本發(fā)明屬于代謝工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種鏈霉菌抗生素生物合成基因簇多拷貝擴(kuò)增方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微生物產(chǎn)生的具有生物活性的天然產(chǎn)物(又稱次級(jí)代謝產(chǎn)物)，是人類抵抗癌癥、衰老和感染性疾病等的寶貴財(cái)富。以抗生素為例，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已報(bào)道的天然來源的抗生素中，有50％左右是由放線菌科的鏈霉菌產(chǎn)生的?？股厣锖铣苫虼匕私Y(jié)構(gòu)、抗性、外排、調(diào)控與后修飾等基因，基因簇大小一般在20-150kb不等。伴隨著代謝工程的迅速發(fā)展，通過設(shè)計(jì)提高抗生素產(chǎn)量的策略被開發(fā)與應(yīng)用，包括優(yōu)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減少競爭途徑、提高耐受性、增加前體供給等。這些策略避免了傳統(tǒng)誘變篩選時(shí)所需大量的時(shí)間與人力成本，可有效優(yōu)化次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。

鏈霉菌屬于放線菌目的鏈霉菌科，為一種原核生物，其是放線菌的典型代表，屬于好氧菌。其廣泛分布于含水量較低、通氣良好、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中，在淡水、海水及淤泥中也有分布。

始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)是一種在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以生產(chǎn)原始霉素(Pristinamycin)的鏈霉菌。

盡管鏈霉菌現(xiàn)在已被較多地應(yīng)用于生產(chǎn)抗生素，但是鑒于其代謝機(jī)制復(fù)雜，生產(chǎn)過程中不確定因素較多，本領(lǐng)域仍然需要進(jìn)一步地開發(fā)優(yōu)化其生物合成抗生素的代謝途徑、優(yōu)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等的技術(shù)，以期進(jìn)一步地提高其生物合成抗生素的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉菌抗生素生物合成基因簇多拷貝擴(kuò)增方法及應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種使鏈霉菌基因組中整合入多拷貝目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的方法，所述方法包括：

(1)在鏈霉菌基因組中引入至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)，獲得攜帶有外源attB位點(diǎn)的鏈霉菌；

(2)通過接合轉(zhuǎn)移的方法，將目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇引入到步驟(1)的鏈霉菌中，選擇目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇整合到鏈霉菌基因組內(nèi)源attB位點(diǎn)以及外源attB位點(diǎn)的鏈霉菌，從而獲得整合入多拷貝基因或基因簇的鏈霉菌。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)為1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)；較佳地為2個(gè)外源的attB位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述的1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)引入到鏈霉菌基因組中選自以下的1-2個(gè)位置：

鏈霉菌基因組中I型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 1,BGC1)所在位置，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇；較佳地，相應(yīng)于始旋鏈霉菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，所述的I型聚酮生物合成基因簇位于第4050261-4072243位的位點(diǎn)。

鏈霉菌基因組中非核糖體肽生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 2,BGC2)所在位置，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇；較佳地，相應(yīng)于始旋鏈霉菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，所述的非核糖體肽生物合成基因簇位于第1106415-1130923位的位點(diǎn)；或

鏈霉菌基因組中III型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 3,BGC3)所在位置，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇；較佳地，相應(yīng)于始旋鏈霉菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，所述的非核糖體肽生物合成基因簇位于第686202-696578位的位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌包括(但不限于)：始旋鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌、玫瑰孢鏈霉菌或吸水鏈霉菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌是缺失papR5基因且包含papR4和papR6基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌的基因組中存在1個(gè)內(nèi)源attB位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇包括(但不限于)：原始霉素組份II(PII)合成基因簇，原始霉素I(PI)合成基因簇，達(dá)托霉素合成基因簇或雷帕霉素合成基因簇。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇引入到步驟(1)的鏈霉菌中的方法包括：將攜帶外源基因或基因簇的質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入到步驟(1)的鏈霉菌中。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種鏈霉菌基因工程菌，該基因工程菌的基因組中包括至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)，1個(gè)內(nèi)源的內(nèi)源attB位點(diǎn)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)為1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)；較佳地為2個(gè)外源的attB位點(diǎn)。

