本發(fā)明屬于醫(yī)藥及其制備和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三環(huán)二萜類似物及其制備方法、及其在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

前列腺癌是一種嚴重威脅中老年男性健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，全世界每年大約有68萬男性被診斷為前列腺癌，其中22萬死于前列腺癌。在歐洲，男性的前列腺癌發(fā)病率已超過肺癌列居第一位；在美國，前列腺癌排在男性癌癥死亡率的第二位；在我國，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，增長率一度達到10％以上。前列腺癌早期無明顯癥狀，常在體檢時發(fā)現(xiàn)psa的數(shù)值升高，進一步檢查后被發(fā)現(xiàn)和確診。前列腺癌早期治療主要采取局部治療策略(手術(shù)或者局部放療)(cancer2003,98,1169-1178.)；多數(shù)患者在診斷時已經(jīng)處于晚期，此時的主要治療策略為去勢治療(手術(shù)或者藥物去勢)。晚期前列腺癌患者在經(jīng)過18—24個月的治療后，幾乎都會發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌，臨床上表現(xiàn)為對激素療法和去勢療法的抵抗。基礎(chǔ)研究表明，去勢抵抗性前列腺癌與雄激素受體密切相關(guān)，靶向雄激素受體信號通路的藥物是臨床上治療前列腺癌的有效手段。雄激素受體蛋白分為四個功能區(qū)(圖1),分別為n端結(jié)構(gòu)域(ntd)、dna結(jié)合域(dbd)、鉸鏈區(qū)(hinge)和配體結(jié)合域(lbd)(journalofcarcinogenesis2011,10,1-20.)。目前針對去勢抵抗性前列腺癌，臨床上廣泛使用的一線治療藥物，如阿比特龍(nature2014,510,278-282.)、恩雜魯胺(mdv3100,drugs2013,73,1723-1732.)都是針對ar的lbd結(jié)合域開發(fā)的藥物，它們能在一定程度上緩解前列腺癌癥進展。研究表明大約有25％的患者一開始就對這兩種藥物耐藥；此外隨著治療的進展，最初對這兩種藥物敏感的患者也會不可避免的均出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，形成轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌，最終導致患者死亡。迄今為止，還沒有其它有效的治療方案。

前列腺癌耐藥的原因除了ar過表達和基因擴增外，最重要因素是ar的突變。突變主要包括：a)lbd結(jié)合域突變，該突變可導致傳統(tǒng)的拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顒T導產(chǎn)生去勢抵抗性前列腺癌；b)突變產(chǎn)生雄激素受體剪切變異體(androgenreceptorsplicevariants,ar-vs)，該突變使得癌細胞對現(xiàn)有的針對lbd結(jié)構(gòu)域的抗前列腺癌藥物產(chǎn)生耐藥。ar-vs(主要為ar-v7和ar-v^567es)是一種截短的ar，這些剪切變異體所編碼的蛋白質(zhì)同ar-fl一樣在n-端都具有ntd和dbd結(jié)構(gòu)域，但是在c-端缺少lbd(ar-v7)結(jié)構(gòu)域或缺少完整的lbd結(jié)構(gòu)域(ar-v^567es)(圖1)。由于ar-vs保留有dbd結(jié)構(gòu)域，且具有持續(xù)性激活活性，因此仍能與基因組dna結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達，促進前列腺癌的發(fā)展。同時，ar-vs缺少完整的lbd結(jié)構(gòu)域，抗雄激素藥物無法與之結(jié)合，也正因為這樣，ar-vs對于傳統(tǒng)抗雄激素治療藥物(作用于lbd結(jié)構(gòu)域)表現(xiàn)出耐藥性。因此，尋找對表達ar全長或同時表達ar全長(ar-fl)和ar-vs剪切變異體的前列腺癌細胞均有抑制作用的活性化合物，對于克服現(xiàn)有藥物的耐藥性，治療去勢抵抗性前列腺癌具有重要意義。目前，加拿大essapharmaceuticals研發(fā)的epi-001被認為是最具有開發(fā)前景的作用于剪切變異體ar-vs的ntd結(jié)構(gòu)域的小分子活性化合物(oncologist2016,21,1427-1435.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在尋找新型抗前列腺癌藥物的研究過程中，首次提出了新的式(i)三環(huán)二萜類似物及其制備方法。在尋找新型抗前列腺癌藥物的過程中，本發(fā)明人在自有化合物庫中通過對三種不同類型的前列腺癌細胞株，包括：a)du145(不表達ar，非雄激素依賴)；b)表達全長ar的lncap(ar-fl)；c)同時表達全長ar和剪切變異體ar-vs的22rv1(ar-fl和ar-vs)，進行抗前列腺癌活性篩選，得到對du145抑制活性差，對lncap和22rv1抑制活性好的先導化合物(5)。如果化合物對于du145抑制活性差，而對于lncap和22rv1抑制活性較好，則說明化合物抗前列腺癌活性是與ar受體和剪切變異體ar-vs均相關(guān)，這類活性化合物有望克服現(xiàn)有藥物的耐藥性，發(fā)展成為新型的治療去勢抵抗性前列腺癌的藥物。本發(fā)明以化合物(5)為先導物設(shè)計、合成了一系列化合物，這些化合物在細胞水平上抗增殖活性結(jié)果如表1所示。

本發(fā)明提供的一種三環(huán)二萜類似物，其結(jié)構(gòu)如式(i)所示：

其中，r為雜環(huán)，包括：五元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)，六元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)，苯并五元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)，苯并六元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)。

