本發(fā)明涉及基因研究
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種智力障礙疾病的致病基因模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：智力障礙(mentalretardation，MR)是一種由于神經(jīng)系統(tǒng)異常所導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病。患者在發(fā)育期間一般智力功能明顯低于同一年齡平均水平，同時(shí)對(duì)社會(huì)環(huán)境日常要求的適應(yīng)能力有明顯缺陷，通常在18歲之前發(fā)病。如下表所示，根據(jù)認(rèn)知功能缺陷的程度可以將智力障礙分為輕度(IQ50一70)、中度(IQ35一50)、重度(IQ20一35)和極重度(IQ<20)。術(shù)語智商極重度<20重度20-35中度35-50輕度50-70邊緣70-85智力障礙群體發(fā)病率約為1-3％，其中，中、重度智力障礙發(fā)病率約0.3-0.4％，男女發(fā)病率比約1.4～1.6:1。智力障礙患者在學(xué)齡前(5歲前)常表現(xiàn)為語言、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯等，故稱之為生長發(fā)育遲緩(NevelopmentDelay，Dn)。在所有的智力障礙患者中，約有1/3與遺傳因素相關(guān)。引起智力障礙的因素很多，智力障礙本身是一種復(fù)雜的疾病，與多因素有關(guān)，其中，遺傳因素包括單基因疾病、染色體結(jié)構(gòu)異常、染色體非整倍體和基因組疾病四大類型。智力障礙是一個(gè)影響人類健康、增加社會(huì)和家庭壓力的一類疾病，在歐洲中部，大概有8％的醫(yī)療保健支出花費(fèi)在智力障礙這一疾病上，遠(yuǎn)超其他疾病。智力障礙為家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力，而此類疾病目前并沒有有效的治愈手段，因此，做好產(chǎn)前 診斷和預(yù)防是相當(dāng)必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種智力障礙疾病的致病基因模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。一種智力障礙疾病的致病基因模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：步驟一：提取智力障礙患者及其家人和非智力障礙的正常人的外周血的全基因組DNA；步驟二：對(duì)所述全基因組DNA進(jìn)行片段化處理；步驟三：對(duì)片段化處理后得到的全基因組DNA片段連接測(cè)序接頭；步驟四：擴(kuò)增連接有測(cè)序接頭的全基因組DNA片段；步驟五：捕獲外顯子DNA序列；步驟六：擴(kuò)增目的DNA片段；步驟七：對(duì)擴(kuò)增的目的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SNPs和Indels分析，篩選致病基因，得到智力障礙疾病的致病基因模型。一種使用該智力障礙疾病的致病基因模型的構(gòu)建方法篩選得到的致病基因模型。以及，該致病基因模型在制備診斷智力障礙疾病的診斷芯片或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對(duì)智力障礙患者及其家人和非智力障礙的正常人的外周血全基因組DNA進(jìn)行分析，找到了與相應(yīng)的智力障礙患者相關(guān)的致病基因，有利于了解智力障礙的發(fā)病機(jī)制及產(chǎn)前診斷預(yù)防。但由于智力障礙也是一種復(fù)雜的疾病，單純的致病基因突變并不能作為診斷是智力障礙的標(biāo)準(zhǔn)，還需要結(jié)合其他分析結(jié)果，如染色體核型分析、家族相關(guān)基因譜系分析等確定是否是智力障礙。附圖說明圖1為實(shí)施例中先證者的家系圖譜；圖2為先證者的染色體G顯帶核型；圖3為先證者13、16、21、22、X及Y染色體的FISH實(shí)驗(yàn)圖；圖4為目標(biāo)基因堿基的測(cè)序深度覆蓋率直方圖；圖5為目標(biāo)區(qū)域的累計(jì)深度分布圖；圖6為不同靈長類的ARHGAP4T491序列保守性分析結(jié)果示意圖；圖7為PCR產(chǎn)物電泳圖；圖8為不同基因型測(cè)序結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的智力障礙疾病的致病基因模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。1.研究對(duì)象本實(shí)施例經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過，獲得實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象的知情同意。先證者，男，22歲，漢族，175cm，66kg，出生時(shí)無異常。3歲開始走路，5歲開始說話，腦電圖正常，腦部核磁共振正常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查病理反射(-)，精神發(fā)育遲滯根據(jù)國際疾病分類第十版(ICD-10)診斷標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定為F71.851，中度精神發(fā)育遲緩，F(xiàn)79.902，智力低下，IQ50。先證者的家人，包括其父母、姐姐及弟弟。