本發(fā)明涉及脂肪酸的生產(chǎn)方法。更具體地講，本發(fā)明涉及通過(guò)使用不飽和脂肪酸作為原材料生產(chǎn)羥基化脂肪酸，其特征在于通過(guò)新型酶的水合反應(yīng)，并且還涉及通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)氧化反應(yīng)從羥基化脂肪酸生產(chǎn)氧代脂肪酸。另外，其涉及通過(guò)所述生產(chǎn)方法獲得的新型稀有脂肪酸。

背景技術(shù)：

已報(bào)道，以共軛亞油酸（cla）為代表的共軛脂肪酸具有各種生理活性如改善脂質(zhì)代謝效果、抗動(dòng)脈硬化作用、降低體脂肪作用等（非專(zhuān)利文件1-3），并且是預(yù)期適用于藥物、功能性食物等各個(gè)領(lǐng)域的功能性脂質(zhì)（專(zhuān)利文件1、2）。雖然已知乳制品和肉制品中含有cla（因?yàn)槠涫怯煞雌c動(dòng)物胃中存在的微生物產(chǎn)生的）并且少量存在于植物油中，但是其產(chǎn)生的詳細(xì)機(jī)理尚不了解。

本發(fā)明人報(bào)道了存在于植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）菌體中的酶（cla-hy、cla-dc、cla-dh）對(duì)于將亞油酸轉(zhuǎn)化成共軛亞油酸的反應(yīng)是必要的（專(zhuān)利文件1）。已經(jīng)報(bào)道了這些酶反應(yīng)中一系列特定反應(yīng)的機(jī)理、中間體的存在等（專(zhuān)利文件4）。雖然對(duì)于生產(chǎn)在含18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸（如亞油酸等）的10-位具有羥基、羰基的稀有脂肪酸而言，這些酶反應(yīng)是有效的，但是在13-位具有羥基、羰基的稀有脂肪酸的生產(chǎn)方法尚不清楚。

另外，近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道了番茄中含有的氧代脂肪酸（如9-氧代-十八碳二烯酸、13-氧代-十八碳二烯酸等）具有改善與生活方式相關(guān)的疾病的活性，如改善脂質(zhì)代謝等（專(zhuān)利文件3；非專(zhuān)利文件4、5）。此外，已經(jīng)報(bào)道了在10-位具有羥基、氧代基的羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸具有改善與生活方式相關(guān)的疾病的活性（如改善代謝、改善脂質(zhì)代謝等）以及改善腸屏障功能的活性（專(zhuān)利文件5、6），羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸正受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，從不飽和脂肪酸合成功能性羥基化脂肪酸、功能性氧代脂肪酸是困難的，這是因?yàn)樵诹u基化脂肪酸和氧代脂肪酸中，有必要區(qū)分不飽和脂肪酸分子中存在的多個(gè)雙鍵并在特定位置引入羥基、羰基。

[文件列表]

[專(zhuān)利文件]

專(zhuān)利文件1：jp-a-2007-259712

專(zhuān)利文件2：jp-a-2007-252333

專(zhuān)利文件3：jp-a-2011-184411

專(zhuān)利文件4：wo2013/168310

專(zhuān)利文件5：wo2014/069227

專(zhuān)利文件6：wo2014/129384

[非專(zhuān)利文件]

非專(zhuān)利文件1：hayl,(1987),carcinogenesis,第8卷,第12號(hào),第1881-1887頁(yè)

非專(zhuān)利文件2：clementip,(1991),cancerres.,第51卷,第6118-6124頁(yè)

非專(zhuān)利文件3：kisunnl,(1994),atherosclerosis,第108卷,第19-25頁(yè)

非專(zhuān)利文件4：kimy-i,(2011),mol.nutr.foodres.,第55卷,第585-593頁(yè)

非專(zhuān)利文件5：kimy-i,(2012),plosone,第7卷,第2號(hào),e31317。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問(wèn)題

本發(fā)明的目標(biāo)是提供通過(guò)使用不飽和脂肪酸作為原材料并使用新型酶生產(chǎn)羥基化脂肪酸、氧代脂肪酸的方法。

解決問(wèn)題的方法

本發(fā)明人已經(jīng)闡明了反應(yīng)，其中嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）羥基化含有18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸的13-位，并且識(shí)別出了生產(chǎn)中涉及到的新型酶（fa-hy）。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過(guò)使用新型酶（fa-hy）將含有16、18、20個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸、順-4,順-7,順-10,順-13,順-16,順-19-二十二碳六烯酸（dha）和順-9-十四碳烯酸（肉豆蔻腦酸）轉(zhuǎn)化成羥基化脂肪酸的方法，并且還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)氧化所生成物質(zhì)的羥基的方法。

本發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)使用新型酶（fa-hy）的新型稀有脂肪酸的生產(chǎn)方法生產(chǎn)了所發(fā)現(xiàn)的具有此前從未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)的羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸，并且發(fā)現(xiàn)其具有核受體pparα和pparγ激動(dòng)劑活性。

具體而言，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過(guò)使用新型酶（fa-hy）從亞油酸生產(chǎn)13-羥基-順-9-十八碳烯酸，并且還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)引入酶反應(yīng)或使用鉻酸的化學(xué)氧化方法從13-羥基-順-9-十八碳烯酸生產(chǎn)13-氧代-順-9-十八碳烯酸。

本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)一步研究并發(fā)現(xiàn)使用新型酶（fa-hy），分別從含有18個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸(stearidonicacid)等）、含有16個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（棕櫚油酸(pulmitoleicaicd)等）、含有20個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（二高-γ-亞麻酸或花生四烯酸等）、含有18或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（11-順-十八碳烯酸(cis-vaccenicacid)、二高-γ-亞麻酸、(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸(meadacid)等）作為底物，生產(chǎn)在13-位、10-位、15-位、12-位被羥基化的脂肪酸。此外，他們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用dha作為底物生產(chǎn)14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸以及通過(guò)使用肉豆蔻腦酸作為底物生產(chǎn)10-羥基-十四烷酸。另外，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所得產(chǎn)物中的一些羥基化脂肪酸具有此前從未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)并且其為新物質(zhì)。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類(lèi)包含新型脂肪酸的羥基化脂肪酸具有作為核受體pparα和pparγ的激動(dòng)劑的活性，并且是可用作代謝改善劑等的物質(zhì)。

他們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由本發(fā)明獲得的羥基化脂肪酸作為原材料可以通過(guò)引入酶反應(yīng)或使用鉻酸的化學(xué)氧化方法而被轉(zhuǎn)化成氧代脂肪酸。他們已經(jīng)在此類(lèi)所得產(chǎn)物的氧代脂肪酸中發(fā)現(xiàn)了具有此前從未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類(lèi)氧代脂肪酸（包括新型脂肪酸）具有作為核受體pparα和pparγ的激動(dòng)劑的活性，并且其是可用作代謝改善劑等的物質(zhì)。已經(jīng)基于以上發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明提供了下列內(nèi)容：

[1]下列(a)-(c)中任一項(xiàng)的酶蛋白質(zhì)：

(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列組成的酶蛋白質(zhì)；

(b)蛋白質(zhì)，其包含氨基酸序列并且具有催化水合反應(yīng)的酶活性，在所述氨基酸序列中seqidno:2所示的所述氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失和/或取代和/或插入和/或添加；

(c)蛋白質(zhì)，其由堿基序列編碼并且具有催化水合反應(yīng)的酶活性，所述堿基序列在嚴(yán)格條件下雜交至核酸，所述核酸由與seqidno:1所示的堿基序列互補(bǔ)的鏈序列組成；

[2]嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）菌體或其菌體碎片，包含[1]的酶蛋白質(zhì)；

[3]編碼[1]的酶蛋白質(zhì)的核酸；

[4]包含[3]的核酸的載體；

[5]用[4]的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；

[6]生產(chǎn)[1]的酶蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)[5]的宿主細(xì)胞以及從所述培養(yǎng)物中回收所述酶；

