本發(fā)明涉及表皮生長因子受體(egfr)酪蛋白激酶家族抑制劑及其藥學(xué)上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤包括白血病是導(dǎo)致人類臨床死亡的重大疾病之一，特別是惡性腫瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、腸癌和食管癌等死亡率極高。至今為止仍沒有有效的方法與藥物完全治愈癌癥。臨床上急需特異性好、活性高、毒性小、無耐藥性產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)抗癌藥物。

癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及惡化和許多因素有關(guān)，其中正常細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化與癌化的重要因素之一，特別是跨膜受體介導(dǎo)的多功能信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。酪氨酸蛋白激酶是細胞生長、發(fā)育、分化、代謝、老化與凋亡等重要生理功能所必須的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)酶，分為膜受體和胞質(zhì)酪蛋白激酶兩種類型。許多酪氨酸蛋白激酶的異常可直接導(dǎo)致臨床上不同類型的疾病例如癌癥、炎癥、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及心腦血管類疾病。人們經(jīng)過幾十年的不斷努力，許多酪氨酸蛋白激酶例如egfr、her2/3/4、vegfr、pdgfr、met、igf-1r、fgfr、csf-1r、trk受體、ephrin受體、tam受體、tie-2、flt-3、ret、alk、bcr-abl、jaks、src、fak、btk、syk，blk等已被鑒定為臨床不同疾病的靶蛋白分子。其中一些酪氨酸蛋白激酶抑制劑已成功的應(yīng)用于臨床，并且呈現(xiàn)出良好的治療效果。

表皮生長因子受體(egfr)是一類跨膜受體蛋白，為酪蛋白激酶。該激酶家族由egfr(her1/erbb1)，her2/erbb2，her3/erbb3和her4/erbb4四個成員組成，此類蛋白激酶介導(dǎo)細胞內(nèi)重要信號傳導(dǎo)途徑，控制與調(diào)節(jié)細胞的諸多生理功能?；A(chǔ)研究與臨床基因組大數(shù)據(jù)顯示egfr、her2、her3、her4基因的異常例如點突變、缺失、擴增、過表達等都可直接導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)生，同時這些基因的異常又和癌細胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)移、侵潤、腫瘤新血管形成以及藥物抗性密切相關(guān)。

在臨床上，egfr基因異常變異(過表達、點突變、缺失、插入等)常常出現(xiàn)在不同癌癥病人中，尤其是肺癌。肺癌是致死率極高的惡性腫瘤之一，其中以腺癌、麟狀細胞癌和大細胞肺癌為主的非小細胞肺癌(nsclc)占整個肺癌的80％左右，而egfr常常在nsclc中高頻率的發(fā)生變異，導(dǎo)致其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑持續(xù)被激活，引起細胞癌化。同樣her2/erbb2基因的異常(例如突變、擴增、過表達)以一定的比例(＞5％)發(fā)生在非小細胞肺癌病人中，特別是her2/erbb2基因的過表達。除了非小細胞肺癌外，her2/erbb2基因的異常頻繁發(fā)生在許多其它癌癥中，有的高達30％以上，例如乳腺癌(20％)、胃癌(22-25％)、食道癌(10-25％)、胰腺癌(2-30％)、膀胱癌(5-15％)、唾管癌(15-37％)、宮頸癌(1-21％)、惡性膠質(zhì)瘤(7-15％)，其次為非小細胞肺癌(5％)、大腸癌(2-3％)、卵巢癌(6-7％)、頭頸癌(3％)、肝癌(2.4％)、黑色素瘤(0-5％)。此外her2過表達的強弱不僅和腫瘤的惡性程度成正相關(guān)，也和許多化療藥物耐藥性相關(guān)聯(lián)例如紫杉醇/奧沙利鉑耐藥性。

egfr和her2作為有效的成藥靶點已用于抗癌藥物的開發(fā)。至今為止，已成功開發(fā)出多種抗癌新藥物，例如作用于egfr/her2蛋白分子胞外部分的大分子單抗藥西妥昔單抗(cetuximab)，帕尼單抗(panitumumab)和赫賽汀(herceptin)以及作用于egfr/her2蛋白分子胞內(nèi)激酶活性部位的小分子藥物吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼等都已在臨床上應(yīng)用多年，呈現(xiàn)良好的治療效果。然而和諸多其他抗癌藥物一樣，egfr類藥物也存在獲得性抗性的問題。如吉非替尼、厄洛替尼以及拉帕替尼在臨床上產(chǎn)生的藥物抗性可達50％以上。獲得性藥物抗性是由多種原因引起，其中靶蛋白分子的結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹匾蛑?。臨床上使用的第一代egfr抑制劑化合物核心架構(gòu)為4-苯胺喹唑啉，以可逆性方式與egfr蛋白激酶活性區(qū)相結(jié)合，通過與atp競爭，起到抑制蛋白激酶活性的作用?；蛲蛔兂３?dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，例如egfrexon19缺失和exon21的l858r點突變使egfr蛋白激酶變成激活性突變體，相對的增加了吉非替尼和厄洛替尼藥物對egfr的抑制作用，但exon20的蘇氨酸790(egfr蛋白激酶活性區(qū)守門氨基酸)突變成蛋氨酸(t790m)時，第一代egfr抑制劑失去與atp競爭能力，導(dǎo)致藥物失效，產(chǎn)生藥物抗性，而這種獲得性藥物抗性使40-55％的臨床癌癥病人對第一代egfr抑制劑無治療效果。盡管在第一代egfr抑制劑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，已研發(fā)出與egfr蛋白質(zhì)中的半胱氨酸797(cys-797)共價結(jié)合的第二代不可逆抑制劑如阿法替尼(afatinib)和來那替尼(neratinib)，雖然體外可抑制egfrt790m但仍對野生型egfr有較強的抑制作用，其臨床表現(xiàn)出高副作用與毒性，加上單獨使用并沒有顯示出對表達egfrt790m的nsclc病人治療的明顯優(yōu)勢，使其臨床應(yīng)用受到極大限制。同時已發(fā)現(xiàn)egfr第二代抑制劑在臨床上應(yīng)用過程中同樣產(chǎn)生不同程度的獲得性藥物抗性，其部分原因和其它癌基因異常(如met/her3擴增，pik3ca/braf突變，nf1缺失，fgfr信號傳導(dǎo)激活等)有關(guān)。

