的4％(w/v)多聚甲醛中固定10分鐘，在室溫下用在pbs中的3％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)封閉30分鐘，然后與抗-hs10e4抗體(在0.3％(w/v)bsa-pbs中1:25稀釋)(amsbiotechnology，abingdon，uk)在室溫下孵育3小時(shí)。然后將細(xì)胞與抗小鼠igm-fitc抗體(在0.3％(w/v)bsapbs中1:500稀釋)(bdpharmingentm，becton，dickinsonandcompany，nj，usa)在室溫下孵育45分鐘，用hoechst33342(2μg/ml的pbs溶液)(lifetechnologies)在室溫下染色細(xì)胞核10分鐘。樣品在olympusix-81上成像。結(jié)果肝素與tgf-β1結(jié)合并增強(qiáng)其活性為了確定肝素對(duì)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，我們首先確定肝素能夠結(jié)合tgf-β1。spr和gag-結(jié)合板測(cè)定證明了tgf-β1以劑量依賴(lài)性方式結(jié)合到已經(jīng)固定在96-孔板中(圖1a)或生物素化并固定在biacoresa-芯片上的肝素(圖1b)。我們的數(shù)據(jù)表明tgf-β1以約0.475μm的kd結(jié)合肝素(圖1b)。這種與肝素的結(jié)合賦予了tgf-β1增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，如通過(guò)dsf測(cè)定的(圖2a)。tgf-β1同源二聚體包含9個(gè)二硫鍵，4個(gè)鏈內(nèi)和1個(gè)鏈間，這賦予它高度的熱穩(wěn)定性。這通過(guò)對(duì)單獨(dú)的tgf-β1觀(guān)察到的66℃的高熔融溫度得到了證明(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)我們測(cè)試前提即肝素與tgf-β1的結(jié)合將通過(guò)引入新的、非共價(jià)的分子間鍵而進(jìn)一步增加其熱穩(wěn)定性時(shí)，有必要將蛋白的熔解溫度降低至該測(cè)定可以檢測(cè)到的水平。這通過(guò)向反應(yīng)中加入10mmdtt來(lái)實(shí)現(xiàn)，其減少蛋白內(nèi)的二硫鍵，從而降低其熱穩(wěn)定性。這導(dǎo)致tgf-β1的熔解溫度從66℃變?yōu)?4℃。加入肝素后，看到表示tgf-β1的熔解溫度的峰向右移動(dòng)，蛋白的熔解溫度升至47.5℃。下一步是確定肝素和tgf-β1之間的相互作用是否影響tgf-β1信號(hào)通路。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，用不同量的肝素和tgf-β1處理hmsc，并在處理后1,6和24小時(shí)收獲蛋白，以檢查psmad2和psmad3的水平(圖2b)。在處理后1小時(shí)，psmad2和psmad3水平在用tgf-β1和肝素處理的所有細(xì)胞中都飽和(數(shù)據(jù)未顯示)。在用單獨(dú)的肝素處理的任何細(xì)胞中沒(méi)有觀(guān)察到可識(shí)別水平的psmad2和psmad3，這表明肝素本身不能激活tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在處理后6小時(shí)，所有細(xì)胞中的psmad水平開(kāi)始消退。然而，已經(jīng)用肝素和tgf-β1處理的細(xì)胞顯示psmad2和psmad3的水平分別比用等量的不含肝素的tgf-β1處理的細(xì)胞高約1.6和約1.35倍(圖2b)。類(lèi)似地，與用單獨(dú)的tgf-β1處理的細(xì)胞相比，用肝素和tgf-β1二者處理的細(xì)胞中24小時(shí)后的psmad水平依然更高(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)首先表明，較高劑量的tgf-β1(5ng/ml對(duì)1ng/ml)產(chǎn)生持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的psmad信號(hào)。其次，它們還表明肝素能夠延長(zhǎng)psmad信號(hào)的半衰期，超過(guò)通常對(duì)單獨(dú)的生長(zhǎng)因子觀(guān)察到的半衰期。為了進(jìn)一步調(diào)查這種影響，我們繼續(xù)檢查在hmscs的軟骨形成分化的早期階段表達(dá)的tgf-β1靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。在培養(yǎng)基(單獨(dú)的tgf-β1)或培養(yǎng)基+hep(tgf-β1+肝素)的存在下進(jìn)行hmsc的軟骨形成分化。在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，在培養(yǎng)基+hep培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微細(xì)胞團(tuán)顯示出約5倍更高水平的sox9和compmrna轉(zhuǎn)錄物(圖2c)?？傊瑪?shù)據(jù)表明肝素能夠結(jié)合tgf-β1，并且這種結(jié)合增強(qiáng)細(xì)胞中所見(jiàn)的tgf-β1信號(hào)。確定了肝素確實(shí)加強(qiáng)tgf-β1的活性之后，我們接下來(lái)試圖排除肝素通過(guò)一些間接途徑而不是通過(guò)tgf-β1信號(hào)途徑產(chǎn)生這些作用的可能性。為此，使用了sb431542，一種tgf-βi型受體抑制劑(42)。用sb431542處理hmsc導(dǎo)致3日齡軟骨形成性微細(xì)胞團(tuán)中sox9和comp基因表達(dá)的減少(圖2d)。數(shù)據(jù)表明tgf-β1活性在受體水平的抑制抵消了肝素的tgf-β1增強(qiáng)作用，這再次意味著肝素通過(guò)調(diào)節(jié)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)tgf-β1活性發(fā)揮其作用。tgf-β1結(jié)合和活性的肝素長(zhǎng)度要求我們接下來(lái)試圖確定結(jié)合tgf-β1所需的肝素的最小長(zhǎng)度?？扇艿?、大小分級(jí)的肝素片段(dp4至dp24)競(jìng)爭(zhēng)性抑制tgf-β1與肝素涂覆的sa芯片結(jié)合的能力與其長(zhǎng)度成比例增加(圖3a)。tgf-β1結(jié)合能力的這種增加似乎從dp18往上達(dá)到了平臺(tái)期，其競(jìng)爭(zhēng)水平類(lèi)似于對(duì)于未分級(jí)的全長(zhǎng)肝素(hep)所見(jiàn)的競(jìng)爭(zhēng)水平。從gag-結(jié)合板測(cè)定獲得的結(jié)果還表明，當(dāng)肝素鏈的長(zhǎng)度從14(dp14)增加至24(dp24)糖單位時(shí)，tgf-β1與肝素的結(jié)合改善(圖3b)。短于dp14(即dp4-12)的肝素鏈不能有效結(jié)合tgf-β1(數(shù)據(jù)未顯示)。用不同長(zhǎng)度的肝素片段和tgf-β1處理的細(xì)胞中，在處理后1小時(shí)psmad2和psmad3水平的蛋白質(zhì)印跡分析顯示兩種psmad信號(hào)飽和(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在處理后6小時(shí)，我們預(yù)期觀(guān)察到各種(dp14-24)肝素片段的增強(qiáng)活性的長(zhǎng)度依賴(lài)性增加，dp24-tgf-β1組合具有預(yù)期的最大的psmad信號(hào)，盡管仍然低于用未分級(jí)肝素(hep)和tgf-β1處理的細(xì)胞中觀(guān)察到的。相反，我們觀(guān)察到已經(jīng)用tgf-β1和dp18和dp22之間的肝素片段處理的細(xì)胞顯示比用未分級(jí)肝素和tgf-β1處理的細(xì)胞中觀(guān)察到的psmad水平更高的psmad水平，其中信號(hào)在dp20-tgf-β1組合情況下達(dá)到峰值(圖3c)。這表明肝素鏈的長(zhǎng)度對(duì)其加強(qiáng)tgf-β1信號(hào)的能力施加相當(dāng)大的影響。tgf-β1結(jié)合和活性的肝素硫酸化要求鑒于肝素-蛋白相互作用的主要離子性質(zhì)，我們接下來(lái)開(kāi)始檢查肝素中的各種硫酸基團(tuán)對(duì)其與tgf-β1之間的相互作用的影響。biacore競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定表明，肝素的2-o硫酸基團(tuán)的損失(2-o-de)對(duì)其競(jìng)爭(zhēng)性抑制tgf-β1結(jié)合固定化肝素的能力具有最小的影響(圖4a)。6-o硫酸基團(tuán)的損失(6-o-de)導(dǎo)致大約40％的tgf-β1結(jié)合能力的損失，而n-硫酸基團(tuán)的損失消除了肝素結(jié)合tgf-β1的能力。相比之下，gag結(jié)合板測(cè)定表明，與完全硫酸化的全長(zhǎng)肝素(hep)相比，從肝素去除2-o硫酸基團(tuán)(2-o-de)減少了tgf-β1結(jié)合約60％(圖4b)。去除6-o硫酸基團(tuán)(6-o-de)使tgf-β1的能力降低約80％，并且n-硫酸化的缺乏(n-de)再次基本上消除了tgf-β1的結(jié)合。有趣的是，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試時(shí)，獲得的結(jié)果與評(píng)估各種肝素長(zhǎng)度時(shí)所見(jiàn)的結(jié)果一樣可變。不同于我們預(yù)期的在用2-o-脫硫的肝素(2-o)處理6小時(shí)的細(xì)胞的psmad水平中相對(duì)于完全硫酸化的肝素的減少，我們觀(guān)察到水平增加至超過(guò)了在肝素處理的細(xì)胞中觀(guān)察到的(圖4c)，表明2-o-脫硫肝素增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)甚至超過(guò)完全硫酸化肝素。類(lèi)似地，6-o-硫酸化(6-o)的去除也導(dǎo)致了psmad水平的穩(wěn)定(相對(duì)于在肝素處理的細(xì)胞中觀(guān)察到的)。然而，n-硫酸化(n)的損失沒(méi)有導(dǎo)致相對(duì)于肝素處理的細(xì)胞的psmad水平的增加?？偟膩?lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)表明，肝素中2-o-硫酸化的喪失以及較小程度的6-o-硫酸化實(shí)際上提高了肝素增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)的能力，表明結(jié)合強(qiáng)度和生物活性的關(guān)系不是線(xiàn)性的。鑒定tgf-β1肝素結(jié)合位點(diǎn)由于肝素已知與許多易感生長(zhǎng)因子中存在的堿性殘基的構(gòu)型相互作用，我們的下一個(gè)目標(biāo)是鑒定tgf-β1中的實(shí)際肝素結(jié)合位點(diǎn)。在tgf-β1上鑒定推定的肝素結(jié)合位點(diǎn)的先前研究通過(guò)鑒定存在于線(xiàn)性蛋白質(zhì)序列中的肝素結(jié)合基序來(lái)進(jìn)行(2,4)。然而，這種方法沒(méi)有考慮蛋白質(zhì)的完整3維(3d)構(gòu)象性質(zhì)，因此不能鑒定僅可從蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)的肝素結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們決定采用ori等人開(kāi)發(fā)的保護(hù)和標(biāo)簽策略(37)以確定這些3d位點(diǎn)是否存在于tgf-β1內(nèi)。我們的分析鑒定了表現(xiàn)出參與tgf-β1與肝素結(jié)合的8種賴(lài)氨酸(k13，k26，k31，k37，k60，k95，k97和k110)(圖5a，表1)。在這8個(gè)中，基于ms/ms測(cè)序，7個(gè)具有高水平的置信度。剩余的賴(lài)氨酸k60被鑒定為具有中等的置信水平，表明其與肝素的相互作用是間歇的，并且對(duì)于tgf-β1與肝素的結(jié)合可能不是必需的，因此也支持lyon等人提出的當(dāng)前結(jié)合模型(2)。在這些鑒定出的賴(lài)氨酸中，除了其中的兩個(gè)，k13和k110，所有賴(lài)氨酸之前已經(jīng)鑒定為tgf-β1的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一部分(圖5a)。當(dāng)定位到3d結(jié)構(gòu)上時(shí)，k13與k26定位到相同的底表面上，k26已被提出是肝素結(jié)合的必要?dú)埢?圖5b)。k110定位到沿著tgf-β1單體之間的界面。然而，k110似乎嵌入在蛋白內(nèi)，因此很可能這個(gè)結(jié)果是假陽(yáng)性，因?yàn)閠gf-β1的“粘性”性質(zhì)導(dǎo)致從肝素小柱洗脫蛋白需要使用酸敏感性去污劑(rapigesttmsf表面活性劑)，而不是2mnacl。