本發(fā)明涉及生物、醫(yī)藥及食品工業(yè)技術領域，尤其是一種從雞蛋清中分離制備溶菌酶的方法。

背景技術：

溶菌酶(Lysozyme)是一種糖苷水解酶，又稱胞壁質酶或N－乙酰胞壁質聚糖水解酶，作用于N－乙酰葡萄糖氨和N－乙酰氨胞壁酸之間的β－1，4鍵，能使某些細菌細胞壁中的粘多糖成份分解，從而水解細菌細胞壁，在細胞內則對吞噬后的病原菌起破壞作用。所以它具有抗炎功效，并以保護機體不受感染。溶菌酶不僅能分解稠厚的粘蛋白，使膿性創(chuàng)口滲出物液化而易于排出，并能清除壞死粘膜，加速粘膜組織的修復和再生。溶菌酶與抗菌素合用具有良好的協(xié)同、增效作用。在臨床上溶菌酶可用來制消炎藥，用于五官科多種粘膜疾病，如副鼻竇炎，慢性鼻炎、滲出性中耳炎等。在食品工業(yè)中，溶菌酶可以用作嬰兒食品的添加劑。溶菌酶還是基因工程及細胞工程必不可少的工具酶。用溶菌酶制成的漱口液及牙膏可防齲齒。溶菌酶的用處如此廣泛，所以實現(xiàn)溶菌酶的工業(yè)化分離與純化具有重要的經(jīng)濟價值。

當前從雞蛋清中分離純化溶菌酶的方法有直接結晶法、親和色譜法、超濾法、反膠團萃取法與離子交換法等。用結晶法生產(chǎn)溶菌酶時容易發(fā)生共晶問題。親和分離技術只能處理小量原材料，而且各種昂貴的親和柱介質也會導致較高的生成成本。色譜技術雖然選擇性好、分離速度快、效率高，容易實現(xiàn)自動化控制，但是存在純度和得率較低的缺陷。使用單一的分離純化方法在分離和純化溶菌酶時很難獲得較高的純度和得率，所以對溶菌酶的分離和純化應該將兩種或者幾種方法結合起來，按照一定的順序進行分離。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蛋清溶菌酶的分離純化方法。該方法將離子交換法、雙水相萃取法和膜分離法結合使用，克服了單一分離純化方法難以獲得較高純度和得率的缺陷。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下步驟：

(1)收集新鮮雞蛋清，按蛋清與緩沖液體積比為1∶2的比例加入PH4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，均勻攪拌，冷處靜置過夜；

(2)8000rpm離心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氫氧化鈉溶液將pH調到6；

(3)將CM－瓊脂糖離子交換介質裝柱，預處理成鈉型后用pH6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液平衡；

(4)按照上樣液和介質體積比為3∶1的比例上柱，用去離子水清洗未交換蛋白，最后用1M氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，并收集洗脫液；

(5)用1M鹽酸將洗脫液調至pH5.5，均勻攪拌1小時，8000rpm離心去除沉淀，收集上清液B；

(6)向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的質量濃度達20～25％，再攪拌1小時，8000rpm離心，收集上清液C；

(7)向所得上清液C中加入飽和硫酸鈉溶液，至硫酸鈉的質量濃度達到15～20％，混勻后于6000rpm離心，收集上清液D；

(8)對所得上清液D，以膜截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行超濾，對超濾所得溶液進行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述步驟(6)中的聚乙二醇的質量濃度達25％，步驟(7)中的硫酸鈉的質量濃度達到15％。

本發(fā)明的有益效果是：相對于現(xiàn)有技術，該方法具有如下優(yōu)點：

(1)該方法將離子交換法、雙水相萃取法和膜分離法結合使用，克服了單一分離純化方法存在的純度和得率低下的缺陷；

(2)本發(fā)明所用工藝操作簡單易行，生產(chǎn)周期短，無需復雜設備，成本低廉，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

(3)本發(fā)明所用工藝未使用任何有毒有害化學物質，確保產(chǎn)品質量的安全性；

(4)本發(fā)明各分離步驟中條件溫和，無相變發(fā)生，有利于保護溶菌酶的生物學活性，可以獲得高純度與高生物活性的溶菌酶。

附圖說明

圖1為采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白質電泳法測定按照實施例1～4的方法制得的溶菌酶的電泳色譜圖。

其中：1、溶菌酶標準蛋白質；2、按實施例1方法制得的溶菌酶；3、按實施例2方法制得的溶菌酶；4、按實施例3方法制得的溶菌酶；5、按實施例4方法制得的溶菌酶。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例一