近來研究發(fā)現(xiàn)以苯胺嘧啶為核心骨架的小分子化合物wz4002能夠高活性的作用于egfrt790m突變株，但對野生型egfr作用較弱。之后制藥公司相繼開發(fā)的苯胺嘧啶類化合物co-1686、azd9291和hm61713，臨床實驗數(shù)據(jù)已顯示對egfrt790m表達病人有較高的應(yīng)答，相對副作用小，是新一代有效的egfrt790m突變株抑制劑。

盡管抑制egfr的活性能夠有效的抑制非小細胞肺癌的生長。但其它一些基因的異常表達如肝細胞生長因子受體(met)擴增，間變性淋巴瘤激酶(alk)擴增與重排，her2/erbb2擴增與過表達，同樣與非小細胞肺癌的惡性生長和藥物抗性密切相關(guān)。而在眾多的其它惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、食管癌和唾管癌中，met，her2/erbb2和alk同樣是重要的癌癥生物標記。

已上市的抗her2單抗藥赫賽汀和唯一小分子化合物拉帕替尼，雖然在臨床上已呈現(xiàn)良好的治療效果，但獲得性藥物抗性以及血腦屏障等問題使它們的臨床應(yīng)用受到一定程度的限制。多年來我們一直致力于研發(fā)特異性好、活性高、毒性低的egfr酪蛋白激酶家族小分子化合物抑制劑。目標是開發(fā)一類即可有效抑制異常高表達egfr或her2/erbb2，同時又能夠抑制獲得性藥物抗性突變株特別是egfrt790m，her2t798i而副作用小的新一代化合物。我們以丙烯酰胺苯胺為核心構(gòu)架，設(shè)計合成一系列新的化合物及其衍生物，通過用高表達egfr或her2以及其不同突變株的細胞系，進行體內(nèi)外腫瘤細胞生長抑制實驗，研究與開發(fā)新的egfr和her2靶向藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及到一系列新的丙烯酰苯胺衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，能夠以不逆的結(jié)合方式作用并抑制egfr突變株(例如egfrexon19缺失dele746-a750激活突變體，l858r/t790m和dele746-a750/t790m雙突變抗性突變體)和her2過表達的多種腫瘤細胞系的體內(nèi)和體外生長，具有應(yīng)用于多種臨床疾病治療的價值。

egfr酪蛋白激酶家族是當今臨床上成功應(yīng)用的靶向抗癌治療的理想靶標。盡管已上市的抗egfr/her2蛋白激酶抑制劑能夠有效的改進癌癥病人的臨床治療效果，但獲得性藥物抗性或藥物引起的嚴重副作用極大的影響到這些藥物的臨床治療效果，滿足不了臨床需求。我們發(fā)明的新化合物無論在體外或體內(nèi)實驗中，均表現(xiàn)出強的抗癌活性。gi50在納摩爾濃度可有效的抑制表達不同egfr突變體的癌細胞生長，特別是t790m抗性突變細胞株。對egfr野生型過表達細胞株的抑制活性較弱，而對正?；驘oegfr表達癌細胞相對無抑制作用，這將在臨床應(yīng)用上大大的降低由于野生型egfr活性被抑制而產(chǎn)生的皮膚和胃腸道副作用的風險例如皮疹、腹瀉。

her2/erbb2是egfr家族中另一個酪蛋白激酶，其異常表達和許多惡性腫瘤相關(guān)。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對her2/erbb2高表達的不同腫瘤細胞系(如nci-n87，calu-3，au565，sk-rb-30，nci-h2170，zr-75-30)的生長有強抑制作用，gi50濃度為納摩爾，而且對拉帕替尼(唯一臨床上應(yīng)用的her2/erb2選擇性可逆抑制劑)抗性細胞系hcc1954也呈現(xiàn)出一定的生長抑制作用，這在臨床上不但可應(yīng)用于nsclc，同樣可以用于her2/erbb2高表達的胃癌、乳腺癌、食管癌和唾管癌。

本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

[1]通式(i)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥：

其中：

x、y和r1選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r1為-nr5r6時；x和y彼此相同或不同，并且各自獨立地選自n、cr4；

b)r1選自-or5和-sr5時；x和y彼此相同或不同，并且各自獨立地選自n、cr4；

c)r1為-cr5r6，且r5和r6和與它們所連接的碳原子成環(huán)時；x為cr4，y為n；

r2選自烷氧基、烷硫基或者nr6r6；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、-or^un(r^y)(r^z)、-sr6、-sr^un(r^y)(r^z)；

r4選自氫、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、氰基；

r5和r6選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r5為任選取代的芳基、任選取代的雜芳基或者任選取代的雜環(huán)基；存在取代基時該取代基選自1-5個r7基團，其中每個r7基團獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜芳基或雜芳基烷基羥基任選地用以下的1-5個基團取代：鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、羥基、烷氧基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、酯基、氰基；

r6選自氫、烷基；

b)r5和r6和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基、雜芳基或者稠環(huán)芳環(huán)，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時任選用1-5個取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

c)r5和r6和與它們所連接的碳原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且芳環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

每個r^u獨立地選自亞烷基、亞烯基或者亞炔基；

r^v選自氫或烷基；

每個r^y和r^z獨立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、羥基烷基、吡咯烷基、烷基氨基、或者鹵代烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基或者雜芳基，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自r5或者r7。

[2]上述[1]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于，所述通式(i)所示化合物為式iia、iib或iic的化合物，

其中r1選擇如下a)或b)的方式：

a)通式(i)所示化合物為式iia、iib時，r1為-nr5r6

b)通式(i)所示化合物為式iic時，r1為-nr5r6；或者r1為-cr5r6(且r5和r6和與它們所連接的碳原子成環(huán))

r2為烷氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r'4各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、鹵代烷基；

r5和r6選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r5為任選取代的芳基；存在取代基時該取代基選自1-5個r7基團，其中每個r7基團獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基、雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個基團取代：鹵素、烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基；

r6選自氫、烷基；

b)r5和r6和與它們所連接的氮原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

c)r5和r6和與它們所連接的碳原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且芳環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

