本發(fā)明涉及分子生物學和基因工程研究與應用領域。具體地說，涉及一種200bp ladder DNA分子量標準制備用載體組合及其在制備200bp ladder DNA分子量標準中的應用。
背景技術：
DNA分子量標準是指一組分子量已知的DNA分子的混合物，電泳后按照其分子量的大小和遷移率的不同，在電泳凝膠（瓊脂糖凝膠或PAGE凝膠）上形成一個DNA片段分布的梯度 (ladder)，用以指示電泳過程中未知DNA樣品的分子量。目前，各種規(guī)格的DNA分子量標準多由專業(yè)的生物技術公司專門生產。國內市場上的DNA分子量標準從最初的以進口產品為主、到目前以國產產品為主和許多自制品的出現(xiàn)，制備和生產DNA分子量標準的方法為越來越多的人所掌握。DNA分子量標準的生產主要涉及DNA樣本的酶切消化產生較大的DNA分子和PCR擴增制備較小的DNA分子；其中限制性內切酶酶切的DNA分子的來源又可以分為天然的基因組DNA 和人工構建的質粒載體；PCR擴增又可分為單片段的擴增和多片段的擴增。
1. 通過限制性核酸內切酶酶切制備DNA分子量標準
利用DNA分子中存在的限制性內切酶酶切位點（天然的或人為加入的），采用合適的內切酶對其進行消化，從而形成一組分子量各異的DNA片段，用來作為DNA分子量標準。按照被消化DNA的來源可以分為兩種：天然來源的特種DNA（如基因組）和人工構建的質粒DNA。天然來源的基因組DNA的限制性內切酶酶切是通過分離某種來源的基因組DNA分子，然后用一種或幾種限制性內切酶進行消化，從而產生一系列的DNA片段組合，目前最常見的此類DNA分子是 Lamda噬菌體的基因組DNA（λDNA），由其產生的DNA分子量標準有λDNA/HindIII， λDNA/EcoRI+HindIII 等，也可以是某種具有多個常見酶切位點質粒，如pBR322 DNA/AluI marker和pBR322 DNA/BsuRI (HaeIII) marker，但是所用的內切酶都是不常用的，因而成本較高。人工構建載體(質粒)的限制性內切酶酶切是通過一次性把所需要的各種DNA片段克隆到高拷貝數(shù)的載體上，轉入大腸桿菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質粒DNA的分離純化，經過適當?shù)拿盖屑纯梢垣@得大量的目標DNA片段。這種方法的優(yōu)勢在于通過大腸桿菌的發(fā)酵擴增質粒獲得目的DNA片段，其制備規(guī)模很容易放大（50升的發(fā)酵體系很容易建立，而PCR擴增一般只能在小于500微升的體系內進行），獲得的DNA片段條帶在凝膠上條帶銳利，過程重復性高。不存在PCR擴增再現(xiàn)性不好的缺點。而且由于質粒是一種遺傳單位具有生命的基本特性即無限繁殖（擴增），所以這種質粒一旦構建好，即可以無限應用，不存在再生的問題。因而具有很大的應用空間。
2. 通過PCR擴增制備DNA分子量標準
由于PCR（Polymerase Chain Reaction）技術強大的DNA片段的擴增能力，同時由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的廣為流傳，目前利用PCR方法生產DNA分子量標準不存在技術問題，成本主要是引物合成和dNTP的購置，其他PCR試劑如TaqDNA聚合酶，模板DNA，反應Buffer等均可自制。由于生產效率低， 濃度強度高， 因而限制了其大規(guī)模的制備和應用。
在DNA分子量標準制備研究方面，我國科研工作者進行了較為系統(tǒng)的研究， 如葉春江等人構建了多個具有實際應用價值的DNA 重組載體，通過酶切可以產生多種具有核酸分子量參考意義的DNA片段組合(Ye Chunjiang. Electrophoresis, 2010, 31:2929–2935; Wu Jianbing Mol Biol Rep. 2011, 38(4): 2729–2731; Zhe Chen Mol. Biotechnol. 2009, 42(1): 128-133; Huang Dongyi. Plant Molecular Biology Reporter 2008 26(4):316-323; 張穎. 中國生物工程雜志.2009, 29 (8) : 119-123)。