使用這種洗滌劑洗脫導(dǎo)致蛋白在標(biāo)記/生物素化步驟之前變性，使得通常嵌入蛋白核心內(nèi)的殘基暴露并被錯(cuò)誤標(biāo)記。分離親和力選擇的tgf-β1-結(jié)合性hs(hs16+ve)已經(jīng)確定了肝素-tgf-β1相互作用的結(jié)構(gòu)特征和要求，我們的下一個(gè)目標(biāo)是從構(gòu)成市售hspm制劑的異質(zhì)池中分離hs的tgf-β1結(jié)合部分。為此，我們首先設(shè)計(jì)了源自tgf-β1的肝素結(jié)合肽(圖6a)并測(cè)試了其結(jié)合3h-肝素的能力(圖6b)。然后使用我們的hs親和分離平臺(tái)(如先前murali等人所述(29))將tgf-β1肽用于分離hs的tgf-β1結(jié)合群體。未結(jié)合到柱的hs稱(chēng)為hs16-ve，而用1.5mnacl從柱洗脫的tgf-β1-結(jié)合性hs稱(chēng)為hs16+ve(圖6c)。表1.通過(guò)保護(hù)和標(biāo)記結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到的肽的概述。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定標(biāo)記的肽，并通過(guò)mascotsearchversion2.3(matrixscience)分析。這里，提供了參與肝素結(jié)合位點(diǎn)和標(biāo)記位置的肽的概述。a殘基編號(hào)根據(jù)圖5a然后進(jìn)行質(zhì)子nmr，hplc-sec-ri和二糖組成分析以確定hspm,hs16+ve和hs16-ve之間是否存在任何系統(tǒng)差異。三個(gè)hs樣品的nmr分析顯示了幾個(gè)細(xì)微的差異(箭頭，圖7a)，而來(lái)自sec的色譜圖表明hs16+ve主要由總是比在hspm和hs16-ve中觀(guān)察到的那些更大的hs鏈組成(圖7b)。三個(gè)hs樣品的nmr譜中最顯著的差異是在hs16+ve的約5.4ppm處的信號(hào)強(qiáng)度的輕微降低(箭頭，圖7a)，其歸于葡糖胺乙酸鹽甲基共振,如guerrini等先前所描述的[complexglycosaminoglycans:profilingsubstitutionpatternsbytwo-dimensionalnuclearmagneticresonancespectroscopy.analbiochem,2005.337(1):p.35-47.].該降低表明與其它兩種級(jí)分相比，hs16+ve中的n-硫酸化水平略高?；趲追N肝素大小標(biāo)準(zhǔn)品(dp8,12,20和26)的洗脫時(shí)間，我們的數(shù)據(jù)還表明hs16+ve由長(zhǎng)于26個(gè)糖的hs鏈組成。最后，三種hs樣品消化物的二糖組成分析顯示，雖然hspm和hs16-ve相似，但是hs16+ve富含δua-glcns，6s和δua，2s-glcns，6s并且含有較少的δua-glcnac，δua-glcns，δua，2s-glcnac和δua，2s-glcns(圖7c，表2)。綜合起來(lái)，數(shù)據(jù)表明，就尺寸分布和組成這二者而言，組成hs16+ve的hs池與hs16-ve和hspm顯著不同。此外，在hs16+中觀(guān)察到的δua，2s-glcnac和δua，2s-glcns的相對(duì)減少證實(shí)了我們?cè)缙陉P(guān)于從肝素中損失2-o-硫酸如何實(shí)際上增加其對(duì)tgf-β1的生物活性的研究結(jié)果(圖4)。已知hs鏈在鏈長(zhǎng)度方面顯著變化[esko,j.d.,k.kimata,andu.lindahl,proteoglycansandsulfatedglycosaminoglycans,inessentialsofglycobiology,a.varki,等,editors.2009,coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,newyork.]，這部分解釋了它們結(jié)合這么多種蛋白質(zhì)的能力。為了增強(qiáng)hs制劑對(duì)給定蛋白的相對(duì)特異性，有必要減少這種變異性。我們檢查了三個(gè)hs樣品中多糖鏈的大小分布。通過(guò)天然page分析三個(gè)樣品和肝素顯示與hs16-ve和hspm相比，hs16+ve主要由更長(zhǎng)的hs鏈組成。使用比hs同質(zhì)性更高的肝素來(lái)評(píng)價(jià)hs制劑中存在的高度異質(zhì)性。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行尺寸排阻色譜(hplc-sec-ri)。來(lái)自sec的色譜圖表明hs16+ve由約dp8至>dp26的hspm的多分散子集組成(圖7b)。然而，hs16+ve群體富含具有更長(zhǎng)鏈長(zhǎng)度(>dp26)的hs，這證實(shí)了我們來(lái)自天然page的數(shù)據(jù)和我們關(guān)于肝素結(jié)合tgf-β1的長(zhǎng)度要求的發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)表明，就尺寸分布和組成二者而言，構(gòu)成hs16+ve的hs池與hs16-ve和hspm顯著不同。此外，在hs16+ve中觀(guān)察到的δua，2s-glcnac和δua，2sglcns的相對(duì)減少證實(shí)了較早的觀(guān)察，即肝素的2-o硫酸的損失實(shí)際上能夠增加其對(duì)tgf-β1的生物活性(圖4c)。δua，2s-glcns，6s的增加的相對(duì)比例可能是由于肽優(yōu)先富集具有n-和6-o-硫酸化的糖，而不管是否存在2-o-硫酸化。表2.肝素裂解酶消化的hs樣品的二糖組成hs樣品用肝素裂解酶i，ii和ii消化，并且通過(guò)hplc分離所得的二糖。通過(guò)將它們的洗脫時(shí)間與已知的二糖標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫時(shí)間進(jìn)行比較來(lái)鑒定二糖，并且用幾個(gè)校準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算它們?cè)诿總€(gè)hs樣品中的比例。hs16+ve結(jié)合并加強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)考慮到hs16+ve與hs16-ve和hspm的組成的差異，我們接下來(lái)開(kāi)始研究這些差異是否導(dǎo)致任何功能結(jié)果。在biacore競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中檢查這些hs級(jí)分結(jié)合tgf-β1的能力表明hs16+ve能夠以比hs16-ve或hspm高得多的親和力結(jié)合tgf-β1(圖8a)。由于使用tgf-β1衍生肽分離hs16+ve，評(píng)估糖掩蓋蛋白上的堿性殘基的能力是重要的。為此，我們用tgf-β1預(yù)結(jié)合糖(hep，hspm，hs16+ve和hs16-ve)，并對(duì)其進(jìn)行纖溶酶消化?？紤]到纖溶酶優(yōu)先切割賴(lài)氨酸和精氨酸殘基的羧基面，我們推斷如果糖以一定程度的特異性結(jié)合tgf-β1，它將賦予蛋白針對(duì)纖溶酶的一定程度的保護(hù)。纖溶酶消化產(chǎn)物的銀染顯示，hs16+ve(tgf-β1+hs16+ve)比任何其他測(cè)試的糖，包括肝素(tgf-β1+hep)，能更好地保護(hù)tgf-β1免于纖溶酶消化(圖8b)。在體外系統(tǒng)中，hs16+ve能夠在hmsc中通過(guò)psmad2和psmad3增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至與肝素類(lèi)似的程度(圖8c)。有趣的是，hspm和hs16-ve不能引起類(lèi)似的反應(yīng)，這佐證了我們?cè)缙诘陌l(fā)現(xiàn)，即hs16+ve在組成和功能上不同于hspm和hs16-ve。由于大多數(shù)tgf-β1在體內(nèi)以無(wú)活性形式存在，稱(chēng)為休眠tgf-β1(ltgf-β1)，且hs16+ve已從hspm庫(kù)中分離，我們接下來(lái)試圖探索hs16+ve可能具有的對(duì)ltgf-β1的功能。我們的數(shù)據(jù)表明，再一次，hs16+ve能夠比肝素(hep)，hspm和hs16-ve更顯著地加強(qiáng)ltgf-β1誘導(dǎo)的psmad信號(hào)(圖10a)?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的數(shù)據(jù)顯示，與hspm起始材料和非結(jié)合hs16-ve相比，hs16+ve分離物能更好地結(jié)合并增強(qiáng)由tgf-β1驅(qū)動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，與hspm起始材料和非結(jié)合hs16-ve相比，hs16+ve能夠增強(qiáng)由生理上更豐富的ltgf-β1驅(qū)動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。hmscs的分離和表征為了檢查肝素-tgf-β1相互作用的生物效應(yīng)，有必要分離原代hmsc。購(gòu)買(mǎi)市售的骨髓細(xì)胞(lonza)，通過(guò)塑料粘附分離hmsc。隨后將0代細(xì)胞擴(kuò)增并以每小瓶1×106個(gè)細(xì)胞批次冷凍。通過(guò)facs篩選細(xì)胞在第5代時(shí)的msc表面標(biāo)志物表達(dá)，如dominici等人[minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.theinternationalsocietyforcellulartherapypositionstatement.cytotherapy,2006.8(4):p.315-317.]。超過(guò)95％的分離的hmsc表達(dá)cd73，cd90和cd105，而cd14，cd19，cd34，cd45和hla-dr不表達(dá)。分離的細(xì)胞還能夠在體外分化成成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。因此，通過(guò)塑料粘附分離的細(xì)胞被認(rèn)為滿(mǎn)足hmsc的最低標(biāo)準(zhǔn)特征。肝素對(duì)hmscs中tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響分離原代hmscs后，我們接下來(lái)檢查肝素和tgf-β1之間的相互作用是否可以影響對(duì)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答，其通過(guò)smad2和smad3的下游磷酸化來(lái)測(cè)量。肝素已顯示出增強(qiáng)tgf-β1在原代大鼠和牛平滑肌細(xì)胞(smc)和ccl64貂肺上皮細(xì)胞系中的作用，但不是在原代人隱靜脈(smc)中的作用[mccaffrey，ta等，transforminggrowthfactor-betaactivityispotentiatedbyheparinviadissociationofthetransforminggrowthfactorbeta/alpha2-macroglobulininactivecomplex.jcellbiol,1989.109(1):p.441-44；mccaffrey,t.a.等,protectionoftransforminggrowthfactorβactivitybyheparinandfucoidan.jcellphysiol,1994.159(1):p.51-59.]。因此，我們假設(shè)，如果肝素在hmsc中增強(qiáng)tgf-β1活性，那么當(dāng)來(lái)自單獨(dú)的tgf-β1的psmad2和psmad3信號(hào)開(kāi)始消退才能看到效果。因此，為我們的初始tgf-β1給藥實(shí)驗(yàn)選擇的時(shí)間點(diǎn)為6,12,24和48小時(shí)。用一系列tgf-β1劑量處理第5代細(xì)胞，并在處理后6,12,24和48小時(shí)收集全細(xì)胞裂解物。然后在4-12％(w/v梯度)sds-page凝膠上分離溶菌產(chǎn)物樣品，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡方法探測(cè)磷酸-dsd2(psmad2)(138d4，cellsignalingtechnology)，磷酸-smad3(psmad3)c25a9，cellsignalingtechnology)，總smad2/3(cellsignalingtechnology)和肌動(dòng)蛋白(clonec4，merckmillipore)。我們的研究結(jié)果表明沒(méi)有tgf-β1(0ng/ml)，有低背景水平的psmad2和psmad3信號(hào)。使用1ng/ml，psmad2信號(hào)在處理后6小時(shí)相當(dāng)強(qiáng)烈，并在12小時(shí)以后開(kāi)始消退。psmad3信號(hào)與psmad2信號(hào)類(lèi)似，盡管強(qiáng)度較低。