每個r^u獨立地選自亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個r^y和r^z獨立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z每一個獨立地選自氫、烷基、或者鹵代烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[3]上述[2]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于：

r1選擇以下的a)或b)：

通式(i)所示化合物為式iia和iib時，r1選自：

通式(i)所示化合物為式iic時，r1選自：

r2為烷氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r4’、r4”各自獨立地選自氫、鹵素、或烷基；

r7^a、r7^b、r7^c、r7^d和r7^e彼此相同或不同，并且各自獨立地為r7；

r7選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、氰基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基和雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個基團取代：鹵素、烷基、烷氧基；

每個r^u獨立地選自亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個r^y和r^z獨立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨立地選自氫或烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[4]上述[3]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于：

r1選擇a)、b)或c)的任一種方式：

通式(i)所示化合物為式iia時，r1選自：

b)通式(i)所示化合物為式iib時，r1為：

c)通式(i)所示化合物為式iic時，r1選自：

r2選自甲氧基或丙氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r4’、r4”各自獨立地選自氫、鹵素或烷基；

r7^a、r7^b、r7^c、r7^d和r7^e彼此相同或不同，并且各自獨立地為r7；

r7選自氫、鹵素、烷基、炔基、烷氧基、氰基、鹵代烷基、或芳基烷基羥基雜芳基烷基羥基；其中芳基烷基羥基和雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個基團取代：鹵素、烷基；

每個r^u獨立地為亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個r^y和r^z獨立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨立地選自氫或烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個獨立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個取代基取代，所述取代基選自烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[5]上述[1]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其中，所述化合物選自：

n-(5-(4-(3-溴苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氟苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-2-氟苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(5-氯-4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(2-((2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-5-(4-(吲哚啉-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-{2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-5-[4-(6-甲氧基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-丙烯酰胺

n-{2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-5-[4-(6-甲基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-丙烯酰胺

n-{5-[4-(6-氰基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-氯-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-溴-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

2-((2-丙烯酰胺基-5-甲氧基-4-(4-(5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基)-氨基)-苯基)-甲基-n，n-二甲基-n-氧化乙胺

n-(5-(4-(5-氯-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-溴-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-三氟甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(二甲胺甲基)-哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(4-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(4-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5，6-二氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(1h-苯基[d]咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺

n-(5-(4-苯并三氮唑-1-基-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-2-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-溴-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-[5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-4-甲氧基-2-(4-(吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-苯基-丙烯酰胺

n-{2-[1，4′]哌啶基-1′-基-5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-{5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-2-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-[5-[4-(3-溴-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-4-甲氧基-2-(4-甲基-[1，4]二氮雜環(huán)庚烷-1-基)-苯基]-丙烯酰胺

n-(5-(6-(3-溴-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-5-(6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(6-(3-炔基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺。

[6]egfr和/或her2/erbb2酪蛋白激酶抑制劑，其含有上述[1]～[5]中任一項所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。

[7]上述[1]～[5]中任一項所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備egfr和/或her2/erbb2酪蛋白激酶抑制劑中的用途。

[8]上述[1]～[5]中任一項所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療癌癥的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的化合物，對egfr突變株和her2/erbb2高表達腫瘤細胞的生長均具有高活性的抑制作用。

具體實施方式

在本說明書中，除非另有規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同含義。所有專利、申請、公開的申請和其他出版物均以全部內(nèi)容并入作為參考。倘若對于本文使用的術(shù)語有多個定義，除非另有說明，以本說明書中的為準。

“鹵素”包括氟、氯、溴、碘。

“烷基”包括碳數(shù)1～18、優(yōu)選碳數(shù)1～10、更優(yōu)選碳數(shù)1～6、還更優(yōu)選碳數(shù)1～4的直鏈或支鏈烷基，可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、正庚基、異庚基、正辛基、異辛基、正壬基、正癸基等。本說明書中，“烷基”還包括碳數(shù)3～10、優(yōu)選碳數(shù)3～8、更優(yōu)選碳數(shù)4～6的環(huán)狀烷基，可例舉例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、十氫萘基、降冰片烷、金剛烷基等。

“烯基”指由碳和氫原子組成的含有至少一個雙鍵的直鏈或支鏈的烴鏈基團，具有2-10個碳原子、優(yōu)選2-6個碳原子，并通過單鍵或雙鍵與分子的其余部分連接，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基等。

“烷氧基”指具有式-or的基團，其中r是如上述定義的烷基?？衫e例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基等。

“炔基”指由碳原子和氫原子組成的含有至少一個三鍵的直鏈或支鏈的烴鏈基團，具有2-10個碳原子、優(yōu)選2-6個碳原子，并通過單鍵或三鍵與分子的其余部分連接，例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。

“烷基酰基”指具有式r(c＝o)的基團，其中r是如上述定義的烷基?？衫e例如乙酰基、丙?；?、丁?；?、戊?；⒓乎；取?/p>

“芳基”指碳環(huán)系的基團，包括單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)、四環(huán)c6-c18環(huán)系，其中至少一個環(huán)是芳香環(huán)。芳基可以是完全芳香族的基團，例如苯基、萘基、蒽基、菲基等。芳基也可以含有芳香環(huán)與非芳香環(huán)的組合，例如，茚、芴和苊等。其中，芳基優(yōu)選苯基、萘基等。

“鹵代烷基”指烷基的一個或多個氫原子被鹵素取代的烷基，其中烷基可以是如上述定義的烷基。這種基團包括但不儀限于氯甲基、三氟甲基、1-氯-2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2-氟丙基、2-氟丙-2-基、2，2，2-三氟乙基、1，1-二氟乙基、1，3-二氟-2-甲基丙基、2，2-二氟環(huán)丙基、(三氟甲基)環(huán)丙基、4，4-二氟環(huán)己基和2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基等。