長期以來，分子生物學試劑與基因工程研究領域，特別是核酸電泳領域，對于200bp DNA ladder 的制備缺少一種簡單高效的方法。普遍存在技術水平低，簡單重復工作為主的DNA marker制備方法。從而使得目前該種類型的DNA marker 價格居高不下，既造成了巨大的人力、原料浪費， 同時對廣大科研工作者造成了一定的影響。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有200bp ladder DNA 分子量標準制備技術的不足，提供一種高效、低成本的制備方法。
經過長期的研究和探索，本發(fā)明恰恰滿足了本領域上述技術缺陷， 實現(xiàn)了DNA 分子量標準的高效率、低成本制造。通過構建兩種DNA片段載體及其組合運用，實現(xiàn)了在200bp ladder DNA 分子量標準制備過程中發(fā)揮核酸發(fā)酵和PCR 擴增兩種方法各自優(yōu)勢的整合。其目的在于：實現(xiàn)一種技術含量高、成本低、效率高的200bp DNA ladder制備方法，提高該種DNA分子量標準質量的同時，有效的降低了制備成本，提高了生產效率。
本發(fā)明進一步的目的在于：公開一種用于200bp DNA ladder制備的重組載體及在制備200bp DNA ladder中的組合運用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案：
1. 重組載體p2186的構建：
利用生物信息學軟件DNAMAN(Lynnon Biosoft)分析NCBI數(shù)據(jù)庫中擬南芥基因組DNA染色體序列數(shù)據(jù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，獲得了一組內源性的EcoRI位點。利用自主開發(fā)的生物信息學軟件GASAP（申請人課題組自有軟件）分析內源性的EcoRI位點分部模式A，獲得了一條特征序列，其特點為GAATTC－－－（1000bp）－－－GAATTC ，命名為S(EcoRI1000EcoRI) 序列， 即兩個相鄰的EcoRI位點之間有1000bp的距離。 然后再用生物信息學軟件DNAMAN定位S(EcoRI1000EcoRI) 上游800 bp、下游600 bp區(qū)域，選擇其中不帶有PstI、SphI和EcoRI位點的基因組區(qū)域為PCR擴增區(qū)，分別設計上游和下游引物靶序列，以使得PCR擴增獲得E800-(EcoRI1000EcoRI)-600E的DNA產物，即2400（800+1000+600）bp的產物。
將上述PCR產物克?。═A克?。┻M入突變過的T載體（載體大小為2kb）, 獲得重組載體p2186, 該載體經過EcoRI酶切，可以釋放其中的 2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片段，其中由于各片段摩爾數(shù)相同，因而其質量數(shù)不同，其質量比例為：2kb:1kb:800bp:600bp=2:1:0.8:0.6。
2. 重組載體p1000的構建：
人工設計了5組重復的200bp片段(片段序列無特別指定)，每兩個相鄰的200bp片段之間均有EcoRI位點序列，且該1000bp片段的首尾（5′和3′末端）均具有EcoRI位點，同時5′和3′末端除了EcoRI位點之外，其序列組成在1000bp片段序列中具有唯一性, 作為引物結合位點，以確保PCR擴增產物的唯一性。該序列被亞克隆到高拷貝質粒pT2K 載體中，所得質粒命名為p1000。
由于重組質粒載體結構特征，p2186經大腸桿菌發(fā)酵富集后，通過質粒提取、純化后，可獲得高質量的重組載體p2186。通過EcoRI完全酶切后產生含有2kb、1kb、800bp 和600bp的Mix1。與之類似，以p1000為PCR擴增模板，以特異性正向引物Pf: 5'-GAATTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3'和反向引物Pr: 5'-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3'）進行擴增，所獲得的1000bp片段中含有4個內部EcoRI位點和2個外部EcoRI位點，以內切酶EcoRI進行部分酶切，可以得到含有200-1000bp 的5條DNA片段混合物-Mix2。