在另一優(yōu)選例中，所述的1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)引入到鏈霉菌基因組中選自以下的1-2個(gè)位置：

鏈霉菌基因組中I型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 1,BGC1)所在位置，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇；

鏈霉菌基因組中非核糖體肽生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 2,BGC2)所在位置，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇。

鏈霉菌基因組中III型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 3,BGC3)所在位置，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇。(較佳地，相應(yīng)于始旋鏈霉菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，所述的非核糖體肽生物合成基因簇位于第686202-696578位的位點(diǎn)。)

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的鏈霉菌基因工程菌的用途，用于制備攜帶多拷貝外源基因或基因簇的鏈霉菌基因工程菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的多拷貝外源基因或基因簇為2-3拷貝。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因組中整合有多拷貝目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的鏈霉菌基因工程菌，該基因工程菌的基因組中至多包括3個(gè)拷貝的目標(biāo)基因簇，且位于以下位置中的之多3個(gè)位置：

鏈霉菌基因組中內(nèi)源attB位點(diǎn)所在位置，并取代該位置原有的attB位點(diǎn)；較佳地，相應(yīng)于始旋鏈霉菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，所述的內(nèi)源attB位點(diǎn)位于第4303498-4303477位的位點(diǎn)。

鏈霉菌基因組中I型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 1,BGC1)所在位置，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中非核糖體肽生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 2,BGC2)所在位置，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中III型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 3,BGC3)所在位置，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇。

在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇包括(但不限于)：原始霉素組份II(PII)合成基因簇，原始霉素I(PI)合成基因簇，達(dá)托霉素合成基因簇或雷帕霉素合成基因簇等。

在一個(gè)優(yōu)選例中，提供一種利用鏈霉菌高效表達(dá)目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的方法，所述的方法包括：

(a)以所述的方法制備鏈霉菌，使鏈霉菌基因組中整合入多拷貝目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇；

(b)培養(yǎng)步驟(a)獲得的鏈霉菌，從而高效表達(dá)目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇。

在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中，還在鏈霉菌的培養(yǎng)液中加入大孔吸附樹脂；較佳地，加入1-12％(w/v)；更佳地3-8％的大孔吸附樹脂。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、基因簇多拷貝擴(kuò)增策略示意圖。在利用CRISPR\Cas9系統(tǒng)敲除其他非目標(biāo)基因簇時(shí)，直接原位引入一個(gè)attB位點(diǎn)；通過接合轉(zhuǎn)移方式將BAC-F1F15(含有PII合成基因簇)導(dǎo)入改造后的菌株中，可分別獲得增加一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)拷貝的工程菌。

圖2、不同PII合成基因簇拷貝數(shù)目引入的效率對(duì)比。

(A)同時(shí)引入PII合成基因簇兩個(gè)拷貝的效率。

(B)同時(shí)引入PII合成基因簇三個(gè)拷貝的效率。M代表DNA marker，C代表對(duì)照菌株ΔpapR5+R4R6(命名為SBJ1000)。

圖3、不同PII合成基因簇拷貝數(shù)引入后獲得的工程菌的PII(Pristinamycin II_A)產(chǎn)量對(duì)比。

圖4、工程菌SBJ1003(包含外源引入的三個(gè)PII合成基因簇拷貝)在添加6％的大孔吸附樹脂HB60后的PII產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