“雜環(huán)基”，包括環(huán)內(nèi)具有一個以上、優(yōu)選1-5個的任意選自o、s和n的雜原子的3-15元(例如3-12元、3-9元等)雜環(huán)基。雜環(huán)基可以是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或四環(huán)環(huán)系，其可以包括稠合或橋接環(huán)系；雜環(huán)基中的氮或硫原子可以任選被氧化；氮原子可以任選被季銨化；雜環(huán)基可以是部分或完全飽和的。雜環(huán)環(huán)系可以在任何雜原子或碳原子處與主結(jié)構(gòu)連接，生成穩(wěn)定的化合物。具體而言包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、三嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異唑基、唑基、二唑基、異噻唑基、噻唑基、噻二唑基等五元～六元雜芳基；吡喃基、噻唑烷基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代、硫代嗎啉基、硫代嗎啉代、二氫吡啶基、四氫吡啶基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、二氮雜基、四氫二氮雜基等非芳族雜環(huán)基；吲哚基、異吲哚基、吲唑基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、萘啶基、喹喔啉基、嘌呤基、蝶啶基、苯并吡喃基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并異唑基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并異噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三氮唑基、噻吩并吡啶基、咪唑并噻唑基、苯并咪唑并噻唑基、吡嗪并噠嗪基、喹唑啉基、喹啉基、異喹啉基等二環(huán)或三環(huán)稠合雜環(huán)基等。其中，優(yōu)選吡咯基、呋喃基、咪唑基、異唑基、唑基、嘧啶基、吡啶基、噻唑基、噻吩基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、吡喃基、吡咯烷基、吲哚基、二氮雜基、苯并噻吩基、苯并三氮唑基、苯并咪唑基等。

“芳烷基”、“芳烷基氧基”、“鹵代芳烷基氧基”、“烷基氨基”、“烷基?；?、“鹵代烷基”中的烷基部分也與上述“烷基”定義相同。

“芳氧基”、“芳基氨基”、“芳基硫基”、“芳基氧基”、“芳烷基”、“芳烷基氧基”、“鹵代芳烷基氧基”、“鹵代芳基”中的芳基部分也與上述“芳基”定義相同。

“雜環(huán)基烷氧基”中的雜環(huán)部分也與上述“雜環(huán)基”定義相同，其中的烷氧基部分也與上述“烷氧基”定義相同。

本說明書中的“任選取代”是指未取代或被一個或多個(例如2、3、4個)取代基取代。其中取代基選自下組：鹵素原子、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、烷氧基、芳基、鹵代芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、雜環(huán)基烷氧基、鹵代芳基烷基氧基、烷基氨基、烷基?；⑶杌?、或雜環(huán)基等。這些取代基還可以進一步被取代。例如，作為取代基的烷基還任選被選自鹵素原子、羥基、烷氧基、烷基氨基、吡咯烷基、苯基、吡啶基、或鹵代苯基中的一個或多個基團取代。作為取代基的雜環(huán)基還任選被選自鹵素原子、烷基、烷氧基中的一個或多個基團取代。

r1可以為任選取代的雜環(huán)基、任選取代的芳基氨基、任選取代的芳基硫基、或任選取代的芳基氧基等。

r1優(yōu)選為任選取代的吲哚基、吲哚啉基、噻吩基、吲唑基、吡咯并吡啶基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、或苯并三氮唑基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、氰基。r1例如可列舉吲哚-1-基、吲哚-3-基、1-甲基-1h-吲哚-3-基、1-乙基-1h-吲哚-3-基、1-丙基-1h-吲哚-3-基、1-異丙基-1h-吲哚-3-基、1-芐基-1h-吲哚-3-基、6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基、5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基、5-氟-1-環(huán)戊基-1h-吲哚-3-基、苯并咪唑-1-基、或苯并三氮唑-1-基等。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基氨基、或萘基氨基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、鹵代烷基、烷氧基、炔基、芳氧基、雜環(huán)基烷氧基、芳烷基氧基、鹵代芳基烷基氧基。r1例如可列舉苯氧基苯基氨基、甲基苯基氨基、鹵代苯基氨基、甲氧基苯基氨基、乙炔基苯基氨基、三氟甲基苯基氨基、氟芐氧基苯基氨基、或吡啶基甲氧基苯基氨基等，優(yōu)選為鹵代苯基氨基。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基硫基、或萘基硫基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、或烷氧基。r1例如可列舉萘基硫基、甲基苯基硫基、或甲氧基苯基硫基等。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基氧基、或萘基氧基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、或烷氧基。r1例如可列舉萘基氧基、甲基苯基氧基、或甲氧基苯基氧基等。

r3可以為任選取代的雜環(huán)基、任選取代的烷氧基、任選取代的氨基等。

r3優(yōu)選為任選取代的哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、二氮雜基、或吡啶基。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、氰基、嗎啉基、哌啶基、烷基哌嗪基、烷基氨基、烷基哌啶基、羥烷基、烷氧基烷基、羥基烷氧基烷基、吡咯烷基烷基、烷基氨基烷基、烷基酰基、芳烷基、芳基、吡啶基烷基、或鹵代芳基烷基等。r3例如可列舉甲基哌嗪基、嗎啉基哌啶基、甲基哌嗪基哌啶基、二甲氨基哌啶基、叔丁基哌嗪基、二甲氨基吡咯烷基、乙基哌嗪基、環(huán)己基甲基哌嗪基、雙哌啶基、甲基二氮雜基、甲基哌啶基哌嗪基、羥乙基哌嗪基、甲氧基乙基哌嗪基、羥基乙氧基乙基哌嗪基、二氟吡咯烷基、吡咯烷基哌嗪基、羥丙基哌啶基、吡啶基乙基哌嗪基、苯并二氧甲基哌嗪基、吡咯烷基乙基哌嗪基、氰基乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基、乙?；哙夯⑵S基哌嗪基、苯基哌嗪基、吡啶基甲基哌嗪基、4-甲基2-苯基哌嗪基、雙(氟苯基)甲基哌嗪基等。

