本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，更具體地，涉及一株解淀粉芽孢桿菌、由其制備的抑菌劑及用途。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)5千多萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的71％。但是每年由水產(chǎn)病害造成的損失產(chǎn)量占15％以上，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1500億元。已知的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害有100多種，病原種類(lèi)有300多種，其中，細(xì)菌性病原種類(lèi)占54.9％。而致病性弧菌、殺鮭氣單胞菌是水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病中最主要的病原菌。由弧菌引起的疾病，流行面積廣，發(fā)病率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)等很多種弧菌可以引起魚(yú)類(lèi)病害，某些種類(lèi)也會(huì)導(dǎo)致人或其他動(dòng)物發(fā)病。另外，殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)也是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物常見(jiàn)的病原菌。殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)主要感染鮭科魚(yú)類(lèi)發(fā)生癤瘡病。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，在生產(chǎn)中感染導(dǎo)致暴發(fā)性出血病。

目前在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中主要使用廣譜抗生素，據(jù)專(zhuān)家調(diào)查，中國(guó)每年生產(chǎn)抗生素原料大約21萬(wàn)噸，其中有9.7萬(wàn)噸抗生素用于畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，占抗生素年總產(chǎn)量的46.1％。雖然使用抗生素能夠有效地控制養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生和蔓延，但在實(shí)際生產(chǎn)中存在盲目使用和藥物濫用現(xiàn)象，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素濫用有多方面的負(fù)面效應(yīng)。第一，抗生素的盲目使用嚴(yán)重干擾養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物腸道中有益微生物的正常生長(zhǎng)和繁殖，破壞了微生態(tài)平衡。第二，水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素長(zhǎng)期大量、不規(guī)范的使用導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原微生物的易感性，更嚴(yán)重的是導(dǎo)致病原菌的耐藥性增強(qiáng)，出現(xiàn)大量耐藥細(xì)菌、甚至超級(jí)細(xì)菌。第三，抗生素的使用還會(huì)導(dǎo)致其在水生動(dòng)物體內(nèi)殘留、富集，最終將危害人類(lèi)的健康。雖然水產(chǎn)品中抗生素的殘 留量很低，但對(duì)人體健康的潛在危害甚為嚴(yán)重，而且影響深遠(yuǎn)。第四，抗生素藥物殘留也造成水產(chǎn)品質(zhì)量降低，成為水產(chǎn)品銷(xiāo)售量和出口貿(mào)易量的限制因素。

微生態(tài)制劑是現(xiàn)行抗生素及合成藥物類(lèi)飼料添加劑最有效的替代產(chǎn)品之一，具有制造成本低、工藝技術(shù)成熟的特點(diǎn)，因此它應(yīng)該能夠以其優(yōu)越的、有利于人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的產(chǎn)品性能，逐步替代抗生素。養(yǎng)殖生產(chǎn)上實(shí)際應(yīng)用的微生態(tài)制劑包括：活菌體、死菌體、菌體成分、代謝產(chǎn)物及具有活性的生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)等部分。因此，發(fā)現(xiàn)新的可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑的菌株具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4，該菌株，可抑制病原性弧菌和病原性氣單胞菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而減少由這些病原菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病的發(fā)生和蔓延，降低了水產(chǎn)動(dòng)物的死亡率。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4，該菌株已于2014年12月10日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.10149。保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

所述的解淀粉芽孢桿菌，分離自海洋循環(huán)水養(yǎng)殖環(huán)境，該菌株具有以下特性：

菌株在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為：白色，半透明，光滑濕潤(rùn)菌落，稍隆起，圓形齊整菌落；革蘭氏染色菌體紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀；堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；萘酚-AS-BI磷酸水解酶實(shí)驗(yàn)陰性；α-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；碳水化合物實(shí)驗(yàn)：甘露醇陽(yáng)性；L-阿拉伯糖陽(yáng)性；D-核糖陽(yáng)性；D-木糖陽(yáng)性；D-葡萄糖陽(yáng)性；D-果糖陽(yáng)性；D-甘露糖陽(yáng)性；肌醇陽(yáng)性；甘露糖醇陽(yáng)性；山梨醇陽(yáng)性；甲基-αD-吡喃葡萄糖苷陽(yáng)性；N-乙酰葡萄糖胺陽(yáng)性；苦杏仁苷陽(yáng)性；ARBULIN陽(yáng)性；七葉靈檸檬酸鐵陽(yáng)性；水楊苷陽(yáng)性；D-纖維二糖陽(yáng)性；D-麥芽糖陽(yáng)性；D-乳糖陽(yáng)性；D-蜜二糖陽(yáng)性；D-蔗糖陽(yáng)性；D-海藻糖陽(yáng)性；D-棉籽糖陽(yáng)性；淀粉陽(yáng)性；糖原陽(yáng)性；木糖醇陽(yáng)性；D-龍膽二糖陽(yáng)性；D-土倫糖陽(yáng)性；葡萄糖酸鉀陽(yáng)性。

