本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體為一種高質(zhì)量咖啡基因組DNA的高效提取方法。

背景技術：

咖啡屬茜草科(Rubiaceae)，仙丹花亞科(Ixoroideae)，咖啡屬(Coffea)的多年生常綠灌木或小喬木，是國際貿(mào)易中繼石油之后的第二大原料產(chǎn)品，其產(chǎn)量、產(chǎn)值和消費量均居三大飲料作物(咖啡、茶葉、可可)之首。而高質(zhì)量基因組DNA是咖啡基因組測序、基因克隆、分子雜交、基因文庫構建和分子標記等一系列分子生物學研究的前提和基礎。咖啡葉片中酚類、色素、多糖、萜類等次生代謝物質(zhì)含量較高，對DNA提取造成嚴重影響，傳統(tǒng)的CTAB法、SDS-CTAB等難以去除這些雜質(zhì)以獲得高質(zhì)量的基因組DNA，并且需要多步純化，技術步驟繁雜，效率較低。因此，有效去除雜質(zhì)及提高DNA提取效率以獲得高質(zhì)量DNA是加強咖啡分子生物學研究的關鍵。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種高質(zhì)量咖啡葉片基因組DNA提取方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

①取咖啡樹枝尖新鮮嫩葉2～3片(約0.2～0.3g)，放入2mL尖底離心管中，蓋上蓋子，將離心管浸入液氮1～3min后取出用鐵絲搗碎。立即加入0.1gPVP粉、0.5mL氯仿(AR)和1mL改良Extraction buffer溶液(350mM山梨醇，100mM Tris-HCl，100mM EDTApH8.0，0.5％Na₂S₂O₃)的混合液，再添加20μLβ-巰基乙醇(2％)后于渦旋振蕩儀上搖勻。如果不溶，65℃水浴1h充分溶解；

②將溶化后的糊狀物在離心機上4℃、5000rpm離心10min，吸棄上層液相和下層氯仿。再向沉淀物中加入600μL Lysis buffer溶液(0.2M Tris-HCl pH8，0.05M EDTA，2M NaCl，CTAB 2％)和12μL β-巰基乙醇(2％)，混勻后放置65℃水浴鍋中溫浴30min；

③添加300μL酚及300μL的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，輕輕上下顛倒10次充分混勻，形成乳狀液后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

④回收上層液相，重復第③步再抽提一次；

⑤將上層液相移至一個新的1.5mL尖底離心管，加入60μL 3M NaAc、600μL預冷的無水乙醇(使用前-20℃冰箱保存)，輕輕上下顛倒混勻后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

⑥吸棄液相，用1mL預冷的無水乙醇洗滌沉淀物2次，棄乙醇；將管倒扣于濾紙上，使乙醇流盡，風干或自然晾干。加入50μL TE緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0)或ddH₂O溶解沉淀物；

⑦電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。

本發(fā)明的DNA提取方法能提取出高質(zhì)量咖啡葉片基因組DNA，其核心技術包括以下內(nèi)容：1、改良了CTAB法，使用PVP粉增強去除酚類、多糖化合物；2、使用了改良Extraction buffer溶液和Lysis buffer溶液進行植物材料提取和裂解組織細胞；3、先將氯仿與異戊醇按24∶1(v/v)配置混合液，再與酚等 體積混合加入有效去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)；4、在沉淀DNA時，采用NaAc(60μL，3M)與冷的無水乙醇(600μL)混合沉淀劑，高速離心，以增加DNA沉淀；5、用預冷的無水乙醇洗滌DNA沉淀物，去除Na⁺。這種方法能快速高效地分離出高質(zhì)量咖啡葉片基因組DNA。

附圖說明

圖1為CTAB法提取的咖啡不同種質(zhì)葉片基因組DNA 1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1～11泳道：常規(guī)CTAB法提取的DNA；

圖2為CTAB-SDS法提取的咖啡不同種質(zhì)葉片基因組DNA 1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1～19泳道：CTAB-SDS法提取的DNA；M泳道：50ng DNA Marker；

圖3為方法III、本發(fā)明(方法IV)提取的咖啡不同種質(zhì)葉片基因組DNA 1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1～5泳道：方法III提取的DNA；6～10泳道：方法IV提取的DNA；M泳道：50ng DNA Marker；

圖4為不同SSR引物對CTAB-SDS法提取的咖啡不同種質(zhì)葉片基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1～9泳道：9對不同SSR引物的PCR擴增產(chǎn)物；M泳道：DL2502型Marker；