在利用鏈霉菌進(jìn)行目標(biāo)基因簇相關(guān)的生物合成研究過程中，為了獲得更為干凈的代謝譜，本發(fā)明人在鏈霉菌中刪減一些與目標(biāo)基因簇不相關(guān)的基因簇，該過程中發(fā)現(xiàn)，刪減一些非目標(biāo)基因簇的同時(shí)，直接在相應(yīng)的位置再引入attB位點(diǎn)，通過進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，可實(shí)現(xiàn)外源目標(biāo)基因簇的一次性多拷貝插入，進(jìn)一步優(yōu)化目標(biāo)基因簇相關(guān)的生物合成。

如本文所用，術(shù)語“位點(diǎn)特異性重組”是一類依賴于小范圍同源序列聯(lián)會(huì)的同源重組方式，需要借助整合酶(如phiC31)與特異性重組位點(diǎn)(如attB/attP)的參與，最終將外源質(zhì)粒整合至基因組中。

如本文所用，術(shù)語“引入”或“轉(zhuǎn)化”是指將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞(本發(fā)明中為鏈霉菌)?？蛇x地，外源多核苷酸可以整合進(jìn)入宿主基因組。

如本文所用，“外源的”或“異源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物體(本發(fā)明中為鏈霉菌)基因組中的基因或蛋白。

本發(fā)明提供了一種使鏈霉菌基因組中整合入多拷貝目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的方法，所述方法包括：(1)在鏈霉菌基因組中引入至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)，獲得攜帶有外源attB位點(diǎn)的鏈霉菌；和(2)通過接合轉(zhuǎn)移的方法，將目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇引入到步驟(1)的鏈霉菌中，選擇目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇整合到鏈霉菌基因組內(nèi)源attB位點(diǎn)以及外源attB位點(diǎn)的鏈霉菌，從而獲得整合入多拷貝基因或基因簇的鏈霉菌。

在鏈霉菌基因組中引入至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)，較佳地為引入2個(gè)外源的attB位點(diǎn)。由于鏈霉菌基因組中通常內(nèi)源存在1個(gè)attB位點(diǎn)，從而可引入至少2個(gè)拷貝的外源目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇；較佳地為引入3個(gè)拷貝的外源目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇。

本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，引入的拷貝數(shù)并非越多越好，當(dāng)利用4個(gè)attB位點(diǎn)引入外源目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇時(shí)，由于整合酶在多處發(fā)生切割而導(dǎo)致菌體死亡，引入后獲得目的菌株的效率并不高。

含有目標(biāo)基因或基因簇的質(zhì)粒上存在1個(gè)attP位點(diǎn)，在接合轉(zhuǎn)移后，其與attB共同作用，從而可實(shí)現(xiàn)外源基因或外源基因簇的定點(diǎn)引入。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在引入attB位點(diǎn)的同時(shí)，還在特定的位置上刪減與目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的生物合成不相關(guān)的其他基因簇，從而減少前體競爭，獲得更為干凈的代謝譜。

刪減特定的基因簇以及引入attB基因簇可以采用本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來篩減不相關(guān)的基因簇。目前，現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)有一些用于實(shí)現(xiàn)基于CRISPR/Cas9原理進(jìn)行鏈霉菌基因編輯的質(zhì)粒，例如pKCcas9dO。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的鏈霉菌是始旋鏈霉菌，引入1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)，并且引入到鏈霉菌基因組中選自以下的1-2個(gè)位置：

鏈霉菌基因組中4050261-4072243位點(diǎn)，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇(BGC1)；或

鏈霉菌基因組中1106415-1130923位點(diǎn)，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇(BGC2)；或

鏈霉菌基因組中第686202-696578位的位點(diǎn)，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇(BGC3)。

更為優(yōu)選地，所述的始旋鏈霉菌是缺失papR5基因且同時(shí)過表達(dá)papR4與papR6基因的鏈霉菌。缺失papR5或過表達(dá)papR4與papR6均可有效提高PII產(chǎn)量，并且獲得調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加松弛的底盤菌。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇為：原始霉素組份II(PII)合成基因簇。為了使得PII能夠被高效地表達(dá)，在引入外源attB的同時(shí)，本發(fā)明人還刪減與原始霉素合成不相關(guān)的、在基因簇合成次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)與原始霉素合成競爭乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A或氨基酸前體的基因簇。