先證者的家系圖請(qǐng)見圖1，其中，24為先證者，12是先證者母親，13是先證者父親，23是先證者姐姐，25是先證者弟弟。非智力障礙的正常人群100人。可理解，在其他實(shí)施例中，研究對(duì)象也可以取自相應(yīng)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)收集的智力障礙先證者及其家人、以及一些非智力障礙的體外外周血或外周血淋巴細(xì)胞樣本。2.主要儀器、試劑與耗材2.1主要儀器DNAVacuumConcentratorEppendorf(Eppendorf)、CovarisE210(Covaris)、Spectrophotometer(NanoDrop)、DynaMag-2Magnet(Invitrogen)、 480InstrumentII(RocheAppliedScience)、IlluminaHiSeq2000Platform(Illumina)、VortexmixerBarnstead(Thermolyne)、Thermocycler(Bio-Rad)、Bioanalyzer2100(Agilent)、AppliedBiosystems37℃培養(yǎng)箱、電烤箱、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)(上海飛鴿)、顯微鏡(OLYMPUS)、冷凍離心機(jī)(HealForce)、恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf，BioPhotometerplus)、PCR儀(杭州博日)、紫外成像儀(北京六一儀器有限公司)、3730測(cè)序分析儀(美國ABI公司)、電泳儀(天能EPS)、全自動(dòng)分子雜交儀、熒光顯微鏡及分析軟件、冰箱(中國海爾)、迷你離心機(jī)、考普林瓶15個(gè)、移液槍(5ml，1000ul，200ul，10ul)(Eppendorff)、震蕩混勻器、計(jì)時(shí)器、溫度計(jì)、洗耳球、吸量管、燒杯、容量瓶、電子天平。2.2實(shí)驗(yàn)試劑小牛血清、乙醇、甲醇、秋水仙素、乙酸、PHA、TaKaRaHSDNAPolymerase(寶生物工程(大連)有限公司，DR010A)、PBS、HCl、KCl、SSC、NP-40、QIAampDNAKitQiagen、IlluminaTruSeqDNASamplePreparationKit(Illumina)、AgencourtAMPureXPKit(Agencourt)、DynabeadsM-270(StreptavidinInvitrogen)、QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen)、PhusionHigh-FidelityPCRMasterMixwithHFBuffer(NEB(Finnzymes))、AgilentDNA1000Kit(Agilent)、溴化乙錠(上海生工)、50×TAE(Promega)、AGROSE(Ecogen)、DNAMarker(天根生化科技有限公司)、PCRGradeWaterRoche(NimbleGen)、PCRKit(Fermentas)、SeqCapEZHumanExomeLibraryKit(RocheNimbleGen)、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(上海生工)、TIANampGenomicDNAKit(北京天根，DP304)、吉姆薩染粉、甲醇、甘油、生理鹽水、75％乙醇、20×SSC、胰蛋白酶干粉、NaOH、蛋白酶K、胃蛋白酶、FISH試劑盒。2.3耗材載玻片、蓋玻片、離心管(10ml，1.5ml，200μL)油性筆、鉛筆一次性吸管、離心管、個(gè)人防護(hù)用品、、標(biāo)簽紙、松節(jié)油等。3.各種溶液的配制2％胰蛋白酶：2g胰蛋白酶干粉置于燒杯中，加入100mL生理鹽水，混勻，置于4℃冰箱保存。細(xì)胞固定液：甲醇30mL，冰乙酸10mL，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。吉姆薩染液：稱取1g的姬姆色素染料加入66mL甘油，混勻，60℃保溫溶解2h，再加入66mL甲醇混勻，即配成姬姆色素原液。原液：PBS(pH6.8)為1:9，即為工作液。4％NaOH液：用天平稱取4g分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。用200mL量筒準(zhǔn)確取100mL蒸餾水，緩緩注入盛放NaOH固體的三角燒瓶中。搖蕩三角燒瓶使NaOH固體充分溶解。緩緩傾倒入250mL廣口瓶中，密封保存?zhèn)溆?。DEPC水：1mLDEPC溶于1L純凈水中，高壓滅菌。2×SSC/0.1％NP-40：取50ml20×SSC(pH5.3)，0.5mLNP-40，加入400mL雙蒸水，調(diào)pH為7.0，定容至500mL，封口膜封好，室溫保存?zhèn)溆茫行?個(gè)月。2×SSC：用20×SSC和雙蒸水，按1:9的比例稀釋，調(diào)pH為7.0，封口膜封好，4℃保存?zhèn)溆谩?.075MKCl：KCl2.794g溶入500mL去離子水中，備用，4℃低溫保存。1MHCl：取9mL濃HCl加去離子到100mL混勻，4℃保存?zhèn)溆?。保?個(gè)月。0.08mg/L胃蛋白酶工作液：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MlEP管中，加1mL去離子水溶解，分裝到10個(gè)200μL離心管中。使用時(shí)，在考普林瓶中加50mL去離子水，加入500mL1MHCl，加入一管分裝的胃蛋白酶溶液(100μL)。