r3優(yōu)選為任選取代的乙氧基、丙氧基或丁氧基等。其中的取代基優(yōu)選為烷基、烷氧基、烷基氨基、嗎啉基、吡咯烷基、烯基?；?、或哌嗪基等。r3例如可列舉甲氧基乙氧基、甲基哌嗪基乙氧基、嗎啉基乙氧基、吡咯烷基乙氧基、丙烯?；哙夯已趸?、或二甲氨基乙氧基等。

r3中的r^y和r^z各自獨立地優(yōu)選為烷基、鹵代烷基、羥基烷基、吡咯烷基、或烷基氨基等，其中的n原子可以被氧化。r3例如可列舉二甲氨基、甲基(2-吡咯烷基乙基)氨基、(2-二甲氨基乙基)甲基氨基、[2-(1-氧化吡咯烷-1-基)乙基]甲基氨基、或甲基-n，n-二甲基-n-氧化乙基氨基等。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物在藥學(xué)上可接受的鹽，可由加酸成鹽或加堿成鹽。酸可選擇無機酸包括但不限于鹽酸、硫酸、磷酸、氫溴酸；有機酸可選用但不限于檸檬酸、馬來酸、草酸，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、苯甲酸、富馬酸、三氟乙酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、谷氨酸、天門冬氨酸、水楊酸、丙酮酸、甲磺酸、苯磺酸、對苯磺酸。堿可選擇無機堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化鈣；有機堿包括但不限于氫氧化銨、三乙胺、精氨酸或賴氨酸。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物及藥學(xué)上可接受的鹽可以溶劑化形式或未溶劑化形式存在例如水合式等。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物，其前藥應(yīng)遵照前藥設(shè)計原則，在生物體內(nèi)正常生理狀況下，能夠通過酶解、水解、酸解或代謝降解，釋放出原活性通式(i)所示的化合物。這里包括但不限于化合物上羥基基團的脂化(如形成磷酸脂和碳酸脂)，氨基基團和羧基基團的保護。前藥設(shè)計參照(1)karamanr，prodrugsdesignbasedoninter-andintramolecularchemicalprocesses.chembioldrugdes.82(6)：643-68，2013；(2)rautioj等，prodrugs：designandclinicalapplications.natrevdrugdiscov.7(3)：255-702008；(3)jampilekj.prodrugs：pharmaceuticaldesignandcurrentperspectives.currpharmdes.17(32)：3480-1，2011；(4)bundgaardh.designofprogrugs.elservier，1985。

本發(fā)明另一方面將通式(i)所示的化合物或藥學(xué)上可接受的鹽或前藥制備成臨床上可使用的藥物組合物。根據(jù)臨床適應(yīng)癥，給藥途徑與方式，其藥用制劑包括但不限于口服制劑如片劑、凝膠劑、軟/硬膠囊、乳劑、分散性粉劑、顆粒劑、水/油懸乳劑；注射劑包括靜脈注射劑、肌肉注射劑、腹腔注射劑、直腸給藥栓劑、顱內(nèi)注射劑，這些劑型可為水溶液也可為油類溶液；局部制劑包括霜劑、軟膏劑、凝膠劑、水/油溶液以及包合物制劑；吸入劑型包括細粉、液體氣溶膠以及適合于體內(nèi)植入的各種劑型。

本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)需要加入常規(guī)藥用輔料。這些輔料應(yīng)符合藥物制劑制備工藝規(guī)則，與活性成分相兼容。固體口服制劑輔料選用但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、葡萄糖、蔗糖、環(huán)糊精以及促進腸吸收分子載體維生素e-peg1000。口服制劑可加入適當?shù)闹珓?、甜味劑、矯味劑及防腐劑。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物按0.1-100mg/kg單位劑量給予溫血動物。

包含本發(fā)明通式(i)所示的化合物或藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物，主要治療與egfr和/或her2相關(guān)的臨床疾病。其中包括但不限于癌癥、糖尿病炎癥、免疫系統(tǒng)疾病、心血管內(nèi)疾病、神經(jīng)類疾病以及呼吸類疾病。

上述臨床疾病中，癌癥包括但不限于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、食道癌、間皮瘤、頭頸癌、膀胱癌、唾腺癌、間變性大細胞淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤。

本發(fā)明藥物組合物在上述癌癥治療中，可單獨使用，或與臨床上常規(guī)使用的手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、免疫療法、融瘤病毒、rnai、癌癥輔助治療的一種或多種方法聯(lián)合治療，其中包括但不限于以下抗腫瘤類藥物和治療方法：

1)烷化劑如順鉑、順鉑、奧沙利鉑、苯丁酸氮芥、卡環(huán)磷酰胺，氮芥、美法侖、替莫唑胺、白消安、亞硝基脲類。

2)抗腫瘤抗生素類如阿霉素、博來霉素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達比星、絲裂霉素c、放線菌素、光神霉素；抗有絲分裂藥如長春新堿，長春堿，長春地辛，長春瑞濱，紫杉醇、泰索帝、polo激酶抑制劑。

3)抗代謝和抗葉酸劑如氟嘧啶、雷甲氨蝶呤、阿糖胞苷、替曲塞、羥基脲。

4)拓撲異構(gòu)酶抑制劑如表鬼臼毒素、喜樹堿。

5)細胞生長抑制劑如抗雌激素/抗雄激素類藥物如他莫昔芬、氟維司群、托瑞米芬、雷諾昔芬、屈諾昔芬、碘昔芬；如比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸環(huán)丙孕酮。

lhrh拮抗劑或lhrh激動劑如戈舍瑞林、亮丙瑞林、和布舍瑞林、孕激素類如醋酸甲地孕酮。

芳香酶抑制劑如阿那曲唑、來曲唑、伏羅唑、伊西美坦、5a-還原酶抑制劑如非那雄胺。

6)抗侵襲劑如c-src激酶家族抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，尿激酶纖溶酶原激活物受體功能的抑制劑或者類肝素酶的抗體。