對(duì)于5ng/ml和10ng/mltgf-β1，觀(guān)察到psmad2信號(hào)在所測(cè)試的所有時(shí)間點(diǎn)都保持飽和，但是psmad3信號(hào)在24小時(shí)后恢復(fù)背景水平。因此選擇6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們的下一個(gè)目標(biāo)是確定用于我們的實(shí)驗(yàn)的肝素的劑量。正如mccaffrey等(supra)]先前已報(bào)道的，肝素的有效tgf-β1增強(qiáng)劑量在1-100μg/ml之間，我們選擇使用該范圍內(nèi)的劑量。與用相同劑量的單獨(dú)tgf-β1處理的細(xì)胞相比，用10μg/ml肝素預(yù)孵育的1ng/mltgf-β1處理的細(xì)胞維持了更強(qiáng)的psmad2和psmad3信號(hào)(圖3.12)。較高劑量的肝素(40μg/ml)不能用1ng/ml的tgf-β1引起相同的效果。當(dāng)用5ng/mltgf-β1預(yù)孵育時(shí)，兩種劑量的肝素都不能增強(qiáng)psmad信號(hào)超過(guò)單獨(dú)從生長(zhǎng)因子獲得的信號(hào)?？傊覀兊慕Y(jié)果表明肝素延長(zhǎng)而不是增強(qiáng)由tgf-β1產(chǎn)生的psmad信號(hào)。我們接下來(lái)試圖檢查細(xì)胞表面hs可能對(duì)tgf-β1驅(qū)動(dòng)的smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。為此，在hmsc培養(yǎng)基中用肝素酶i，ii和iii(各1.2miu/ml)處理第5代細(xì)胞24小時(shí)，然后在無(wú)血清培養(yǎng)基中用含或不含肝素的tgf-β1處理。用于蛋白質(zhì)印跡的6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)需要在肝素酶處理后使用無(wú)血清培養(yǎng)基，以避免血清中的生長(zhǎng)因子對(duì)smad2和3的背景水平可能具有的影響。用抗hs10e4抗體對(duì)細(xì)胞表面hs的免疫熒光染色顯示，在24小時(shí)處理后，幾乎所有的細(xì)胞表面hs都被除去。然而，細(xì)胞表面hs的去除似乎不影響當(dāng)用tgf-β1處理細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的psmad信號(hào)。我們的研究結(jié)果表明肝素在加強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用不同于它在fgf-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[schlessinger,j.等,crystalstructureofaternaryfgf-fgfr-heparincomplexrevealsadualroleforheparininfgfrbindinganddimerization.molecularcell,2000.6(3):p.743-750.].hs16+ve和bmp-2-結(jié)合性hs(hs3+ve)的比較已經(jīng)顯示hs16+ve增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，我們(繼而)感興趣的是確定其是否可以類(lèi)似地增強(qiáng)tgf-β超家族的其他成員的活性。我們的小組先前報(bào)道了hs級(jí)分即hs3+ve(其增強(qiáng)bmp-2的活性)的親和分離[murali,s.等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605；wo2010/030244]。兩種蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性保證了hs16+ve和hs3+ve的組成的比較(圖12)。發(fā)現(xiàn)hs3+ve和hs16+ve含有相似量的δua-glcnac，δua-glcns和δua，2s-glcns，而hs16+ve含有比hs3+ve更多的δua-glcnac,6s,δua-glcns,6s和δua,2s-glcns,6s，以及更少的δua,2s-glcnac。必須注意的是，hs3+ve的組成通過(guò)毛細(xì)管電泳(ce)測(cè)定，而hs16+ve和hspm的組成通過(guò)hplc測(cè)定，因此在后兩個(gè)樣品中沒(méi)有檢測(cè)到δua，2s-glcnac，6s二糖。有人可能認(rèn)為，不能檢測(cè)到這種二糖將改變hs變體的組成特征，但是使用ce方法的先前的hspm分析產(chǎn)生了與hplc獲得的組成分布類(lèi)似的組成分布，不含δua，2s-glcnac，6s二糖。hs16+ve和hs3+ve的組成中觀(guān)察到的差異對(duì)其活性具有功能性后果。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)在基于spr的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中hs16+ve結(jié)合bmp-2比hs3+ve更好(圖13)。然而，當(dāng)研究其在小鼠c2c12成肌細(xì)胞系中增強(qiáng)bmp-2驅(qū)動(dòng)的堿性磷酸酶(alp)表達(dá)的能力時(shí)，hs16+ve和bmp-2的組合不能實(shí)現(xiàn)當(dāng)hs3+ve與bmp-2一起使用時(shí)的相同alp表達(dá)水平(圖14)。總的來(lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)顯示，使用tgf-β1肽親和純化的hs在組成上不同于原始hs制劑，將結(jié)合全長(zhǎng)蛋白并以其活性和休眠形式增強(qiáng)其活性。此外，用tgf-β1肽純化的hs不同于用bmp-2肽純化的hs，并且該差異足以改變或調(diào)節(jié)其對(duì)tgf-β1的活性并減少未分級(jí)hspm的異質(zhì)效應(yīng)。討論在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)表明肝素能夠結(jié)合到tgf-β1，并因此增強(qiáng)了生長(zhǎng)因子的熱穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定化似乎延長(zhǎng)了hmsc中tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的半衰期。在軟骨形成分化條件下，這種肝素介導(dǎo)的強(qiáng)化作用增強(qiáng)了早期軟骨形成基因的表達(dá)。我們的發(fā)現(xiàn)支持這樣的想法，即肝素對(duì)這種軟骨形成基因表達(dá)的增強(qiáng)效應(yīng)的發(fā)生是由于肝素通過(guò)tgf-β1信號(hào)通路起作用，并且需要18-22糖長(zhǎng)度之間的gag鏈以最佳地結(jié)合tgf-β1并加強(qiáng)其信號(hào)。三元tgf-β1配體-受體復(fù)合物的研究表明，更長(zhǎng)的肝素鏈可能干擾tgf-βii型受體(tβrii)與tgf-β1在復(fù)合物形成期間的結(jié)合(43)。盡管結(jié)合親和力降低，但是2-o硫酸化的損失以及較小程度的6-o硫酸化實(shí)際上提高了肝素增強(qiáng)tgf-β1信號(hào)的能力。加上我們?cè)缙陉P(guān)于肝素鏈長(zhǎng)度的影響的研究結(jié)果，這些結(jié)果為當(dāng)前的hs“糖代碼”假說(shuō)(44-47)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，并支持了結(jié)合強(qiáng)度和生物活性之間的非線(xiàn)性關(guān)系的想法(48)。我們還鑒定了k13作為參與肝素結(jié)合的tgf-β1單體上的新殘基。在該數(shù)據(jù)的指導(dǎo)下，我們繼續(xù)從獲自豬粘膜制劑的異質(zhì)混合物中分離優(yōu)先結(jié)合tgf-β1的hs群體(hs16+ve)。hs16+ve的表征證明它在組成上不同于hspm和hs16-ve，并且這種差異使得它能夠更好地結(jié)合并加強(qiáng)hmsc中的tgf-β1和ltgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。以前的研究表明，肝素將結(jié)合tgf-β1并保護(hù)其免受α2-巨球蛋白的蛋白酶活性和循環(huán)清除，從而增強(qiáng)其信號(hào)(3,5)。這導(dǎo)致其在一些軟骨修復(fù)研究中用作tgf-β載體或作為支架材料(49,50)。一些研究甚至利用肝素控制在鼠msc的軟骨形成誘導(dǎo)過(guò)程中生長(zhǎng)因子的釋放(51)。然而，這種糖不太可能被廣泛采用作為組織修復(fù)或生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的治療劑，不僅因?yàn)椴皇芸刂频某鲅脱“鍦p少的風(fēng)險(xiǎn)(52),而且因?yàn)楦嗡氐倪^(guò)硫酸化意味著能夠預(yù)先結(jié)合超過(guò)200種不同的細(xì)胞外蛋白，統(tǒng)稱(chēng)為肝素相互作用體或肝素體(53,54)。這意味著肝素不具有足夠的特異性用于體內(nèi)系統(tǒng)(其中生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生和定位不容易控制)中的靶向生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)。然而，我們的體外數(shù)據(jù)表明肝素可以用于在hmsc軟骨分化過(guò)程中延長(zhǎng)tgf-β1活性，這表明如果這些固有的局限性可以克服，將實(shí)現(xiàn)一種治療潛力。使用hs代替肝素理論上可以克服這些障礙，因?yàn)閔s不具有肝素的抗凝血活性(55)。然而，hs確實(shí)產(chǎn)生其自身的一系列問(wèn)題，包括原始制備物的高度可變性。然而，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出克服這些困難的技術(shù)(26,27,29)并且通過(guò)利用這些技術(shù)中的一種(29)，我們能夠證明了可以分離優(yōu)先結(jié)合特定生長(zhǎng)因子的hs選擇性亞群。值得注意的是，雖然使用了tgf-β1衍生肽分離hs16+，但hs16+ve也能夠調(diào)節(jié)ltgf-β1的作用，ltgf-β1是生理上豐富的tgf-β1體內(nèi)形式。有趣的是，已報(bào)道肝素抑制ltgf-β1的活化(56)，而hs16+ve不抑制。這提出了關(guān)于在正常和改變的生理狀態(tài)期間細(xì)胞體內(nèi)合成tgf-β1-結(jié)合性hs的有趣問(wèn)題。這里報(bào)道的工作為未來(lái)tgf-β1-hs研究奠定了基礎(chǔ)，并建立在lyon等人提出的結(jié)合模型上。(2)。我們的數(shù)據(jù)將k13鑒定為新的殘基，其似乎通過(guò)穿過(guò)凹槽(在蛋白單體之間延伸)的多肽的空間定向而影響肝素與tgf-β1的結(jié)合(圖9)。此外，最近的幾個(gè)大肝素片段的結(jié)構(gòu)解決方案(57)使我們能夠比較和驗(yàn)證我們關(guān)于tgf-β1和肝素結(jié)構(gòu)的物理測(cè)量的體外研究結(jié)果。目前，ltgf-β1結(jié)構(gòu)的有限知識(shí)(58-60)也引起了關(guān)于肝素和hs對(duì)調(diào)節(jié)這種較大蛋白的活性的作用的問(wèn)題(補(bǔ)充圖s1b，c)。tgf-β1首先合成為前蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)裂解以產(chǎn)生小的休眠復(fù)合物(slc)。成熟slc由tgf-β1二聚體組成，非共價(jià)連接到二聚的休眠相關(guān)肽(lap)。對(duì)于迄今研究的大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，slc與休眠型tgf-β1結(jié)合蛋白-1(ltbp-1)一起釋放，從而形成大的休眠復(fù)合物(llc)(61)。ltbp-1通過(guò)與多種粘附蛋白相互作用將休眠tgf-β1推入細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)(62)，從而產(chǎn)生休眠性tgf-β1的儲(chǔ)備物，這些儲(chǔ)備物被激活(細(xì)胞介導(dǎo)的激活)后成為可以使用的。盡管lap具有被認(rèn)為是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但是分子的兩個(gè)區(qū)域可以解折疊從而在slc中捕獲tgf-β1(60)。當(dāng)這些區(qū)域的構(gòu)象被機(jī)械強(qiáng)制完全打開(kāi)時(shí)，活性tgf-β1從lap釋放(58)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的同時(shí)解折疊是完全tgf-β1釋放所必需的全或無(wú)的快速機(jī)制，只有當(dāng)lap與ltbp-1結(jié)合時(shí)才是可能的。