PBS緩沖液：磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.27g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g，氯化鈉(NaCl)：8g，氯化鉀(KCl)0.2g，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。高溫高壓滅菌后室溫保存。酒精配制：取無水乙醇28mL和34mL，分別與12mL和6mL雙蒸水混合，配成70％和85％的酒精，與無水乙醇共同組成70％，85％，100％的系列酒精，封口膜封好，室溫保存?zhèn)溆?。蛋白酶K工作液：稱取0.1g蛋白酶K(PK)干粉溶于2×SSC(pH＝7.0)溶液中，輕輕搖動(dòng)，直至PK完全溶解，不要漩渦混勻。-20℃保存。使用時(shí)取0.4mLPK儲(chǔ)存液溶于40ml2×SSC(pH7.0)溶液中。4.研究方法4.1染色體核型分析外周血淋巴細(xì)胞染色體檢查采用含有PHA和小牛血清的人工液體培養(yǎng)基對(duì)外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)72h，加入秋水仙素使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化停留在中期以獲得更多的中期分裂相，提取淋巴細(xì)胞制片，經(jīng)胰蛋白酶消化、吉姆薩染色后，于顯微鏡下檢查染色體數(shù)目和形態(tài)。4.1.1標(biāo)本采集肝素鈉真空管抽取靜脈血4mL，立即混勻、接種(患者在放療、化療和使用抗生素治療期間抽血做染色體檢查會(huì)顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，很有可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗而無法進(jìn)行診斷，因此請(qǐng)盡量避免在上述治療期間做染色體檢查。標(biāo)本采集時(shí)注意用品消毒，嚴(yán)格無菌。)。4.1.2標(biāo)本接種用2.5mL注射器向培養(yǎng)液中滴加混勻后的全血約0.5mL(成人)、0.4mL(<5周歲的兒童)，搖勻，放入37℃孵箱培養(yǎng)72h，并做好記錄。標(biāo)本接種全過程應(yīng)在超凈工作臺(tái)、無菌環(huán)境下進(jìn)行，嚴(yán)防外界細(xì)菌污染實(shí)驗(yàn)用品和標(biāo)本。4.1.3加秋水仙素加秋水仙素前注意觀察培養(yǎng)基上清液是否仍清亮，若上清變混濁，說明標(biāo)本被污染，應(yīng)立即重新抽血再次培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至第70h時(shí)，用1mL注射器向培養(yǎng)液中加入秋水仙素0.07mL/瓶，搖勻再培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。4.1.4收集細(xì)胞將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至15mL刻度離心管中，1500轉(zhuǎn)/分，離心10min，取出離心管棄去上清液。沿管壁緩緩加入已預(yù)熱至37℃的0.075mol/LKCl溶液7-8mL，懸起沉淀的細(xì)胞，置37℃水浴12min，在低滲溶液中使RBC溶解，淋巴細(xì)胞膨脹、染色體分散。4.1.5固定從水浴箱中取出離心管，沿管壁緩緩加入新鮮配制的固定液(甲醇：乙酸3：1)1-2mL，小心混勻，室溫靜置2min，1500轉(zhuǎn)/分，離心10min，棄上清液，用吸管輕輕吹打沉淀直至吹打均勻?yàn)橹?，沿管壁緩緩加入新鮮配制的固定液8mL，混勻，室溫靜置≥30min，重復(fù)上述步驟兩次，第二次放室溫>2h可不再固定第三次，或連續(xù)固定三次，每次不少于30min。4.1.6制片將固定后管底沉淀的細(xì)胞用吸管輕輕吹打直至吹打均勻?yàn)橹?，加適量固定液混勻，從一定高度將細(xì)胞懸液滴落在冰玻片上，立即置75℃烤箱3h，或75℃烤10min后轉(zhuǎn)65℃烤過夜。4.1.7顯帶將2％的胰蛋白酶1mL加入已預(yù)熱至37℃的約50mL生理鹽水中，充分混勻，加入0.1NNaOH8滴調(diào)節(jié)pH至7.0，一次性吸管吸取約3-4mL飽和吉姆薩染液加入約50mL磷酸鹽緩沖液中，充分混勻，G顯帶，立即吹干。G顯帶法：制好的玻片浸入胰酶中消化30秒，立即取出浸入生理鹽水，立即取出浸入稀釋后的吉姆薩染液中染色約4分鐘，自來水沖清、吹干即可。4.1.8染色體形態(tài)觀察將玻片置于顯微鏡下觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)。4.2FISH使用熒光原位雜交(FluorensenceinSituHybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行部分染色體三體(13，16，18，21，22，X，Y)檢測(cè)。4.2.1樣本玻片制備1)樣本采集。取外周血細(xì)胞懸液(2-5mL)置入肝素抗凝管中，4℃保存，不能過夜。2)將樣本移入15mL離心管中，加入PBS，1200rpm，離心8min，去上清。可以重復(fù)一次。去上清，加入5mL37℃預(yù)熱的0.075M的KCl，重新吹打懸浮細(xì)胞，37℃水浴低滲15-20min，期間吹打2～3次。3)預(yù)固定。直接于細(xì)胞低滲混合液中緩慢加入2mL固定液(甲醇：冰醋酸 ＝3：1，必須現(xiàn)配現(xiàn)用)，輕輕吹打混勻。4)一固定。1500RPM離心8min，去上清，室溫下緩慢加入5mL固定液，輕輕吹打懸浮細(xì)胞。5)二固定。1500RPM離心8min，去上清，室溫下緩慢加入5mL固定液，輕輕吹打懸浮細(xì)胞。1500RPM離心8min，去上清。