7)生長功能的抑制劑如生長因子抗體和生長因子受體抗體如抗her2抗體曲妥珠單抗、抗egfr抗體帕尼單抗、抗egfr抗體西妥昔單抗等；這種抑制劑還包括其它酪氨酸激酶抑制劑以及絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制劑如ras/raf信號傳導(dǎo)抑制劑，mek和/或akt激酶的細胞信號傳導(dǎo)抑制劑、c-kit抑制劑、abl激酶抑制劑、pi3激酶抑制劑、flt3激酶抑制劑、csf-1r激酶抑制劑、igf受體激酶抑制劑，極光激酶抑制劑，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑如cdk2和/或cdk4，cdk6抑制劑。

8)抗血管生成劑如抑制血管內(nèi)皮生長因子作用的藥劑貝伐珠單抗以及vegf受體酪氨酸激酶抑制劑。

9)腫瘤免疫治療法包括任何提高患者腫瘤細胞的免疫原性的體外和體內(nèi)方法。如細胞因子il-2、il-4或者gm-csf進行轉(zhuǎn)染；降低t細胞無效能的方法如抗pd-1/pd-l單抗；使用轉(zhuǎn)染的免疫細胞如細胞因子轉(zhuǎn)染的樹突狀細胞的方法；使用細胞因子轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞系的方法；降低免疫抑制性細胞如調(diào)節(jié)性t細胞、髓源性抑制細胞、或表達吲哚胺2，3-脫氧酶的樹突狀細胞的功能方法；以及腫瘤相關(guān)抗原蛋白類或肽類組成的癌癥疫苗的方法。

10)嵌合抗原受體t細胞免疫療(cart)。

11)腫瘤基因治療如crispr-cas9，rnai，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

應(yīng)予說明，如果任何給定取代基的數(shù)量沒有規(guī)定(例如，鹵代烷基)，則可以存在一個或多個取代基。例如，“鹵代烷基”可以含有一個或多個相同或不同的鹵素。

在本文的描述中，如果化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)名稱彼此矛盾時，則是以其化學(xué)結(jié)構(gòu)為準。

當在本文使用時，對于任何保護基團和其他化合物的縮寫，除非另有說明，以其常用的公認縮寫表示，或根據(jù)iupac-iubcommissiononbiochemicalnomenclature表示(參見，biochem.1972，77：942-944)。

實施例

以下列舉實施例來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的任何限制。

實施例1

n-(5-(4-(3-溴苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物1)的制備

3-溴苯胺(2.7g，15mmol)、2，4-二氯嘧啶(2.7g，18mmol)、碳酸氫鈉(2.5g，30mmol)加到30ml異丙醇中，85℃加熱反應(yīng)10小時，減壓蒸去異丙醇，再加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3g)。m/z：esimh⁺286.0

中間體1(1.4g，5mmol)、2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(0.9g，5mmol)、對甲苯磺酸(1.03g，6mmol)加到15ml2-戊醇中，115℃加熱3小時，冷至室溫過濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗兩次，干燥得中間體2(1.6g)。m/z：esimh⁺434.0。

中間體2(43g，1mmol)、n，n，n′-三甲基乙二胺(0.15g，1.5mmol)、無水碳酸鉀(0.28g，2mmol)加到2mldmf中，90℃加熱3小時，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體4(0.24g)，m/z：esimh⁺486.1。

中間體4(0.24g，0.5mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.05g，0.55mmol)，加完攪拌1小時，升至室溫攪拌2小時，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標化合物70mg。

采用與實施例1同樣的方式制備表1中的化合物。

表1

實施例2

n-(5-(4-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物32)的制備

吲哚(8.7，74mmol)、2，4-二氯嘧啶(16g，107mmol)、hobt(2g，14.8mmol)、無水碳酸鉀(20g，145mmol)加到dmf中，85℃反應(yīng)15小時，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(8g)。msm/z：es⁺mh⁺230.1

按照實施例1的方法，可制備目標化合物。

采用與實施例2同樣的方式制備表2中的化合物。

表2

實施例3

n-(5-(4-(1h-苯基[d]咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物106)的制備

苯并咪唑(2.4g，20mmol)、碳酸鉀(5.6g，40mmol)、2，4-二氯嘧啶(4.5g，30mmol)加到5mldmf中，室溫攪拌1小時，反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(2.1g)。m/z：esimh⁺231.0。

按照實施例1的方法，可制備目標化合物。

采用與實施例3同樣的方式制備表3中的化合物。

表3

實施例4

n-(5-(4-(3-氯-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物108)的制備

3-氯苯胺(2.56g，20mmol)、diea(3.08g，24mmol)加到20mldmf中，冰鹽浴冷卻，滴加2，4-二氯-1，3，5-三嗪(3.29g，22mmol)的dmf溶液，冰鹽浴攪拌2.5小時，反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3.65g)。m/z：esimh⁺241.0。

按照實施例1的方法，可制備目標化合物。

采用與實施例4同樣的方式制備表4中的化合物。

表4

實施例5

n-(5-(6-(3-溴-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物133)的制備

3-溴苯胺(2.7g，15mmol)、4，6-二氯嘧啶(2.7g，18mmol)、碳酸氫鈉(2.5g，30mmol)加到30ml異丙醇中，85℃加熱反應(yīng)10小時，減壓蒸去異丙醇，再加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(4g)。m/z：esimh⁺286.0

按照實施例1的方法，可制備目標化合物。

采用與實施例5同樣的方式制備表5中的化合物。

表5

實施例6

n-(5-(6-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-4-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物155)的制備

按照實施例2、3的方法用4，6-二氯嘧啶代替2，4-二氯嘧啶，可制備目標化合物。

采用與實施例6同樣的方式制備表6中的化合物。

表6

實施例7

n-(4-甲氧基-5-(6-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-4-基氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯基)-丙烯酰胺(158)的制備

1-甲基吲哚(2.5ml，23mmol)、4，6-二氯嘧啶(3g，23mmol)、無水三氯化鋁(3g，23mmol)加到30ml1，2-二氯乙烷中，45℃加熱反應(yīng)4小時，冷至室溫，加入1m稀鹽酸、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3.5g)。m/z：esimh⁺244.1