以適量Mix1和Mix2進行調配，這樣就獲得了一種較為完整的200bp DNA 片段長度標志物，即DNA分子量標準， 其組成為：200bp、400bp、600bp、800bp、1kb和2kb。其中600bp、800bp和1000bp 3種DNA片段一部分來自質粒完全酶切，一部分來自PCR產物部分酶切，200bp、400bp 2種DNA片段全部來自PCR產物部分酶切。
本發(fā)明的有益效果在于：設計了兩種可用于200bp DNA ladder 制備的重組載體，能夠通過核酸發(fā)酵及完全酶切和PCR擴增及部分酶切的方式進行200bp DNA ladder 的優(yōu)化制備方式。本發(fā)明的優(yōu)勢在于結合了核酸發(fā)酵（制備較大DNA片段具有優(yōu)勢）和PCR擴增（制備較小DNA片段具有優(yōu)勢）各自的優(yōu)勢，互補了兩種方法制備不同分子量DNA片段的不足。
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1：重組載體p2186的構建
首先利用NCBI中開放的基因組序列數(shù)據(jù)，利用生物信息學軟件DNAMAN (Lynnon Biosoft)分析基因組序列已知的物種DNA序列, 如模式植物擬南芥的基因組數(shù)據(jù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，獲得一組候選的內源性的EcoRI位點。在利用自主開發(fā)的生物信息學軟件GASAP（申請人課題組自有軟件）分析內源性的EcoRI位點分部模式，獲得了一條特征序列，其特點為GAATTC－－－（800bp）－－－GAATTC ，命名為S8(EcoRI800EcoRI) 序列， 即兩個相鄰的EcoRI位點之間有800bp的距離。 然后再用生物信息學軟件DNAMAN定位S8(EcoRI800EcoRI) 上游1000 bp、下游600 bp區(qū)域，選擇其中不帶有PstI、SphI和EcoRI位點的基因組區(qū)域為PCR擴增區(qū)，分別設計上游和下游引物靶序列，以使得PCR擴增獲得E1000-(EcoRI800EcoRI)-600E的DNA產物，即2400（1000+800+600）bp的產物。
將上述PCR產物克?。═A克隆）進入突變過的T載體（載體大小為2kb）, 獲得重組載體p2186, 該載體經過EcoRI酶切，可以釋放其中的 2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片段，其中由于各片段摩爾數(shù)相同，因而其質量數(shù)不同，其質量比例為：2kb:1kb:800bp:600bp=2:1:0.8:0.6。
實施例2：重組載體p2186的構建
首先利用NCBI中開放的基因組序列數(shù)據(jù)， 利用生物信息學軟件如DNAMAN(Lynnon Biosoft)分析基因組序列已知的物種DNA序列, 如模式植物擬南芥的基因組數(shù)據(jù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，獲得一組候選的內源性的EcoRI位點。在利用自主開發(fā)的生物信息學軟件GASAP（申請人課題組自有軟件）分析內源性的EcoRI位點分部模式，獲得了一條特征序列，其特點為GAATTC－－－（600bp）－－－GAATTC，命名為S6(EcoRI600EcoRI) 序列， 即兩個相鄰的EcoRI位點之間有600bp的距離。 然后再用生物信息學軟件DNAMAN定位S6(EcoRI600EcoRI) 上游800 bp、下游1000 bp區(qū)域，選擇其中不帶有PstI、SphI和EcoRI位點的基因組區(qū)域為PCR擴增區(qū)，分別設計上游和下游引物靶序列，以使得PCR擴增獲得E800-(EcoRI600EcoRI)-1000E的DNA產物，即2400（800+600+1000）bp的產物。
實施例3：載體p1000的構建
設計人工序列E200E200E200E200E200E，其結構特點為：由5組重復的200bp片段組成，每兩個相鄰的200bp片段之間均有EcoRI位點序列。全序列合成并由上海閃晶生物科技有限公司合成，并將之亞克隆到高拷貝載體pUC18 載體中，獲得重組載體p1000。且該1000bp片段的首尾（5′和3′末端）均具有EcoRI位點，同時5′和3′末端除了EcoRI位點之外，其序列組成在1000bp片段序列中具有唯一性, 作為引物結合位點，以確保PCR擴增產物的唯一性。
實施例4：200bp ladder DNA分子量標準的制備