(固定至細(xì)胞完全無紅色，呈乳白色)6)細(xì)胞懸液的制備和保存。根據(jù)細(xì)胞量加適量的固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液。輕輕吹打混勻后，取適量懸液滴于處理好的干燥玻片上，自然晾干后，于光鏡下觀察細(xì)胞密度。剩余細(xì)胞懸液置-20℃冰箱中可保存1個(gè)月。在此期間可隨時(shí)取出，離心去上清加入新鮮固定液，用于制片。7)老化玻片。室溫下過夜老化玻片或56℃烤片機(jī)上烘烤30min以上，老化備用。4.2.2玻片預(yù)處理37℃2×SSC(pH7.0)均衡玻片30分鐘。將玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分鐘脫水。自然干燥玻片。4.2.3變性雜交56℃，烤片2-5分鐘。探針準(zhǔn)備：雜交液8μL，探針2μL，加入到0.5mL離心管中混勻，離心1～3秒，備用。將10μl探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用封片膠封邊準(zhǔn)備雜交儀器，共變性條件，78℃7分鐘，雜交條件，42℃16h。4.2.4玻片洗滌46℃，2×SSC洗5分鐘。46℃，0.1％NP-40/2×SSC洗片5分鐘。室溫，70％乙醇洗片3分鐘，并于暗處自然風(fēng)干玻片。在室溫下，將15μlDAPI復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片，15分鐘后觀察。4.2.5FISH結(jié)果觀察首先在10×物鏡下，于FISH標(biāo)本上找到細(xì)胞區(qū)域；然后在40×物鏡下掃描整個(gè)雜交區(qū)域，觀察標(biāo)本的質(zhì)量，滿意的標(biāo)本應(yīng)是75％以上細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)；在100×物鏡下觀察細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì) 胞。4.3全基因外顯子組測(cè)序4.3.1全基因組DNA提取全基因組DNA根據(jù)說明用QIAampDNABloodMinikit(Qiagen，Hilden，Germany)從研究對(duì)象外周血中提取出來。具體操作步驟如下：EDTA抗凝管抽取血樣2mL，混勻，吸取200μL置于1.5mL離心管中。往離心管中加入蛋白酶K20μL，搖勻。置于水浴箱中56℃孵育10min。從水浴箱中去除，瞬時(shí)離心。加入200μL無水乙醇，搖勻，瞬時(shí)離心。將Minispincolumn置于2mL收集管，將液體全部加入離心管，蓋好，6000×g，1min。丟棄收集管及液體。將Minispincolumn置于另一2mL收集管，加入AW1緩沖液500μL，蓋好，6000×g，1min。丟棄收集管及液體。將Minispincolumn置于另一2mL收集管，加入AW2緩沖液500μL，蓋好，2000×g，3min。丟棄收集管及液體。將Minispincolumn置于另一2mL收集管中，加入AE緩沖液200μL，室溫放置1min，6000×g，1min。收集洗脫的基因組DNA，并對(duì)提取到的DNA進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。4.3.2全基因外顯子組捕獲根據(jù)操作說明用NimbleGenSeqCapEZHumanExomeLibraryv2.0kit(RocheNimbleGenInc.，Wisconsin，USA)對(duì)外顯子進(jìn)行捕獲，共包括樣本全基因組DNA片段化、接頭連接、LM-PCR擴(kuò)增全基因組DNA、雜交及捕獲全基因外顯子組、通過LM-PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段等五個(gè)步驟。1)全基因組DNA片段化取已獲得的DNA，加入1×TEbuffer至120μL，用DNA切割儀將DNA隨意切割成150bp-200bp的片段。用AMPure磁珠純化切割所得的片段。2)接頭連接在片段化的DNA3’端加“A”并連接測(cè)序接頭(IlluminaPaired-EndSamplePreparationKit)，并用AMPure磁珠純化所得的片段。3)LM-PCR擴(kuò)增全基因組DNA表1LM-PCR擴(kuò)增全基因組DNA實(shí)驗(yàn)體系試劑體積(μL)2×mix50.0ddH2O26.0TS-PCRoligo12.01TS-PCRoligo22.0樣品20.0總體積100.0PCR擴(kuò)增參數(shù)：98℃30sec，(98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec)×8，4℃5min，4℃hold。4)雜交及捕獲全基因外顯子組按順序加入COTDNA、擴(kuò)增后的目標(biāo)序列、DNA文庫、PE-HE1和PE-HE2oligos后真空熱干燥，加入適量的2×雜交液及雜交組分A，95℃變性10分鐘，47℃雜交72h。用免疫磁珠捕獲外顯子DNA序列。5)通過LM-PCR法擴(kuò)增目標(biāo)片段表2LM-PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列DNA實(shí)驗(yàn)體系試劑體積(μL)2×Mix50Sample20100ΜmPE-PRE1oligo2100ΜmPE-PRE2oligo2ddH2O26總體積100PCR擴(kuò)增參數(shù)：98℃30sec，(98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec)×18，72℃5min，4℃hold。