本發(fā)明還提供了應(yīng)用前述方法制備的鏈霉菌基因工程菌，該基因工程菌的基因組中包括至少1個(gè)外源的attB位點(diǎn)，1個(gè)內(nèi)源的內(nèi)源attB位點(diǎn)。較佳地，所述的至少含有1個(gè)外源的attB位點(diǎn)；較佳地為2個(gè)外源的attB位點(diǎn)。更佳地，所述的1-2個(gè)外源的attB位點(diǎn)引入到鏈霉菌基因組中選自以下的1-2個(gè)位置：

鏈霉菌基因組中I型聚酮生物合成基因簇所在位置，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中非核糖體肽生物合成基因簇所在位置，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中III型聚酮生物合成基因簇所在位置，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇。

本發(fā)明還提供了一種基因組中整合有多拷貝目標(biāo)基因或目標(biāo)基因簇的鏈霉菌基因工程菌，該基因工程菌的基因組中至多包括3個(gè)拷貝的目標(biāo)基因簇，且位于：

鏈霉菌基因組中內(nèi)源attB位點(diǎn)所在位置，并取代該位置原有的attB位點(diǎn)；

鏈霉菌基因組中I型聚酮生物合成基因簇所在位置，并取代該位置的原I型聚酮生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中非核糖體肽生物合成基因簇所在位置，并取代該位置的原非核糖體肽生物合成基因簇；或

鏈霉菌基因組中III型聚酮生物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster 3,BGC3)所在位置，并取代該位置的原III型聚酮生物合成基因簇。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，本發(fā)明人在刪除其他非目標(biāo)基因簇的同時(shí)引入了多個(gè)attB位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因簇的多拷貝擴(kuò)增。以PII合成基因簇為例，在始旋鏈霉菌(ΔpapR5+R4R6)中外源導(dǎo)入一個(gè)PII合成基因簇，可將PII產(chǎn)量提高1.5倍。為檢測繼續(xù)增加拷貝數(shù)目時(shí)是否可進(jìn)一步提高PII產(chǎn)量，本發(fā)明人在刪除其他與原始霉素合成不相關(guān)基因簇的同時(shí)，在相同位置引入了一個(gè)attB位點(diǎn)，從而增加了基因組中attB數(shù)目，以實(shí)現(xiàn)更多PII合成基因簇拷貝數(shù)的插入。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)與三個(gè)拷貝的同時(shí)引入的效率分別為100％與10％，證實(shí)了多個(gè)attB位點(diǎn)可利用位點(diǎn)特異性重組方式有效介導(dǎo)目標(biāo)基因簇的擴(kuò)增。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在獲得了上述鏈霉菌基因工程菌后，在進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，還在鏈霉菌的培養(yǎng)液中加入大孔吸附樹脂；較佳地，加入1-12％(w/v)；更佳地3-8％的大孔吸附樹脂。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，以始旋鏈霉菌(ΔpapR5+R4R6)(SBJ1000)為底盤菌，分別增加一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)拷貝后的工程菌SBJ1001、SBJ1002與SBJ1003的PII產(chǎn)量分別達(dá)到了468、508與720mg/L，產(chǎn)量提升顯著。通過添加大孔吸附樹脂以減弱原始霉素對(duì)自身的反饋抑制效應(yīng)與對(duì)菌體生長的毒性效應(yīng)，SBJ1003的PII產(chǎn)量達(dá)到1.75g/L，相對(duì)底盤菌提升極其顯著。

本發(fā)明的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)的基因簇多拷貝擴(kuò)增的方法，可廣泛用于各種放線菌的遺傳改造，為提高重要微生物天然產(chǎn)物的發(fā)酵水平奠定了良好基礎(chǔ)。

