本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有分泌生產(chǎn)高酶活中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，一般為好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，胞內(nèi)可產(chǎn)生圓形、橢圓形或柱狀的內(nèi)生芽孢。芽孢壁中有皮質(zhì)層，對熱、紫外線和離子輻射及抗菌素具有很高的抗性，可以耐受飼料加工、儲(chǔ)藏、耐酸、高溫、耐擠壓等優(yōu)點(diǎn)。

中性蛋白酶是能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解, 最適作用pH 值在7.0 左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反應(yīng)速度快、無工業(yè)污染、催化反應(yīng)條件適應(yīng)性較寬等性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)。

酶的應(yīng)用已有千年以上的歷史，雖然中性蛋白酶是最早為人類所發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一，但是廣泛應(yīng)用還是最近幾十年的事。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，隨著酶的制備、酶和細(xì)胞固定化、酶分子改造等酶技術(shù)的發(fā)展，中性蛋白酶的應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。自上世紀(jì)以來，世界各國科研工作者一直都致力于中性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、酶提取、純化以及酶學(xué)性質(zhì)的研究和應(yīng)用研究工作，取得了一定的成績。

國內(nèi)目前從事中性蛋白酶生產(chǎn)與銷售的酶制劑企業(yè)很少，主要是由于所采用生產(chǎn)菌種大多為上世紀(jì)八十年代所開發(fā)的誘變菌株，產(chǎn)酶能力下降、不太穩(wěn)定、部分優(yōu)良性狀出現(xiàn)部分退化或喪失，且易受到酵母及噬菌體的污染，對生產(chǎn)造成一定程度的損失，加之，目前我國中性蛋白酶發(fā)酵單位相對較低，濃縮成本高，不便保存與運(yùn)輸。國外對中性蛋白酶的研究比較早，一些產(chǎn)品化的中性蛋白酶類，都已經(jīng)研究得比較透徹，且都申請了專利，所以要篩選新的中性蛋白酶生產(chǎn)菌株將成為一個(gè)發(fā)展方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明是從天津?yàn)I海新區(qū)大港水庫的土壤中分離篩選出一株中性性蛋白酶高產(chǎn)菌株，該高產(chǎn)菌株能高效分泌表達(dá)中性蛋白酶，酶活力較高，為低成本、規(guī)?；a(chǎn)中性蛋白酶奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的優(yōu)勢是：（1）解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 是從天津?yàn)I海新區(qū)大港水庫的土壤中分離出來的，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生高活性的蛋白酶。（2）解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生長迅速，具有較強(qiáng)分解蛋白的能力。

本發(fā)明通過分離篩選的方法獲得了一株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌。所述菌株能顯著提高中性蛋白酶的產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵酶活高達(dá)8000U/ml，且該菌株株表達(dá)的中性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1菌落在脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上水解圈圖；

圖2： 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 16SrDNA電泳圖；

圖3：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生長曲線圖；

圖4：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶酶活圖；

圖5：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1在不同的發(fā)酵條件下，生產(chǎn)中性蛋白酶酶活圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1 解淀粉芽孢桿菌的篩選

（1）蛋白酶菌株初篩。將采集的土樣稱取10 g，加入裝有90ml無菌水并放有玻璃珠的250 ml三角瓶中，80℃水浴30 min，再充分振蕩30 min，制成10^-5g/ml，10^-6g/ml，10^-7 g/ml的土壤懸液，分別涂布于用于初篩的加有脫脂牛奶的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2-4天，觀察透明圈的有無。如果產(chǎn)生透明圈，分別測量透明圈和菌落的直徑并計(jì)算其比值，選擇比值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。附圖1中1和2為篩選到的解淀粉芽孢桿菌在脫脂牛奶平板中形成的透明圈，3和4為不分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌1A751對照組。

（2）蛋白酶菌株復(fù)篩。取初篩獲得的中性蛋白酶菌株分別接種到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)48h，用福林（Folin）法測定（參照《中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法），其原理是蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍(lán)色（生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物）。藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定。從中選擇出酶活力最高的菌株作為目的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化鑒定。

（3）菌種的確認(rèn)

采用常規(guī)生理生化反應(yīng)與分子16S rRNA技術(shù)對從土壤中篩選出來的菌株進(jìn)行鑒定。根據(jù)解淀粉芽孢桿菌在Genebank中的16S rRNA進(jìn)行分子鑒定，電泳結(jié)果如附圖2所示；所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，革蘭氏染色呈陽性，鏡檢為長桿狀，有芽孢，可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P 實(shí) 驗(yàn)、氧化酶與過氧化氫酶均為陽性，且具運(yùn)動(dòng)性，進(jìn)一步采用法國生物梅里埃細(xì)菌鑒定儀(參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》)，最終確定BAP-1為解淀粉芽孢桿菌。

(4)生長曲線的測定

從-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢桿菌BAP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1%的接種量接種到30mL的LB培養(yǎng)基中，每隔30min取樣測定其OD₆₀₀得到其生長曲線，結(jié)果附圖3所示。

實(shí)施例2 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶

從-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢桿菌BAP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1%的接種量接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃，220 rpm培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每間隔12h后，將發(fā)酵液離心，以福林酚法測定粗酶液活力，結(jié)果附圖4所示。

實(shí)施例3 產(chǎn)中性蛋白酶出發(fā)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在原來發(fā)酵培養(yǎng)基2×SR的基礎(chǔ)上添加不同濃度的不同的碳源或氮源，發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，具體方法同上。這些碳源或氮源的終濃度分別為1%的棉籽粉，1%的淀粉，0.3%的牛肉膏，0.5%的蛋白胨，0.5%的酵母膏和0.5%的葡萄糖，標(biāo)記為BAP-1-a，BAP-1-b，BAP-1-c，BAP-1-d，BAP-1-e, BAP-1-f。終濃度分別為4%的棉籽粉，4%的淀粉，0.8%的牛肉膏，1.5%的蛋白胨，2%的酵母膏和2%的葡萄糖，標(biāo)記為BAP-1-g，BAP-1-h，BAP-1-i，BAP-1-j，BAP-1-k, BAP-1-l。其中添加終濃度為0.5%的葡萄糖和終濃度為1%的淀粉時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)的中性蛋白酶酶活最高。結(jié)果附圖5所示。

堿性蛋白酶活力的測定

采用《中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定方法即福林（Folin）法。

其中各培養(yǎng)基的配方如下：

(1) LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，脫脂牛奶10 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌 20min。

(2)LB種子培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L， pH自然，121℃滅菌 20min。

(3)2×SR發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉50 g/L，蛋白胨30 g/L，K₂HPO₄ 6 g/L，pH 7.2. 121℃滅菌 20min。