4.3.3高通量測(cè)序所獲得的目標(biāo)文庫序列上機(jī)測(cè)序(Hiseq2000測(cè)序儀)，測(cè)序所得原始圖像文件經(jīng)過Illuminabase-callingSoftware1.7進(jìn)行堿基讀取，獲得讀長為90bp雙末端序列(reads)。4.4數(shù)據(jù)處理及分析4.4.1原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所得的序列結(jié)果用SOAPaligner(SOAP2.20)分析測(cè)序結(jié)果，包括測(cè)序序列長度、測(cè)序深度、測(cè)序總量、文件輸出總量、測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度等，并通過這些指標(biāo)結(jié)果來評(píng)估測(cè)序質(zhì)量。4.4.2SNPs及Indels檢測(cè)分析所得的序列結(jié)果用SOAPaligner(SOAP2.20)與NCBI的參考基因相比較。共有序列和每一個(gè)等位基因的質(zhì)量通過用SOAPsnp系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行分析。所預(yù)測(cè)的SNPs應(yīng)該滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：(a)SNP質(zhì)量值大于或等于20；(b)測(cè)序深度應(yīng)在4×到10，000，000×之間；(c)所預(yù)測(cè)的拷貝數(shù)小于2；(d)兩個(gè)SNPs之間的距離應(yīng)大于5bp；(e)運(yùn)用BWA軟件來進(jìn)行Indels的分析。4.4.3致病基因篩選1)用SIFT(SortingIntolerantFromTolerant)對(duì)SNPs進(jìn)行分析評(píng)分，當(dāng)評(píng)分值大于0.05時(shí)表示這個(gè)突變是可以接受的，即對(duì)蛋白質(zhì)功能沒有影響或者影響較小，標(biāo)記為“tolerated”；當(dāng)小于或等于0.05的時(shí)候則說明這個(gè)突變是有害的，即對(duì)蛋白質(zhì)功能有較大影響，標(biāo)記為“damaging”，所選出的突變基因應(yīng)是“damaging”。2)將測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI人類參考基因序列(NCBIbuild37)、NCBIdbSNPBuild132、千人基因組、hapmap、YH數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，基因不存在于這些基因庫中。3)結(jié)合家系分析，篩選可能基因。4)用GO(GeneOntology)分析和KEGG分析查找相關(guān)的可能致病基因功能，分析排除。5)用Clustalw2在線軟件ARHGAP4T491進(jìn)行序列保守性分析。4.5Sanger測(cè)序驗(yàn)證致病基因在用全基因組測(cè)序方法確定致病基因后，用sanger測(cè)序法對(duì)全基因組外顯 子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并在先證者的家人中探究該基因的表達(dá)情況，在100例非智力障礙的正常人中驗(yàn)證該基因突變的存在情況。4.5.1基因組DNA提取DNA提取步驟嚴(yán)格按天根TIANampGenomicDNAKit說明書進(jìn)行。1)向緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇。2)細(xì)胞樣品加入200μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。3)加入20μLProteinaseK溶液，混勻。4)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。5)加人200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)。7)12，000rpm(～13，400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。9)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。10)重復(fù)操作步驟8。11)將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(～13，400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。12)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12，000rpm(～13，400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。4.5.2電泳檢測(cè)DNA提取情況1)煮膠：稱取0.5g瓊脂糖置于錐形瓶，后量取50mL1×TAE混勻，置于微波爐中中高火煮2min。2)凝膠：清洗凝膠槽，濾紙擦干，倒膠凝膠1h。3)加樣：取3μL2xLoadingBuffer(含20％SYBR染料)與3μLDNA混勻，點(diǎn)樣。4)電泳：120V，20min。5)電泳完成后，置于紫外儀觀察并照相。4.5.3PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列表3PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列DNA實(shí)驗(yàn)體系PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃3min，(94℃30s，55～58℃35s，72℃40s)×35，72℃5min，4℃hold。