[7]生產(chǎn)含有18個(gè)碳原子并在13-位具有羥基的羥基化脂肪酸的方法，包括使含有18個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[8]生產(chǎn)含有18個(gè)碳原子并在13-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有18個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)，以誘導(dǎo)含有18個(gè)碳原子并在13-位具有羥基的羥基化脂肪酸，并使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[9]生產(chǎn)含有16個(gè)碳原子并在10-位具有羥基的羥基化脂肪酸的方法，包括使含有16個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[10]生產(chǎn)含有16個(gè)碳原子并在10-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有16個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)，以誘導(dǎo)含有16個(gè)碳原子并在10-位具有羥基的羥基化脂肪酸，并使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[11]生產(chǎn)含有20個(gè)碳原子并在15-位具有羥基的羥基化脂肪酸的方法，包括使含有20個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[12]生產(chǎn)含有20個(gè)碳原子并在15-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有20個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)，以誘導(dǎo)含有20個(gè)碳原子并在15-位具有羥基的羥基化脂肪酸，并使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[13]生產(chǎn)含有18或20個(gè)碳原子并在12-位具有羥基的羥基化脂肪酸的方法，包括使含有18或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[14]生產(chǎn)含有18或20個(gè)碳原子并在12-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有18或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)，以誘導(dǎo)含有18或20個(gè)碳原子并在12-位具有羥基的羥基化脂肪酸，并使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[15][7]或[8]的方法，其中所述含有18個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸為亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸、10-羥基-順-12-十八碳烯酸、10-羥基-順-6,順-12-十八碳二烯酸、10-羥基-順-12,順-15-十八碳二烯酸、10-羥基-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸、10-氧代-順-12-十八碳烯酸、10-氧代-順-6,順-12-十八碳二烯酸、10-氧代-順-12,順-15-十八碳二烯酸、10-氧代-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸、皮諾斂酸(pinolenicacid)或哥倫比亞酸(columbinicacid)；

[16][9]或[10]的方法，其中所述含有16個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸為棕櫚油酸（pulmitoleicacid）；

[17][11]或[12]的方法，其中所述含有20個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸為順-11,順-14-二十碳二烯酸、順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸、二高-γ-亞麻酸、順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸、花生四烯酸、5(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸(sciadonicacid)或(5z,11z,14z,17z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸(juniperonicacid)；

[18][13]或[14]的方法，其中所述含有18或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸為11-順-十八碳烯酸、順-11-順-14-二十碳二烯酸、順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸、二高-γ-亞麻酸、(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸、順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸或花生四烯酸；

[19]生產(chǎn)14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使順-4,順-7,順-10,順-13,順-16,順-19-二十二碳六烯酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[20]生產(chǎn)14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使順-4,順-7,順-10,順-13,順-16,順-19-二十二碳六烯酸經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸，并且使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[21]生產(chǎn)10-羥基-十四烷酸的方法，包括使順-9-十四碳烯酸（肉豆蔻腦酸）經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)；

[22]生產(chǎn)10-氧代-十四烷酸的方法，包括使順-9-十四碳烯酸（肉豆蔻腦酸）經(jīng)受使用[1]的酶蛋白質(zhì)的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)10-羥基-十四烷酸，并使所述羥基化脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化；

[23][8]、[10]、[12]、[14]-[18]、[20]或[22]的方法，其中所述脫氫反應(yīng)使用來(lái)源于乳桿菌的脫氫酶；

[24][23]的方法，其中所述乳桿菌為植物乳桿菌fermbp-10549菌株；

[25]由[7]的方法生產(chǎn)的13-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸、13-羥基-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸、10,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸、10,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸、10,13-二羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸、10-氧代-13-羥基-順-6-十八碳烯酸、10-氧代-13-羥基-順-15-十八碳烯酸、10-氧代-13-羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸、13-羥基-順-5,順-9-十八碳二烯酸或13-羥基-反-5,順-9-十八碳二烯酸；

[26]由[11]的方法生產(chǎn)的15-羥基-順-11,順-17-二十碳二烯酸、15-羥基-順-8,順-11-二十碳二烯酸、15-羥基-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸、15-羥基-順-5,順-11-二十碳二烯酸或15-羥基-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸；

[27]由[13]的方法生產(chǎn)的12-羥基-順-14-二十碳烯酸、12-羥基-順-14,順-17-二十碳二烯酸或12-羥基-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸；

[28]由[8]的方法生產(chǎn)的13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸、13-氧代-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸、10,13-二氧代-順-6-十八碳烯酸、10,13-二氧代-順-15-十八碳烯酸、10,13-二氧代-順-6,順-15-十八碳二烯酸、13-氧代-順-5,順-9-十八碳二烯酸或13-氧代-反-5,順-9-十八碳二烯酸；

[29]由[12]的方法生產(chǎn)的15-氧代-順-11,順-17-二十碳二烯酸、15-氧代-順-8,順-11-二十碳二烯酸、15-氧代-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸、15-氧代-順-5,順-11-二十碳二烯酸或15-氧代-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸；

[30]由[14]的方法生產(chǎn)的12-氧代-順-14-二十碳烯酸、12-氧代-順-14,順-17-二十碳二烯酸、12-氧代-順-8,順-14-二十碳二烯酸、12-氧代-順-5,順-8-二十碳二烯酸或12-氧代-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸；

[31]由[19]的方法生產(chǎn)的14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸；

[32]由[20]的方法生產(chǎn)的14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸；

[33]含脂肪酸的物質(zhì)，其包含[25]-[32]中任一項(xiàng)的羥基化脂肪酸或氧代脂肪酸；

[34]包括[1]的酶蛋白質(zhì)的嗜酸乳桿菌菌體或其菌體碎片在生產(chǎn)[25]-[32]中任一項(xiàng)的羥基化脂肪酸或氧代脂肪酸中的用途。

[發(fā)明效果]

在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)上未知的脂肪酸水合酶（fa-hy），發(fā)現(xiàn)了將含有16、18或20個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸、dha或肉豆蔻腦酸轉(zhuǎn)化成羥基化脂肪酸的方法，并且還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)氧化所得物質(zhì)的羥基的方法。要生產(chǎn)的稀有脂肪酸等極為有用，這是因?yàn)槠溆糜谌缢幬?、食物、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域中。另外，可以通過(guò)使用新型酶的生產(chǎn)來(lái)產(chǎn)生新型稀有脂肪酸，并且所述新型稀有脂肪酸也具有作為核受體pparα和pparγ的激動(dòng)劑的活性。因此，其可以是用于如藥物、食物、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域中的有用物質(zhì)。

[附圖說(shuō)明]

圖1示出了源自亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸的稀有脂肪酸的pparα激動(dòng)劑活性的結(jié)果。etoh顯示陰性對(duì)照（加入乙醇），而gw7647顯示陽(yáng)性對(duì)照（加入pparα激動(dòng)劑）。縱軸顯示相對(duì)的螢光素酶活性。

圖2示出了源自亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸的稀有脂肪酸的pparγ激動(dòng)劑活性的結(jié)果。etoh顯示陰性對(duì)照（加入乙醇），而tro顯示陽(yáng)性對(duì)照（加入pparγ激動(dòng)劑）?？v軸顯示相對(duì)的螢光素酶活性。

[具體實(shí)施方式]

本發(fā)明詳細(xì)解釋于下。

本發(fā)明提供了新型脂肪酸水合酶“fa-hy”。

具體地講，本發(fā)明的新型酶“fa-hy”是

(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列組成的酶蛋白質(zhì)；

(b)蛋白質(zhì)，其包含氨基酸序列并且具有酶活性，在所述氨基酸序列中seqidno:2所示的所述氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失和/或取代和/或插入和/或添加，所述酶活性是由seqidno:2所示的氨基酸序列組成的酶蛋白質(zhì)所具有的酶活性；或

(c)蛋白質(zhì)，其由堿基序列編碼并且具有酶活性，所述堿基序列在嚴(yán)格條件下雜交至核酸，所述核酸由與seqidno:1所示的堿基序列互補(bǔ)的鏈序列組成，所述酶活性是由seqidno:2所示的氨基酸序列組成的酶蛋白質(zhì)所具有的酶活性。

上述(b)的更具體的實(shí)例包括含有以下的蛋白質(zhì)：(i)氨基酸序列，其是seqidno:2所示的氨基酸序列，其中1-20、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1-幾個(gè)（5、4、3或2）氨基酸被缺失，(ii)氨基酸序列，其是seqidno:2所示的氨基酸序列，其中1-20、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1–幾個(gè)數(shù)目（5、4、3或2）的氨基酸被添加，(iii）氨基酸序列，其是seqidno:2所示的氨基酸序列，其中1-20、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1–幾個(gè)（5、4、3或2）氨基酸被插入，(iv)氨基酸序列，其是seqidno:2所示的氨基酸序列，其中1-20、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1–幾個(gè)（5、4、3或2）氨基酸被其它氨基酸取代，或(v)通過(guò)將其組合而獲得的氨基酸序列。當(dāng)具有相似特性的氨基酸（例如，甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸和異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、賴(lài)氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等）彼此取代等時(shí)，可能有更大數(shù)目的取代等。

當(dāng)如上所述氨基酸被缺失、取代或插入時(shí)，缺失、取代和插入的位置不受特別限制，只要上述酶活性得以保持。

在上述(c)中，“嚴(yán)格條件”是這樣的條件：在該條件下，具有高同一性（例如，70、80、90、95或99%或以上的同一性）的核苷酸序列相互雜交，而具有低于所述的同一性的核苷酸序列不雜交；具體地講，于對(duì)應(yīng)于常規(guī)dna雜交的洗滌條件中那些的鹽濃度和溫度（60℃,1xssc,0.1%sds,優(yōu)選地，0.1xssc,0.1%sds,更優(yōu)選地,68℃,0.1xssc,0.1%sds）等，洗滌一次、更優(yōu)選2–3次的條件。