hs是否以及如何參與這種機(jī)械力的產(chǎn)生或釋放是一個(gè)有趣的問(wèn)題。所有這些考慮指出需要大量的計(jì)算機(jī)模擬肝素-tgf-β1相互作用以驗(yàn)證我們的結(jié)果，并開(kāi)發(fā)計(jì)算工具來(lái)破譯hs制劑如hs16+ve的結(jié)構(gòu)域組織(63)。這樣的研究將開(kāi)放改進(jìn)我們基于親和力的hs分離或甚至化學(xué)上定義的tgf-β1特異性hs分子的合成的可能性(64)?？傊?，我們顯示肝素和親和力分離的hs，可以用于調(diào)節(jié)hmscs上的tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們也是第一個(gè)報(bào)道了肝素-tgf-β1相互作用的結(jié)構(gòu)要求?？傊瑪?shù)據(jù)重申了理解這些分子之間的結(jié)構(gòu)相互作用可以如何指導(dǎo)治療發(fā)展的重要性。這有希望開(kāi)發(fā)軟骨修復(fù)的新型治療策略，其利用碳水化合物分子調(diào)節(jié)tgf-β1活性來(lái)驅(qū)動(dòng)hmsc的軟骨形成分化。這種策略也可以擴(kuò)展到涉及使用生長(zhǎng)因子的其他組織修復(fù)策略。在我們的研究中，使用含有tgf-β1的肝素結(jié)合位點(diǎn)的肽通過(guò)親和純化從豬粘膜hs(hspm)中分離hs的tgf-β1結(jié)合部分。發(fā)現(xiàn)分離的tgf-β1肽結(jié)合hs(稱(chēng)為hs16+ve)在組成上不同于不結(jié)合的hs級(jí)分(其被稱(chēng)為hs16-ve)和原始hspm起始材料。組成上的這種變化增強(qiáng)了hs16+ve相對(duì)于hs16-ve和hspm結(jié)合并調(diào)節(jié)tgf-β1活性的能力。令人驚訝的是，hs16+ve也能夠調(diào)節(jié)ltgf(tgf-β1的無(wú)活性、存儲(chǔ)形式)的活性。當(dāng)與hs3+ve(一種hs變體，被開(kāi)發(fā)以增強(qiáng)bmp-2活性)比較時(shí)，[murali,s.等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605.]，發(fā)現(xiàn)hs16+ve具有組成差異，這種差異改變了其增強(qiáng)bmp-2活性的能力(與hspm和hs3+ve相比)。在這項(xiàng)工作中，所用的肽長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸，而全長(zhǎng)成熟tgf-β1的長(zhǎng)度為112個(gè)氨基酸。已知溶液中的肽采用不同于完全蛋白的一部分時(shí)所假定的構(gòu)象，并且用于分離hs16+ve的利用pepfold[maupetit,j.,p.derreumaux,andp.tuffery,pep-fold:anonlineresourcefordenovopeptidestructureprediction.nucleicacidsresearch,2009.37(suppl2):p.w498-w503；maupetit,j.,p.derreumaux,和p.tufféry,afastmethodforlarge-scaledenovopeptideandminiproteinstructureprediction.journalofcomputationalchemistry,2010.31(4):p.726-738；和216.thévenet,p.等,pep-fold:anupdateddenovostructurepredictionserverforbothlinearanddisulfidebondedcyclicpeptides.nucleicacidsresearch,2012.40(w1):p.w288-w293.]進(jìn)行的tgf-β1肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)不匹配其tgf-β1中的天然結(jié)構(gòu)。這提出了驅(qū)動(dòng)我們基于肽的親和純化的機(jī)制的問(wèn)題，因?yàn)楹茈y設(shè)想單個(gè)肽段將能夠重建tgf-β1肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的空間組織。有人可以提出肽和hs之間的相互作用主要由離子相互作用驅(qū)動(dòng)，這對(duì)于肽-肝素相互作用幾乎肯定是真的(來(lái)自我們組的未發(fā)表的數(shù)據(jù))，但是在這里似乎不是這樣的情況，因?yàn)槭褂脕?lái)自不同蛋白(bmp-2)的肽改變了分離的hs級(jí)分的特性(profile)。廣泛研究的涉及肝素結(jié)合的堿性殘基的共有序列被提議采用堿性殘基的兩個(gè)基序之一：-x-b-b-bx-x-b-x-x-或-x-b-b-x-b-x-x-(其中x為任何中性或酸性的氨基酸且b是堿性殘基)[cardin,a.d.和h.j.weintraub,molecularmodelingofproteinglycosaminoglycaninteractions.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology,1989.9(1):p.21-32.]。已經(jīng)提出了存在于tgf-β1中的第三種基序：-x-bx-x-b-x-x-b-x-x-b-x-[mccaffrey,t.a.,d.j.falcone，和b.du,transforminggrowthfactor-β1isaheparin-bindingprotein:identificationofputativeheparin-bindingregionsandisolationofheparinswithvaryingaffinityfortgf-β1.jcellphysiol,1992.152(2):p.430-440.]。有趣的是，pace和scholtz[nickpace,c.和j.martinscholtz,ahelixpropensityscalebasedonexperimentalstudiesofpeptidesandproteins.biophysicaljournal,1998.75(1):p.422-427]已報(bào)道堿性殘基具有在溶液中形成α-螺旋的高傾向?？紤]到這些提出的基序中的堿性殘基的組織以及α-螺旋的組織(每一圈3.6個(gè)氨基酸殘基)，并不奇怪地發(fā)現(xiàn)這些基序在溶液中采用螺旋結(jié)構(gòu)，而其堿性殘基沿著相同的平面排列。如果是真的，這樣的組織可能賦予肽一定程度的選擇性。hs16+ve的大小和組成分析顯示，相對(duì)于hs16-ve和hspm，它富集了更長(zhǎng)的多糖鏈，鏈長(zhǎng)度分布方面較少異質(zhì)性，并富集了6-o-和n-硫酸化二糖。這證實(shí)了我們?cè)诟嗡?tgf-β1相互作用的研究中的發(fā)現(xiàn)，其中我們鑒定了肝素鏈需要至少等同于dp22并具有6-o-和n-硫酸基團(tuán)以有效地結(jié)合和調(diào)節(jié)tgf-β1活性。hs富含更長(zhǎng)的鏈這一點(diǎn)可以通過(guò)需要至少22個(gè)糖單元來(lái)橋接tgf-β1同源二聚體上的兩個(gè)肝素/hs結(jié)合位點(diǎn)而得到解釋。這樣的鏈還必須滿(mǎn)足硫酸分布標(biāo)準(zhǔn)以有效地與tgf-β1相互作用，這將進(jìn)一步縮窄通過(guò)我們的純化而選擇的hs鏈的范圍。hs16+ve能夠加強(qiáng)tgf-β1驅(qū)動(dòng)的smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至與肝素類(lèi)似的程度。出人意料的是，其對(duì)ltgf-β1的影響比肝素對(duì)ltgf-β1的影響更顯著。由于ltgf-β1是體內(nèi)tgf-β1的主要形式，這引起關(guān)于hs在tgf-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的合成和生理作用的有趣問(wèn)題。ltgf的休眠相關(guān)肽(lap)部分具有被認(rèn)為是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，雖然分子的兩個(gè)區(qū)域可以解折疊[shi,m.等,latenttgf-βstructureandactivation.nature,2011.474(7351):p.343-349]以使其在ltgf-β1復(fù)合物中捕獲tgf-β1。當(dāng)這些區(qū)域的構(gòu)象被機(jī)械強(qiáng)制完全打開(kāi)時(shí)，活性tgf-β1從lap釋放[buscemi,l.等,thesingle-moleculemechanicsofthelatenttgf-β1complex.currbiol,2011.21(24):p.2046-2054]。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的同時(shí)解折疊是完全tgf-β1釋放所必需的全或無(wú)的快速機(jī)制，只有當(dāng)lap與ltgf-結(jié)合蛋白-1(ltbp-1)結(jié)合時(shí)才是可能的。有趣的是，已經(jīng)報(bào)道lap和ltbp-1都與肝素相互作用[lee,m.j.,heparininhibitsactivationoflatenttransforminggrowthfactor-β1.pharmacology,2013.92(5-6):p.238-244；chen,q.等,potentialroleforheparansulfateproteoglycansinregulationoftransforminggrowthfactor-β(tgf-β)bymodulatingassemblyoflatenttgf-β-bindingprotein-1.jbiolchem,2007.282(36):p.26418-26430；andparsi,m.k.,等,ltbp-2hasmultipleheparin/heparansulfatebindingsites.matrixbiology,2010.29(5):p.393-401].hs是否以及如何參與這種機(jī)械力的產(chǎn)生或釋放是一個(gè)相關(guān)的問(wèn)題，雖然證據(jù)表明在體內(nèi)合成的hs可以被調(diào)節(jié)以激活ltgf-β1。hs16+ve的組成與hs3+ve的組成的比較顯示了它們組成上的差異。在hs變體結(jié)合和調(diào)節(jié)bmp-2活性的能力中觀(guān)察到的差異可能是組成差異和繼而體現(xiàn)在hs鏈中的二糖序列的組合的結(jié)果。bmp-2-肝素相互作用的建模[gandhi,n.s.和r.l.mancera,predictionofheparinbindingsitesinbonemorphogeneticproteins(bmps).biochimicaetbiophysicaacta(bba)-proteinsandproteomics,2012.1824(12):p.1374-1381]表明，它們的結(jié)合與tgf-β1和肝素的結(jié)合顯著不同，這將解釋hs16+ve和hs3+ve的組成的差異，也提示了tgf-β超家族內(nèi)肝素/hs結(jié)合位點(diǎn)的多樣化[rider,c.c.,heparin/heparansulphatebindinginthetgf-βcytokinesuperfamily.biochemsoctrans,2006.34(pt3):p.458-460.]。在hs16+ve相對(duì)于hspm增強(qiáng)bmp-2驅(qū)動(dòng)的alp表達(dá)的能力中觀(guān)察到的中度增加可能歸因于hs16+ve中硫酸化hs鏈的富集，使得其比hspm更類(lèi)似于肝素，或者在hs16+ve和hs3+ve制劑中hs鏈的組成的重疊。盡管hs似乎不以核酸和蛋白質(zhì)中觀(guān)察到的相同的絕對(duì)序列特異性被編碼，但我們的結(jié)果為當(dāng)前的hs“糖代碼”假說(shuō)[gama,c.i.等,sulfationpatternsofglycosaminoglycansencodemolecularrecognitionandactivity.natchembiol,2006.2(9):p.467-473；duchesne,l.,等,transportoffibroblastgrowthfactor2inthepericellularmatrixiscontrolledbythespatialdistributionofitsbindingsitesinheparansulfate.plosbiol,2012.10(7):p.e1001361；chang,z.,等,differentialabilityofheparansulfateproteoglycanstoassemblethefibroblastgrowthfactorreceptorcomplexinsitu.fasebj,2000.14(1):p.137-144；andjastrebova,n.,等,heparansulfatedomainorganizationandsulfationmodulatefgf2inducedcellsignaling.jbiolchem,2010]提供了有力的證據(jù)并支持了結(jié)合強(qiáng)度和生物活性之間的非線(xiàn)性關(guān)系的想法[rudd,t.r.