優(yōu)選地，r選自含一個雜原子的五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)、六元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)、苯并六元雜環(huán)c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)；含兩個雜原子的五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)、六元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)、苯并六元雜環(huán)c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)；其中，所述雜原子選自n、o、s，所述雜原子可以相同或不同。

進一步優(yōu)選地，r選自吲唑環(huán)，c1～c10烷基取代的吲唑環(huán)，苯并噻唑環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并噻唑環(huán)，吲哚環(huán)，c1～c10烷基取代的吲哚環(huán)，吡啶環(huán)，c1～c10烷基取代的吡啶環(huán)，苯并咪唑環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并咪唑環(huán)，噻唑環(huán)，c1～c10烷基取代的噻唑環(huán)。

進一步優(yōu)選地，r選自：即，所對應(yīng)的三環(huán)二萜類似物，其結(jié)構(gòu)如式(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)所示：

本發(fā)明還提供了一種三環(huán)二萜類似物的制備方法，包括以下步驟：

以式(1)為原料，經(jīng)酯化反應(yīng)、傅克?；磻?yīng)、鹵仿反應(yīng)、水解反應(yīng)后，得到如式(4)所示的三環(huán)二萜類似物；所述制備方法如路線(i)所示：

具體地，所述方法包括以下步驟(其中(2)和(3)的合成參照europeanjournalofmedicinalchemistry2015,90，10-20.)：

(a)酯化反應(yīng)

在有機溶劑中，在dmap催化下，原料(1)和乙酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)生成化合物(2)。

步驟(a)中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、無水二氯甲烷之任意的一種；優(yōu)選地，為無水二氯甲烷。

步驟(a)中，所述催化劑為dmap。

步驟(a)中，所述原料(1)、乙酸酐、dmap的摩爾比為1：(1.5-3)：(0.1-0.5)；優(yōu)選地，為1：3：0.2。

步驟(a)中，所述酯化反應(yīng)的溫度為0-40℃；優(yōu)選地，25℃。

步驟(a)中，所述酯化反應(yīng)的時間為1-6h；優(yōu)選地，為4h。

(b)傅克?；磻?yīng)

在有機溶劑中，在三氯化鋁(alcl3)催化下，化合物(2)和乙酰氯發(fā)生傅克?；磻?yīng)，生成化合物(3)。

步驟(b)中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、無水二氯甲烷、四氫呋喃之任意的一種；優(yōu)選地，為無水二氯甲烷。

步驟(b)中，所述三氯化鋁的作用為催化劑，所述乙酰氯為?；膩碓?。

步驟(b)中，所述化合物(2)、三氯化鋁、乙酰氯的摩爾比為1：1-3：1.5-4.0；優(yōu)選地，為1:3:3。

步驟(b)中，所述傅克?；磻?yīng)的溫度為0-25℃；優(yōu)選地，為0℃。

步驟(b)中，所述傅克?；磻?yīng)的時間為1-3h；優(yōu)選地，為2h。

(c)鹵仿反應(yīng)和水解反應(yīng)

(c-1)鹵仿反應(yīng)

在溶劑中，溴單質(zhì)和氫氧化鈉發(fā)生歧化反應(yīng)，生成次溴酸鈉；然后在溶劑中，化合物(3)和次溴酸鈉發(fā)生鹵仿反應(yīng)，生成中間體。

步驟(c-1)中，歧化反應(yīng)中，所述溶劑選自水、1,4-二氧六環(huán)、二氯甲烷之任意的一種或多種；優(yōu)選地，為水和1,4-二氧六環(huán)的混合溶劑。

步驟(c-1)中，歧化反應(yīng)中，所述溴單質(zhì)、氫氧化鈉的摩爾比為3-6：1.5-2；優(yōu)選地，為2：1；進一步優(yōu)選地，為624：306。

步驟(c-1)中，所述歧化反應(yīng)的溫度為0-25℃；優(yōu)選地，為0℃。

步驟(c-1)中，所述歧化反應(yīng)的時間為0.5-2h；優(yōu)選地，為1h。

步驟(c-1)中，鹵仿反應(yīng)中，所述溶劑選自二氯甲烷、無水二氯甲烷、水、四氫呋喃和1,4-二氧六環(huán)之任意的一種或多種；優(yōu)選地，為水和1,4-二氧六環(huán)的混合溶劑。

步驟(c-1)中，鹵仿反應(yīng)中，次溴酸鈉使化合物(3)羰基鄰位的甲基變?yōu)轸然?/p>

步驟(c-1)中，鹵仿反應(yīng)中，所述化合物(3)和次溴酸鈉的摩爾比為1-2：8-20；優(yōu)選地，為1：18。

步驟(c-1)中，所述鹵仿反應(yīng)的溫度為0-25℃；優(yōu)選地，為0℃。

步驟(c-1)中，所述鹵仿反應(yīng)的時間為0.4-1h；優(yōu)選地，為0.5h。

(c-2)水解反應(yīng)