關(guān)于上述(b)或(c)，由seqidno:2所示的氨基酸序列組成的酶蛋白質(zhì)所具有的酶活性不受特別限制，只要其具有下列中的至少一項(xiàng)、優(yōu)選全部：（1）能夠?qū)⒂米鞯孜锏暮?8個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“順-12不飽和脂肪酸”）轉(zhuǎn)化成含有18個(gè)碳原子并在13-位具有羥基的羥基化脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“13-羥基脂肪酸”）（反應(yīng)1）的酶活性；（2）能夠?qū)⒂米鞯孜锏暮?6個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“順-9不飽和脂肪酸”）轉(zhuǎn)化成含有16個(gè)碳原子并在10-位具有羥基的羥基化脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“10-羥基脂肪酸”）（反應(yīng)2）的酶活性；（3）能夠?qū)⒂米鞯孜锏暮?0個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“順-14不飽和脂肪酸”）轉(zhuǎn)化成含有20個(gè)碳原子并在15-位具有羥基的羥基化脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“15-羥基脂肪酸”）（反應(yīng)3）的酶活性；（4）能夠?qū)⒂米鞯孜锏暮?8或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“順-11不飽和脂肪酸”）轉(zhuǎn)化成含有18或20個(gè)碳原子并在12-位具有羥基的羥基化脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“12-羥基脂肪酸”）（反應(yīng)4）的酶活性、能夠?qū)㈨?4,順-7,順-10,順-13,順-16,順-19-二十二碳六烯酸（dha）轉(zhuǎn)化成14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸（反應(yīng)a）的酶活性以及能夠?qū)㈨?9-十四碳烯酸（肉豆蔻腦酸）轉(zhuǎn)化成10-羥基-十四烷酸（反應(yīng)i）的酶活性。

上述“順-12不飽和脂肪酸”、“順-9不飽和脂肪酸”、“順-14不飽和脂肪酸”和“順-11不飽和脂肪酸”不受特別限制，只要其分別是含有18個(gè)碳原子并在12-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸、含有16個(gè)碳原子并在9-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸、含有20個(gè)碳原子并在14-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸、含有18或20個(gè)碳原子并在11-位具有順式雙鍵的不飽和脂肪酸，并且可以提及例如，單價(jià)不飽和脂肪酸、二價(jià)不飽和脂肪酸、三價(jià)不飽和脂肪酸、四價(jià)不飽和脂肪酸、五價(jià)不飽和脂肪酸等。在本說(shuō)明書(shū)中，“脂肪酸”不僅涵蓋了游離酸，而且涵蓋了酯的形式、與堿性化合物的鹽等。“dha”和“肉豆蔻腦酸”也不僅涵蓋了游離酸，而且涵蓋了酯的形式、與堿性化合物的鹽等。

本發(fā)明的fa-hy可以通過(guò)本身已知的蛋白質(zhì)分離和純化技術(shù)分離自，例如，嗜酸乳桿菌的菌體、培養(yǎng)基。作為另外一種選擇，fa-hy可作為含有fa-hy的嗜酸乳桿菌的菌體或其菌體碎片使用。含有fa-hy的嗜酸乳桿菌的菌體不受特別限制，只要其含有本發(fā)明的fa-hy，并且，例如，可以提及nitebp-01788等。作為另外一種選擇，fa-hy也可以通過(guò)如下步驟作為重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)：根據(jù)實(shí)施例2中所述的方法分離編碼fa-hy的基因，將所述基因亞克隆到合適的載體中，將所述載體引入到合適的宿主（如大腸桿菌(escherichiacoli)等）中并培養(yǎng)所述宿主。fa-hy可以是經(jīng)過(guò)純化或粗純化的。作為另外一種選擇，可以在菌體（如大腸桿菌等）中表達(dá)水合酶，并且可使用所述菌體自身或可使用其培養(yǎng)基。此外，所述酶可以是游離形式或由各種載體固定化的。

作為含有編碼本發(fā)明的fa-hy的核酸的載體，適用于將要引入所述載體的宿主細(xì)胞的載體可以根據(jù)目標(biāo)（例如，蛋白質(zhì)表達(dá)）而恰當(dāng)選擇并使用。就表達(dá)載體而言，其含有本發(fā)明的核酸，所述核酸可操作地連接至適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，并且優(yōu)選地在本發(fā)明的核酸的下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，即，終止子區(qū)。此外，其也可以含有用以選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記基因（耐藥基因、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的基因等）。其也可含有編碼標(biāo)簽序列的序列，所述標(biāo)簽序列用于分離和純化所表達(dá)蛋白質(zhì)等。另外，可將載體整合入靶宿主細(xì)胞的基因組中?？梢酝ㄟ^(guò)本身已知的轉(zhuǎn)化方法（如感受態(tài)細(xì)胞法、原生質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法等）將本發(fā)明的載體引入到靶宿主細(xì)胞中。

在本發(fā)明中，“宿主細(xì)胞”可以是任何細(xì)胞，只要其可以表達(dá)含有編碼本發(fā)明的fa-hy的核酸的載體，并且可以提及細(xì)菌、酵母、真菌、高等真核細(xì)胞等。細(xì)菌的實(shí)例包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如芽孢桿菌、鏈霉菌屬(streptomyces)等）和革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等）。引入了含有編碼fa-hy的核酸的載體的重組細(xì)胞可以通過(guò)本身已知的適用于所述宿主細(xì)胞的方法來(lái)培養(yǎng)。

“純化”本發(fā)明的fa-hy可以通過(guò)本身已知的方法進(jìn)行，例如，將通過(guò)離心等收集到的菌體通過(guò)超聲處理或玻璃珠等破裂，將固體（如細(xì)胞碎片）通過(guò)離心等移除等以得到粗酶溶液，使所述粗酶溶液經(jīng)受鹽析法（使用硫酸銨、硫酸鈉等）、層析（如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等）、凝膠電泳等。

如上所述，本發(fā)明的fa-hy具有能夠?qū)⒂米鞯孜锏捻?12不飽和脂肪酸、順-9不飽和脂肪酸、順-14不飽和脂肪酸、順-11不飽和脂肪酸、dha、肉豆蔻腦酸分別轉(zhuǎn)化成13-羥基脂肪酸、10-羥基脂肪酸、15-羥基脂肪酸、12-羥基脂肪酸、14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸、10-羥基-十四烷酸的酶活性。因此，本發(fā)明也提供了[1]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從順-12不飽和脂肪酸生產(chǎn)13-羥基脂肪酸的方法（生產(chǎn)方法1），[2]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從順-9不飽和脂肪酸生產(chǎn)10-羥基脂肪酸的方法（生產(chǎn)方法2），[3]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從順-14不飽和脂肪酸生產(chǎn)15-羥基脂肪酸的方法（生產(chǎn)方法3），[4]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從順-11不飽和脂肪酸生產(chǎn)12-羥基脂肪酸的方法（生產(chǎn)方法4），[a]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從dha生產(chǎn)14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸的方法（生產(chǎn)方法a）和[i]通過(guò)使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)從肉豆蔻腦酸生產(chǎn)10-羥基-十四烷酸的方法（生產(chǎn)方法i）。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法1中的“順-12不飽和脂肪酸”的實(shí)例包括：順-9,順-12-十八碳二烯酸（亞油酸）、順-6,順-9,順-12-十八碳三烯酸（γ-亞麻酸）、順-9,順-12,順-15-十八碳三烯酸（α-亞麻酸）、順-6,順-9,順-12,順-15-十八碳四烯酸（(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）以及現(xiàn)在可以通過(guò)wo2013/168310生產(chǎn)的10-羥基-順-12-十八碳烯酸、10-羥基-順-6,順-12-十八碳二烯酸、10-羥基-順-12,順-15-十八碳二烯酸、10-羥基-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸、10-氧代-順-12-十八碳烯酸、10-氧代-順-6,順-12-十八碳二烯酸、10-氧代-順-12,順-15-十八碳二烯酸、10-氧代-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸、順-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（皮諾斂酸）、反-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（哥倫比亞酸）等。這些底物可以通過(guò)wo2013/168310以外的方法獲得。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法1所生產(chǎn)的“13-羥基脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-9,順-12-十八碳二烯酸（亞油酸）誘導(dǎo)的13-羥基-順-9-十八碳烯酸、由順-6,順-9,順-12-十八碳三烯酸（γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的13-羥基-順-6,順-9-十八碳二烯酸、由順-9,順-12,順-15-十八碳三烯酸（α-亞麻酸）誘導(dǎo)的13-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸、由順-6,順-9,順-12,順-15-十八碳四烯酸（(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）誘導(dǎo)的13-羥基-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸、由10-羥基-順-12-十八碳烯酸誘導(dǎo)的10,13-二羥基-十八烷酸、由10-羥基-順-6,順-12-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸、由10-羥基-順-12,順-15-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸、由10-羥基-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸誘導(dǎo)的10,13-二羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸、由10-氧代-順-12-十八碳烯酸誘導(dǎo)的10-氧代-13-羥基-十八烷酸、由10-氧代-順-6,順-12-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10-氧代-13-羥基-順-6-十八碳烯酸、由10-氧代-順-12,順-15-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10-氧代-13-羥基-順-15-十八碳烯酸、由10-氧代-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸誘導(dǎo)的10-氧代-13-羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸、由順-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（皮諾斂酸）誘導(dǎo)的13-羥基-順-5,順-9-十八碳二烯酸、由反-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸(哥倫比亞酸)誘導(dǎo)的13-羥基-反-5,順-9-十八碳二烯酸等。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法2中的“順-9不飽和脂肪酸”的實(shí)例包括：順-9-十六碳烯酸（棕櫚油酸）等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法2所生產(chǎn)的“10-羥基脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-9-十六碳烯酸（棕櫚油酸）誘導(dǎo)的10-羥基-十六烷酸等。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法3中的“順-14不飽和脂肪酸”的實(shí)例包括：順-11,順-14-二十碳二烯酸、順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸、順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）、順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸、順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）、順-5,順-11,順-14-二十碳三烯酸（5(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸）、順-5,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸（(5z,11z,14z,17z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法3所生產(chǎn)的“15-羥基脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-11,順-14-二十碳二烯酸誘導(dǎo)的15-羥基-順-11-二十碳烯酸、由順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸誘導(dǎo)的15-羥基-順-11,順-17-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的15-羥基-順-8,順-11-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸誘導(dǎo)的15-羥基-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸、由順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）誘導(dǎo)的15-羥基-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸、由順-5,順-11,順-14-二十碳三烯酸（5(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸）誘導(dǎo)的15-羥基-順-5,順-11-二十碳二烯酸、由順-5,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸（(5z,11z,14z,17z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）誘導(dǎo)的15-羥基-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸等。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法4中的“順-11不飽和脂肪酸”的實(shí)例包括：順-11-十八碳烯酸（11-順-十八碳烯酸）、順-11,順-14-二十碳二烯酸、順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸、順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）、順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸（(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）、順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸、順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法4所生產(chǎn)的“12-羥基脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-11-十八碳烯酸（11-順-十八碳烯酸）誘導(dǎo)的12-羥基-十八烷酸、由順-11,順-14-二十碳二烯酸誘導(dǎo)的12-羥基-順-14-二十碳烯酸、由順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸誘導(dǎo)的12-羥基-順-14,順-17-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的12-羥基-順-8,順-14-二十碳二烯酸、由順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸（(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）誘導(dǎo)的12-羥基-順-5,順-8-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸誘導(dǎo)的12-羥基-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸、由順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）誘導(dǎo)的12-羥基-順-5,順-8,順-14-二十碳三烯酸等。