等,comparablestabilisation,structuralchangesandactivitiescanbeinducedinfgfbyavarietyofhsandnon-gaganalogues:implicationsforsequence-activityrelationships.orgbiomolchem,2010.8(23):p.5390-5397.]。尚待回答的主要問(wèn)題之一是給定hs鏈與給定蛋白相互作用所需的嚴(yán)格性水平。希望開(kāi)發(fā)改進(jìn)的計(jì)算工具來(lái)解碼gag的組織將有助于這項(xiàng)工作[spencer,j.l.等,acomputationalapproachfordecipheringtheorganizationofglycosaminoglycans.plosone,2010.5(2):p.e9389]。實(shí)施例1參考文獻(xiàn)1.ori,a.,wilkinson,m.c.,和fernig,d.g.(2011)jbiolchem2.lyon,m.,rushton,g.,和gallagher,j.t.(1997)jbiolchem272,18000-180063.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,brayton,c.f.,agarwal,l.a.,welt,f.g.,和weksler,b.b.(1989)jcellbiol109,441-4484.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,和du,b.(1992)jcellphysiol152,430-4405.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,vicente,d.,du,b.,consigli,s.,和borth,w.(1994)jcellphysiol159,51-596.lee,j.-h.,lee,h.,joung,y.k.,jung,k.h.,choi,j.-h.,lee,d.-h.,park,k.d.,和hong,s.-s.(2011)biomaterials32,1438-14457.watson,r.s.,gouze,e.,levings,p.p.,bush,m.l.,kay,j.d.,jorgensen,m.s.,dacanay,e.a.,reith,j.w.,wright,t.w.,和ghivizzani,s.c.(2010)labinvest90,1615-16278.siebert,n.,xu,w.,grambow,e.,zechner,d.,和vollmar,b.(2011)labinvest91,1753-17659.jakowlew,s.(2006)cancermetastasisrev25,435-45710.yang,y.-a.,dukhanina,o.,tang,b.,mamura,m.,letterio,j.j.,macgregor,j.,patel,s.c.,khozin,s.,liu,z.-y.,green,j.,anver,m.r.,merlino,g.,和wakefield,l.m.(2002)jclininvest109,1607-161511.grimaud,e.,heymann,d.,和rédini,f.(2002)cytokinegrowthfactorrev13,241-25712.rosen,f.,mccabe,g.,quach,j.,solan,j.,terkeltaub,r.,seegmiller,j.e.,和lotz,m.(1997)arthritisrheum40,1275-128113.toh,w.s.,liu,h.,heng,b.c.,rufaihah,a.j.,ye,c.p.,和cao,t.(2005)growthfactors23,313-32114.vanderkraan,p.m.,blaneydavidson,e.n.,blom,a.,和vandenberg,w.b.(2009)osteoarthritiscartilage17,1539-154515.yang,x.,chen,l.,xu,x.,li,c.,huang,c.,和deng,c.-x.(2001)jcellbiol153,35-4616.miura,y.,parvizi,j.,fitzsimmons,j.s.,和o’driscoll,s.w.(2002)jbonejointsurgam84,793-79917.sato,m.,ishihara,m.,ishihara,m.,kaneshiro,n.,mitani,g.,nagai,t.,kutsuna,t.,asazuma,t.,kikuchi,m.,和mochida,j.(2007)jbiomedmaterresbapplbiomater83b,181-18818.wang,w.,li,b.,li,y.,jiang,y.,ouyang,h.,和gao,c.(2010)biomaterials31,5953-596519.allen,j.b.,manthey,c.l.,hand,a.r.,ohura,k.,ellingsworth,l.,和wahl,s.m.(1990)jexpmed171,231-24720.leah,e.(2013)natrevrheumatol9,382-38221.bakker,a.c.,vandeloo,f.a.j.,vanbeuningen,h.m.,sime,p.,vanlent,p.l.e.m.,vanderkraan,p.m.,richards,c.d.,和vandenberg,w.b.(2001)osteoarthritiscartilage9,128-13622.blaneydavidson,e.n.,scharstuhl,a.,vitters,e.l.,vanderkraan,p.m.,和vandenberg,w.b.(2005)arthritisresther7,r1338-r134723.kopesky,p.w.,vanderploeg,e.j.,kisiday,j.d.,frisbie,d.d.,sandy,j.d.,和grodzinsky,a.j.(2011)tissueengparta17,83-9224.shah,r.n.,shah,n.a.,delrosariolim,m.m.,hsieh,c.,nuber,g.,和stupp,s.i.(2010)procnatlacadsciusa107,3293-329825.coupes,b.m.,williams,s.,roberts,i.s.d.,short,c.d.,和brenchley,p.e.c.(2001)nephroldialtransplant16,361-36726.bramono,d.s.,murali,s.,rai,b.,ling,l.,poh,w.t.,lim,z.x.,stein,g.s.,nurcombe,v.,vanwijnen,a.j.,和cool,s.m.(2012)bone50,954-96427.helledie,t.,dombrowski,c.,rai,b.,lim,z.x.h.,hin,i.l.h.,rider,d.a.,stein,g.s.,hong,w.,vanwijnen,a.j.,hui,j.h.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2012)stemcellsdev21,1897-191028.murali,s.,leong,d.f.m.,lee,j.j.l.,cool,s.m.,和nurcombe,v.(2011)jbiolchem286,17755-1776529.murali,s.,rai,b.,dombrowski,c.,lee,j.l.j.,lim,z.x.h.,bramono,d.s.,ling,l.,bell,t.,hinkley,s.,nathan,s.s.,hui,j.h.,wong,h.k.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2013)biomaterials34,5594-560530.samsonraj,r.m.,raghunath,m.,hui,j.h.,ling,l.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2013)gene519,348-35531.rider,d.a.,dombrowski,c.,sawyer,a.a.,ng,g.h.b.,leong,d.,hutmacher,d.w.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2008)stemcells26,1598-160832.zhang,l.,su,p.,xu,c.,yang,j.,yu,w.,和huang,d.(2010)biotechnollett32,1339-134633.hernaiz,m.,liu,j.,rosenberg,r.d.,和linhardt,r.j.(2000)biochembiophysrescommun276,292-29734.uniewicz,k.a.,ori,a.,xu,r.,ahmed,y.,wilkinson,m.c.,fernig,d.g.,和yates,e.a.(2010)analchem82,3796-380235.xu,r.,ori,a.,rudd,t.r.,uniewicz,k.a.,ahmed,y.a.,guimond,s.e.,skidmore,m.a.,siligardi,g.,yates,e.a.,和fernig,d.g.(2012)jbiolchem287,40061-4007336.livak,k.j.,和schmittgen,t.d.(2001)methods25,402-40837.ori,a.,free,p.,courty,j.,wilkinson,m.c.,和fernig,d.g.(2009)molcellproteomics8,2256-226538.guerrini,m.,naggi,a.,guglieri,s.,santarsiero,r.,和torri,g.(2005)analbiochem337,35-4739.knobloch,j.e.,和shaklee,p.n.(1997)analbiochem245,231-24140.brickman,y.g.,ford,m.d.,gallagher,j.t.,nurcombe,v.,bartlett,p.f.,和turnbull,j.e.(1998)jbiolchem273,4350-435941.skidmore,m.a.,guimond,s.e.,dumax-vorzet,a.f.,yates,e.a.,和turnbull,j.e.(2010)natprotoco5,1983-199242.inman,g.j.,nicolás,f.j.,callahan,j.f.,harling,j.d.,gaster,l.m.,reith,a.d.,laping,n.j.,和hill,c.s.(2002)molpharmacol62,65-7443.radaev,s.,zou,z.,huang,t.,lafer,e.m.,hinck,a.p.,和sun,p.d.(2010)jbiolchem285,14806-1481444.gama,c.i.,tully,s.e.,sotogaku,n.,clark,p.m.,rawat,m.,vaidehi,n.,goddard,w.a.,nishi,a.,和hsieh-wilson,l.c.(2006)natchembiol2,467-47345.chang,z.,meyer,k.,rapraeger,a.c.,和friedl,a.(2000)fasebj14,137-14446.duchesne,l.,octeau,v.,bearon,r.n.,beckett,a.,prior,i.a.,lounis,b.,和fernig,d.g.(2012)plosbiol10,e100136147.jastrebova,n.,vanwildemeersch,m.,lindahl,u.,和spillmann,d.(2010)jbiolchem48.rudd,t.r.,uniewicz,k.a.,ori,a.,guimond,s.e.,skidmore,m.a.,gaudesi,d.,xu,r.,turnbull,j.e.,guerrini,m.,torri,g.,siligardi,g.,wilkinson,m.c.,fernig,d.g.,和yates,e.a.(2010)orgbiomolchem8,5390-539749.kim,m.,kim,s.e.,kang,s.s.,kim,y.h.,和tae,g.(2011)biomaterials32,7883-789650.park,j.s.,woo,d.g.,yang,h.n.,lim,h.j.,chung,h.-m.,和park,k.-h.(2008)transplantation85,589-59651.xu,x.,jha,a.k.,duncan,r.l.,和jia,x.(2011)actabiomater7,3050-305952.kelton,j.g.,arnold,d.m.,和bates,s.m.(2013)nengljmed368,737-74453.lamanna,w.c.,kalus,i.,padva,m.,baldwin,r.j.,merry,c.l.r.,和dierks,t.(2007)jbiotechnol129,290-30754.ori,a.,wilkinson,m.c.,和fernig,d.g.