收集新鮮雞蛋清，按蛋清與緩沖液體積比為1∶2的比例加入PH4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，均勻攪拌，冷處靜置過夜；8000rpm離心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氫氧化鈉溶液將pH調到6；將CM－瓊脂糖離子交換介質裝柱，預處理成鈉型后用pH6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液平衡；按照上樣液和介質體積比為3∶1的比例上柱，用去離子水清洗未交換蛋白，最后用1M氯化鈉 溶液洗脫2個柱體積，并收集洗脫液。用1M鹽酸將洗脫液調至pH5.5，均勻攪拌1小時，8000rpm離心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的質量濃度達20％，再攪拌1小時，8000rpm離心，收集上清液C；向所得上清液C中加入飽和硫酸鈉溶液，至硫酸鈉的質量濃度達到15％，混勻后于6000rpm離心，收集上清液D；對所得上清液D，以膜截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行超濾，對超濾所得溶液進行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白質電泳法對所得溶菌酶檢測為單一條帶，用比濁法測得酶活可達到25000U/mg，收率為每1kg蛋清得3.3～3.6g溶菌酶。

實施例二

收集新鮮雞蛋清，按蛋清與緩沖液體積比為1∶2的比例加入PH4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，均勻攪拌，冷處靜置過夜；8000rpm離心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氫氧化鈉溶液將pH調到6；將CM－瓊脂糖離子交換介質裝柱，預處理成鈉型后用pH6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液平衡；按照上樣液和介質體積比為3∶1的比例上柱，用去離子水清洗未交換蛋白，最后用1M氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，并收集洗脫液。用1M鹽酸將洗脫液調至pH5.5，均勻攪拌1小時，8000rpm離心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的質量濃度達20％，再攪拌1小時，8000rpm離心，收集上清液C；向所得上清液C中加入飽和硫酸鈉溶液，至硫酸鈉的質量濃度達到20％，混勻后于6000rpm離心，收集上清液D；對所得上清液D，以膜截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行超濾，對超濾所得溶液進行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白質電 泳法對所得溶菌酶檢測為單一條帶，用比濁法測得酶活可達到25000U/mg，收率為每1kg蛋清得3.4～3.7g溶菌酶。

實施例三

收集新鮮雞蛋清，按蛋清與緩沖液體積比為1∶2的比例加入PH4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，均勻攪拌，冷處靜置過夜；8000rpm離心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氫氧化鈉溶液將pH調到6；將CM－瓊脂糖離子交換介質裝柱，預處理成鈉型后用pH6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液平衡；按照上樣液和介質體積比為3∶1的比例上柱，用去離子水清洗未交換蛋白，最后用1M氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，并收集洗脫液。用1M鹽酸將洗脫液調至pH5.5，均勻攪拌1小時，8000rpm離心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的質量濃度達25％，再攪拌1小時，8000rpm離心，收集上清液C；向所得上清液C中加入飽和硫酸鈉溶液，至硫酸鈉的質量濃度達到20％，混勻后于6000rpm離心，收集上清液D；對所得上清液D，以膜截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行超濾，對超濾所得溶液進行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白質電泳法對所得溶菌酶檢測為單一條帶，用比濁法測得酶活可達到25000U/mg，收率為每1kg蛋清得3.5～3.8g溶菌酶。

實施例四

收集新鮮雞蛋清，按蛋清與緩沖液體積比為1∶2的比例加入PH4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，均勻攪拌，冷處靜置過夜；8000rpm離心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氫氧化鈉溶液將pH調到6；將CM－瓊脂糖離子交換介質裝柱，預處理成鈉型后用pH6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液平衡；按照上樣液和介 質體積比為3∶1的比例上柱，用去離子水清洗未交換蛋白，最后用1M氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，并收集洗脫液。用1M鹽酸將洗脫液調至pH5.5，均勻攪拌1小時，8000rpm離心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的質量濃度達25％，再攪拌1小時，8000rpm離心，收集上清液C；向所得上清液C中加入飽和硫酸鈉溶液，至硫酸鈉的質量濃度達到15％，混勻后于6000rpm離心，收集上清液D；對所得上清液D，以膜截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行超濾，對超濾所得溶液進行真空冷凍干燥，得到白色粉末，即為溶菌酶。采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白質電泳法對所得溶菌酶檢測為單一條帶，用比濁法測得酶活可達到25000U/mg，收率為每1kg蛋清得4.1～4.4g溶菌酶。