水合反應(yīng)可以在合適的緩沖液（例如，磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液等）中通過(guò)以下進(jìn)行：將作為底物的不飽和脂肪酸與本發(fā)明的fa-hy于合適的濃度混合并溫育所述混合物。底物濃度為，例如，1-1000g/l，優(yōu)選10-500g/l，更優(yōu)選20-250g/l。將要加入的上述fa-hy的量為，例如，0.001-10mg/ml，優(yōu)選0.1-5mg/ml，更優(yōu)選0.2-2mg/ml。

“輔因子”可用于水合反應(yīng)（反應(yīng)1-4、反應(yīng)a或反應(yīng)i）并且，例如，可使用fad等。添加的濃度可以是任意的，只要所述水合反應(yīng)有效地進(jìn)行。優(yōu)選0.001–20mm，更優(yōu)選0.01–10mm。

此外，“激活劑”可用于所述水合反應(yīng)并且，例如，可以提及選自nadh和nadph的1種或2種化合物。其添加的濃度可以是任意的，只要所述水合反應(yīng)有效地進(jìn)行。優(yōu)選0.1–20mm，更優(yōu)選1–10mm。

期望的是，水合反應(yīng)在本發(fā)明的fa-hy的優(yōu)選溫度下和優(yōu)選ph范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，反應(yīng)溫度為5-50℃，優(yōu)選20-45℃。反應(yīng)混合物的ph為，例如，ph4-10，優(yōu)選ph5-9。反應(yīng)時(shí)間不受特別限制，并且其為，例如，10分鐘-72小時(shí)，優(yōu)選30分鐘-36小時(shí)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的fa-hy以重組細(xì)胞（例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等）的形式提供給反應(yīng)體系，所述重組細(xì)胞中引入了含有編碼所述酶的核酸的表達(dá)載體。在這種情況下，水合反應(yīng)也可以通過(guò)如下進(jìn)行：在適合于所述細(xì)胞的培養(yǎng)、并加入了輔因子和底物以及在必要時(shí)激活劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。

此外，通過(guò)脫氫反應(yīng)或使用鉻酸的化學(xué)氧化，從在本發(fā)明的生產(chǎn)方法1-4、生產(chǎn)方法a、生產(chǎn)方法i中獲得的13-羥基脂肪酸生產(chǎn)了含有18個(gè)碳原子并在13-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“13-氧代脂肪酸”）（反應(yīng)5），從10-羥基脂肪酸生產(chǎn)了含有16個(gè)碳原子并在10-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“10-氧代脂肪酸”）（反應(yīng)6），從15-羥基脂肪酸生產(chǎn)了含有20個(gè)碳原子并在15-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“15-氧代脂肪酸”）（反應(yīng)7），從12-羥基脂肪酸生產(chǎn)了含有18或20個(gè)碳原子并在12-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)“12-氧代脂肪酸”）（反應(yīng)8），從14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸生產(chǎn)了14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸（反應(yīng)b），以及從10-羥基-十四烷酸生產(chǎn)了10-氧代-十四烷酸（反應(yīng)ii）。

因此，本發(fā)明也提供了：[5]生產(chǎn)13-氧代脂肪酸的方法，包括使順-12不飽和脂肪酸經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)13-羥基脂肪酸，并使所述13-羥基脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法5）；[6]生產(chǎn)10-氧代脂肪酸的方法，包括使順-9不飽和脂肪酸經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)10-羥基脂肪酸，并使所述10-羥基脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法6）；[7]生產(chǎn)15-氧代脂肪酸的方法，包括使順-14不飽和脂肪酸經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)15-羥基脂肪酸，并使所述15-羥基脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法7）；[8]生產(chǎn)12-氧代脂肪酸的方法，包括使順-11不飽和脂肪酸經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)12-羥基脂肪酸，并使所述12-羥基脂肪酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法8）；[b]生產(chǎn)14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使dha經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸，并使所述14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法b）；以及[ii]生產(chǎn)10-氧代-十四烷酸的方法，包括使肉豆蔻腦酸經(jīng)受使用本發(fā)明的fa-hy的水合反應(yīng)以誘導(dǎo)10-羥基-十四烷酸，并使所述10-羥基-十四烷酸經(jīng)受脫氫反應(yīng)或化學(xué)氧化（生產(chǎn)方法ii）。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法5-8中的“順-12不飽和脂肪酸”、“順-9不飽和脂肪酸”、“順-14不飽和脂肪酸”、“順-11不飽和脂肪酸”與上述生產(chǎn)方法1-4中的底物相同。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法5所生產(chǎn)的“13-氧代脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-9,順-12-十八碳二烯酸（亞油酸）誘導(dǎo)的13-氧代-順-9-十八碳烯酸、由順-6,順-9,順-12-十八碳三烯酸（γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸、由順-9,順-12,順-15-十八碳三烯酸（α-亞麻酸）誘導(dǎo)的13-氧代-順-9,順-15-十八碳二烯酸、由順-6,順-9,順-12,順-15-十八碳四烯酸（(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）誘導(dǎo)的13-氧代-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸、由10-羥基-順-12-十八碳烯酸或10-氧代-順-12-十八碳烯酸誘導(dǎo)的10,13-二氧代-十八烷酸、由10-羥基-順-6,順-12-十八碳二烯酸或10-氧代-順-6,順-12-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10,13-二氧代-順-6-十八碳烯酸、由10-羥基-順-12,順-15-十八碳二烯酸或10-氧代-順-12,順-15-十八碳二烯酸誘導(dǎo)的10,13-二氧代-順-15-十八碳烯酸、由10-羥基-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸或10-氧代-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸誘導(dǎo)的10,13-二氧代-順-6,順-15-十八碳二烯酸、由順-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（皮諾斂酸）誘導(dǎo)的13-氧代-順-5,順-9-十八碳二烯酸、由反-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸(哥倫比亞酸)誘導(dǎo)的13-氧代-反-5,順-9-十八碳二烯酸等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法6所生產(chǎn)的“10-氧代脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-9-十六碳烯酸（棕櫚油酸）誘導(dǎo)的10-氧代-十六烷酸等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法7所生產(chǎn)的“15-氧代脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-11,順-14-二十碳二烯酸誘導(dǎo)的15-氧代-順-11-二十碳烯酸、由順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸誘導(dǎo)的15-氧代-順-11,順-17-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的15-氧代-順-8,順-11-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸誘導(dǎo)的15-氧代-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸、由順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）誘導(dǎo)的15-氧代-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸、由順-5,順-11,順-14-二十碳三烯酸（5(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸）誘導(dǎo)的15-氧代-順-5,順-11-二十碳二烯酸、由順-5,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸（(5z,11z,14z,17z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）誘導(dǎo)的15-氧代-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸等。