(2008)frontbiosci13,4309-433855.naimy,h.,leymarie,n.,和zaia,j.(2010)biochemistry49,3743-375256.lee,m.j.(2013)pharmacology92,238-24457.khan,s.,gor,j.,mulloy,b.,和perkins,s.j.(2010)jmolbiol395,504-52158.buscemi,l.,ramonet,d.,klingberg,f.,formey,a.,smith-clerc,j.,meister,j.-j.,和hinz,b.(2011)currbiol21,2046-205459.chen,q.,sivakumar,p.,barley,c.,peters,d.m.,gomes,r.r.,farach-carson,m.c.,和dallas,s.l.(2007)jbiolchem282,26418-2643060.shi,m.,zhu,j.,wang,r.,chen,x.,mi,l.,walz,t.,和springer,t.a.(2011)nature474,343-34961.annes,j.p.,munger,j.s.,和rifkin,d.b.(2003)journalofcellscience116,217-22462.ramirez,f.,和rifkin,d.b.(2009)currentopinionincellbiology21,616-62263.spencer,j.l.,bernanke,j.a.,buczek-thomas,j.a.,和nugent,m.a.(2010)plosone5,e938964.chappell,e.p.,和liu,j.(2013)bioorgmedchem21,4786-4792實(shí)施例2：hs16+ve對(duì)msc在體外和體內(nèi)的軟骨形成分化的影響介紹關(guān)節(jié)軟骨是在長(zhǎng)骨的末端發(fā)現(xiàn)的組織，其在我們的關(guān)節(jié)中用作減震器和潤(rùn)滑劑。由于其無(wú)血管性質(zhì)，關(guān)節(jié)軟骨遭受的損傷通常不能愈合。目前對(duì)軟骨修復(fù)策略的發(fā)展的研究集中于通過(guò)使用活化的生物材料或向細(xì)胞提供誘導(dǎo)線(xiàn)索來(lái)刺激來(lái)自?xún)?nèi)源或移植細(xì)胞的反應(yīng)[145.guo,x.等,repairofosteochondraldefectswithbiodegradablehydrogelcompositesencapsulatingmarrowmesenchymalstemcellsinarabbitmodel.actabiomaterialia,2010.6(1):p.39-47；chu,c.r.,m.szczodry,和s.bruno,animalmodelsforcartilageregenerationandrepair.tissueengineeringpartb:reviews,2009.16(1):p.105-115；fritz,j.等人,articularcartilagedefectsintheknee-basics,therapiesandresults.injury,2008.39(1,supplement):p.50-57；hunziker,e.b.,articularcartilagerepair:basicscienceandclinicalprogress.areviewofthecurrentstatusandprospects.osteoarthritiscartilage,2002.10(6):p.432-463；gille,j.等人,cell-ladenandcell-freematrix-inducedchondrogenesisversusmicrofractureforthetreatmentofarticularcartilagedefects:ahistologicalandbiomechanicalstudyinsheep.cartilage,2010.1(1):p.29-42；haleem,a.m.等人,theclinicaluseofhumanculture-expandedautologousbonemarrowmesenchymalstemcellstransplantedonplatelet-richfibringlueinthetreatmentofarticularcartilagedefects.cartilage,2010.1(4):p.253-261；moran,c.j.等人,restorationofarticularcartilage.jbonejointsurgam,2014.96(4):p.336-344；l.u.等人,thetissueengineeringofarticularcartilage:cells,scaffoldsandstimulatingfactors.expbiolmed,2012.237(1):p.10-17.]。tgf-β1已經(jīng)成為誘導(dǎo)軟骨修復(fù)的關(guān)鍵參與者，因?yàn)槠浯碳sc的軟骨形成分化的能力[buxton,a.n.等,temporalexposuretochondrogenicfactorsmodulateshumanmesenchymalstemcellchondrogenesisinhydrogels.tissueengparta,2011.17(3-4):p.371-80；233.bosnakovski,d.等人,chondrogenicdifferentiationofbovinebonemarrowmesenchymalstemcellsinpelletculturalsystem.experimentalhematology,2004.32(5):p.502-509；ng,f.等人,pdgf,tgf-β,andfgfsignalingisimportantfordifferentiationandgrowthofmesenchymalstemcells(mscs):transcriptionalprofilingcanidentifymarkersandsignalingpathwaysimportantindifferentiationofmscsintoadipogenic,chondrogenic,andosteogeniclineages.blood,2008.112(2):p.295-307.]，并驅(qū)動(dòng)軟骨ecm分子的表達(dá)[li,h.等人,comparativeanalysiswithcollagentypeiidistinguishescartilageoligomericmatrixproteinasaprimarytgfβ-responsivegene.osteoarthritiscartilage,2011.19(10):p.1246-1253；iqbal,j.等人,age-relatedeffectsoftgf-βonproteoglycansynthesisinequinearticularcartilage.biochembiophysrescommun,2000.274(2):p.467-471；grimaud,e.,d.heymann,和f.rédini,recentadvancesintgf-βeffectsonchondrocytemetabolism:potentialtherapeuticrolesoftgf-βincartilagedisorders.cytokinegrowthfactorrev,2002.13(3):p.241-257；serra,r.等人,expressionofatruncated,kinase-defectivetgf-βtypeiireceptorinmouseskeletaltissuepromotesterminalchondrocytedifferentiationandosteoarthritis.jcellbiol,1997.139(2):p.541-552.；blaneydavidson,e.等人,tgfbeta-inducedcartilagerepairismaintainedbutfibrosisisblockedinthepresenceofsmad7.arthritisresther,2006.8(3):p.r65]。因此，迄今為止的大多數(shù)研究已經(jīng)使用外源tgf-β1(單獨(dú)或與其它生長(zhǎng)因子組合)驅(qū)動(dòng)hmsc軟骨形成分化[blaneydavidson,e.n.,p.m.vanderkraan,和w.b.vandenberg,tgf-βandosteoarthritis.osteoarthritiscartilage,2007.15(6):p.597-604；park,j.s.等,heparin-boundtransforminggrowthfactor-β3enhancesneocartilageformationbyrabbitmesenchymalstemcells.transplantation,2008.85(4):p.589-596；goepfert,c.等,cartilageengineeringfrommesenchymalstemcells,inbioreactorsystemsfortissueengineeringii,c.kasper,m.vangriensven,和r.editors.2010,springerberlin/heidelberg.p.163-200；mara,c.s.等,regulationofchondrogenesisbytransforminggrowthfactor-β3andinsulin-likegrowthfactor-1fromhumanmesenchymalumbilicalcordbloodcells.jrheumatol,2010.37(7):p.1519-1526.]。雖然最初看起來(lái)成功，但是這些方法在其轉(zhuǎn)移到臨床中面臨顯著的障礙，因?yàn)榻?jīng)常使用超生理劑量的tgf-β1來(lái)克服清除，并且甚至20ng劑量已經(jīng)顯示產(chǎn)生不期望的結(jié)果，例如滑膜炎[leah,e.,osteoarthritis:tgf-βoverloadatbonesofcartilagedegeneration.natrevrheumatol,2013.9(7):p.382-382；allen,j.b.等人,rapidonsetsynovialinflammationandhyperplasiainducedbytransforminggrowthfactorbeta.jexpmed,1990.171(1):p.231-247]。除了非生理劑量的問(wèn)題之外，還需要將生長(zhǎng)因子定位于治療部位以防止其引發(fā)全身副作用，例如纖維化和腫瘤發(fā)生[jakowlew,s.,transforminggrowthfactor-βincancerandmetastasis.cancermetastasisrev,2006.25(3):p.435-457；bakker,a.c.等人,overexpressionofactivetgf-beta-1inthemurinekneejoint:evidenceforsynovial-layer-dependentchondro-osteophyteformation.osteoarthritiscartilage,2001.9(2):p.128-136；yang,y.-a.等人,lifetimeexposuretoasolubletgf-βantagonistprotectsmiceagainstmetastasiswithoutadversesideeffects.jclininvest,2002.109(12):p.1607-1615.]。此外，對(duì)tgf-β1的敏感性隨年齡增加而降低[blaneydavidson,e.n.等人,reducedtransforminggrowthfactor-betasignalingincartilageofoldmice:roleinimpairedrepaircapacity.arthritisresther,2005.7(6):p.r1338-r1347.]，因此足夠的tgf-β1給藥對(duì)老年患者呈現(xiàn)更大的風(fēng)險(xiǎn)。響應(yīng)于這些挑戰(zhàn)，正在考慮新的策略，其減少或完全消除對(duì)外源性生長(zhǎng)因子的需要，更好地定位和控制生長(zhǎng)因子在治療部位的遞送，并且提高對(duì)生長(zhǎng)因子的細(xì)胞敏感性或因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。已經(jīng)描述了hs16+ve的發(fā)展及其在msc單層培養(yǎng)物中增強(qiáng)tgf-β1驅(qū)動(dòng)的smad應(yīng)答的能力，我們假設(shè)它可以用于通過(guò)隱蔽內(nèi)源性tgf-β1來(lái)改善軟骨愈合。因此，我們?cè)噲D研究其對(duì)以下兩方面的影響：(1)體外hmscs的軟骨形成分化；和(2)兔模型中的軟骨愈合響應(yīng)。本實(shí)施例描述了用改良的微細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)研究hs16+ve對(duì)hmsc的軟骨形成分化的體外作用。然后，在用于軟骨修復(fù)的兔模型中滑車(chē)槽(trochleagroove)的完全深度的軟骨缺陷中，繼續(xù)研究了先前描述的hs變體當(dāng)與當(dāng)前的臨床“護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)”組合使用時(shí)的效果。