在溶劑中，中間體和氫氧化鈉發(fā)生水解反應(yīng)，生成化合物(4)。

步驟(c-2)中，所述溶劑選自甲醇、水、乙醇之任意一種或者多種；優(yōu)選地，甲醇和水的混合溶劑。

步驟(c-2)中，氫氧化鈉使中間體含有的酯基水解成羥基和羧酸。

步驟(c-2)中，優(yōu)選地，所述水解反應(yīng)所用試劑為naoh固體。

步驟(c-2)中，所述氫氧化鈉的用量與化合物(3)的摩爾比為1-6：0.5-2；優(yōu)選地，為2:1。

步驟(c-2)中，所述水解反應(yīng)的溫度為25-60℃；優(yōu)選地，為25℃。

步驟(c-2)中，所述水解反應(yīng)的時間為1-12h；優(yōu)選地，為6h。

本發(fā)明還提出了式(i)所示三環(huán)二萜類似物的制備方法，包括以下步驟：以式(4)所示的三環(huán)二萜類似物為原料，在dmap、edci、hobt催化下，分別與雜環(huán)胺r-nh2進行酰胺化反應(yīng)，得到式(i)所示的三環(huán)二萜類似物。

所述制備方法的反應(yīng)路線如下：

其中，r為雜環(huán)，包括：五元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)，六元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)，苯并五元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)，苯并六元雜環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)。

優(yōu)選地，r選自含一個雜原子的五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)、六元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)、苯并六元雜環(huán)c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)；含兩個雜原子的五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的五元雜環(huán)、六元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的六元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)、c1～c10烷基取代的苯并五元雜環(huán)、苯并六元雜環(huán)c1～c10烷基取代的苯并六元雜環(huán)；其中，所述雜原子選自n、o、s，所述雜原子可以相同或不同。

優(yōu)選地，r選自吲唑環(huán)，c1～c10烷基取代的吲唑環(huán)，苯并噻唑環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并噻唑環(huán)，吲哚環(huán)，c1～c10烷基取代的吲哚環(huán)，吡啶環(huán)，c1～c10烷基取代的吡啶環(huán)，苯并咪唑環(huán)，c1～c10烷基取代的苯并咪唑環(huán)，噻唑環(huán)，c1～c10烷基取代的噻唑環(huán)。

進一步優(yōu)選地，r選自：

本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述雜環(huán)胺r-nh2選自：5-氨基吲哚、2-氨基苯并噻唑、2-氨基-4甲基苯并噻唑、6-氨基苯并噻唑、6-氨基吲哚、5-氨基吲哚、6-氨基吲唑、2-氨基苯并咪唑、2-氨基-5甲基噻唑、2-氨基吡啶、2-氨基噻唑、2-氨基-4甲基吡啶、2-肼基-1h-1,3-苯并咪唑。

其中，所述化合物(4)、edci、hobt、dmap：雜環(huán)胺的摩爾比為1：(2～6)：2：(4～8)：(2～6)；優(yōu)選地，為1：2：2：4：3。

其中，所述酰胺化反應(yīng)的溫度為25-50℃；優(yōu)選地，為25℃。

其中，所述酰胺化反應(yīng)的時間為6-12h；優(yōu)選地，為8h。

本發(fā)明制備方法中，上述反應(yīng)通常用薄板層析法跟蹤測定反應(yīng)的進度，反應(yīng)完畢后采用的后處理方法通常包括濃縮、萃取、柱層析分離等，最終產(chǎn)物以核磁共振譜來驗證。

本發(fā)明還提供了所述三環(huán)二萜類似物在制備全長ar-fl和剪切變異體ar-vs的轉(zhuǎn)錄活性的抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的三環(huán)二萜類似物在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。其中，所述三環(huán)二萜類似物用于抑制前列腺癌細胞的增殖，克隆形成的數(shù)量以及克隆形成的大小；所述前列腺癌細胞是指不表達ar的前列腺癌細胞、表達全長ar-fl的前列腺癌細胞以及同時表達全長ar-fl和剪切變異體ar-vs的前列腺癌細胞；其中，所述前列腺癌細胞包括lncap、22rv1、du145、vcap。

本發(fā)明三環(huán)二萜類似物在抑制表達ar-fl和ar-vs前列腺癌細胞增殖方面具有顯著效果。本發(fā)明三環(huán)二萜類似物在前列腺癌細胞株lncap(ar-fl)和22rv1(ar-fl&ar-vs)均有抑制活性；luciferase實驗(naturecommunications2016,7.)發(fā)現(xiàn)對ar-fl和ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)均有轉(zhuǎn)錄抑制活性，其中化合物10活性最好；化合物10能夠在較低濃度下抑制前列腺癌細胞的克隆形成。