過程I：將載體p2186轉入大腸桿菌5DHα中，挑取單菌落；以LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨:10g/L、酵母提取物:5g/L、 氯化鈉:10g/L）過夜培養(yǎng)（添加1/1000的氨芐青霉素），待OD=30時，離心收菌，用堿法提取質粒DNA（Sambrook J , Russell DW. Molecular cloning : A laboratory manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001），所獲得粗提質粒經過等體積氯仿多次抽提之后加入2倍體積的無水乙醇，置于-20℃ 沉淀過夜。8000rpm離心，棄去上清，所得沉淀用70%乙醇懸浮洗滌3次，晾干。再以TE溶液溶解，加入適量的酶切緩沖液和EcoRI內切酶，37℃連續(xù)酶切，期間定期電泳檢查酶切程度，直至完全酶切，獲得Mix1。
過程II：以適量p1000為PCR模板，用引物組合（Pf: 5’-GAA TTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3’ 和Pr: 5’-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3’）為擴增引物。PCR體系如下：
94℃度預變性1分鐘；循環(huán)程序為：94℃變性60s，61℃退火36s，72℃延伸80s，36個循環(huán)；最后72℃延伸15分鐘。反應結束后，所得PCR產物（800bp的復合體DNA片段）進行純化和濃縮。首先以氯仿抽提PCR反應液，然后加入1/10體積的3M NaAC和2倍體積的無水乙醇，置于-20℃ 過夜沉淀。離心收集沉淀，并晾干后，以PCR反應液1/5體積的TE溶液溶解沉淀，建立EcoRI內切酶部分酶切體系，獲得部分酶切產生的200-1000bp的組合物產物-Mix2。
取5 mL Mix1和10mL Mix2 冰浴上充分混合，然后取2uL 進行平板瓊脂糖凝膠電泳檢測，判定二者的濃度關系，根據(jù)電泳檢測結果，調整和補加濃度弱的一方，直至二者亮度相當。
實施例5：重組載體p2186的搖瓶發(fā)酵
過程I-搖瓶發(fā)酵：挑取含有重組載體p2186的大腸桿菌單菌落（菌株為TOP10）， 接種于5mL含有 1/1000體積的氨芐青霉素母液（50mg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩（180rpm）過夜(12小時)培養(yǎng)，然后全量轉接到含有300mL 2×YT 培養(yǎng)基（蛋白胨16g/L、酵母抽提物 10g/L、NaCl 5g/L）的2升三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，直至培養(yǎng)體系中大腸桿菌OD600=80。此時，停止培養(yǎng)， 離心收菌，采用堿裂解法提取質粒DNA，其過程同實施例3。
同樣的，以含有p1000質粒的大腸桿菌JM09進行搖瓶發(fā)酵，采用天根生物科技有限公司的質粒提取試劑盒提取質粒DNA。得到質粒DNA先采用70%乙醇洗滌3次，并8000rpm離心回收沉淀，晾干。以適量的TE溶解風干后的質粒DNA，并以80℃水浴孵育該質粒DNA溶液，以滅活其中殘留的外源核酸酶活性，以利于p1000質粒DNA的保存。置于-20℃保存，其保存期可達到5-10年。
過程II：以適量p1000為PCR模板，用引物組合（Pf: 5’-GAA TTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3’ 和Pr: 5’-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3’）為擴增引物。PCR體系如下：
96℃度預變性30s；循環(huán)程序為：95℃變性50s，61℃退火30s，72℃延伸70s，42個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結束后，所得PCR產物（1000bp的復合體DNA片段）進行純化和濃縮。首先以氯仿抽提PCR反應液，以去除DNA聚合酶；然后加入1/10體積的3M NaAC和2/3倍體積的異丙醇，充分混勻，然后置于-20℃ 過夜沉淀。離心收集沉淀，并晾干后，以PCR反應液1/4體積的TE溶液溶解沉淀，建立EcoRI內切酶部分酶切體系，獲得部分酶切產生的200-1000bp的組合物產物-Mix2。
