本發(fā)明涉及一種潑尼松的制備方法，是通過生物發(fā)酵進行1，2位脫氫和21醋酸酯水解反應，從醋酸可的松一步制備潑尼松。
背景技術：
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潑尼松一種常見的皮質激素，既可以作為皮質激素治療藥物，也可以作為其他皮質激素藥物的原料，具有廣泛的應用價值，十分重要。國內外對于該產(chǎn)品的制備研究持續(xù)不斷。
國內生產(chǎn)潑尼松常用的起始原料為來源于雙烯的霉菌氧化物，開環(huán)脫溴后，先經(jīng)過C11位氧化后再經(jīng)過C1、2位脫氫，之后再在側鏈進行修飾得到21位酯化。此工藝的難點在于C11位羰基和C1、2位雙鍵的引入，由于在C11位周圍，沒有活性功能基團對其起影響，常規(guī)條件下很難將C11位羥基氧化成C11位羰基；而且沃式氧化物經(jīng)過C11位氧化后，下一步的C1、2位脫氫很難進行，存在著收率低、成本高的問題。
還有其他的合成路線，如專利CN201210070704.7(一種潑尼松的制備方法)以霉菌氧化物(I)為起始原料制備潑尼松，霉菌氧化物經(jīng)過普氏氧化反應得到普氏物(II)；b)普氏物(II)經(jīng)上溴反應得到上溴物(III)；c)上溴物(III)經(jīng)脫溴反應得到脫溴物(IV)；d)脫溴物(IV)經(jīng)21位上碘反應、置換得到醋酸可的松。如果希望得到潑尼松，則需要進一步進行1,2位生物脫氫和相應的水解反應。但問題依然在于在于當普氏氧化如果早于生物脫氫，就會使得1,2位脫氫很難進行。
或是以孕甾-4-烯-11，17-雙羥基-3,20-雙酮為原料進行1,2位脫氫-21位鹵代置換-普氏氧化-水解得到潑尼松。而該路線的問題在于，將11位氧化放在1,2脫氫或 是21位鹵代置換之后，則會造成氧化反應對于1,，2位雙鍵或是21位醋酸酯基團的直接破壞，從而增加雜質。
潑尼松的結構是在孕甾母核上具有1位和4位雙鍵、11位酮基、21位醋酸酯、17位羥基多個基團，而醋酸可的松通過1，2位脫氫和21位水解兩個單元反應形成1，2位雙鍵和21位羥基。常見的制備方法，是通過生物法得出1，2位雙鍵，如江蘇遠大仙樂藥業(yè)有限公司申請的發(fā)明CN201510076695.6；再通過堿水解得到21位羥基，如天津天藥藥業(yè)股份有限公司申請的CN200510016229.5發(fā)明。而通常認為直接用醋酸可的松作起始原料，進行C1、2位的生物發(fā)酵，得到醋酸潑尼松，此工藝的缺點在于生物發(fā)酵的收率低，導致成本高。
事實上，1，4雙鍵、11酮、21-醋酸酯是目前抗炎甾體激素的常用基本結構。制備具有上述基團的化合物既可以成為供臨床使用的藥物，也可以成為制備甾體藥物的中間體。由于上世紀五十年代以來，科學家對上述基團合成方法反復摸索，已經(jīng)形成了成熟的制備工藝，以起始物，通過生物脫氫制備1,2位雙鍵，再通過三氧化鉻、醋酸進行氧化，得到11位酮基，最后通過對21位進行碘化，再置換得出式1化合物，這條工藝路線經(jīng)過數(shù)代人的摸索，被認為是最為合理的制備路線，已經(jīng)形成了行業(yè)的共識。近年來科研人員努力地方向更多的是對于單步工藝進行革新和改良，但是囿于傳統(tǒng)經(jīng)驗思維，目前還沒有開展工藝路線的調整。
技術實現(xiàn)要素：
為了提高收率，實驗人員通過不斷地研究，在研究中驚奇的發(fā)現(xiàn)在以醋酸可的松為原料，通過采用簡單節(jié)桿菌Arthrobacter Simple ATCC 21032經(jīng)過生物發(fā)酵可以一步直接生成潑尼松。
一種在以醋酸可的松為原料，通過采用簡單節(jié)桿菌Arthrobacter Simple ATCC 21032經(jīng)過生物發(fā)酵一步直接生成潑尼松的制備方法。
上述的制備方法，其特征是將醋酸可的松粉碎或以溶劑溶解，投入已培養(yǎng)好節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進行生物轉化，轉化后提取得到潑尼松。
上述的制備方法，其特征是所述溶解底物的溶劑選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)、DMF中的一種或幾種，溶解倍數(shù)優(yōu)選常溫下能將底物溶解的最小倍數(shù)。
上述的制備方法，其特征是：所述的底物優(yōu)選微粉化為D90≤40μm的微粒。
上述的制備方法，其特征是作為底物的化合物(1)的投料濃度為≤4％。
上述的制備方法，其特征是作為底物的醋酸可的松的投料濃度優(yōu)選1％～3％，發(fā)酵溫度為29℃～32℃，反應時間為36～72小時。
上述的生物脫氫方法，其特征是所述的生物脫氫反應可以采用以下發(fā)酵工藝。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至 pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基采用以下％配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來水配制，用無機堿溶液調至pH至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米漿1％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：蛋白陳0.4％，葡萄糖0.6％，玉米漿0.6％，磷酸二氫鉀0.07％，磷酸氫二鉀0.05％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的無機堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀中的一種或幾種。
如權利要求8-11所述的制備方法，其特征是所述方法采用的無機堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或幾種。
上述的制備方法，其特征是所述方法在采用粉碎醋酸可的松投料前向發(fā)酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶劑。上述的制備方法，其特征是所述的促溶劑為優(yōu)選吐溫-80。
將醋酸可的松粉碎或以溶劑全溶或半溶，投入已培養(yǎng)好簡單節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進行生物脫氫反應，轉化后提取得到潑尼松。所述溶劑選自但不僅限于甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的一種或幾種，所述粉碎投料的醋酸可的松優(yōu)選微粉化為D90(90％通過粒徑)≤40μm的微粒。優(yōu)選粉碎醋酸可的松投料前向發(fā)酵液中加入1～3％(v/v)促溶劑，所述的促溶劑為優(yōu)選吐溫-80。