在具體實施方式中，本發(fā)明通過對c環(huán)羧基上進行結(jié)構(gòu)改造，增強了三環(huán)二萜類似物對前列腺癌細胞株lncap(ar-fl)和22rv1(ar-fl&ar-vs)增殖抑制活性，如表1所示，表1的抗前列腺癌細胞活性測試結(jié)果表明，大多數(shù)化合物均能較好地抑制前列腺癌細胞增殖，ic50數(shù)據(jù)表明苯并雜環(huán)胺有利于抗前列腺癌增殖活性的提高(例如化合物5、8、9、10、12和17等)，并且對前列腺癌細胞株lncap(ar-fl)和22rv1(ar-fl&ar-vs)均有良好的抑制活性。本發(fā)明選取ic50較好的化合物5、8、9、10、12和17用luciferase實驗做進一步研究，結(jié)果如表2、表3和表4所示。表2的實驗結(jié)果表明，化合物5、8、9、10、12和17對ar-fl有轉(zhuǎn)錄抑制活性；表3和表4的實驗結(jié)果表明，化合物5、8、9、10、12和17對ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)均有轉(zhuǎn)錄抑制活性。根據(jù)表1、2、3和4的結(jié)果，化合物10對ar-fl、ar-v7、ar-v^567es的抑制率分別為42％、64.5％和77.2％，本發(fā)明以化合物10作為最優(yōu)候選化合物。圖2的結(jié)果表明陰性對照mdv3100對ar-v7和ar-v^567es的轉(zhuǎn)錄活性幾乎沒有抑制作用，化合物10抑制剪切變異體ar-v7轉(zhuǎn)錄活性的ic50為7.502um，抑制剪切變異體ar-v^567es轉(zhuǎn)錄活性的ic50為8.813um，與陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100相比，抑制活性更好。此外，化合物10在5um時能很好地抑制前列腺癌細胞系lncap(ar-fl)和vcap(ar-fl和ar-vs)的克隆形成，其效果明顯優(yōu)于10um的陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100(圖3)。因此本發(fā)明三環(huán)二萜類似物對表達ar全長或同時表達ar全長和ar-vs剪切變異體的前列腺癌細胞均有很好的抑制效果，具有良好的開發(fā)前景。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明將初始原料化合物(1)依次通過酯化、傅克酰基化、鹵仿反應(yīng)、水解反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)制備得到本發(fā)明三環(huán)二萜類似物。本發(fā)明合成化合物(4)的方法，操作簡單、產(chǎn)率高。本發(fā)明將自有化合物庫中篩選得到的具有抗去勢抵抗性前列腺癌活性的三環(huán)二萜先導物(5)，并在其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進行修飾，通過化合物(4)與不同的雜環(huán)胺酰胺化反應(yīng)，制備得到一系列結(jié)構(gòu)新穎的目的產(chǎn)物即式(i)三環(huán)二萜類似物。本發(fā)明制備方法的反應(yīng)條件溫和、所用試劑價格便宜、環(huán)境友好、合成路線短、產(chǎn)率高、合成方法簡便。制備得到的本發(fā)明三環(huán)二萜類似物在在細胞水平上的抗前列腺癌效果均有相關(guān)實驗評估，前列腺癌細胞株lncap(ar-fl)和22rv1(ar-fl&ar-vs)均有抑制活性；luciferase實驗(naturecommunications2016,7.)發(fā)現(xiàn)所述三環(huán)二萜類似物對ar-fl和ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)均有轉(zhuǎn)錄抑制活性，其中化合物(10)活性最好；化合物(10)能夠在較低濃度下抑制前列腺癌細胞的克隆形成。

附圖說明

圖1全長雄激素受體(ar-fl)和剪切變異體(ar-vs)結(jié)構(gòu)圖：ar-vs的剪切變異體包括ar-v7和ar-v^567es。

圖2化合物10抑制剪切變異體ar-vs(包括ar-v7和ar-v^567es)的轉(zhuǎn)錄活性(16h)；陰性對照mdv3100對剪切變異體ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)的轉(zhuǎn)錄活性幾乎沒有抑制作用，化合物10抑制剪切變異體ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)的轉(zhuǎn)錄活性的ic50分別為7.502um和8.813um，與陽性對照epi-001相比，化合物10抑制前列腺癌細胞系ar-vs的轉(zhuǎn)錄活性效果更好。

圖3化合物10抑制前列腺癌細胞克隆形成(7天)；化合物10在5um時，很好地抑制前列腺癌細胞系lncap(ar-fl)和vcap(ar-vs)的克隆形成，明顯優(yōu)于10um的陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。下述實施例中，化合物結(jié)構(gòu)由核磁共振儀測定；試劑主要由上海國藥化學試劑公司提供；產(chǎn)品純化主要通過柱色譜，硅膠(200-300)由青島海洋化工廠生產(chǎn)。

實施例1：式(4)所示化合物的制備

式(4)所示三環(huán)二萜類似物即化合物4的制備：將化合物1(10.0g，36.5mmol)、dmap(558mg，7.3mmol)置于單頸瓶，n2置換，注入60ml無水dcm，慢慢滴加乙酸酐(10.4ml，109.5mmol)，滴加完畢后，室溫攪拌4h。tlc檢測原料反應(yīng)完全，慢慢滴加30ml水，用dcm(20ml×3)萃取水相，合并有機相，水洗,飽和nacl溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析(pe:ea＝10：1)，濃縮得產(chǎn)物2(11.42g白色固體，99.0％)。¹hnmr400mhz,cdcl3)δ6.97(d,j＝8.4hz,1h),6.77(d,j＝2.4hz,1h),6.67(dd,j＝8.4,2.8hz,1h),4.56(dd,j＝11.2,4.8hz,1h),3.77(s,3h),2.94–2.86(m,1h),2.84–2.73(m,1h),2.27(dt,j＝13.2,3.2hz,1h),2.08(s,3h),1.90–1.68(m,4h),1.66–1.58(m,1h),1.40(dd,j＝12.0,2.3hz,1h),1.22(s,3h),0.97(s,3h),0.96(s,3h).