本發(fā)明的方法在刪減其他基因簇的同時(shí)，引入多個(gè)attB，借助位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，一次實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因簇多拷貝擴(kuò)增，大幅提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。由于引入的目標(biāo)基因簇成離散分布，相對(duì)利用ZouA-RsA/B系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的基因簇串聯(lián)擴(kuò)增，不僅操作簡單有效，而且工程菌的遺傳穩(wěn)定性更好，可廣泛用于其他工業(yè)放線菌進(jìn)行遺傳改造。

由于目標(biāo)基因簇引入后成離散分布，不易發(fā)生同源重組，本發(fā)明的方法獲得的鏈霉菌基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性很好。因此，本發(fā)明的方法的建立為放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量優(yōu)化提供了一種穩(wěn)健、普適的改造策略，在減弱競爭途徑時(shí)利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因簇拷貝數(shù)的擴(kuò)增，從而獲得遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明使用的菌株、質(zhì)粒與試劑：

本發(fā)明涉及始旋鏈霉菌Streptomyces pristinaespiralisΔpapR5+R4R6(命名為SBJ1000)為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，構(gòu)建方法參見Li et al.,Metabolic Engineering,2015。

E.coli S17-1(用于接合轉(zhuǎn)移)：購自Biomedal Life Science公司。

HCCB10218于2011年11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC NO.5486。

本發(fā)明中所使用到的質(zhì)粒pKCcas9dO，構(gòu)建方法參見Huang et al.,Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015。

本發(fā)明中所使用到的質(zhì)粒BAC-F1F15(含有PII合成基因簇)，其中含有大腸桿菌的細(xì)菌染色體(BAC)復(fù)制單元，阿普拉霉素抗性基因aac(3)IV表達(dá)盒，phiC31整合酶表達(dá)盒、整合位點(diǎn)attP以及與接合轉(zhuǎn)移相關(guān)的oriT(RK2)位點(diǎn)。構(gòu)建方法參見Lei Li et al.,Metabolic Engineering,2015。

DNA膠回收純化以及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。

E.Z.N.A.BAC/PAC DNA Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司。

KOD plus new購自TOYOBO公司。

大孔吸附樹脂HB60為上海旻永實(shí)業(yè)有限公司購買。

其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

本發(fā)明使用的培養(yǎng)基：

1.液體LB培養(yǎng)基(1L)

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，121℃滅菌20分鐘。

2.固體LB培養(yǎng)基(1L)

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉20g；121℃滅菌20分鐘。

3.固體RP培養(yǎng)基配方(1L)

可溶性淀粉20g，黃豆餅粉10g，NaCl 2g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 1g，CaCO₃ 3g，瓊脂粉20g，調(diào)pH 6.4，121℃滅菌20分鐘。

4、種子培養(yǎng)基(1L)

可溶性淀粉15g，葡萄糖10g，黃豆餅粉15g，酵母粉5g，KNO₃ 2.5g，NaCl 2g，CaCO₃4g，調(diào)pH 7.0～7.2，121℃滅菌20分鐘。

5、發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)

可溶性淀粉40g，葡萄糖22.5g，棉籽粉32g，酵母粉3.5g，KH₂PO₄ 0.1g，ZnSO₄.7H₂O 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，CaCO₃ 6g，調(diào)pH 6.0，121℃滅菌20分鐘。

實(shí)施例1、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)的基因簇多拷貝擴(kuò)增策略

1、刪減基因簇及attB插入位點(diǎn)的選取

如圖1，鏈霉菌基因組中一般僅含有一個(gè)attB位點(diǎn)，引入新的attB位點(diǎn)有利于引入更多拷貝的目標(biāo)基因簇。與此同時(shí)，刪減與原始霉素合成不相關(guān)的其他基因簇，可避免其他次級(jí)代謝產(chǎn)物合成時(shí)與原始霉素合成競爭乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A或氨基酸等前體。