圖5為不同SSR引物對方法III、本發(fā)明(方法IV)提取的咖啡不同種質(zhì)葉片基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1～9泳道：9對不同SSR引物對方法III提取的DNA PCR擴增產(chǎn)物；10～18泳道：9對不同SSR引物對方法IV提取的DNA PCR擴增產(chǎn)物；M泳道：DL2502型Marker。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

材料：咖啡葉片取自云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所的農(nóng)業(yè)部瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃內(nèi)的12～14齡咖啡樹，于5月下旬摘取的咖啡樹枝尖新鮮嫩葉，葉片保存在4℃冰箱。

試劑：

Extraction buffer溶液：350mM山梨醇，100mM Tris-HCl，100mM EDTA pH 8.0，0.5％重硫酸鈉；

改良Extraction buffer溶液：350mM山梨醇，100mM Tris-HCl，100mM EDTA pH 8.0，0.5％Na₂S₂O₃；

Lysis buffer溶液：0.2M Tris-HCl pH8，0.05M EDTA，2M NaCl，CTAB 2％；

CTAB溶液(2％(W/V)CTAB)：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.4mmol/L NaCl；

TE緩沖液：10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0；

(6×)Loading buffer溶液：0.25％溴酚藍，40％(m/V)蔗糖；

其他試劑：液氮，SDS(20％)，PVP粉，氯仿(AR)，β-巰基乙醇(2％)，Tris平衡酚，氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，5M NaCl，3M NaAc，預冷的異戊醇(使用前-20℃冰箱保存)，預冷的無水乙醇(使用前存放-20℃冰箱)，70％乙醇，ddH2O(高溫高壓滅菌)。除Tris平衡酚購自中國醫(yī)學科學院生物工程研究所外，其它均為常規(guī)國產(chǎn)試劑。

主要儀器和設備：剪刀，尖底離心管(2mL、1.5mL)，鐵絲，記號筆，濾紙，冰盒及冰塊，移液槍及槍頭(10uL、20uL、50uL、100uL、200uL、500uL、1000uL)，渦旋振蕩儀(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)，水浴鍋，冷凍高速離心機(Thermo MICROLITERF 200/240)，-20℃超低溫冰箱(Harris)，臺式恒溫培養(yǎng)搖床(HNY-200B)，可見紫外分光光度計(ABI)，PCR擴增儀(Biometra)， DYY-III-12B型三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(UVI)。

1.DNA提取方法

方法I：常規(guī)的CTAB法，參照王關林等的《植物基因工程》。

方法II：CTAB-SDS法

①取咖啡樹枝尖新鮮嫩葉2～3片(約0.2～0.3g)，放入2mL尖底離心管中，在液氮條件下快速搗碎，并加入500uL Extraction buffer溶液，放于冰上；

②加150uL提前在水浴鍋中溶化的SDS(20％)，搖勻，放入37℃搖床中搖30～60min；

③加入200uL的5M NaCl溶液，并上下顛倒搖勻；再加入200uL 2％CTAB溶液(提前在65℃水浴鍋中預熱)，混勻后放入水浴鍋中65℃溫浴10～20min；

④加入500uL氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，平衡后充分搖勻，放入離心機4℃、10000rpm離心10min；

⑤吸取上清液至另一個2mL的尖底離心管中，加入500uL氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，放入離心機4℃、10000rpm離心10min；

⑥吸取上清液至1.5mL尖底離心管中，加入600uL預冷的異戊醇(使用前-20℃冰箱保存)，置于-20℃冰箱1～2h或-80℃冰箱10～15min(如稀釋液則放在-20℃冰箱)；

⑦放在離心機上4℃、10000rpm離心10min，倒棄上清液；

⑧加400uL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀物，在離心機上4℃、12000rpm離心10min后棄乙醇，再加250uL預冷的無水乙醇(使用前-20℃冰箱保存)洗滌沉淀物，棄乙醇；放入干燥箱37℃干燥5～10min，緩慢烘干；

⑨將粗提取的DNA沉淀物用600uL TE緩沖液溶解，加入1.5uL 10mg/mL的RNase母液(相當15ug RNase)，放入水浴鍋中37℃溫育30min；

⑩加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，輕輕上下顛倒10次充分混勻，形成乳狀液后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

吸取500uL上清液，重復第⑩步再抽提一次；

吸取400uL上清液，加入1/10體積的3M NaAc、等體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻后放入離心機4℃、6 500rpm離心10min；