由本發(fā)明的生產(chǎn)方法8所生產(chǎn)的“12-氧代脂肪酸”的實(shí)例包括：由順-11-十八碳烯酸（11-順-十八碳烯酸）誘導(dǎo)的12-氧代-十八烷酸、由順-11,順-14-二十碳二烯酸誘導(dǎo)的12-氧代-順-14-二十碳烯酸、由順-11,順-14,順-17-二十碳三烯酸誘導(dǎo)的12-氧代-順-14,順-17-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亞麻酸）誘導(dǎo)的12-氧代-順-8,順-14-二十碳二烯酸、由順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸（(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）誘導(dǎo)的12-氧代-順-5,順-8-二十碳二烯酸、由順-8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸誘導(dǎo)的12-氧代-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸、由順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）誘導(dǎo)的12-氧代-順-5,順-8,順-14-二十碳三烯酸等。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法5-8、生產(chǎn)方法b或生產(chǎn)方法ii中所用的脫氫酶不受特別限制，只要其是這樣的酶：能夠?qū)⒂米鞯孜锏?3-羥基脂肪酸、10-羥基脂肪酸、15-羥基脂肪酸、12-羥基脂肪酸、14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸、10-羥基-十四烷酸分別轉(zhuǎn)化成13-氧代脂肪酸、10-氧代脂肪酸、15-氧代脂肪酸、12-氧代脂肪酸、14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸、10-氧代-十四烷酸，并且，例如，優(yōu)選來(lái)源于乳桿菌的羥基化脂肪酸–脫氫酶（cla-dh）。更優(yōu)選的是來(lái)源于植物乳桿菌的cla-dh，并且特別優(yōu)選的是來(lái)源于植物乳桿菌fermbp-10549菌株的cla-dh。cla-dh可以由jp-a-2007-259712中所述的方法、wo2013/168310中所述的方法獲得。脫氫酶可以是經(jīng)過(guò)純化或粗純化的。作為另外一種選擇，可以在菌體（如大腸桿菌等）中表達(dá)脫氫酶，并且可使用所述菌體自身或可使用其培養(yǎng)基。此外，所述酶可以是游離形式或由各種載體固定化的。

脫氫反應(yīng)可以在合適的緩沖液（例如，磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液等）中通過(guò)以下進(jìn)行：將作為底物的13-羥基脂肪酸、10-羥基脂肪酸、15-羥基脂肪酸、12-羥基脂肪酸、14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸、10-羥基-十四烷酸與脫氫酶于合適的濃度混合并溫育所述混合物。底物濃度為，例如，0.01-100g/l，優(yōu)選0.05-50g/l，更優(yōu)選0.1-5g/l。將要加入的脫氫酶的量為，例如，0.001-10mg/ml，優(yōu)選0.005-1mg/ml，更優(yōu)選0.05-0.2mg/ml。

“輔因子”可用于脫氫反應(yīng)并且，例如，可使用nad⁺、nadp⁺等。其添加的濃度可以是任意的，只要所述水合反應(yīng)有效地進(jìn)行。優(yōu)選0.001–20mm，更優(yōu)選0.01–10mm。

期望的是，脫氫反應(yīng)在脫氫酶的優(yōu)選溫度和優(yōu)選ph范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，反應(yīng)溫度為5-50℃，優(yōu)選20-45℃。反應(yīng)混合物的ph為，例如，ph4-10，優(yōu)選ph5-9。反應(yīng)時(shí)間不受特別限制，并且其為，例如，10分鐘-72小時(shí)，優(yōu)選30分鐘-36小時(shí)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使脫氫酶以重組細(xì)胞（例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等）的形式經(jīng)受反應(yīng)體系，所述重組細(xì)胞中引入了含有編碼所述脫氫酶的核酸的表達(dá)載體。在這種情況下，氧化反應(yīng)也可以通過(guò)如下進(jìn)行：在適合于所述細(xì)胞的培養(yǎng)、并加入了底物以及在必要時(shí)輔因子和激活劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。

另外，通過(guò)用使用鉻酸的化學(xué)氧化來(lái)替代脫氫反應(yīng)，可以以化學(xué)方式獲得類(lèi)似于通過(guò)酶反應(yīng)所得到的氧代脂肪酸。

作為化學(xué)氧化，可以提及本身已知的方法，例如，鉻酸氧化，優(yōu)選瓊斯氧化（jonesoxidation）等。作為鉻酸，可以使用所述化合物的鹽或絡(luò)合物如無(wú)水鉻酸cro3、鉻酸h2cro4和重鉻酸h2cr2o7。

具體來(lái)說(shuō)，將硫酸（2.3ml）和水（7.7ml）加入無(wú)水鉻酸（2.67g）中，并將丙酮（90ml）加入所述混合物中以得到鉻酸溶液。將2g羥基化脂肪酸和40ml丙酮加入錐形瓶中，并在置于冰上的攪拌器中攪拌下將上述鉻酸溶液逐滴滴入。當(dāng)溶液由藍(lán)色變?yōu)椴杈G色時(shí)，停止逐滴加入所述鉻酸溶液，并用異丙醇終止反應(yīng)。將沉淀的沉積物通過(guò)濾紙過(guò)濾，置于分液漏斗中，加入二乙醚（150ml）和milli-q水（300ml），將混合物充分振蕩，并用milli-q水洗滌二乙醚層幾次。向洗滌后的二乙醚層中加入適量的（無(wú)水）硫酸鈉，攪拌混合物并移除殘余水。通過(guò)濾紙將所加入的無(wú)水硫酸鈉濾掉，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮所得的二乙醚層，并提取反應(yīng)產(chǎn)物（氧代脂肪酸）和未反應(yīng)的底物。

使通過(guò)使用無(wú)水鉻酸的氧化反應(yīng)所獲得的提取物（含有底物和所得產(chǎn)物（氧代脂肪酸）的混合物）經(jīng)受中等壓力層析，將從柱中流出的溶液回收于級(jí)分中。通過(guò)lc/ms和氣相層析分析所回收的各個(gè)級(jí)分，收集僅含有氧代脂肪酸的級(jí)分并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將獲得的最終所得產(chǎn)物的一部分甲酯化，通過(guò)氣相層析評(píng)價(jià)氧代脂肪酸的純度，而可以獲得具有不低于98%的純度的氧代脂肪酸。

通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法1-8和生產(chǎn)方法a、b所獲得的下列羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸是具有傳統(tǒng)上未知的結(jié)構(gòu)的新型脂肪酸。

<羥基化脂肪酸>

13-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸

13-羥基-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸

13-羥基-順-5,順-9-十八碳二烯酸

13-羥基-反-5,順-9-十八碳二烯酸

12-羥基-順-14-二十碳烯酸

12-羥基-順-14,順-17-二十碳二烯酸

15-羥基-順-11,順-17-二十碳二烯酸

15-羥基-順-8,順-11-二十碳二烯酸

12-羥基-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸

15-羥基-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸

15-羥基-順-5,順-11-二十碳二烯酸

15-羥基-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸

10,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸

10,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸

10,13-二羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸

10-氧代-13-羥基-順-6-十八碳烯酸

10-氧代-13-羥基-順-15-十八碳烯酸

10-氧代-13-羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸

14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸。

<氧代脂肪酸>

13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸

13-氧代-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸

13-氧代-順-5,順-9-十八碳二烯酸

13-氧代-反-5,順-9-十八碳二烯酸

12-氧代-順-14-二十碳烯酸

12-氧代-順-14,順-17-二十碳二烯酸

15-氧代-順-11,順-17-二十碳二烯酸

15-氧代-順-8,順-11-二十碳二烯酸

12-氧代-順-8,順-14-二十碳二烯酸

12-氧代-順-5,順-8-二十碳二烯酸

12-氧代-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸

15-氧代-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸

15-氧代-順-5,順-11-二十碳二烯酸

15-氧代-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸

10,13-二氧代-順-6-十八碳烯酸

10,13-二氧代-順-15-十八碳烯酸

10,13-二氧代-順-6,順-15-十八碳二烯酸

14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸。

因?yàn)橛杀景l(fā)明所獲得的羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸具有作為核受體pparα和pparγ的激動(dòng)劑的活性，所以其可以用作代謝改善劑等。因此，新型羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸也是可以用作代謝改善劑等的新物質(zhì)。