本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了以上所述的解淀粉芽孢桿菌V4在抑制病原性弧菌和病原性氣單胞菌生長(zhǎng)和/或繁殖的用途。

在上述技術(shù)方案中，所述病原性弧菌包括創(chuàng)傷弧菌、需鈉弧菌、哈維氏弧菌和黑?；【?，所述病原性氣單胞菌包括嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌。

本發(fā)明還提供了一種抑菌劑，其活性成分為以上所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4。

上述抑菌劑的制備方法，包括如下步驟：

將以上所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28～32℃，振蕩速度180～210rpm，培養(yǎng)時(shí)間1～3天，獲得的培養(yǎng)液即所述抑菌劑。

優(yōu)選地，培養(yǎng)溫度為30℃，振蕩速度200rpm，培養(yǎng)時(shí)間2天。

在上述技術(shù)方案中，所述LB培養(yǎng)基包括如下成分：蛋白胨8～12質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏4～6質(zhì)量份，氯化鈉8～12質(zhì)量份，蒸餾水970～980質(zhì)量份，NaOH調(diào)pH 7～7.5。

優(yōu)選地，蛋白胨10質(zhì)量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5質(zhì)量份，氯化鈉10質(zhì)量份，蒸餾水975質(zhì)量份，用NaOH調(diào)pH 7.2。

本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種預(yù)防和/或殺滅水產(chǎn)病原性弧菌和水產(chǎn)病原性氣單胞菌的方法，向水體中接入以上所述的抑菌劑。

在上述技術(shù)方案中，所述病原性弧菌包括創(chuàng)傷弧菌、需鈉弧菌、哈維氏弧菌和黑?；【霾≡詺鈫伟ㄊ人畾鈫伟蜌Ⅴq氣單胞菌。

本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種降低水產(chǎn)動(dòng)物死亡率和飼料系數(shù)、提高增重率的方法，按0.1％～0.3％體積比向水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖水體中接入以上所述的抑菌劑。

本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌V4菌株和/或菌劑在養(yǎng)殖水體通常的育苗和養(yǎng)殖溫度下即可產(chǎn)生拮抗病原性弧菌和病原性氣單胞菌的細(xì)菌素，抑制創(chuàng)傷弧菌、需鈉弧菌、哈維氏弧菌、黑?；【?、嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)和繁殖，能夠起到有效地控制由病原性弧菌和病原性氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病的發(fā)生和蔓延的作用，降低了水產(chǎn)動(dòng)物的死 亡率，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的增重。

附圖說(shuō)明

圖1解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)生長(zhǎng)的抑制；

圖2解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)需鈉弧菌(Vibrio natriegens)生長(zhǎng)的抑制；

圖3解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)生長(zhǎng)的抑制；

圖4解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)生長(zhǎng)的抑制；

圖5解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生長(zhǎng)的抑制；

圖6解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)黑?；【?Vibrio ponticus)生長(zhǎng)的抑制。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說(shuō)明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1菌株的物種鑒定

生物學(xué)特性：菌株在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為：白色，半透明，光滑濕潤(rùn)菌落，稍隆起，圓形齊整菌落；革蘭氏染色菌體紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀；堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；萘酚-AS-BI磷酸水解酶實(shí)驗(yàn)陰性；α-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；碳水化合物實(shí)驗(yàn)：甘露醇陽(yáng)性；L-阿拉伯糖陽(yáng)性；D-核糖陽(yáng)性；D-木糖陽(yáng)性；D-葡萄糖陽(yáng)性；D-果糖陽(yáng)性；D-甘露糖陽(yáng)性；肌醇陽(yáng)性；甘露糖醇陽(yáng)性；山梨醇陽(yáng)性；甲基-αD-吡喃葡萄糖苷陽(yáng)性；N-乙酰葡萄糖胺陽(yáng)性；苦杏仁苷陽(yáng)性；ARBULIN陽(yáng)性；七葉靈檸檬酸鐵陽(yáng)性；水楊苷陽(yáng)性；D-纖維二糖陽(yáng)性；D-麥芽糖陽(yáng)性；D-乳糖陽(yáng)性；D-蜜二糖陽(yáng)性；D-蔗糖陽(yáng)性；D-海藻糖陽(yáng)性；D-棉籽糖陽(yáng)性；淀粉陽(yáng)性；糖原陽(yáng)性；木糖醇陽(yáng)性；D-龍膽二糖陽(yáng)性；D-土倫糖陽(yáng)性；葡萄糖酸鉀陽(yáng)性。