吸棄液相，加入200uL 70％乙醇洗滌沉淀物2次，棄乙醇；將管倒扣于濾紙上，使乙醇流盡，風干或自然晾干。加入50μL TE緩沖液或ddH₂O溶解沉淀物；

電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。

方法III：

①取咖啡樹枝尖新鮮嫩葉2～3片(約0.2～0.3g)，放入2mL尖底離心管中，蓋上蓋子，將離心管浸入液氮1～3min后取出用鐵絲搗碎。立即依次加入0.1g PVP粉、0.5mL氯仿(AR)、1mL改良Extraction buffer溶液和20μLβ-巰基乙醇(2％)，然后在渦旋振蕩儀上搖勻。如果不溶，65℃水浴1h充分溶解；

②將溶化后的糊狀物在離心機上4℃、5000rpm離心10min，吸棄上層液相和下層氯仿。再向沉淀物中加入600μL Lysis buffer溶液和12μLβ-巰基乙醇(2％)，混勻后放置65℃水浴鍋中溫浴30min；

③添加300μL酚及300μL的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，輕輕上下顛倒10次充分混勻，形成乳狀液后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

④回收上層液相，重復第③步再抽提一次；

⑤將上層液相移至一個新的1.5mL尖底離心管，加入60μL 3M NaAc、600μL預冷的無水乙醇(使用前-20℃冰箱保存)，輕輕上下顛倒混勻后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

⑥吸棄液相，用1mL預冷的無水乙醇洗滌沉淀物2次，棄乙醇；將管倒扣于濾紙上，使乙醇流盡，風干或自然晾干；

⑦將粗提取的DNA沉淀物用600uL TE緩沖液溶解，加入1.5uL 10mg/mL的RNase母液(相當15ug RNase)，放入水浴鍋中37℃溫育30min；

⑧加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，輕輕上下顛倒10次充分混勻，形成乳狀液后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

⑨吸取500uL上清液，重復第⑧步再抽提一次；

⑩吸取400uL上清液，加入1/10體積的3M NaAc、等體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻后放入離心機4℃、6500rpm離心10min；

吸棄液相，加入200uL 70％乙醇洗滌沉淀物2次，棄乙醇；將管倒扣于濾紙上，使乙醇流盡，風干或自然晾干。加入50μL TE緩沖液或ddH₂O溶解沉淀物；

電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。

方法IV：

①取咖啡樹枝尖新鮮嫩葉2～3片(約0.2～0.3g)，放入2mL尖底離心管中，蓋上蓋子，將離心管浸入液氮1～3min后取出用鐵絲搗碎。立即加入0.1gPVP粉、0.5mL氯仿(AR)和1mL改良Extraction buffer溶液的混合液，再添加20μLβ-巰基乙醇(2％)后于渦旋振蕩儀上搖勻。如果不溶，65℃水浴1h充分溶解；

②將溶化后的糊狀物在離心機上4℃、5000rpm離心10min，吸棄上層液相和下層氯仿。再向沉淀物中加入600μL Lysis buffer溶液和12μLβ-巰基乙醇(2％)，混勻后放置65℃水浴鍋中溫浴30min；

③添加300μL酚及300μL的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，輕輕上下顛倒10次充分混勻，形成乳狀液后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

④回收上層液相，重復第③步再抽提一次；

⑤將上層液相移至一個新的1.5mL尖底離心管，加入60μL 3M NaAc、600μL預冷的無水乙醇(使用前-20℃冰箱保存)，輕輕上下顛倒混勻后放入離心機4℃、12000rpm離心15min；

⑥吸棄液相，用1mL預冷的無水乙醇洗滌沉淀物2次，棄乙醇；將管倒扣于濾紙上，使乙醇流盡，風干或自然晾干。加入50μL TE緩沖液或ddH₂O溶解沉淀物；

⑦電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。

2.DNA質(zhì)量檢測

2.1DNA完整性檢測

取3μL DNA樣品與3μL(6×)Loading buffer溶液混勻，點樣于1％瓊脂糖凝膠上，在電泳儀中4V/cm電壓下電泳40min，然后用凝膠成像儀觀察、拍照，檢測總DNA的完整性。