為了實(shí)現(xiàn)刪減不相關(guān)基因簇且引入attB位點(diǎn)的目的，本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究分析，選取了始旋鏈霉菌中3個(gè)非目標(biāo)基因簇，分別位于始旋鏈霉菌基因組(GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)的4050261-4072243(BGC1)、1106415-1130923位(BGC2)以及686202-696578(BCG3)，分別可能編碼一種未知I型聚酮、一種非核糖體肽以及一種III型聚酮。采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行一一刪減并同時(shí)加入attB位點(diǎn)。

2、以PII合成基因簇為目標(biāo)基因簇，構(gòu)建工程菌株

以始旋鏈霉菌SBJ1000作為出發(fā)菌株，以BGC1、BGC2、BGC3分別作為將被刪減的非目標(biāo)基因簇，并在相應(yīng)的刪減位置加入attB。以PII生物合成基因簇為目標(biāo)基因簇，構(gòu)建工程菌株。如圖1。

以敲除BGC1并原位引入一個(gè)attB位點(diǎn)為例，首先采用引物BGC1-up-fw/rev、BGC1-down-fw/rev與BGC1-sgRNA-fw/DM-sgRNA-rev，以HCCB10218基因組為模板，PCR擴(kuò)增分別獲得敲除的上下游同源臂BGC1-UP、BGC1-DOWN與靶向BGC1的gRNA表達(dá)元件BGC1-sgRNA。然后采用BGC1-up-fw與DM-sgRNA-rev為引物，上述三個(gè)PCR產(chǎn)物為模板，以overlapping PCR擴(kuò)增的方式獲得BGC1-UP-DOWN-sgRNA，然后采用Spe I與Hind III酶切，連接至采用相同限制性內(nèi)切酶酶切的載體pKCcas9dO中，最終獲得BGC1靶向敲除載體pKCcas9-BGC1-sgRNA。其中，attB位點(diǎn)已經(jīng)添加在引物至BGC1-down-fw中(見表1相應(yīng)引物中斜體加黑下劃線標(biāo)注的序列)。pKCcas9-BGC1-sgRNA接合轉(zhuǎn)移至底盤菌SBJ1000中，長出的菌落采用ID-BGC1-fw與ID-BGC1-rev進(jìn)行PCR鑒定與測序。結(jié)果正確的菌株在無抗性RP培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代自行丟掉質(zhì)粒pKCcas9-BGC1-sgRNA，獲得工程菌SBJ1000::attB2。該菌株中，一個(gè)外源的attB替換了原有的BGC1(即始旋鏈霉菌基因組的第4050261-4072243位，基因組序列參見GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2，使得基因組中存在2個(gè)attB位點(diǎn))。

BGC2的敲除與BGC1類似，以SBJ1000::attB2為出發(fā)菌，敲除BGC2引入第3個(gè)attB獲得SBJ1000::attB3。具體方法為：首先采用引物BGC2-up-fw/rev、BGC2-down-fw/rev與BGC2-sgRNA-fw/DM-sgRNA-rev，以HCCB10218基因組為模板，PCR擴(kuò)增分別獲得敲除的上下游同源臂BGC2-UP、BGC2-DOWN與靶向BGC2的gRNA表達(dá)元件BGC2-sgRNA。然后采用BGC2-up-fw與DM-sgRNA-rev為引物，上述三個(gè)PCR產(chǎn)物為模板，以overlapping PCR擴(kuò)增的方式獲得BGC2-UP-DOWN-sgRNA，然后采用Spe I與Hind III酶切，連接至采用相同限制性內(nèi)切酶酶切的載體pKCcas9dO中，最終獲得BGC2靶向敲除載體pKCcas9-BGC2-sgRNA。其中，attB位點(diǎn)已經(jīng)添加在引物至BGC2-down-fw中(見表1相應(yīng)引物中斜體加黑下劃線標(biāo)注的序列)。pKCcas9-BGC2-sgRNA接合轉(zhuǎn)移至底盤菌SBJ1000::attB2中，長出的菌落采用ID-BGC2-fw與ID-BGC2-rev進(jìn)行PCR鑒定與測序。結(jié)果正確的菌株在無抗性RP培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代自行丟掉質(zhì)粒pKCcas9-BGC2-sgRNA，獲得工程菌SBJ1000::attB3。該菌株中，一個(gè)新的外源attB插入替換的原有BGC2(即始旋鏈霉菌基因組第1106415-1130923位，參見GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，使得基因組中存在3個(gè)attB位點(diǎn)。