分子生物學(xué)鑒定：序列表中16S rRNA基因的獲得過(guò)程以及與現(xiàn)有菌種 的比對(duì)結(jié)果

菌株V4接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28～32℃，振蕩速度180～210rpm，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，取1ml液體培養(yǎng)液于1.5ml離心管中，8000r/min離心5min，棄上清液，加入500μl ddH₂O，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液8000r/min離心5min，棄上清液，加入100μl ddH₂O重懸細(xì)胞，再將離心管放入沸水中煮10min，使細(xì)胞裂解，8000r/min離心5min后取上清2μl作為PCR模板，以27F、1492R分別作為上下游引物于50μl反應(yīng)體系中擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因。經(jīng)基因測(cè)序后獲得V4菌株的16S rRNA序列SEQ ID NO:1所示。

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相近菌株的16S rRNA基因序列，用MEGA軟件進(jìn)行多序列對(duì)位排列，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如下。

實(shí)施例2解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)創(chuàng)傷弧菌CZ-A2(Vibrio vulnificus)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

將解淀粉芽孢桿菌V4菌株接種到100mL的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h得到菌劑，將菌劑8000r/min離心10分鐘，得到菌劑上清液，將該上清液用一次性針式過(guò)濾器過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。

LB培養(yǎng)基成分：蛋白胨10質(zhì)量份，酵母浸膏5質(zhì)量份，氯化鈉10質(zhì)量份，蒸餾水975質(zhì)量份，pH 7.2。

2.菌劑上清液對(duì)創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)CZ-A2生長(zhǎng)的抑制作用：

將創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)CZ-A2制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生的抑菌圈， 抑菌圈面積為220.71±6.61mm²(附圖1)。

實(shí)施例3、解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)需鈉弧菌(Vibrio natriegens FS-1)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

按實(shí)施例2中步驟1制作解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液。

2.菌劑上清液對(duì)需鈉弧菌(Vibrio natriegens FS-1)生長(zhǎng)的抑制作用：

將需鈉弧菌(Vibrio natriegens)制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)需鈉弧菌產(chǎn)生的抑菌圈,抑菌圈面積為50.24±3.6mm²(附圖2)。

實(shí)施例4、解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

按實(shí)施例2中步驟1制作解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液。

2.菌劑上清液對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)生長(zhǎng)的抑制作用：

將嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的抑菌圈,抑菌圈面積為176.625±5.18mm²(附圖3)。

實(shí)施例5、解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

按實(shí)施例2中步驟1制作解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液。

2.菌劑上清液對(duì)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)生長(zhǎng)的抑制作 用：

將殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)殺鮭氣單胞菌產(chǎn)生的抑菌圈,抑菌圈面積為240.41±4.57mm²(附圖4)。

實(shí)施例6、解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

按實(shí)施例2中步驟1制作解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液。

2.菌劑上清液對(duì)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生長(zhǎng)的抑制作用：

將哈維氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)哈維氏弧菌產(chǎn)生的抑菌圈,抑菌圈面積為47.78±4.62mm²(附圖5)。

實(shí)施例7、解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液對(duì)黑?；【?Vibrio ponticus)生長(zhǎng)的抑制

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液的制備：

按實(shí)施例2中步驟1制作解淀粉芽孢桿菌V4菌劑上清液。

2.菌劑上清液對(duì)黑海弧菌(Vibrio ponticus B8)生長(zhǎng)的抑制作用：

將黑?；【?Vibrio ponticus B8)制備菌懸液，100μl菌懸液涂布LB固體平板，將直徑6mm的無(wú)菌濾紙片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢桿菌V4無(wú)菌發(fā)酵液于無(wú)菌濾紙片上，再將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀(guān)察可見(jiàn)解淀粉芽孢桿菌V4對(duì)黑?；【a(chǎn)生的抑菌圈,抑菌圈面積為63.59±2.9mm²(附圖6)。

實(shí)施例8、添加不同比例解淀粉芽孢桿菌V4菌劑對(duì)虹鱒生長(zhǎng)及存活的 影響

1.解淀粉芽孢桿菌V4菌劑的制備

將解淀粉芽孢桿菌V4菌株接種到實(shí)施例2中所述成分的液體LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，所得培養(yǎng)液為解淀粉芽孢桿菌V4菌劑。

2.在道氏虹鱒養(yǎng)殖池中添加不同比例解淀粉芽孢桿菌V4制劑

按體積比0.1％～0.3％比例添加解淀粉芽孢桿菌V4制劑到道氏虹鱒養(yǎng)殖池中，設(shè)置對(duì)照組，監(jiān)測(cè)道氏虹鱒的初始體重、末期體重、增重率、飼料系數(shù)、特定生長(zhǎng)率、及死亡率。養(yǎng)殖45天后,與對(duì)照組相比，添加組能促進(jìn)道氏虹鱒的增重，促進(jìn)比例為17.08～71.22％。同時(shí)能降低飼料系數(shù)，最高比例達(dá)19.49％。同時(shí)，與對(duì)照組相比，添加組能降低道氏虹鱒的死亡率，比例為27.25～81.86％(見(jiàn)表1)。

表1