將上述所得的化合物2(5.4g，17.06mmol)、alcl3(6.83g，51.2mmol)置于單頸瓶，n2置換，注入40ml無水dcm，溶解完全，0℃下滴加乙酰氯(3.66ml，51.2mmol)，攪拌2h。tlc檢測原料反應(yīng)完全，0℃下慢慢滴加20ml冰水，用dcm(20ml×3)萃取水相，合并有機相，水洗,飽和nacl溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析(pe:ea＝10：1)，濃縮得產(chǎn)物3(6.01g白色固體，98.1％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.44(s,1h),6.79(s,1h),4.55(dd,j＝11.2,4.8hz,1h),3.86(s,3h),2.98–2.87(m,1h),2.84–2.71(m,1h),2.57(s,3h),2.29(dt,j＝13.2,3.2hz,1h),2.07(s,3h),1.38(dd,j＝12.0,2.4hz,1h),1.23(s,3h),0.97(s,3h),0.96(s,3h).

500ml單頸瓶中加入naoh(12.24g，306mmol)，水105ml和1,4-二氧六環(huán)68ml，攪拌均勻，0℃下滴加br2(4ml,624mmol),滴加完畢，攪拌1h備用。

將上述反應(yīng)所得的化合物wy358(3.0g，8.37mmol)置于500ml單頸瓶中，加入1,4-二氧六環(huán)84ml和28ml，攪拌均勻，0℃下滴加170ml新制得nabro溶液，1h滴加完畢，立即tlc反應(yīng)完全，滴加飽和nahso3水溶液至溶液至無色，濃鹽酸調(diào)節(jié)ph為5-6，加入100mldcm,用dcm(60ml×3)萃取水相,合并有機相，水洗，飽和nacl溶液洗，濃縮得粗品3.5g(無需純化，直接進行下一步)。

將上述3.5g粗品溶于甲醇(40ml)和水(5ml)的混合溶液，加入naoh(1.2g，30mmol)，常溫攪拌6h，tlc反應(yīng)完全，用稀hcl調(diào)節(jié)ph＜7，用dcm(40ml×3)萃取水相，合并有機相，水洗,飽和nacl溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析(dcm:meoh＝50:1)，得到產(chǎn)物4(2.4g白色固體，兩步產(chǎn)率90.2％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ12.35(s,1h),7.32(s,1h),6.89(s,1h),4.44(s,1h),3.76(s,3h),3.43(s,2h),3.09(t,j＝8.0hz,1h),2.82(dd,j＝16.8,6.0hz,1h),2.72–2.63(m,1h),2.30(d,j＝13.2hz,1h),1.78(dd,j＝12.8,7.2hz,1h),1.65(d,j＝10.0hz,2h),1.42-1.33(m,1h),1.12(s,3h),0.97(s,3h),0.78(s,3h).

實施例2：式(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)所示三環(huán)二萜類似物的制備

三環(huán)二萜類似化合物(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)的通用合成方法：

將化合物(4)(150mg，0.47mmol)、edci(180.2mg，0.94mmol)、hobt(127mg，0.94mmol)、dmap(230mg，1.88mmol)及雜環(huán)胺(1.41mmol)置于50ml單頸瓶，n2置換，注入10ml無水dcm或者無水dmf，室溫攪拌8h。tlc檢測原料反應(yīng)完全，加10ml水，用稀hcl調(diào)節(jié)體系ph＜7，用dcm(10ml×3)萃取水相，合并有機相，水洗,飽和nacl溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析(dcm:meoh＝60:1)，濃縮得相應(yīng)目標產(chǎn)物。

式(5)所示三環(huán)二萜類似物即化合物5，白色固體(90.2％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.89(s,1h),8.25(s,1h),8.05–7.9(m,2h),7.49(s,2h),6.88(s,1h),5.57(s,1h),4.03(s,3h),3.67–3.55(m,2h),3.34(dd,j＝10.8,4.8hz,1h),3.06-2.98(m,2h),2.96(s,1h),2.88(s,1h),2.31(d,j＝12.4hz,1h),1.96–1.91(m,1h),1.88–1.84(m,1h),1.24(s,3h),1.09(s,3h),0.92(s,3h).

式(6)所示三環(huán)二萜類似物即化合物6，白色固體(34.5％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.21(s,1h),7.99(s,1h),7.82(dd,j＝13.2,8.0hz,2h),7.44(t,j＝7.2hz,1h),7.30(t,j＝7.6hz,1h),6.90(s,1h),4.07(s,3h),3.34-3.31(m,1h),3.03-2.95(m,1h),2.89-2.82(m,1h),2.30(d,j＝12.8hz,1h),1.96-1.86(m,2h),1.81-1.70(m,3h),1.65-1.61(m,1h),1.31-1.23(m,1h),1.23(s,3h),1.09(s,3h),0.92(s,3h).

式(7)所示三環(huán)二萜類似物即化合物7，白色固體(68.7％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.19(s,1h),7.99(s,1h),7.67(d,j＝7.6hz,1h),7.25-7.18(m,2h),6.90(s,1h),4.09(s,3h),3.35-3.31(m,1h),3.00-2.97(m,1h),2.89-2.80(m,1h),2.68(s,3h),2.31(d,j＝13.2hz,1h),1.96-1.71(m,6h),1.34(d,j＝12.4hz,1h),1.24(s,3h),1.09(s,3h),0.92(s,3h).

式(8)所示三環(huán)二萜類似物即化合物8，白色固體(72.0％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.05(s,1h),8.90(s,1h),8.76(s,1h),8.05(d,j＝8.4hz,1h),7.98(s,1h),7.42(d,j＝8.8hz,1h),6.88(s,1h),4.04(s,3h),3.38–3.28(m,1h),3.05–2.97(m,1h),2.95–2.80(m,2h),2.30(d,j＝12.8hz,1h),1.96–1.90(m,1h),1.87–1.83(m,1h),1.77–1.73(s,2h),1.32(d,j＝12.0hz,1h),1.23(s,3h),1.09(s,3h),0.91(s,3h).