中間體1(1.2g，5mmol)、2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(0.9g，5mmol)、對甲苯磺酸(1.03g，6mmol)加到15ml2-戊醇中，115℃加熱3小時，冷至室溫過濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗兩次，干燥得中間體2(1.4g)。m/z：esimh⁺394.1。

中間體2(0.4g，1mmol)、n-甲基哌嗪(0.15g，1.5mmol)、無水碳酸鉀(0.28g，2mmol)加到2mldmf中，90℃加熱3小時，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體4(0.23g)。m/z：esimh⁺444.3。

中間體4(0.22g，0.5mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.05g，0.55mmol)，加完攪拌1小時，升至室溫攪拌2小時，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標化合物70mg。m/z：esimh⁺498.4

實施例8

n-(4-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-5-(6-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-丙烯酰胺(化合物196)的制備

實施例7中的中間體2(0.4g，1mmol)、乙二醇單甲醚(0.15g，2mmol)、氫氧化鈉(0.16g，4mmol)加到2mldmf中，60℃加熱5小時，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體70.18g。m/z：esimh⁺420.

中間體7(0.18g，0.43mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.045g，0.5mmol)，加完攪拌1小時，升至室溫攪拌2小時，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標化合物45mg。

采用與實施例7、8同樣的方式制備表7中的化合物。

表7

試驗例化合物活性測定

以下對上述實施例中合成的丙烯酰胺苯胺組合衍生物的代表例，進行表達不同癌基因的腫瘤細胞體外與體內(nèi)生長抑制活性的測定。測定方法和結(jié)果如下。

試驗例1

化合物對egfr野生型和突變型以及her2/erbb2表達陽性腫瘤細胞體外生長

50％抑制(gi50)濃度范圍的測定

實驗材料與方法

1.腫瘤細胞系及細胞培養(yǎng)

腫瘤細胞系是研究腫瘤體外生長抑制的有效細胞模型。我們選擇具有代表性的腫瘤細胞系應(yīng)用于化合物活性測定。所有使用的細胞系分別購于atcc和中科院細胞庫。細胞培養(yǎng)條件與方法按每種細胞系要求進行。每次體外培養(yǎng)不超過3次傳代。根據(jù)需要，可對細胞系進行單克隆純化與鑒定。

細胞培養(yǎng)基分別選用rpmi1640(gibco)，mem(gibco)，mccoy′s5a(gibco)，imdm(gibco)，加入5-20％胎牛血清(gibco)，1％雙抗，2mm谷氨酰胺或者1mm丙酮酸鈉。

(1)表達egfr酪蛋白激酶野生型和突變型的腫瘤細胞系

egfr野生型細胞系：a431人表皮癌細胞(egfr野生型/高表達，中科院上海細胞庫)，nci-h460人大細胞肺癌細胞(egfr為野生型，krasg61h，atcc)，h1299非小細胞肺癌細胞株(egfr為野生型，atcc)，a375黑色素瘤細胞系(egfr野生型性，brafv600e，中科院上海細胞庫)，nci-h292人肺癌(egfr野生型性，來自人肺粘液表皮樣癌/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，中科院上海細胞庫)，用1×rpmi1640，加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)以上。用1×ham'sf12k，加10％fbs，1％雙抗，2mm谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)a549非小細胞肺癌細胞(egfr野生型，krasg12s突變型，中科院上海細胞庫)。

egfr突變型細胞系：非小細胞肺癌細胞pc-9(atcc)和hcc827細胞(中科院上海細胞庫)是egfrexon19(e746-a750)缺失型突變細胞系，第一代egfr抑制劑敏感。人非小細胞肺腺癌細胞nci-h1975，表達egfrl858r/t790m雙突變(atcc)，第一代egfr抑制劑抗性；pc-9er由本公司建立的pc-9細胞株厄洛替尼(erlotinib)獲得性抗性細胞系，egfr為dele746-a750/t790m突變型，第一代egfr抑制劑抗性。

(2)her2基因擴增或高表達的細胞系

人胃癌細胞系nci-n87(atcc)，人乳腺癌細胞株hcc1954((her2/erb2選擇性可逆抑制劑拉帕替尼lapatinib耐藥性細胞株，gi50＞1000nm)和zr-75-30(atcc)，au565(atcc)腺癌細胞系，nci-h2170人肺鱗狀細胞癌(atcc)，分別用1×rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10％fbs)培養(yǎng)；人肺腺癌細胞calu-3(atcc)培養(yǎng)基為1×mem，10％fbs，1％雙抗，1％neaa(gibco)，2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸鈉。人乳腺癌細胞sk-br-3用mccoy′s5a完全培養(yǎng)基(10％fbs)培養(yǎng)。

(3)過表達met酪蛋白激酶的腫瘤細胞系

mkn-45人胃癌細胞(atcc)和非小細胞肺癌nci-h1993(atcc)分別用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(4)表達alk融合蛋白及突變株的腫瘤細胞系

人非小細胞肺癌細胞株nci-h2228(atcc)表達eml4-alk融合基因，人間變性大細胞淋巴瘤細胞株karpas-299(atcc)表達npm-alk融合基因，用1xrpmi1640(10％fbs)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。神經(jīng)母細胞瘤細胞sh-sy5y(中科院上海細胞庫)表達alkf1174l突變蛋白，用mem完全培養(yǎng)基(1xmem，10％fbs，1％neaa，1mm丙酮酸鈉)培養(yǎng)。

(5)表達bcr-abl酪蛋白激酶細胞系

人白血病細胞株k562(atcc)表達bcr-abl融合蛋白。用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(6)表達flt3-itd酪蛋白激酶突變株的細胞系

flt3屬于酪蛋白激酶，其中臨床上約20-30％急性髓細胞白血病(aml)病人表達flt3-itd突變蛋白。mv4-11表達flt3-itd酪蛋白激酶，用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(7)表達jak2v617f酪蛋白激酶突變株細胞系

jak2是一種非受體酪蛋白激酶(januskinase2)。在細胞生長，分化與轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。jak2基因突變往往導(dǎo)致骨髓增生及轉(zhuǎn)化，特別是jak2v167f突變常見于臨床病人。人紅白血病細胞系hel表達jak2v167f，用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(8)表達brutons酪蛋白激酶(btk)突變株細胞系

ramos是btk酪蛋白激酶表達陽性的人b淋巴細胞白血病細胞系用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(9)表達kit酪蛋白激酶突變株細胞系

kasumi-1是kit酪蛋白激酶n822k突變株表達陽性白血病細胞系。kit酪蛋白激酶異常變異常常出現(xiàn)在一些癌癥病人中。kasumi-1細胞用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.藥物處理