以SBJ1000::attB3為出發(fā)菌敲除BGC3引入第4個(gè)attB獲得SBJ1000::attB4。具體方法為：首先采用引物BGC3-up-fw/rev、BGC3-down-fw/rev與BGC3-sgRNA-fw/DM-sgRNA-rev，以HCCB10218基因組為模板，PCR擴(kuò)增分別獲得敲除的上下游同源臂BGC3-UP、BGC3-DOWN與靶向BGC3的gRNA表達(dá)元件BGC3-sgRNA。然后采用BGC3-up-fw與DM-sgRNA-rev為引物，上述三個(gè)PCR產(chǎn)物為模板，以overlapping PCR擴(kuò)增的方式獲得BGC3-UP-DOWN-sgRNA，然后采用Spe I與Hind III酶切，連接至采用相同限制性內(nèi)切酶酶切的載體pKCcas9dO中，最終獲得BGC3靶向敲除載體pKCcas9-BGC3-sgRNA。其中，attB位點(diǎn)已經(jīng)添加在引物至BGC3-down-fw中(見表1相應(yīng)引物中斜體加黑下劃線標(biāo)注的序列)。pKCcas9-BGC3-sgRNA接合轉(zhuǎn)移至底盤菌SBJ1000::attB3中，長出的菌落采用ID-BGC3-fw與ID-BGC3-rev進(jìn)行PCR鑒定與測序。結(jié)果正確的菌株在無抗性RP培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代自行丟掉質(zhì)粒pKCcas9-BGC3-sgRNA，獲得工程菌SBJ1000::attB4。該菌株中，一個(gè)外源的attB替換原有的BGC3(即始旋鏈霉菌基因組的第686202-696578位，參見GenBank登錄號(hào)：NZ_ABJI00000000.2)，使得基因組中存在4個(gè)attB位點(diǎn)。以上方法中采用的引物序列如表1所示。

表1、引物列表

注：正體下劃線代表酶切位點(diǎn)，斜體加黑下劃線標(biāo)注為attB位點(diǎn)。

2、不同拷貝基因簇引入時(shí)效率對(duì)比

利用上述策略，本發(fā)明人分別構(gòu)建獲得了工程菌SBJ1000::attB2、SBJ1000::attB3與SBJ1000::attB4，其基因組中分別含有2個(gè)、3個(gè)和4個(gè)attB位點(diǎn)。

將含有PII合成基因簇的質(zhì)粒(BAC-F1F15)以接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入了上述SBJ1000、SBJ1000::attB2與SBJ1000::attB3三株菌中，待長出菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過凝膠電泳鑒定。

結(jié)果如圖2，同時(shí)插入2個(gè)拷貝的效率達(dá)到100％，插入3個(gè)拷貝的效率僅為10％，而插入4個(gè)PII合成基因簇拷貝時(shí)沒有菌落長出。推測是在引入更多PII合成基因簇拷貝時(shí)，整合酶phiC31(由BAC-F1F15質(zhì)粒帶入)在基因組多處attB位點(diǎn)進(jìn)行切割但不能及時(shí)修復(fù)，從而導(dǎo)致菌體死亡。插入2個(gè)拷貝的鑒定引物是ID-attB-fw/ID-BGC1-attB-fw與ID-BAC-F1F15-rev，插入3個(gè)拷貝的鑒定引物除上述兩對(duì)引物外，另有ID-BGC2-attB-fw與ID-BAC-F1F15-rev，其序列如表1所示。