式(9)所示三環(huán)二萜類似物即化合物9，白色固體,(58.9％)；¹hnmr(400mhz,dmso)δ11.07(s,1h),9.97(s,1h),8.13(s,1h),7.44(d,j＝8.4hz,1h),7.40(s,1h),7.27(s,1h),7.10(d,j＝8.4hz,1h),6.97(s,1h),6.36(s,1h),5.33(s,1h),4.50(d,j＝5.2hz,1h),3.91(s,3h),3.14-3.09(m,1h),2.93-2.87(m,1h),2.79-2.70(m,1h),2.39-2.35(d,j＝12.8hz,1h),1.86-1.81(m,1h),1.71-1.64(m,3h),1.46-1.37(m,1h),1.17(s,3h),1.00(s,3h),0.81(s,3h).

式(10)所示三環(huán)二萜類似物即化合物10，白色固體(78.7％)；¹hnmr(400mhz,dmso)δ11.01(s,1h),9.88(s,1h),8.00(s,1h),7.42(s,1h),7.33(d,j＝6.0hz,3h),6.97(s,1h),6.39(s,1h),4.48(d,j＝4.8hz,1h),3.91(s,3h),3.14–3.09(m,1h),2.92–2.87(m,1h),2.79–2.70(m,1h),2.37(d,j＝12.8hz,1h),1.86–1.79(m,1h),1.70–1.64(m,3h),1.46–1.39(m,1h),1.26–1.20(m,2h),1.17(s,3h),1.00(s,3h),0.81(s,3h).

式(11)所示三環(huán)二萜類似物即化合物11，白色固體(45.0％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.07(s,1h),8.50(s,1h),7.99(d,j＝8.8hz,2h),7.68(d,j＝8.4hz,1h),6.94(d,j＝8.4hz,1h),6.89(s,1h),4.05(s,3h),3.60(dd,j＝13.6,6.4hz,1h),3.34(dd,j＝11.2,4.8hz,1h),3.02(dd,j＝16.4,5.2hz,1h),2.33(d,j＝12.8hz,1h),1.96-1.86(m,2h),1.83–1.74(m,2h),1.47(t,j＝6.82h),1.24(s,3h),1.09(s,3h),0.92(s,3h).

式(12)所示三環(huán)二萜類似物即化合物12，白色固體,(38.5％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.19(s,1h),10.89(s,1h),7.95(s,1h),7.62(d,j＝6.8hz,1h),7.2(d,j＝6.4hz,1h),7.23(d,j＝7.8hz,2h),6.91(s,1h),4.07(s,3h),3.346-3.32(m,1h),3.06-2.86(m,3h),2.32(d,j＝12.8hz,1h),1.98-1.93(m,1h),1.90–1.81(m,2h),1.78–1.74(m,1h),1.33(d,j＝12.0hz,1h),1.24(s,3h),1.10(s,3h),0.92(s,3h).

式(13)所示三環(huán)二萜類似物即化合物13，白色固體(40.0％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.98(s,1h),7.96(s,1h),7.11(s,1h),6.86(s,1h),4.02(s,3h),3.33-3.30(m,1h),3.01-2.95(m,1h),2.87-2.78(m,1h),2.41(s,3h),2.30(d,j＝13.2hz,1h),1.96-1.86(m,2h),1.85-1.78(m,2h),1.75-1.70(m,1h),1.63-1.60(m,1h),1.22(s,3h),1.08(s,3h),0.90(s,3h).

式(14)所示三環(huán)二萜類似物即化合物14，白色固體(46.7％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.35(s,1h),8.41(d,j＝8.4hz,1h),8.32(d,j＝3.2hz,1h),7.94(s,1h),7.74-7.69(m,1h),7.04–7.01(m,1h),6.87(s,1h),4.03(s,3h),3.34-3.28(m,1h),3.02-2.97(m,1h),2.89–2.80(m,1h),2.30(d,j＝12.8hz,1h),1.91(d,j＝7.6hz,2h),1.79–1.73(m,2h),1.65–1.58(m,2h),1.23(s,3h),1.09(s,3h),0.91(s,3h).

式(15)所示三環(huán)二萜類似物即化合物15，白色固體(68.0％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.13(s,1h),7.96(s,1h),7.49(d,j＝3.6hz,1h),6.99(d,j＝3.2hz,1h),6.88(s,1h),4.04(s,3h),3.33(dd,j＝11.2,4.8hz,1h),3.00(dd,j＝16.8,6.0hz,1h),2.89–2.80(m,1h),2.33-2.28(m,1h),1.96–1.85(m,2h),1.83–1.72(m,2h),1.70–1.61(m,3h),1.23(s,3h),1.09(s,3h),0.91(s,3h).

式(16)所示三環(huán)二萜類似物即化合物16，白色固體(76.9％)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.26(s,1h),8.27(s,1h),8.16(d,j＝5.2hz,1h),7.93(s,1h),6.86(d,j＝5.6hz,2h),4.00(s,3h),3.32(d,j＝8.8hz,1h),3.03–2.97(m,1h),2.89–2.80(m,1h),2.38(s,3h),2.30(d,j＝12.8hz,1h),1.96–1.90(m,1h),1.88–1.85(m,1h),1.83–1.78(m,1h),1.76–1.70(m,1h),1.62(m,1h),1.50(s,1h),1.33(dd,j＝12.6,2.0hz,1h),1.23(s,3h),1.09(s,3h),0.91(s,3h).