引物序列如下：ARHGAP4-F:5'CTCTCTGCACAGGGTGAAGT3'ARHGAP4-R:5'GTGGCACAGAACATGGACTC3'5.結(jié)果及分析5.1先證者染色體核型正常如圖2所示，G顯帶核型分析證明先證者的染色體核型為(46，XY)。如圖3所示，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)先證者染色體13，16，21，22，X，Y均無三體情況。 由此，可以排除染色體結(jié)構(gòu)異常、染色體非整倍體方面的原因造成的智力障礙。從該家庭的家系圖可見，先證者父母、姐姐和弟弟均為正常表型，可判斷在此家庭中的智力障礙屬于伴X染色體隱性遺傳疾病。先證者中度精神發(fā)育遲緩，智力低下，IQ50符合智力障礙評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。5.2全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果5.2.1全基因外顯子組高通量測(cè)序概況用高通量外顯子測(cè)序?qū)ο茸C者進(jìn)行外顯子測(cè)序，如表4、圖4和圖5所示，在本實(shí)施例的結(jié)果中，目標(biāo)區(qū)域共計(jì)46036367bp，測(cè)序覆蓋率為99.13％，目標(biāo)區(qū)域的平均測(cè)序深度為141.36，平均讀長為89.88bp，chrX的測(cè)序深度為101.92，chrY的測(cè)序深度為158，GC堿基對(duì)出現(xiàn)率為43.82％，這些數(shù)據(jù)均表明本次全基因外顯子組的測(cè)序質(zhì)量良好，數(shù)據(jù)可靠。圖4中，X-測(cè)序深度，Y-對(duì)應(yīng)測(cè)序深度目標(biāo)基因堿基所占比率；圖5中X-測(cè)序深度，Y-取得的分?jǐn)?shù)達(dá)到或超過一個(gè)給定的測(cè)序深度。表4全基因外顯子組測(cè)序概況ExomeCaptureStatistics先證者Targetregion(bp)(1)46036367Rawreads154317500Rawdatayield(Mb)13889Readsmappedtogenome123252949Readsmappedtotargetregion(2)87220162Datamappedtotargetregion(Mb)6507.56Meandepthoftargetregion(X)141.36Coverageoftargetregion(％)99.13Averagereadlength(bp)89.88Rateofnucleotidemismatch(％)0.27Fractionoftargetcovered>＝4X(％)97.4Fractionoftargetcovered>＝10X(％)94.22Fractionoftargetcovered>＝20X(％)89.56Capturespecificity(％)(3)70.97Readsmappedtoflankingregion(4)14653823Meandepthofflankingregion(X)38.17Coverageofflankingregion(％)96.48Fractionofflankingcovered>＝4X(％)86.73Fractionofflankingcovered>＝10X(％)69.69Fractionofflankingcovered>＝20X(％)50.66Fractionofuniquemappedbasesonorneartarget82.11(％)Duplicationrate(％)(5)17.98MeandepthofchrX(X)101.92MeandepthofchrY(X)158GCrate(％)43.82GendertestresultM注：(1)Targetregion是指實(shí)際覆蓋的設(shè)計(jì)的探針的區(qū)域。(2)Readsmappedtotargetregions是指讀取內(nèi)或與目標(biāo)區(qū)域重疊。(3)Capturespecificity是指比對(duì)到目標(biāo)區(qū)域的有效數(shù)據(jù)量占總的數(shù)據(jù)量的比例。(4)Flankingregion是指區(qū)域+/-200bp的每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的兩側(cè)。(5)PCR復(fù)制對(duì)兩鏈的起始和終止都是相同的，偶然不相同的情況很少發(fā)生。Duplicationrate是復(fù)制序列的部分。5.2.2致病基因的篩選如表5所示，用SOAPaligner對(duì)所得的外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，用BWA軟件來進(jìn)行Indel的分析，共在先證者外顯子中鑒別出108767個(gè)突變，包括101787個(gè)SNPs和6980個(gè)Indels。表5高通量測(cè)序所得SNP、Indels信息如表6和表7所示，將測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI人類參考基因序列(NCBIbuild37)、NCBIdbSNPBuild132、千人基因組、hapmap、YH數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)高通量 測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)生在X染色體上的突變共有10個(gè)，其中SNP7個(gè)，Indel3個(gè)。