10 mL Mix1和15mL Mix2 冰浴上充分混合，然后取1uL 進行平板瓊脂糖凝膠電泳檢測，判定二者的濃度關系，根據(jù)電泳檢測結果，調整和補加濃度弱的一方，直至二者亮度相當。
實施例6：重組載體p2186的發(fā)酵罐培養(yǎng)
以涂布有含p2186質粒的DH5α大腸桿菌茄子瓶斜面（LB培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10g/L, 酵母粉5g/L, NaCl 10g/L）, 37℃過夜培養(yǎng)。同時在10升發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基5升，組成如下(TB培養(yǎng)基)：胰蛋白胨12g/L, 酵母粉24g/L, 甘油4g/L, 消泡劑50μl。接種量5%。發(fā)酵過程中控制溫度在33~35 ℃之間，自動流加30%的氨水，使pH保持在6.8-7.1左右。 攪拌轉速在100~200rpm之間。溶氧大于等于20%。
發(fā)酵補料：根據(jù)實際經驗，流加補料分三個階段進行，發(fā)酵過程中0~8h不加補料，8~15h補加含50g葡萄糖的補料1000mL，15~22h加入含190g葡萄糖的補料1000mL。
待茄子瓶斜面長好后，以250mL滅菌水洗脫斜面上的菌體，并將其轉移和接種到10升發(fā)酵罐中，開動攪拌，保持溶氧 ≥20%。發(fā)酵過程中每小時取樣測定OD值，當OD值增長趨緩后，開始流加5×LB培養(yǎng)基，以補加營養(yǎng)成分。對于5升初始發(fā)酵體積而言，流加補料培養(yǎng)基量為2升。當OD值停止增加后，繼續(xù)保持攪拌和通氧3小時后，停止發(fā)酵。
離心收菌、堿裂解法提取質粒DNA、質粒純化及EcoRI酶切等流程與實施例3相似。
綜上所述，本發(fā)明公開的200bp ladder DNA分子量標準制備體系及其制備方法，是一種便捷、高效、成本低制備200bp ladder的方法。與現(xiàn)有技術相比，在很大程度上節(jié)約了成本，首先體現(xiàn)在本發(fā)明是利用核酸發(fā)酵的方法制備200bp ladder中的2kb、1kb、800bp和600bp DNA片段，而同類型重組載體尚未見報道。再次，本發(fā)明中采用的人工復合體方式作為PCR模板，一對引物通過單次擴增循環(huán)，可以產生5個產物單位（通過酶切釋放），從而高效的節(jié)省了普通PCR擴增反應中的引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs的用量。
另外，質粒p1000也可以單獨用于DNA片段的制備。以質粒p1000為PCR擴增模板，獲得的1000bp復合體結構經過EcoRI 完全酶切可以獲得200bpDNA片段，是一種高效的獲得200bp DNA 片段的方式, 可以用于含有200bp片段的DNA marker。同時，該1000bp復合體結構可以單獨通過EcoRI部分酶切產生200～1000bp的DNA ladder, 形成一種含有200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp 5條DNA片段的DNA marker。
由于目前200bp DNA ladder是一種很常用的DNA分子量標準之一，所以本發(fā)明中涉及的兩種重組載體組合及其用于制備200bp DNA ladder的方法均具有一定的應用價值或技術創(chuàng)新示例作用。
對于本技術領域的技術人員，本發(fā)明所公開的技術案例僅是示例作用，如本發(fā)明中的技術方案中的酶切位點，理論上可以是任何限制性內切酶，即使從成本角度出發(fā)，合適的內切酶也可以是PstI、EcoRI、HindIII、BamHI等。
供生物信息學分析的基因組也可以是任何已知的物種基因組序列（微生物、植物、動物等）。
本發(fā)明的通過一般性說明及具體實施方案已對本發(fā)明的核心實質做了較為詳盡的闡述，但是在本發(fā)明的基礎上，本領域的專業(yè)技術人員可以對其做出修改或改進，甚至是提高，而這種改進及提高是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或提高，均應屬于本發(fā)明要求保護的范圍。