式(17)所示三環(huán)二萜類似物即化合物17，白色固體(46.3％)；¹hnmr(400mhz,dmso)δ6.86(s,1h),6.81(s,1h),4.46(s,1h),3.75(s,3h),3.67(s,1h),3.23(s,2h),3.08-3.02(m,2h),2.82(dd,j＝16.8,5.6hz,1h),2.72–2.65(m,3h),2.54(s,1h),2.39(s,3h),2.37(s,3h),2.32(d,j＝12.8hz,1h),1.82–1.77(m,1h),1.66(s,2h),1.39(s,1h),1.20(t,j＝7.6hz,3h),1.14(s,3h),0.98(s,3h),0.79(s,3h).

實施例3：三環(huán)二萜類似物抗前列腺癌細胞增殖測試

采用srb法對3株前列腺癌細胞(du145、lncap、22rv1)進行抑制增殖活性測試。

(1)測試原理

srb(磺酰羅丹明b)是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在515nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細胞量成良好線性正相關(guān)，可用作細胞數(shù)的定量檢測。

(2)樣品測試

(1)待測化合物用dmso溶劑溶解到20mm作為母液保存。(2)腫瘤細胞以適當?shù)拿芏冉臃N到96孔板上，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，細胞加入不同濃度梯度的待測化合物處理48小時。其中，藥物組分別用不同濃度梯度的本發(fā)明中三環(huán)二萜衍生物，對照組用相同對應(yīng)濃度的dmso培養(yǎng)液，并使最終的dmso濃度不超過0.4％。(3)化合物處理細胞48小時后，取出培養(yǎng)板，加入50％tca溶液25μl/孔，4℃固定1小時，用水洗滌5遍，風干。(4)加入0.4％srb溶液50μl/孔，染色10分鐘，棄去染色液，1％冰醋酸洗滌5遍，風干。(5)用100μltris-base堿液(10mm)溶解與細胞蛋白結(jié)合的srb染料，采用酶標儀在515nm波長下測定吸光值。(6)用graphpad軟件計算ic50，實驗重復(fù)三次，ic50取其平均值。

(3)測試結(jié)果

表1為各測試化合物對不同前列腺癌細胞株(du145不表達ar，lncap表達全長ar，22rv1表達全長ar和截短型ar)抑制細胞增殖方面活性數(shù)據(jù)(ic50)值見表1(48h)。測試結(jié)果表明，本發(fā)明三環(huán)二萜類似物均能較好地抑制前列腺癌細胞增殖，ic50數(shù)據(jù)表明苯并雜環(huán)胺有利于抗前列腺癌增殖活性的提高(例如化合物5、8、9、10、12和17等)，本發(fā)明一系列式(i)三環(huán)二萜類似物對抑制雄激素受體陽性的前列腺癌細胞(lncap、22rv1)增殖均有較好效果。如表1所示，大多數(shù)三環(huán)二萜類似物均能在較低濃度下抑制雄激素受體陽性的前列腺癌細胞(lncap、22rv1)增殖，尤其是化合物5、8、9、10、12和17的抑制效果最佳。與不表達雄激素受體蛋白的前列腺癌細胞株du145相比，有數(shù)量級的差異。

表1三環(huán)二萜衍生物對前列腺癌細胞株的抗增殖活性(ic50)

實施例4：三環(huán)二萜類似物對ar全長和ar截短體轉(zhuǎn)錄活性測試

采用luciferase法對ic50較好的化合物5、8、9、10、12和17對ar全長和ar截短體的轉(zhuǎn)錄活性進行測試。

(1)測試原理

對于ar全長轉(zhuǎn)錄活性的測試，其原理為：arr2-luci質(zhì)粒的啟動子是能夠和ar蛋白結(jié)合，并受到ar調(diào)控的dna區(qū)段。當質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入lncap細胞并作饑餓處理后，10nm的r1881能刺激ar蛋白轉(zhuǎn)錄活性，促使arr2-luciferase下游luciferase的表達，并經(jīng)由dual-luciferasereporterassay檢測試劑盒進行檢測，讀值多少可表征下游基因的表達量。待測化合物和r1881同時處理細胞再測luciferase值，即可檢測出待測化合物是否抑制ar轉(zhuǎn)錄活性及其抑制強度。

對于ar截短體轉(zhuǎn)錄活性的測試，其原理為：在本身不表達ar的pc3細胞中同時轉(zhuǎn)入ar截短體質(zhì)粒(ar-v7或ar-v^567es)和arr2-luciferase。表達出來的ar截短體蛋白能夠和arr2-luciferase結(jié)合，促使arr2-luciferase下游luciferase的表達，并經(jīng)由luciferase檢測試劑盒進行檢測，讀值多少可表征下游基因的表達量。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后同時加以待測化合物處理后的luciferase讀值即可反映待測化合物是否抑制ar轉(zhuǎn)錄活性及其抑制強度。