2.2DNA純度檢測

取10μL DNA樣品用TE緩沖液稀釋至25μL，用TE緩沖液做空白對照。通過紫外分光光度計測定260nm/280nm比值，判斷總DNA的純度。

2.3PCR擴增檢測

擴增體系(20μL)：2μL 10×Buffer(Mg²⁺Plus)，1.6μL dNTP Mixture(2.5mM)，2μL SSR Primer(10μM)，0.2μL Tap DNA polymerase(5units/μL)，1μL模板DNA(50ng/μL)，13.2μL ddH₂O。擴增程序：94℃2min，接著進入下列循環(huán)：94℃45s，55℃1min(每個循環(huán)降低1℃)，72℃1.5min，5個循環(huán)；然后再進入下列循環(huán)：94℃45s，50℃1min，72℃1.5min，30個循環(huán)；72℃8min。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠4V/cm電壓下電泳40min檢測，然后用凝膠成像儀觀察、拍照。

3.結(jié)果與分析

3.1CTAB法、CTAB-SDS法、方法III、方法IV提取的DNA完整性檢測結(jié)果

1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，常規(guī)CTAB法(圖1中1～11泳道)未能充分從植物材料中提取和裂解組織細胞，提取咖啡葉片基因組DNA效果不明顯。CTAB-SDS法(圖2中1～19泳道)提取的DNA中酚類、多糖化合物與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染嚴重，樣品孔EB吸收明顯，DNA與多糖等次生物質(zhì)相結(jié)合在電場中無法遷移，DNA亮帶下方有大量雜質(zhì)污染條帶存在。方法III(圖3中1～5泳道)、方法IV(圖4中6～10泳道)提取的DNA條帶整齊、明亮清晰、無雜帶，而Marker和各樣品孔均有DNA殘余，除3泳道以外的樣品DNA條帶下方均有明顯的拖帶，這是由于電泳時提取的DNA放置時間過長引發(fā)DNA部分降解以及上樣量太多、上樣操作不當和電泳時間太短所致，3泳道因上樣操作失誤未將DNA樣品注進樣品孔。因此，說明方法III、方法IV提取的咖啡葉片基因組DNA完整、純凈，而且觀察發(fā)現(xiàn)，圖3中1～5泳道與6～10泳道的DNA完整性沒有顯著差異。

3.2CTAB-SDS法、方法III、方法IV提取的DNA純度檢測結(jié)果

經(jīng)紫外分光光度計測定，圖2中1～19泳道對應的OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.48～1.65，表明提取的DNA中有大量蛋白質(zhì)、酚類等化合物存在，DNA純度差。圖3中1～5泳道對應的OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.78～1.82，6～10泳道對應的OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.78～1.84，表明方法III、方法IV提取的DNA中沒有蛋白質(zhì)、酚類、RNA等化合物污染，DNA純度較高；而且分析發(fā)現(xiàn)方法III、方法IV提取的DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀沒有顯著性差異，均是適合提取富含酚類、色素、多糖、萜類等次生代謝物質(zhì)的咖啡葉片基因組DNA的較好方法。

3.3CTAB-SDS法、方法III、方法IV提取的DNA PCR擴增驗證

分別以上述CTAB-SDS法(圖2中15泳道)、方法III(圖3中5泳道)、方法IV(圖3中10泳道)提取的DNA作為模板，用篩選出的9對多態(tài)性高的SSR引物進行PCR擴增驗證，擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4、圖5。結(jié)果表明，CTAB-SDS法提取的咖啡葉片基因組DNA無擴增產(chǎn)物(圖4中1～9泳道)，不能用來進行分子標記等分子生物學實驗研究。而方法III(圖5中1～9泳道)、方法IV(圖5中10～18泳道)提取的咖啡葉片基因組DNA擴增結(jié)果均較好，條帶清晰，多態(tài)性顯著，說明方法III、方法IV提取的咖啡葉片基因組DNA完全可用來進行分子標記等分子生物學實驗研究。另外，據(jù)圖5觀察發(fā)現(xiàn)，方法III與方法IV的PCR擴增差異不顯著。

上述DNA質(zhì)量檢測結(jié)果表明，常規(guī)CTAB法、CTAB-SDS法均不能用來提取咖啡葉片基因組DNA，而方法III、方法IV提取咖啡葉片基因組DNA的效果較好，適用于分子標記等分子生物學實驗研究。方法III與方法IV相比較，方法IV比方法III減少了繁雜的DNA純化步驟，所提取的咖啡葉片基因組DNA完整性、 DNA純度以及PCR擴增均沒有顯著性差異，且便于操作、節(jié)藥省時，能顯著提高提取咖啡葉片基因組DNA的效率，適應于咖啡葉片基因組DNA的精細提取和大批量生產(chǎn)。

應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。