表6表7如表8、表9和表10所示，對(duì)這些鑒別出來的突變基因用SIFT進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估，并對(duì)基因功能進(jìn)行逐一排查，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)發(fā)生在X染色體上的突變只有ARHGAP4(chrX：153173202[g.153173202G>A；p.Thr941Met])。表8表9表10ARHGAP4測(cè)序信息patientGeneNameARHGAP4ChromosomechrXPosition153173202Depth6ReferencealleleGnunberofreadswithRef.allele[freq.]0AlternateAlleleAnunberofreadswithAlt.allele[freq.]6mutationtypemissenseCodonsACG2822ATGSubstitutionT941MGenedescriptionRhoGTPaseactivatingprotein4在生物進(jìn)化的過程中，基因序列的保守性與其功能重要性存在重要關(guān)聯(lián)，主要是由于在進(jìn)化過程中，重要的功能基因因?yàn)檫M(jìn)化選擇而得以保存，而非功能基因片段的突變對(duì)機(jī)體存活影響不大而使相關(guān)的突變可以被容忍并且得以累積，因此，當(dāng)不同的個(gè)體間同一個(gè)位點(diǎn)序列越保守，會(huì)被認(rèn)為功能越重要，其突變所引起的后果越嚴(yán)重。如圖6所示，Sanger測(cè)序法證實(shí)ARHGAP4突變是導(dǎo)致X染色體相關(guān)智力障礙的原因，本實(shí)施例用Clustalw2在線軟件對(duì)靈長類多個(gè)物種的ARHGAP4T491進(jìn)行序列保守性分析，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)在靈長類多個(gè)物種中均表現(xiàn)出保守性。本實(shí)施例利用sanger測(cè)序法對(duì)先證者及其家人(父親、母親、姐姐及弟弟)、100例智力障礙以外的人進(jìn)行ARHGAP4基因測(cè)序。所用引物為ARHGAP4-F:5'CTCTCTGCACAGGGTGAAGT3'，ARHGAP4-R:5'GTGGCACAGAACATGGACTC3'，電泳結(jié)果如圖7所示，1：父親:2：母親:3：先證者姐姐:4：先證者5：先證者弟弟，產(chǎn)物質(zhì)量良好。如圖8所示，Sanger測(cè)序所得父親在ARHGAP4153173202的堿基為G/G，母親為A/G，姐姐為G/G，弟弟為G/G，先證者為A/A，100例正常人對(duì)照結(jié)果為G/G。 由此可見，sanger測(cè)序結(jié)果與外顯子測(cè)序結(jié)果一致。家系臨床資料與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在尋找此家系的智力發(fā)育不全所導(dǎo)致因素時(shí)，本實(shí)施例通過分析其核型、用FISH來分析其染色體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該家系的發(fā)病原因與染色體結(jié)構(gòu)異常無關(guān)，結(jié)合到家系的遺傳信息，判斷該家系的智力障礙屬于單基因遺傳性疾病，因此用外顯子測(cè)序方法來尋找其致病基因。單基因病是單基因遺傳病是指符合孟德爾遺傳定律的、由單個(gè)基因或一對(duì)等位基因發(fā)生突變所致的遺傳病。根據(jù)基因所在位置、疾病遺傳屬于顯性遺傳或者顯性遺傳可以把單基因遺傳病分為五種：常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X染色體連鎖顯性遺傳病、X染色體連鎖隱性遺傳病和Y染色體連鎖遺傳病。X染色體連鎖隱性遺傳病的最主要特點(diǎn)是家系內(nèi)男性發(fā)病率明顯比女性高(甚至只有男性發(fā)病)，隔代遺傳，如紅綠色盲和家族性低色素貧血等。通過對(duì)先證者家系來進(jìn)行分析，家系內(nèi)表現(xiàn)出來的患者均為男性，且符合隔代遺傳的特點(diǎn)，可以判斷其為X染色體連鎖隱性遺傳病。從外顯子測(cè)序結(jié)果和sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果可見，父親在ARHGAP4153173202的堿基為G/G，母親為A/G，姐姐為G/G，弟弟為G/G，先證者為A/A，100例正常人對(duì)照結(jié)果為G/G，ARHGAP4基因是該家系智力發(fā)育不全的相關(guān)基因。當(dāng)153173202位點(diǎn)的參考?jí)A基為G，當(dāng)其突變?yōu)锳時(shí)成為致病基因。G是X染色體上的顯性因素，A為隱性因素，雜合狀態(tài)時(shí)由于正常的顯性基因的作用掩蓋致病基因作用而不發(fā)病。ARHGAP4基因與蛋白功能ARHGAP4基因與大腦的發(fā)育相關(guān)。ARHGAP4位于Xq28，基因坐標(biāo)為X:153172829-153191776(NCBI)，最早是Tribioli等在1996年在構(gòu)建Xq28上的轉(zhuǎn)錄圖時(shí)發(fā)現(xiàn)的，長約200kb，共編碼3.5kbmRNA，翻譯的蛋白共計(jì)946個(gè)氨基酸。