本發(fā)明中所獲得的羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸可以基于傳統(tǒng)上已知的生理活性，通過(guò)與例如藥物、食物或化妝品試劑摻合而使用。

含有羥基化脂肪酸、氧代脂肪酸的藥物的劑型包括，例如，粉末、顆粒、丸劑、軟膠囊、硬膠囊、片劑、可咀嚼片劑、快速崩解片劑、糖漿、液體、懸浮液、栓劑、軟膏、乳膏、凝膠、粘合劑、吸入劑、注射劑等。其制劑是根據(jù)常規(guī)方法配制的。由于氧代脂肪酸等難溶于水，所以將其溶解于非親水性有機(jī)溶劑（如植物來(lái)源的油、動(dòng)物來(lái)源的油等）中或?qū)⑵渑c乳化劑、分散劑、表面活性劑等一起通過(guò)勻漿器（高壓勻漿器）分散或乳化于水溶液中且使用。

可用于配制的添加劑的實(shí)例包括：動(dòng)物和植物油，如大豆油、紅花油、橄欖油、胚芽油、葵花油、牛脂肪、沙丁魚(yú)油等；多元醇，如聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨糖醇等；表面活性劑，如脂肪酸的脫水山梨糖醇酯、脂肪酸的蔗糖酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸的聚甘油酯等；賦形劑，如純凈水、乳糖、淀粉、結(jié)晶纖維素、d-甘露糖醇、卵磷脂、阿拉伯樹(shù)膠、山梨糖醇溶液、碳水化合物溶液等；增甜劑、著色劑、ph調(diào)節(jié)劑、食用香料等。在使用時(shí)，可將液體制劑溶解或懸浮于水或其它合適介質(zhì)中。片劑和顆粒也可通過(guò)眾所周知的方法包被。

對(duì)于以注射劑的形式施用，優(yōu)選靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、骨膜內(nèi)、舌下、口服等，并且尤其優(yōu)選靜脈內(nèi)施用或腹膜內(nèi)施用。靜脈內(nèi)施用可以是滴注施用和快速灌注(bolus)施用中的任一種。

含有由本發(fā)明所獲得的羥基化脂肪酸、氧代脂肪酸等的“食物”的形式的實(shí)例包括：補(bǔ)充劑（粉末、顆粒、軟膠囊、硬膠囊、片劑、可咀嚼片劑、快速崩解片劑、糖漿、液體等）；飲料（茶飲料、碳酸飲料、乳酸飲料、運(yùn)動(dòng)飲料等）；糖食（橡皮糖、果凍、口香糖、巧克力、餅干、糖果等）；油、脂肪和油脂食物（蛋黃醬、調(diào)味品、黃油、乳油、人造奶油等）等。

上述食物在必要時(shí)可以含有：各種營(yíng)養(yǎng)物、各種維生素（維生素a、維生素b1、維生素b2、維生素b6、維生素c、維生素d、維生素e、維生素k等）、各種礦物質(zhì)（鎂、鋅、鐵、鈉、鉀、硒等）、膳食纖維、分散劑、穩(wěn)定劑如乳化劑等、增甜劑、調(diào)味組分（檸檬酸、蘋(píng)果酸等）、食用香料、蜂王膠、蜂膠、蘑菇屬(agaricus)等。

含有由本發(fā)明所獲得的羥基化脂肪酸、氧代脂肪酸等的“化妝品”的實(shí)例包括：乳膏、乳液(skinmilk)、化妝水(toner)、微乳精華、浴粉等，且可能添加香料等。

以下參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了更詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的示范而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

[實(shí)施例1]

嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)方法

將嗜酸乳桿菌從含有2%瓊脂并保存于4℃的mrs高層培養(yǎng)基接種到15mlmrs液體培養(yǎng)基（由difco生產(chǎn)；ph6.5）中，并在37℃培養(yǎng)20小時(shí)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，通過(guò)在3,000rpm、4℃離心10分鐘收集細(xì)胞以得到嗜酸乳桿菌的菌體。

上述嗜酸乳桿菌于2014年1月17日在nite專(zhuān)利微生物保藏中心（npmd）提交保藏，保藏號(hào)nitebp-01788。

[實(shí)施例2]

克隆具有seqidno:2所示的氨基酸序列的酶（fa-hy：脂肪酸水合酶）的基因

(1)獲得基因組dna

將上述嗜酸乳桿菌接種在10mlmrs液體培養(yǎng)基（由difco生產(chǎn)）中并在37℃進(jìn)行靜置培養(yǎng)過(guò)夜，并通過(guò)離心收集細(xì)胞。將獲得的菌體用1ml無(wú)菌水洗滌兩次并加入0.1ml無(wú)菌水、0.125ml裂解緩沖液（含有80mmedta的200mmtris-hcl緩沖液（ph8.0））、0.25mlte飽和酚，并將所述混合物渦旋1分鐘并通過(guò)離心回收上清液。向所獲得的上清液（0.2ml）中加入0.2mlpci溶液（由nacalaitesque生產(chǎn)），并用手搖動(dòng)混合物，并通過(guò)在15,000rpm、4℃離心5分鐘回收上清液（0.125ml）。加入0.0125ml5mnacl、0.31ml乙醇，并使所述混合物在室溫靜置10分鐘并在15,000rpm、4℃離心5分鐘。棄去上清液并用0.2ml70%乙醇洗滌沉淀。向所述沉淀加入0.1ml無(wú)菌水并將所述混合物在65℃溫育10分鐘以得到基因組dna。

(2)通過(guò)pcr獲得fa-hy基因

在已公布的嗜酸乳桿菌菌株的總基因組基因序列中，靶向的是與wo/2013/168310中的cla-hy的基因序列具有同源性（約32%）的可讀框（orf）?；趏rf的起始密碼子的5’側(cè)的序列設(shè)計(jì)了有義引物（seqidno:3），并基于終止密碼子的3’側(cè)的序列設(shè)計(jì)了反義引物（seqidno:4）。使用這些引物，以嗜酸乳桿菌的基因組dna作為模板，進(jìn)行了pcr。對(duì)經(jīng)過(guò)pcr擴(kuò)增的約1.8kbp基因區(qū)段的堿基序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，此基因區(qū)段含有1,773bp的一個(gè)可讀框（orf）（seqidno:1），其始于起始密碼子atg而終于終止密碼子tag，并取此基因作為fa-hy基因。所述fa-hy基因編碼由seqidno:2所示的590個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

[實(shí)施例3]

在大腸桿菌中表達(dá)（fa-hy）

使用了由大腸桿菌表達(dá)載體pet21b（novagen）和rosetta2（de3）菌株組成的宿主載體系統(tǒng)。將使用嗜酸乳桿菌的基因組dna作為模板通過(guò)pcr擴(kuò)增的fa-hy基因區(qū)段插入到pet21b中以構(gòu)建表達(dá)載體（pfa-hy）。用pfa-hy轉(zhuǎn)化rosetta2（de3）菌株以得到轉(zhuǎn)化的rosetta/pfa-hy菌株。將所獲得的rosetta/pfa-hy菌株在37℃、300rpm下于含有0.5mg氨芐青霉素、0.3mg氯霉素的10mllb培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含有1%bactotripton（difco）、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉（ph7.0））中需氧培養(yǎng)，當(dāng)od600nm為0.5時(shí)，加入1μl1miptg，并將所述混合物在16℃進(jìn)一步培養(yǎng)18小時(shí)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，將混合物在3,000rpm離心10分鐘以得到濕的rosetta/pfa-hy菌株的菌體。

[實(shí)施例4]

使用轉(zhuǎn)化的表達(dá)脂肪酸水合酶的大腸桿菌從不飽和脂肪酸生產(chǎn)羥基化脂肪酸

使用脂肪酸水合酶誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行了從各種不飽和脂肪酸生產(chǎn)羥基化脂肪酸的測(cè)試。用含有脂肪酸水合酶誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（濕體重0.3g/ml）、nadh（5mm）、fad（0.1mm）、不飽和脂肪酸（100mg）、bsa（10mg）的100mm磷酸鉀緩沖液（ph6.5）將反應(yīng)混合物的總量調(diào)整至1ml。反應(yīng)在存在氧吸附劑安寧包（anaeropack）（mitsubishichemicalcorporation）的情況下，于37℃、120rpm下厭氧搖動(dòng)進(jìn)行16至60小時(shí)。經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，向反應(yīng)混合物（1ml）中加入2ml氯仿、2ml甲醇和1ml0.5%kcl，并攪拌所述混合物并回收氯仿層。通過(guò)離心蒸發(fā)器將所回收的氯仿層濃縮，并提取反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)的底物。將所述提取物的一部分甲酯化并通過(guò)氣相層析評(píng)價(jià)所述反應(yīng)產(chǎn)物。

[實(shí)施例5]