(2)樣品測試

對于ar全長轉(zhuǎn)錄活性的測試，其步驟為：在24孔板中接入適量lncap細胞，細胞貼壁生長24小時后，將arr2-luci質(zhì)粒和renilla質(zhì)粒以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染入細胞。6h后將替換培養(yǎng)基，加入含有待測試藥物和10nmr1881的去酚紅和含5％活性炭過濾血清的培養(yǎng)基。處理16小時后用裂解細胞，按照dual-luciferasereporterassay試劑盒說明，用lumistaroptima化學發(fā)光多功能酶標儀測定luciferase和renilla讀值，并進行數(shù)據(jù)換算和分析。

對于ar截短體轉(zhuǎn)錄活性的測試，其步驟為：在24孔板中接入適量pc3細胞，細胞貼壁生長24小時后，將ar截短體質(zhì)粒(ar-v7或ar-v^567es)、arr2-luciferase質(zhì)粒和renilla質(zhì)粒以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染入細胞。6h后將替換培養(yǎng)基，加入含有待測試藥物的去酚紅和含5％活性炭過濾血清的培養(yǎng)基。處理16小時后用裂解細胞，按照dual-luciferasereporterassay試劑盒說明，用lumistaroptima化學發(fā)光多功能酶標儀測定luciferase和renilla讀值，并進行數(shù)據(jù)換算和分析。

(3)測試結(jié)果

ar全長轉(zhuǎn)錄活性的測試結(jié)果如表2所示?？梢姳景l(fā)明所述化合物5、8、9、10、12和17在1um時ar全長轉(zhuǎn)錄活性均有明顯抑制作用，其中化合物17的抑制率達到40.1％，優(yōu)于陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100。ar-v7轉(zhuǎn)錄活性的測試結(jié)果如表3所示，可見本發(fā)明所述化合物5、8、9、10、12和17在10um時均對表達ar-v7的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用，其中化合物10達到64.5％，優(yōu)于陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100。ar-v^567es轉(zhuǎn)錄活性的測試結(jié)果如表4所示?？梢姳景l(fā)明所述化合物5、8、9、10、12和17在10um時，對ar-v^567es的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用，其中化合物10達到77.2％，優(yōu)于陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100。因此，表3和表4的實驗結(jié)果表明，化合物5、8、9、10、12和17對ar-vs(ar-v7和ar-v^567es)均有轉(zhuǎn)錄抑制活性。

綜上，根據(jù)表1、2、3和4的結(jié)果，化合物10對ar-fl、ar-v7、ar-v^567es的抑制率分別為42％、64.5％和77.2％，本發(fā)明以化合物10作為最優(yōu)候選化合物。

表2.化合物對ar-fl的轉(zhuǎn)錄活性抑制(16h)

表3.化合物對ar-v7剪切體的轉(zhuǎn)錄活性的抑制(16h)

表4.化合物對ar-v^567es剪切體的轉(zhuǎn)錄活性的抑制(16h)

實施例5：化合物10抑制ar-v7和ar-v^567es的轉(zhuǎn)錄活性測試

1、測試原理與樣品測試方法同實施例4中ar截短體轉(zhuǎn)錄活性的測試的測試原理與樣品測試方法。

2、測試結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，陰性對照mdv3100對ar-v7和ar-v^567es的轉(zhuǎn)錄活性幾乎沒有抑制作用，化合物10分別對ar-v7和ar-v^567es均有良好的轉(zhuǎn)錄活性抑制效果，半數(shù)抑制濃度ic50分別為7.502um和8.813um，在10um時的抑制效果優(yōu)于同濃度的陽性對照epi-001。

實施例6：化合物10抑制lncap細胞和vcap細胞的克隆形成測試

采用體外克隆形成實驗的方法測試化合物10分別對表達ar全長的lncap細胞和表達ar截短體的vcap細胞克隆形成能力的影響。

1、測試原理

細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

2、樣品測試

(1)消化處理處于對數(shù)生長期的相應(yīng)細胞，并進行計數(shù)，每孔2x10³個細胞接種于六孔板中，確保接種的細胞分布均勻。(2)待細胞貼壁后換液，加入含有不同濃度(0，1，2，5，10μm)測試化合物的完全培養(yǎng)基。(3)培養(yǎng)一周后，用吸泵吸掉原來的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗3次，用多聚甲醛溶液對細胞進行固定處理(20min)，然后2‰結(jié)晶紫染液將細胞染色5min，最后用緩慢流動的自來水輕輕清洗，以洗掉未結(jié)合的結(jié)晶紫染液，室溫自然干燥。(4)顯微鏡下拍照，計算細胞克隆形成數(shù)量

3、測試結(jié)果

實驗結(jié)果如圖3所示，圖3表明化合物10能夠在體外實驗中以劑量依賴性的方式抑制表達ar全長的lncap(ar-fl)細胞和表達ar截短體的vcap(ar-fl和ar-vs)細胞的克隆形成數(shù)量和克隆形成大小。在5μm的濃度下，與10μm的陽性對照epi-001和陰性對照mdv3100相比，化合物10明顯具有更好的克隆形成抑制能力。

目前，mdv3100和阿比特龍的耐藥主要是因為治療過程中產(chǎn)生了ar-vs剪切變異體的前列腺癌細胞。本發(fā)明實驗表明，式(i)三環(huán)二萜類似物均有抗前列腺癌的活性，特別是化合物10是一種對表達ar全長或同時表達ar全長和ar-vs剪切變異體的前列腺癌細胞均有很好的抑制效果，能克服現(xiàn)有一線藥物mdv3100和阿比特龍的耐藥性，有望成為治療去勢抵抗性前列腺癌的潛在藥物，具有良好的開發(fā)前景。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例，在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。