材料和方法逆轉(zhuǎn)錄和定量pcr(qpcr)使用trizol試劑(lifetechnologies,ca,usa)根據(jù)制造商的方案從軟骨形成微細(xì)胞團(tuán)中分離總rna。使用vilotmcdna分析試劑盒(lifetechnologies)，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，在1μgrna上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在42℃下孵育2小時(shí)而不是1小時(shí)。每個(gè)qpcr含有40ngcdna，每個(gè)基因1μl引物-探針混合物和10μl快速通用pcr主混合物(lifetechnologies)，終體積為20μl。熱循環(huán)條件為95℃，20秒，然后在95℃下進(jìn)行1秒，60℃下進(jìn)行20秒，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)qpcr一式兩份進(jìn)行，基因表達(dá)相對(duì)于hprt1表達(dá)歸一化以獲得δct值。取生物學(xué)一式三份的平均值。在不含gag或tgf-β1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的軟骨形成性微細(xì)胞團(tuán)用作對(duì)照(δδct)。各個(gè)引物集的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)2-δδct方法[livak,k.j.和t.d.schmittgen,analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods,2001.25(4):p.402-408.]表示為倍數(shù)變化。使用以下引物-探針測(cè)定(lifetechnologies)：體內(nèi)研究設(shè)計(jì)二十二只骨骼成熟的雄性新西蘭白兔(平均年齡9個(gè)月，體重3.9kg)被用于本研究。所有兔子接受股骨滑車(chē)槽上雙側(cè)軟骨缺損，每個(gè)缺陷隨機(jī)分配到四個(gè)治療組之一：(1)凝膠單獨(dú)，(2)凝膠+hspm，(3)凝膠+hs16+ve和(4)凝膠+hs16-ve。每個(gè)缺陷接受60μl基于透明質(zhì)酸的水凝膠(gel)(auxigeltm，termiraab，stockholm，sweden)[bergman,k.等,injectablecell-freetemplateforbone-tissueformation.journalofbiomedicalmaterialsresearchparta,2009.91a(4):p.1111-1118.]和10μg的hspm,hs16+ve或hs16-ve。兩只兔子死于胃潴留術(shù)后，不包括在分析中。缺陷創(chuàng)建和凝膠注射用于本研究的研究方案由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(a*star新加坡)批準(zhǔn)，并遵循所有合適的指導(dǎo)方針。所有外科手術(shù)在全身麻醉下進(jìn)行，所述麻醉在無(wú)菌條件下通過(guò)面罩采用氯胺酮(35mg/kg)和賽拉嗪(5mg/kg)注射液和異氟烷的組合組成。進(jìn)行15-20mm的內(nèi)側(cè)對(duì)-髕骨皮膚切口，并且髕骨側(cè)向脫位。在每個(gè)股骨滑車(chē)槽的中心制造一個(gè)完整厚度的臨界尺寸的軟骨缺損(直徑4mm，深2mm)，完全清除鈣化軟骨。隨后，使用整形外科鉆子在每個(gè)缺陷中制造3個(gè)微裂縫(0.8mm直徑，2mm深度)并用外科手術(shù)紗布施加直接壓力以確保在施加指定的治療之前所有的出血停止。用200μl移液管施加治療并待其凝固。當(dāng)凝膠載體凝固時(shí)，觀(guān)察到所有缺陷都充滿(mǎn)血液。一旦凝膠載體凝固，將髕骨重新定位，并將關(guān)節(jié)彎曲15次，以確保在切口閉合成層之前，治療保持在原位，并允許兔子承受重量。用vetbondtm組織粘合劑(3m，mn，usa)進(jìn)一步密封傷口部位。在手術(shù)后5天皮下施用預(yù)防性抗生素(恩氟沙星，10mg/kg)和止痛劑(丁丙諾啡，0.1mg/kg)。在12周時(shí)，所有兔子在鎮(zhèn)靜后用戊巴比妥(150mg/kg)安樂(lè)死。收獲遠(yuǎn)端股骨并在處理用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)(ihc)分析之前進(jìn)行宏觀(guān)成像。關(guān)節(jié)的大體病理觀(guān)察關(guān)節(jié)的圖像由不知道各治療組的盲觀(guān)察者檢查和評(píng)分。宏觀(guān)評(píng)分基于國(guó)際軟骨修復(fù)學(xué)會(huì)(icrs)視覺(jué)評(píng)估量表(icrsi評(píng)分系統(tǒng))[brittberg,m.和l.peterson,introductionofanarticularcartilageclassification.icrsnewsletter,1998.1:p.5-8.].組織學(xué)分析收獲的遠(yuǎn)端股骨頭在真空下在10％(v/v)中性緩沖福爾馬林(nbf)中固定1周，并在室溫下在5％(v/v)甲酸中脫鈣平均6-7天。隨后將樣品包埋在石蠟中并沿缺損中間橫切(5μm)。將切片脫石蠟并用馬松三色，阿爾新藍(lán)(ph1，用中性紅復(fù)染)和番紅o染色。免疫組織化學(xué)(ihc)分析使用leicabondtm-iii或leicabondtm-maxautostainer(leicanusslochgmbh，germany)和bondtm精細(xì)檢測(cè)試劑盒(leica)進(jìn)行ihc染色。將切片用bondtmdewax溶液(leica)脫蠟并通過(guò)與蛋白酶k(20μg/ml)(sigma-aldrich)在室溫下孵育15分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。通過(guò)用3-4％(v/v)h2o2孵育15分鐘來(lái)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后將切片在10％(v/v)山羊血清中封閉30分鐘，然后與稀釋于bondtm一抗稀釋劑(leica)中的第一抗體(i型膠原蛋白(1：1000)，novusbiologicals，co，usa和ii型膠原蛋白(1:2000)，inc.，ca，usa)在室溫下孵育30分鐘。染色的檢測(cè)如bondtm精細(xì)檢測(cè)試劑盒中所述的進(jìn)行，并將細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染色5分鐘。所有洗滌用1×bondtm洗滌溶液(leica)進(jìn)行。組織學(xué)評(píng)分染色切片的檢查和評(píng)分由不知道治療組的被掩蔽的觀(guān)察者進(jìn)行。基于o’driscoll[o’driscoll,s.w.,f.w.keeley,和r.b.salter,thechondrogenicpotentialoffreeautogenousperiostealgraftsforbiologicalresurfacingofmajorfullthicknessdefectsinjointsurfacesundertheinfluenceofcontinuouspassivemotion.anexperimentalinvestigationintherabbit.jbonejointsurgam,1986.68(7):p.1017-1035]和icrsii[mainil-varlet,p.等,anewhistologyscoringsystemfortheassessmentofthequalityofhumancartilagerepair:icrsii.theamericanjournalofsportsmedicine,2010]打分系統(tǒng)進(jìn)行打分，并且通過(guò)量化軟骨和軟骨下空間內(nèi)每種組織類(lèi)型(即骨組織，纖維組織，纖維軟骨，混合軟骨和透明軟骨)的百分比來(lái)確定組織填充。結(jié)果hs16+ve對(duì)hmsc在體外的軟骨形成分化的影響為了評(píng)估hs16+ve對(duì)hmscs體外軟骨形成分化的影響，首先必須確定單獨(dú)的tgf-β1的作用。軟骨形成分化使用改良的微團(tuán)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行[zhang,l.等人,chondrogenicdifferentiationofhumanmesenchymalstemcells:acomparisonbetweenmicromassandpelletculturesystems.biotechnollett,2010.32(9):p.1339-1346.]。簡(jiǎn)言之，收獲第4代hmsc，并以2×107個(gè)細(xì)胞/ml重懸于化學(xué)成分確定的軟骨形成培養(yǎng)基(pt-3003，lonza,md,usa)中。然后將12.5μl的液滴接種在24孔板的每個(gè)孔的中間，使之在37℃下貼壁2小時(shí)，之后，將500μl的軟骨形成培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中，所述軟骨形成培養(yǎng)基補(bǔ)充有1或10ng單獨(dú)的tgf-β1(100-2c，peprotech)或具有5或10μg/ml肝素(sigma-aldrich)、豬粘膜hs(hspm)(celsus實(shí)驗(yàn)室)、hs16+ve或hs16-ve。細(xì)胞小滴在24小時(shí)后聚結(jié)成球形團(tuán)塊。培養(yǎng)基每3天更換，并且在第3，7,14和第21天收集微團(tuán)。在第3,7,14和21天取得所得對(duì)照(ctrl)和tgf-β1處理(10ng/ml)(tgf-β1)組微細(xì)胞團(tuán)的濕重(圖15)。雖然在任一治療組中的細(xì)胞團(tuán)的重量隨時(shí)間降低，但是在tgf-β1處理組的細(xì)胞團(tuán)中的重量損失不如對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)顯著。在第3(僅sox9和comp)，7,14和21天對(duì)微細(xì)胞團(tuán)的基因表達(dá)分析顯示，相對(duì)于未處理的對(duì)照細(xì)胞團(tuán)(對(duì)照)，用10ng/mltgf-β1(tgf-β1)處理一致性地導(dǎo)致軟骨形成標(biāo)志物sox9(圖16a)、comp(圖16b)和聚集蛋白聚糖(圖16c)表達(dá)的增加。使用未分化的hmsc作為第0天對(duì)照。ii型膠原轉(zhuǎn)錄物僅在tgf-β1處理的細(xì)胞團(tuán)和未分化的hmsc中可檢測(cè)到(圖16d)。這似乎表明當(dāng)在單層中生長(zhǎng)時(shí)，hmsc表達(dá)低水平的ii型膠原轉(zhuǎn)錄物，但是當(dāng)在沒(méi)有tgf-β1的軟骨形成培養(yǎng)基中作為微團(tuán)培養(yǎng)時(shí)，該表達(dá)丟失。最后，發(fā)現(xiàn)tgf-β1處理的細(xì)胞團(tuán)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞團(tuán)表達(dá)極高水平的x型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄物(軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志物)(圖16e)。這種高表達(dá)水平表明細(xì)胞團(tuán)正經(jīng)歷軟骨形成性肥大，作為軟骨內(nèi)骨化的前奏[shen,g.,theroleoftypexcollageninfacilitatingandregulatingendochondralossificationofarticularcartilage.orthodontics&craniofacialresearch,2005.8(1):p.11-17]。在第21天通過(guò)阿爾辛藍(lán)染色(其染色的gag為藍(lán)色)的石蠟包埋的細(xì)胞團(tuán)的組織學(xué)檢查顯示，相較于對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)，tgf-β1處理的細(xì)胞團(tuán)含有更多的gag。已經(jīng)確立了tgf-β1對(duì)hmscs的軟骨形成分化的作用，接下來(lái)我們?cè)噲D檢查肝素具有的效應(yīng)，然后開(kāi)始研究hs16+ve的作用。在實(shí)施例1中，我們顯示肝素能夠在處理后6小時(shí)增強(qiáng)hmsc中tgf-β1驅(qū)動(dòng)的psmad信號(hào)。由于在軟骨形成分化過(guò)程中每3天更換培養(yǎng)基，我們選擇使用第3天時(shí)間點(diǎn)來(lái)檢查肝素對(duì)sox9和comp的表達(dá)的影響,sox9和comp均為早期軟骨形成的標(biāo)志物[barry,f.