醋酸可的松的投料濃度為≤4％(相對于發(fā)酵液容積)；優(yōu)選投料濃度為1％～3％，發(fā)酵溫度31±1℃，生物反應時間36～72小時。生物反應結束后終止反應，優(yōu)選采用將發(fā)酵液升溫至70～90℃而使菌體滅活的方法，終止反應后用優(yōu)選采用溶媒萃取發(fā)酵液的形式提取產(chǎn)物。所述萃取用溶媒優(yōu)選乙酸乙酯。
所述生物反應所使用簡單節(jié)桿菌(拉丁命名：Arthrobacter simplexArthrobacter Simple ATCC 21032。
以下幾種菌株：AS 1.754、AS 1.94*均由中國科學院微生物研究所提供。
所述的生物脫氫反應可以采用以下發(fā)酵工藝：
所述的生物發(fā)酵工藝還可采用任何公知的生物發(fā)酵工藝方法，如參考《生物合成藥物學》(化學工業(yè)出版社，2000年出版，褚志義主編；666～675頁)中公開的生物發(fā)酵工藝。
所述的生物脫氫所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比：
斜面培養(yǎng)基1采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
斜面培養(yǎng)基2采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來水配制，用無機堿溶液調至pH至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
發(fā)酵培養(yǎng)基1為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米漿0.1％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
發(fā)酵培養(yǎng)基2為以下配比：蛋白陳0.4％，葡萄糖0.6％，玉米漿0.6％，磷酸二氫鉀0.07％，磷酸氫二鉀0.05％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
實施例
底物轉化率的測定：轉化率用反應過程中轉化為產(chǎn)物的底物質量占初始底物總質量的百分比來表示。采用HPLC測定，分離柱為C18柱，檢測波長為240nm，流動相是乙腈：水(體積比)＝60：40的溶于流速為1.5mL/min。采用面積歸一法計算底物轉化率。
斜面培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基分裝于20×200mm的試管中，滅菌30min后擺成斜面。斜面于37℃培養(yǎng)箱中放置2d，觀察無染菌情況即可進行接種。接種后斜面于30℃下培養(yǎng)2d，然后置于4℃冰箱中保存。
一級培養(yǎng)：從生長良好的簡單節(jié)桿菌斜面上取菌體，接入裝有30ml培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30～34℃，180r/min振蕩培養(yǎng)，24小時
二級培養(yǎng)：將完成一級培養(yǎng)后的發(fā)酵液以5％～10％接種量接入裝有150ml培養(yǎng)基的1000mL二級種子培養(yǎng)三角瓶中，以同樣的條件進行二級培養(yǎng)， 二級培養(yǎng)時間為24小時
生物脫氫和水解：與二級培養(yǎng)相同的接種量接入5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度29～32℃，攪拌轉速150r/min，通氣量2.0L/min，培養(yǎng)24小時后加入底物進行生物脫氫反應。
斜面培養(yǎng)基1采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
斜面培養(yǎng)基2采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來水配制，用無機堿溶液調至pH至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
發(fā)酵培養(yǎng)基1為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米漿1％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
發(fā)酵培養(yǎng)基2為以下配比：蛋白陳0.4％，葡萄糖0.6％，玉米漿0.6％，磷酸二氫鉀0.07％，磷酸氫二鉀0.05％，以及余量的蒸餾水，用無機堿溶液調至pH 7.0-7.2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物反應中。
DMF：N，N-二甲基甲酰胺。
實施例1：
將簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter Simple ATCC 21032)依次進行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機溶劑的醋酸可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應溫度為31±1℃。反應時間見下表，反應完成后升溫至70℃終止反應，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機相濃縮，測得潑尼松轉化率。
實施例2：
具體制備方法培養(yǎng)基、投料濃度均同實施例1，僅是在醋酸可的松投入前在發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中加入吐溫80。
對照實施例1：
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機溶劑的醋酸可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應溫度為31±1℃。反應時間見下表，反應完成后升溫至70℃終止反應，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機相濃縮，測得潑尼松轉化率。
對照實施例2：
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機溶劑的醋酸可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應溫度為31±1℃。反應時間見下表，反應完成后升溫至70℃終止反應，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機相濃縮，測得潑尼松轉化率。
經(jīng)檢測，對照實施例得到的基本上是醋酸潑尼松(大于70％)和極少量的醋酸可的松，而潑尼松極少。