貼壁細胞用0.25％胰酶-edta(gibco)消化，懸浮培養(yǎng)細胞直接離心收集(1700rpm，3分鐘)，棄上清，計數(shù)細胞。根據(jù)每種細胞生長周期，配制不同的細胞濃度(每毫升5-10×10⁴細胞)，接種到96孔板(coming)，每孔100微升，37℃，5％co2培養(yǎng)過夜。第二天，加入待測化合物到培養(yǎng)細胞中，平行2孔。有機溶劑終濃度不超過千分之一，細胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，mtt測定。

待測化合物與參比化合物用dmso(sigma)溶解，化合物純度達98％以上?；衔镔A存濃度為10mm，-20℃保存，使用前對倍或者10倍系列稀釋。

3.mtt檢測及gi50計算

mtt檢測試劑為dojindocck8試劑盒，酶標測定儀為thermomultiskanfc儀。

將貼壁細胞培養(yǎng)基吸出，立即加入新配制的含10％cck8的完全培養(yǎng)基(5％fbs)，每孔100ul。懸浮細胞可直接加入cck8試劑，終濃度為10％，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時，當溶劑對照孔呈現(xiàn)暗黃色時，測od450nm光吸收值，按下列公式計算細胞生長率。細胞生長率％＝100*(t-t0)/(c-t0)，t＝藥物處理細胞孔光密度值-空白對照孔光密度值；t0＝藥物處理前細胞孔光密度值-空白對照孔光密度值；c＝溶劑對照組細胞孔光密度。通過藥物濃度與細胞生長率曲線，計算細胞生長50％抑制的藥物濃度即gi50。試驗重復(fù)進行三次，并對數(shù)據(jù)進行生物學(xué)統(tǒng)計分析。

實驗結(jié)果

表8總結(jié)本發(fā)明化合物對不同腫瘤細胞生長抑制gi50濃度范圍的結(jié)果，gi50值越小，細胞生長抑制活性越強，而化合物對egfr野生型細胞生長抑制(gi50)濃度越高，即egfr野生型gi50/egfr突變型gi50比值越大，化合物選擇性越好。

表8

試驗例2

化合物對不同腫瘤細胞生長抑制gi50值的測定

選擇10個本發(fā)明化合物2，18，19，32，106，114，118，140，147，183，采用第三代egfr抑制劑azd9291作參比，對表達臨床常見癌基因的一些腫瘤細胞進行生長抑制試驗?；衔镆?000nm為起始濃度，對倍稀釋到0.03nm，按照gi50計算方法計算每種化合物的gi50值(表9)。結(jié)果顯示測試化合物對表達egfr突變型細胞(h1975，pc-9，hcc827)具有較高的抑制活性，gi50小于20nm，對egfr野生型高表達細胞a431需要相對高的濃度才呈現(xiàn)明顯的抑制作用，而對多數(shù)egfr野生型正常表達細胞株相對無抑制效果。同時發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對her2基因擴增或高表達的腫瘤細胞系(n87，au565，sk-rb-3，h2170，zr-75-30和calu-3)具有選擇性的強抑制作用，活性遠強于參比化合物。除化合物114，118，140，147和183對表達flt3-itd及btk基因的mv4-11和ramos細胞有中等程度的抑制作用外，測試化合物對其它癌基因表達陽性細胞相對無抑制作用。

表9

試驗例3

腫瘤細胞體內(nèi)生長抑制實驗

免疫缺陷小鼠的異種移植是測試化合物動物體內(nèi)抗腫瘤活性的有效模型。一般來講，人腫瘤細胞異種移植試驗的有效性和人體腫瘤臨床治療呈一定的正相關(guān)。bab/c免疫缺陷小鼠是最常用的腫瘤細胞異種移植動物之一。為了測試本發(fā)明化合物是否能夠同樣抑制egfr突變株細胞和her2/erbb2過表達腫瘤細胞的體內(nèi)生長，首先選用h1975，pc-9和nci-n87細胞bab/c裸鼠腫瘤模型進行試驗。將生長對數(shù)期的h1975，pc-9，nci-n87腫瘤細胞用胰酶消化，加適量1xrpmi1640培養(yǎng)基(無血清)終止消化，收集細胞于50ml離心管(coming)，1700rm離心3分鐘。棄上清，用1xrpmi1640培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，配制成5-10x10⁷細胞/毫升，置冰上，皮下接種5-10x10⁶(0.2ml)細胞于6-8周齡(重20克左右)雌性bab/c裸鼠右側(cè)背部。當腫瘤塊生長到大小在100-200mm³體積時，隨機分組(每組3-6只)，耳扎標記，稱重。待測化合物純度達為99％以上，單雜不高于0.2％，用cm(30％聚乙二醇400，0.5％tween-80，2.5％丙二醇)將藥物配制成乳狀混懸液，以0.1ml/每10克的體積每日一次，連續(xù)灌胃給藥，藥量為25mg/kg。每周測量腫瘤3次。當cm對照組腫瘤平均體積達到1500mm³時，或給藥到30天時，實驗結(jié)束。

腫瘤體積按v＝1/2axb²計算，a為長，b為寬。抑瘤率＝(對照組平均體積-治療組平均體積)/對照組平均體積×100％。

測試化合物藥量為25mg/kg灌胃給藥19天時，三種腫瘤細胞動物模型的腫瘤生長均能夠有效的被抑制而動物體重不受影響。

表10本發(fā)明化合物對腫瘤細胞體內(nèi)生長抑制實驗(第19天)的結(jié)果