等人,chondrogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsfrombonemarrow:differentiation-dependentgeneexpressionofmatrixcomponents.expcellres,2001.268(2):p.189-200；li,h.等人,comparativeanalysiswithcollagentypeiidistinguishescartilageoligomericmatrixproteinasaprimarytgfβ-responsivegene.osteoarthritiscartilage,2011.19(10):p.1246-1253；huang,a.h.,a.stein,和r.l.mauck,evaluationofthecomplextranscriptionaltopographyofmesenchymalstemcellchondrogenesisforcartilagetissueengineering.tissueengparta,2010.16(9):p.2699-708；zaucke,f.等人,cartilageoligomericmatrixprotein(comp)andcollagenixaresensitivemarkersforthedifferentiationstateofarticularprimarychondrocytes.biochemj,2001.358(1):p.17-24.]。我們還推斷，如果肝素能加強(qiáng)tgf-β1的作用，則對(duì)推薦劑量10ng/ml的響應(yīng)的進(jìn)一步增加可能是檢測(cè)不到的。因此，與推薦劑量平行使用較低劑量的tgf-β1。我們的數(shù)據(jù)顯示，不管使用的tgf-β1的量如何，5μg/ml的肝素不顯著改變sox9表達(dá)的水平(圖17a)。相反，10μg/ml的肝素本身不影響sox9表達(dá)，但是當(dāng)與1ng/mltgf-β1一起使用時(shí)，能夠增加sox9的表達(dá)。當(dāng)與10ng/ml的tgf-β1一起使用時(shí)，相同劑量的肝素不能引起sox9表達(dá)的任何變化，表明tgf-β1信號(hào)已經(jīng)飽和。在comp表達(dá)的情況下，發(fā)現(xiàn)兩種劑量的肝素自身都輕微地減少其表達(dá)(圖17b)。然而，當(dāng)與1ng/mltgf-β1組合使用時(shí)，肝素能夠以劑量依賴(lài)性方式增加comp表達(dá)水平。使用任一劑量的肝素與10ng/ml的tgf-β1不能引起comp表達(dá)的進(jìn)一步增加。事實(shí)上，較高劑量的肝素實(shí)際上降低了comp表達(dá)水平。這再次表明10ng/ml的tgf-β1是使得hmsc經(jīng)歷軟骨形成分化的飽和劑量。當(dāng)10μg/ml肝素與10ng/mltgf-β1一起使用時(shí)觀(guān)察到的comp表達(dá)的降低表明響應(yīng)于過(guò)量tgf-β1信號(hào)的負(fù)反饋機(jī)制的激活。選擇劑量為10μg/ml的gag以與1ng/ml劑量的tgf-β1聯(lián)合使用。用1ng/mltgf-β1,1ng/mltgf-β1和10μg/ml肝素或10ng/mltgf-β1培養(yǎng)21天的細(xì)胞團(tuán)的組織學(xué)分析顯示，較高劑量的tgf-β1導(dǎo)致gag產(chǎn)生和沉積的增加(基于阿爾辛藍(lán)染色)。與單獨(dú)的1ng/ml的tgf-β1相比，使用肝素與tgf-β1導(dǎo)致gag沉積略微增加，但是該增加仍然小于對(duì)10ng/ml的tgf-β1觀(guān)察到的增加。接下來(lái)，在單獨(dú)1ng/mltgf-β1(1tgf-β1)或與10μg/mlgag(肝素，hspm，hs16+ve或hs16-ve)組合的存在下，或用10ng/mltgf-β1(10tgf-β1)作為陽(yáng)性對(duì)照，使hmsc分化21天。在21天時(shí)分析sox9mrna表達(dá)，顯示使用的所有糖都沒(méi)有產(chǎn)生顯著變化(圖18a)。當(dāng)用肝素或hs16+ve(p<0.05)結(jié)合1ng/mltgf-β1培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，相對(duì)于單獨(dú)的1ng/mltgf-β1，comp表達(dá)增加約2.5倍(圖18b)。在補(bǔ)充有低(1ng/ml)tgf-β1和hspm或者h(yuǎn)s16-ve，或補(bǔ)充有高(10ng/ml)tgf-β1的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)相對(duì)于單獨(dú)的低劑量tgf-β1沒(méi)有顯著改變comp表達(dá)。在第21天，聚集蛋白聚糖表達(dá)對(duì)于低劑量和高劑量的tgf-β1以及肝素和hs16+ve是類(lèi)似的(圖18c)。然而，與hspm和hs16-ve一同培養(yǎng)降低了聚集蛋白聚糖的轉(zhuǎn)錄水平。相對(duì)于低tgf-β1，高tgf-β1誘導(dǎo)了x型膠原表達(dá)的顯著增加(p<0.001)(圖18d)。用gag處理相對(duì)于低tgf-β1沒(méi)有顯著改變x型膠原表達(dá)。ii型膠原轉(zhuǎn)錄物僅在用高tgf-β1處理的細(xì)胞團(tuán)中檢測(cè)到，因此這里未顯示。應(yīng)當(dāng)注意，在用hs16+ve處理的所有樣品中觀(guān)察到的高方差源自數(shù)據(jù)集內(nèi)的異常值的存在。相對(duì)于低tgf-β1，在第21天通過(guò)阿爾辛藍(lán)染色的細(xì)胞團(tuán)的組織學(xué)檢查未表明用各種糖培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)之間的顯著差異。然而，與低tgf-β1相比，高tgf-β1的確誘導(dǎo)了gag產(chǎn)量的中度增加。hs16對(duì)msc在體內(nèi)的軟骨形成分化的影響選擇骨骼成熟的成年新西蘭白兔用于我們的體內(nèi)試驗(yàn)，這既是由于它們?cè)谲浌切迯?fù)研究中的廣泛使用，也是為了避免在未成年兔中會(huì)觀(guān)察到的自發(fā)性愈合。我們選擇在包括在股骨滑車(chē)槽中的全深度軟骨缺損的模型中試驗(yàn)我們的化合物，其中微裂縫與市售的基于透明質(zhì)酸的水凝膠(auxigeltm，termiraab)一起使用[bergman,k.,等,injectablecell-freetemplateforbone-tissueformation.journalofbiomedicalmaterialsresearchparta,2009.91a(4):p.1111-1118.],基于reinholz等提出的指南[reinholz,g.g.等人,animalmodelsforcartilagereconstruction.biomaterials,2004.25(9):p.1511-1521.],icrs[hurtig,m.b.等人,preclinicalstudiesforcartilagerepair:recommendationsfromtheinternationalcartilagerepairsociety.cartilage,2011.2(2):p.137-152.],以及醫(yī)院當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)治療實(shí)踐[fritz,j.等,articularcartilagedefectsintheknee-basics,therapiesandresults.injury,2008.39(1,supplement):p.50-57；hunziker,e.b.,articularcartilagerepair:basicscienceandclinicalprogress.areviewofthecurrentstatusandprospects.osteoarthritiscartilage,2002.10(6):p.432-463].兔和人tgf-β1的序列比對(duì)揭示了tgf-β1不僅在兩個(gè)物種之間高度保守，而且鑒定的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域幾乎相同(圖19)。已發(fā)現(xiàn)兔的關(guān)節(jié)液中tgf-β1的平均水平范圍從年輕兔中的112.7pg/ml到成年兔中的52.3pg/ml[wei,x.和k.messner,age-andinjury-dependentconcentrationsoftransforminggrowthfactor-β1andproteoglycanfragmentsinrabbitkneejointfluid.osteoarthritisandcartilage,1998.6(1):p.10-18.]，而發(fā)現(xiàn)抗凝血的骨髓穿刺液的水平在成年兔(n＝20)中的范圍為190-881.8pg/ml，(lim,z.x.h.,未出版數(shù)據(jù))。單獨(dú)的研究還報(bào)告了在血小板活化后高達(dá)納克水平的tgf-β1的增加[coupes,b.m.等,plasmatransforminggrowthfactorβ1andplateletactivation:implicationsforstudiesintransplantrecipients.nephroldialtransplant,2001.16(2):p.361-367]，以及足夠水平的tgf-β1在傷口中的存在以刺激軟骨修復(fù)[shah,r.n.等人,supramoleculardesignofself-assemblingnanofibersforcartilageregeneration.procnatlacadsciusa,2010.107(8):p.3293-3298]。因此，我們的糖處理排除了外源性tgf-β1的使用。進(jìn)行12周的研究從而比較下列組：(1)每個(gè)缺陷用60μl水凝膠處理的對(duì)照組(單獨(dú)凝膠)；(2)用60μl水凝膠和10μghspm處理的缺陷(hspm)；(3)用60μl水凝膠和10μg的hs16+ve處理的缺陷(hs16+ve)，和(4)用60μl水凝膠和10μghs16-ve處理的缺陷(hs16-ve)?；谖覀兿惹暗墓ぷ?，10μg/ml的gag被確定為對(duì)于增強(qiáng)1ng/mltgf-β1的作用是最佳的。因此，確定10μggag的劑量將足以在缺陷內(nèi)實(shí)現(xiàn)該最佳濃度，即使在考慮滑膜腔內(nèi)可能的擴(kuò)散之后。如上所述創(chuàng)建缺陷。兩只兔子在試驗(yàn)結(jié)束前死于胃潴留，因此被排除在分析之外。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從兔中收獲整個(gè)股骨，在10％(v/v)nbf中固定，并在脫鈣并進(jìn)行組織學(xué)處理之前進(jìn)行宏觀(guān)成像。12周后宏觀(guān)觀(guān)察缺陷顯示對(duì)照(單獨(dú)凝膠)和處理組之間在組織填充方面的微小差異。雖然在每個(gè)治療組內(nèi)組織填充有相等量的變化，但是相對(duì)于其他組中的那些，在對(duì)照組中有更多的缺陷被不完全填充。用hspm，hs16+ve和hs16-ve治療的組的中值分?jǐn)?shù)高于單獨(dú)的凝膠的那些(圖20b)，表明使用hs16+ve可以提高愈合反應(yīng)的一致性。來(lái)自o’driscoll和icrsii評(píng)分系統(tǒng)的組織學(xué)評(píng)分顯示治療組之間沒(méi)有顯著差異。通過(guò)首先識(shí)別軟骨和軟骨下空間的邊界，在成像部分上疊加網(wǎng)格，然后測(cè)量每個(gè)組織學(xué)空間所填充的空間量，來(lái)確定缺損的組織填充。在組織填充方面，幾乎所有的樣品表現(xiàn)出完全的軟骨下填充和高水平的軟骨填充。所有治療組的組織填充分?jǐn)?shù)之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有樣品中軟骨下填充的中值百分比相似。所有三種化合物(hspm，hs16-ve和hs16+ve)具有高于對(duì)照樣品(gel，其為目前的臨床標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療)的中值組織填充分?jǐn)?shù)。體外數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于hspm和hs16-ve，hs16+ve能夠增強(qiáng)tgf-β1誘導(dǎo)的許多軟骨形成標(biāo)志物的表達(dá)。這表明可能需要在植入前用hs和tgfβ1預(yù)加載(例如，涂覆或浸漬)凝膠構(gòu)建物。體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，用單劑量的糖治療全深度軟骨缺損，結(jié)合微裂縫和水凝膠植入，至少與目前的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療一樣好，并且不產(chǎn)生不期望的副作用。hs16+ve在體內(nèi)數(shù)據(jù)中具有高于對(duì)照樣品(gel，其是當(dāng)前的臨床標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療)的中值分?jǐn)?shù)。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12