實(shí)施例2、不同PII合成基因簇拷貝數(shù)目引入后的工程菌PII產(chǎn)量對(duì)比

通過上述策略，本發(fā)明人以SBJ1000為底盤菌，構(gòu)建了含有增加PII合成基因簇1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)拷貝的工程菌，分別命名為SBJ1001、SBJ1002與SBJ1003。

本發(fā)明人分別對(duì)SBJ1001、SBJ1002與SBJ1003進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以SBJ1000、SBJ1000::attB2、SBJ1000::attB3為對(duì)照。

(1)發(fā)酵方法和條件

始旋鏈霉菌SBJ1000及各衍生的工程菌分別劃線于RP平板，30℃靜置培養(yǎng)3-5天，分別挑取等體積的菌塊接入種子培養(yǎng)基，27℃240rpm培養(yǎng)44-48h后，以8％(v/v)比例轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在30、48、72、96與120h后取樣進(jìn)行HPLC測定。

(2)原始霉素測定方法

吸取培養(yǎng)液600μl，加入等體積丙酮，振蕩后室溫放置60min，12000轉(zhuǎn)離心5min，取上清，進(jìn)行HPLC檢測，柱子型號(hào)：Agilent Eclipse，填料：XDB C18 5微米，尺寸：4.6mm×150mm，波長206nm，流速1ml/min，流動(dòng)相：乙腈：0.03M KH₂PO₄緩沖液＝45：55。

(3)發(fā)酵結(jié)果

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著拷貝數(shù)的逐級(jí)增加，PII(Pristinamycin II_A)產(chǎn)量也相應(yīng)提高，SBJ1001、SBJ1002與SBJ1003分別為468、508與720mg/L，相對(duì)出發(fā)菌(產(chǎn)量323mg/L)分別提高45％、57％與123％，如圖3。

同時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，工程菌SBJ1000::attB2與SBJ1000::attB3的PII產(chǎn)量與出發(fā)菌沒有顯著差異。

上述結(jié)果表明，工程菌SBJ1002與SBJ1003的PII產(chǎn)量的進(jìn)一步增加是由于PII合成基因拷貝數(shù)的增加而不是其他基因簇刪減導(dǎo)致的。

(4)遺傳穩(wěn)定性測定

同時(shí)，本發(fā)明人將工程菌SBJ1003進(jìn)行了5代連續(xù)傳代培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)果顯示后代的PII產(chǎn)量與母代沒有顯著差異，證明這種基于位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的多拷貝基因簇整合所構(gòu)建的工程菌在遺傳上是很穩(wěn)定，相同基因簇之間不易發(fā)生同源重組。

實(shí)施例3、發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)一步提高工程菌的PII產(chǎn)量

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，由于原始霉素對(duì)于自身合成與菌體生長均有較強(qiáng)的抑制效果，添加大孔吸附樹脂可有效緩解這種毒性效應(yīng)，進(jìn)一步提高原始霉素的生物合成。

因此，本發(fā)明人在SBJ1003發(fā)酵過程中添加了6％(w/v)的大孔吸附樹脂HB60，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pristinamycin II_A產(chǎn)量相對(duì)不添加樹脂發(fā)酵時(shí)再次提升1.4倍，而相對(duì)出發(fā)菌株SBJ1000在相同培養(yǎng)條件下也提高了1.3倍。通過基因簇多拷貝擴(kuò)增方法與后期的發(fā)酵優(yōu)化，最終將PII產(chǎn)量提高了4.4倍，從原來的323mg/L提升至1.75g/L，如圖4。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。