從實(shí)施例4中獲得的提取物（含有底物和所得產(chǎn)物（羥基化脂肪酸）的混合物）純化所得產(chǎn)物

使得自實(shí)施例4的提取物（含有底物和所得產(chǎn)物（羥基化脂肪酸）的混合物）經(jīng)受中等壓力層析，將從柱中流出的溶液回收于級(jí)分中。通過(guò)lc/ms和氣相層析分析所回收的各個(gè)級(jí)分，收集僅含有所得產(chǎn)物（羥基化脂肪酸）的級(jí)分并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將所獲得的最終所得產(chǎn)物（羥基化脂肪酸）的一部分甲酯化，并通過(guò)氣相層析評(píng)價(jià)所述所得產(chǎn)物的純度。結(jié)果，從各個(gè)底物均獲得了具有不低于98%的純度的所得產(chǎn)物。所得產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)nmr、二維nmr、gc-ms分析等確定。結(jié)果，可以從順-9-十六碳烯酸（棕櫚油酸）獲得具有不低于98%的純度的10-羥基-十六烷酸?？梢詮捻?11-十八碳烯酸（11-順-十八碳烯酸）獲得具有不低于98%的純度的12-羥基-十八烷酸。可以從順-9,順-12-十八碳二烯酸（亞油酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-順-9-十八碳烯酸?？梢詮捻?6,順-9,順-12-十八碳三烯酸（γ-亞麻酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-順-6-順-9-十八碳二烯酸?？梢詮捻?9,順-12,順-15-十八碳三烯酸（α-亞麻酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-順-9-順-15-十八碳二烯酸?？梢詮捻?6,順-9,順-12-順-15-十八碳四烯酸（(6z,9z,12z,15z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-順-6-順-9-順-15-十八碳三烯酸。可以從順-11,順-14-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-羥基-順-14-二十碳烯酸和15-羥基-順-11-二十碳烯酸?？梢詮捻?11,順-14,順-17-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-羥基-順-14,順-17-二十碳二烯酸和15-羥基-順-11,順-17-二十碳二烯酸?？梢詮捻?8,順-11,順-14-二十碳三烯酸(二高-γ-亞麻酸)獲得具有不低于98%的純度的15-羥基-順-8,順-11-二十碳二烯酸和12-羥基-順-8,順-14-二十碳二烯酸?？梢詮捻?5,順-8,順-11-二十碳三烯酸（(5z,8z,11z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）獲得具有不低于98%的純度的12-羥基-順-5,順-8-二十碳二烯酸?？梢詮捻?8,順-11,順-14,順-17-二十碳四烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-羥基-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸和15-羥基-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸。可以從順-5,順-8,順-11,順-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）獲得具有不低于98%的純度的15-羥基-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸和12-羥基-順-5,順-8,順-14-二十碳三烯酸。可以從10-羥基-順-12-十八碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二羥基-十八烷酸。可以從10-羥基-順-6,順-12-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸?？梢詮?0-羥基-順-12,順-15-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸。可以從10-羥基-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸。可以從10-氧代-順-12-十八碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-13-羥基-十八烷酸。可以從10-氧代-順-6,順-12-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-13-羥基-順-6-十八碳烯酸?？梢詮?0-氧代-順-12,順-15-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-13-羥基-順-15-十八碳烯酸?？梢詮?0-氧代-順-6,順-12,順-15-十八碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-13-羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸。可以從順-5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（皮諾斂酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-順-5-順-9-十八碳二烯酸?？梢詮姆?5,順-9,順-12-十八碳三烯酸（哥倫比亞酸）獲得具有不低于98%的純度的13-羥基-反-5-順-9-十八碳二烯酸。可以從順-5,順-11,順-14-二十碳三烯酸（5(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸）獲得具有不低于98%的純度的15-羥基-順-5,順-11-二十碳二烯酸?？梢詮捻?5,順-11,順-14-順-17-二十碳四烯酸（(5z,11z,14z,17z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）獲得具有不低于98%的純度的15-羥基-順-5-順-11-順-17-二十碳三烯酸。可以從順-4,順-7,順-10,順-13,順-16,順-19-二十二碳六烯酸（dha）獲得具有不低于98%的純度的14-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸?？梢詮捻?9-十四碳烯酸（肉豆蔻腦酸）獲得具有不低于98%的純度的10-羥基-十四烷酸。

[實(shí)施例6]

通過(guò)使用在大腸桿菌中表達(dá)的脫氫酶（cla-dh）從羥基化脂肪酸生產(chǎn)氧代脂肪酸

使用純化的來(lái)源于植物乳桿菌fermbp-10549菌株的脫氫酶（cla-dh）（由jp-a-2007-259712中所述的方法或wo/2013/168310中所述的方法獲得）進(jìn)行了從羥基化脂肪酸生產(chǎn)氧代脂肪酸的測(cè)試。用含有純化的脫氫酶（酶量83μg）、0.5mmnad⁺、0.5mg羥基化脂肪酸的50mm磷酸鉀緩沖液（ph8.0）將反應(yīng)混合物調(diào)整至1ml的總量。反應(yīng)在存在氧吸附劑安寧包（anaeropack）（mitsubishichemicalcorporation）的情況下，于37℃、120rpm下厭氧搖動(dòng)進(jìn)行24小時(shí)。經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，通過(guò)bligh-dyer方法從反應(yīng)混合物中提取脂質(zhì)。將所述提取物甲酯化并通過(guò)氣相層析評(píng)價(jià)氧代脂肪酸的生產(chǎn)。結(jié)果，當(dāng)羥基化脂肪酸13-羥基-順-9-十八碳烯酸被用作底物時(shí)，確認(rèn)了氧代脂肪酸13-氧代-順-9-十八碳烯酸的生產(chǎn)（0.01mg）。當(dāng)13-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸被用作底物時(shí)，確認(rèn)了13-氧代-順-9,順-15-十八碳二烯酸的生產(chǎn)（0.02mg），而當(dāng)13-羥基-順-6,順-9-十八碳二烯酸被用作底物時(shí)，確認(rèn)了13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸的生產(chǎn)（0.06mg）。

使用類(lèi)似方法，通過(guò)使用各種羥基化脂肪酸作為底物可以獲得所得產(chǎn)物氧代脂肪酸。

[實(shí)施例7]

通過(guò)使用無(wú)水鉻酸（cro3）從羥基化脂肪酸生產(chǎn)氧代脂肪酸

向無(wú)水鉻酸（2.67g）中加入硫酸（2.3ml）和水（7.7ml），并向其中加入丙酮（90ml）以得到鉻酸溶液。將2g羥基化脂肪酸和40ml丙酮加入錐形瓶中，并在用攪拌器攪拌混合物的同時(shí)在冰上將上述鉻酸溶液逐滴滴入。當(dāng)溶液由藍(lán)色變?yōu)榉勰罹G茶的顏色時(shí)，停止逐滴加入所述鉻酸溶液，并用異丙醇猝滅反應(yīng)。將沉淀的沉積物用濾紙過(guò)濾并置于分液漏斗中。另外加入二乙醚（150ml）和milliq水（300ml）并將混合物充分振蕩。用milliq水洗滌二乙醚層幾次。向經(jīng)過(guò)洗滌的二乙醚層中加入適量的（無(wú)水）硫酸鈉，攪拌混合物并移除殘余水。用濾紙將所加入的無(wú)水硫酸鈉濾掉，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮所得二乙醚層，并提取反應(yīng)產(chǎn)物（氧代脂肪酸）和未反應(yīng)的底物。

[實(shí)施例8]

從實(shí)施例6、7中獲得的提取物（含有底物和所得產(chǎn)物（氧代脂肪酸）的混合物）純化所得產(chǎn)物

使在實(shí)施例6、7中獲得的提取物（含有底物和所得產(chǎn)物（氧代脂肪酸）的混合物）經(jīng)受中等壓力層析，將從柱中流出的溶液回收于級(jí)分中。通過(guò)lc/ms和氣相層析分析所回收的各個(gè)級(jí)分，收集僅含有氧代脂肪酸的級(jí)分并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將所獲得的最終所得產(chǎn)物的一部分甲酯化，并通過(guò)氣相層析評(píng)價(jià)氧代脂肪酸的純度。結(jié)果，從各個(gè)底物均獲得了具有不低于98%的純度的氧代脂肪酸。所得產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)nmr、二維nmr、gc-ms分析等確定。結(jié)果，可以從13-羥基-順-9-十八碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-順-9-十八碳烯酸?？梢詮?3-羥基-順-6,順-9-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸?？梢詮?3-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-順-9,順-15-十八碳二烯酸。