在自然界中存在有很多RhoGTPase調(diào)節(jié)分子，在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的也有很多報(bào)道。ARHGAP4基因編碼的ARHGAP4也稱為C1、P115、KIAA0131、RGC1、RhoGAP4，是一種RhoGAP，其是RhoGTPase激活蛋白家族中的成員，作用于 RhoGTPase，朝胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，引起下游效應(yīng)。ARHGAP4由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中包括一個(gè)N端FCH(Fer/FesCIP4homology)結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)Coiled-coil基序，一個(gè)中間RhoGAP(RhoGTPase-activatingprotein)結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)C端SH3(Srchomology3)結(jié)構(gòu)域。FCH域?qū)τ诳臻g定位ARHGAP4到NIH/3T3細(xì)胞和軸突生長錐的前緣是重要的，并且GAP域和C末端的SH3域?qū)RHGAP4介導(dǎo)抑制的細(xì)胞和軸突蠕動(dòng)是必需的。RhoGAP在神經(jīng)系統(tǒng)中有重要作用，其通過影響所調(diào)節(jié)的RhoGTPase或擾亂RhoGTPase所在的信號(hào)通路而起作用。同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞中不同的RhoGTPase表達(dá)情況高度表明RhoGAP在不同的神經(jīng)元中有不同的表達(dá)，在機(jī)體的發(fā)育和分化過程中的大腦特定區(qū)域占有獨(dú)立專門的作用。ARHGAP4mRNA表達(dá)在發(fā)育中的、成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中均能見到。在進(jìn)一步的蛋白分析中，發(fā)現(xiàn)ARHGAP4在神經(jīng)系統(tǒng)中的特定區(qū)域特異性表達(dá)，其中包括了海馬區(qū)中的CA3區(qū)域的透明層、腦干和紋狀體的策府的神經(jīng)纖維、顆粒細(xì)胞。亞細(xì)胞中，內(nèi)源性的ARHGAP4表達(dá)位于高爾基復(fù)合體并可再分配到微管，就比如說有絲分裂中的微管。此外，本實(shí)施例研究還發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞的不同分化程度的神經(jīng)元細(xì)胞中有不同的蛋白表達(dá)。這些研究都說明ARHGAP4與精神發(fā)育相關(guān)。在本實(shí)施例的研究以前，ARHGAP4基因突變的臨床表型并不十分清楚，而本實(shí)施例的研究清楚顯示ARHGAP4中的一個(gè)堿基突變會(huì)導(dǎo)致智力障礙。本實(shí)施例運(yùn)用了外周血染色體核型檢查法、FISH實(shí)驗(yàn)法、外顯子測(cè)序法，并結(jié)合了該家系的遺傳特點(diǎn)篩選出了該疾病的致病基因，最后用sanger測(cè)序法對(duì)致病基因進(jìn)行篩選驗(yàn)證。幾種研究方法穿插利用及結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，有效地保證了本實(shí)施例數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，在疾病致病基因篩選的過程中，立足疾病的本身的特點(diǎn)是最重要的。研究數(shù)據(jù)與疾病的特點(diǎn)相結(jié)合，才能找到準(zhǔn)確的致病基因。篩選出的ARHGAP4的突變基因可以用于設(shè)計(jì)檢測(cè)智力障礙的檢測(cè)芯片或檢測(cè)試劑，用于智力障礙的產(chǎn)前診斷和預(yù)防。但由于智力障礙也是一種復(fù)雜的疾病，單純的ARHGAP4基因突變并不能作為診斷是智力障礙的標(biāo)準(zhǔn)，還需要結(jié)合其他分析結(jié)果，如染色體核型分析、家族相關(guān)基因譜系分析等確定是否是智力障礙。查找智力障礙家系致病原因的必要性在中國，人口基數(shù)大，人口增長快。據(jù)國家人口計(jì)生委數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年出生的新生兒約2000萬，而出生缺陷兒約占總新生兒人數(shù)的4％到6％，即每年約有80萬到120萬的缺陷兒出生，由此推算我國平均每30秒鐘就有1名缺陷兒出生。XLMR發(fā)生率在男性約1/600～1/1000，危害人類健康，及時(shí)有效地查找出生缺陷的病因，以采取積極有效的措施減少或避免缺陷兒出生，是我國及世界各國面臨的一個(gè)巨大難題。在已發(fā)現(xiàn)的所報(bào)道的XLMR致病基因中，大多數(shù)基因只存在于個(gè)別的家系或患病患者中，甚至還有一些XLMR家系目前僅能鎖定致病基因所在的X染色體特定區(qū)域，而不能確定具體的致病基因，可見在XLMR的致病基因查找的過程中還有大量的工作需要進(jìn)行。高通量測(cè)序的高速發(fā)展，對(duì)基因突變的快速定位，定會(huì)給XLMR致病基因的篩選提供有力的幫助。發(fā)現(xiàn)了XLMR的致病基因，可有效地進(jìn)行產(chǎn)前篩查，幫助減相關(guān)家庭和社會(huì)的壓力。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3