使用類(lèi)似方法，可以從10-羥基-十六烷酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-十六烷酸?？梢詮?2-羥基-十八烷酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-十八烷酸?？梢詮?3-羥基-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-順-6,順-9,順-15-十八碳三烯酸?？梢詮?5-羥基-順-11-二十碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-11-二十碳烯酸。可以從12-羥基-順-14-二十碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-14-二十碳烯酸。可以從12-羥基-順-14,順-17-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-14,順-17-二十碳二烯酸。可以從15-羥基-順-11,順-17-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-11,順-17-二十碳二烯酸。可以從15-羥基-順-8,順-11-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-8,順-11-二十碳二烯酸?？梢詮?2-羥基-順-8,順-14-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-8,順-14-二十碳二烯酸?？梢詮?2-羥基-順-5,順-8-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-5,順-8-二十碳二烯酸?？梢詮?2-羥基-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-8,順-14,順-17-二十碳三烯酸?？梢詮?5-羥基-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-8,順-11,順-17-二十碳三烯酸?？梢詮?5-羥基-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸?？梢詮?2-羥基-順-5,順-8,順-14-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的12-氧代-順-5,順-8,順-14-二十碳三烯酸?？梢詮?0,13-二羥基-十八烷酸或10-氧代-13-羥基-十八烷酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二氧代-十八烷酸?？梢詮?0,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸或10-氧代-13-羥基-順-6-十八碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二氧代-順-6-十八碳烯酸?？梢詮?0,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸或10-氧代-13-羥基-順-15-十八碳烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二氧代-順-15-十八碳烯酸。可以從10,13-二羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸或10-氧代-13-羥基-順-6,順-15-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的10,13-二氧代-順-6,順-15-十八碳二烯酸?？梢詮?3-羥基-順-5,順-9-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-順-5,順-9-十八碳二烯酸。可以從13-羥基-反-5,順-9-十八碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的13-氧代-反-5,順-9-十八碳二烯酸?？梢詮?5-羥基-順-5,順-11-二十碳二烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-5,順-11-二十碳二烯酸?？梢詮?5-羥基-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸獲得具有不低于98%的純度的15-氧代-順-5,順-11,順-17-二十碳三烯酸?？梢詮?4-羥基-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸獲得具有不低于98%的純度的14-氧代-順-4,順-7,順-10,順-16,順-19-二十二碳五烯酸?？梢詮?0-羥基-十四烷酸獲得具有不低于98%的純度的10-氧代-十四烷酸。

[實(shí)施例9]

測(cè)量作為核受體pparα和pparγ的激動(dòng)劑的活性

參考nobuyukitakahashi等人,febsletters514(2002)第315-322頁(yè),“dualactionofisoprenolsfromherbalmedicinesonbothppargammaandpparalphain3t3-l1adipocytesandhepg2hepatocytes.”,材料與方法部分“reporterplasmidsandluciferaseassays”測(cè)量了本發(fā)明的ppar配體的pparα、γ活化能力。具體地講，pparα、γ配體活性是通過(guò)基于螢光素酶的表達(dá)，評(píng)價(jià)對(duì)ppar配體結(jié)合區(qū)與gal4dna結(jié)合區(qū)的融合蛋白的結(jié)合以及靶基因活化的報(bào)道分子測(cè)定來(lái)測(cè)量的。具體地，將包含編碼pparα、γ配體結(jié)合區(qū)與gal4dna結(jié)合區(qū)的融合蛋白的dna的質(zhì)粒和其中螢光素酶連接至結(jié)合了gal4的dna序列的報(bào)道分子質(zhì)粒引入cv-1細(xì)胞中，將下述配體加入所述細(xì)胞中，溫育細(xì)胞并檢測(cè)螢光素酶活性。

用乙醇調(diào)整樣品的濃度。將乙醇用作陰性對(duì)照，而將pparα、γ配體gw7647（10nm）和曲格列酮（5μm）用作陽(yáng)性對(duì)照。

如下有代表性的羥基化脂肪酸、氧代脂肪酸的pparα、γ配體活性數(shù)據(jù)示于圖1和圖2中：(1)13-羥基-順-9-十八碳烯酸（表示為“13-ohla”）；(2)13-氧代-順-9-十八碳烯酸（表示為“13-oxola”）；(3)10,13-二羥基-十八烷酸（表示為“10,13-ohla”）；(4)13-羥基-順-9,順-15-十八碳二烯酸（表示為“13-ohala”）；(5)13-氧代-順-9,順-15-十八碳二烯酸（表示為“13-oxoala”）；(6)10,13-二羥基-順-15-十八碳烯酸（表示為“10,13-ohala”）；(7)13-羥基-順-6,順-9-十八碳二烯酸（表示為“13-ohgla”）；(8)13-氧代-順-6,順-9-十八碳二烯酸（表示為“13-oxogla”）；(9)10,13-二羥基-順-6-十八碳烯酸（表示為“10,13-ohgla”）；(10)15-羥基-順-5,順-8,順-11-二十碳三烯酸（表示為“15-ohaa”）。在這之中，(4)、(6)、(8)和(9)的稀有脂肪酸是新型脂肪酸。

雖然已經(jīng)著重從優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，所述優(yōu)選的實(shí)施方案是可以修改的。

本文所引用的任何出版物（包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)）中所公開(kāi)的內(nèi)容，均在此整體引入作為參考，其程度如同其已在本文中公開(kāi)。

[工業(yè)適用性]

根據(jù)本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)各種羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸，并且因此，所述羥基化脂肪酸和氧代脂肪酸可應(yīng)用于藥物、食物等各個(gè)領(lǐng)域。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)極為有用的新型稀有脂肪酸。

本申請(qǐng)基于在日本提交的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?014-011855（申請(qǐng)日：2014年1月24日），其內(nèi)容全文并入本文。

序列表

<110>kyotouniversity

nittopharmaceuticalindustries,ltd.

<120>使用新型酶生產(chǎn)稀有脂肪酸的方法以及新型稀有脂肪酸

<130>092262

<150>jp2014-011855

<151>2014-01-24

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1773

<212>dna

<213>嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1773)

<400>1

atgcattatagtagtggtaattatgaagcttttgtaaacgcaagtaaa48

methistyrserserglyasntyrglualaphevalasnalaserlys

151015

cctaaggatgtcgatcagaagtccgcatatcttgttggttcaggtttg96

prolysaspvalaspglnlysseralatyrleuvalglyserglyleu

202530

gcatcgcttgctagtgctgtatttttaattcgtgatggtcacatgaag144

alaserleualaseralavalpheleuileargaspglyhismetlys

354045

ggtgatagaattcatatccttgaagaattgagccttccaggtggttca192

glyaspargilehisileleuglugluleuserleuproglyglyser

505560

atggatgggatctataataagcaaaaagaaagctacatcattcgtggt240

metaspglyiletyrasnlysglnlysglusertyrileilearggly

65707580

ggtcgtgaaatggaagcccattttgaatgcttgtgggacttgtttaga288

glyargglumetglualahispheglucysleutrpaspleuphearg

859095

tcgattccatcagctgaaaataaagatgaatcggtcctggatgaattt336

serileproseralagluasnlysaspgluservalleuaspgluphe

100105110

taccgtttaaatagaaaagatccaagtttcgcaaagactcgtgtcatt384

tyrargleuasnarglysaspproserphealalysthrargvalile

115120125

gttaaccgcggacatgaacttccaactgacggtcaattacttcttact432

valasnargglyhisgluleuprothraspglyglnleuleuleuthr

130135140

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prolysalavallysgluileileaspleucysleuthrproglulys

145150155160

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165170175

gaatcaaacttctggctttactggtcaacgatgtttgcctttgagcca576

gluserasnphetrpleutyrtrpserthrmetphealapheglupro

180185190

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195200205

cacgtttctacacttaagaatttatcatcactacgctttactaagtat672

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210215220

aaccaatatgaatcattaattttaccaatggttaaatacttgaaagat720

asnglntyrgluserleuileleuprometvallystyrleulysasp

225230235240

cgcggcgtgcaattccattacaacaccgttgttgataatatctttgtt768

argglyvalglnphehistyrasnthrvalvalaspasnilepheval

245250255

aaccgttcaaatggtgaaaagattgctaagcaaattcttttaactgaa816

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260265270

aacggtgaaaaaaagagcatcgatttaacagaaaatgacctcgtcttc864

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275280285

gttactaacggttcaattactgaaagtacaacttatggtgataacttg912

valthrasnglyserilethrgluserthrthrtyrglyaspasnleu

290295300

cacccagcttctgaggaacataaattaggtgctacttggaaattatgg960

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305310315320

caaaacttggcagcgcaagatgatgacttcggtcacccagatgtcttc1008

glnasnleualaalaglnaspaspasppheglyhisproaspvalphe

325330335

tgcaaggatattccaaaggctaactgggtaatgtctgctacaattact1056

cyslysaspileprolysalaasntrpvalmetseralathrilethr

340345350

tttaagaataatgatattgtgccattcattgaagcagttaataagaag1104

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355360365

gatccacacagcggctcaattgtaactagtgggcctactacgattaag1152

aspprohisserglyserilevalthrserglyprothrthrilelys

370375380

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<211>27

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<213>人工序列

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<223>引物

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<220>

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<400>4

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