一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因SNP位點(diǎn)的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因SNP位點(diǎn)的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明屬于涉及基因檢測領(lǐng)域，其檢測方法是：(1)、樣品DNA的提?。?2)、DNA模板多重PCR反應(yīng)；(3)、DNA片段化；(4)、DNA末端修復(fù)；(5)、接頭連接；(6)、連接產(chǎn)物純化；(7)、PCR富集；(8)、PCR產(chǎn)物純化；(9)、文庫質(zhì)量檢測；(10)、高通量測序；(11)、測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析；本發(fā)明具有檢測通量高、靈敏度、特異性強(qiáng)及操作簡便且安全，而且本發(fā)明操作能夠更迅速、更準(zhǔn)確、更全面；不含有毒有害物質(zhì)，對試驗(yàn)人員以及環(huán)境都無危害。
【專利說明】
一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及Rett綜合癥基因突變位點(diǎn)的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] Rett綜合征(Rett syndrome，RTT)是一種X連鎖的神經(jīng)發(fā)育障礙性遺傳病，嚴(yán)重影 響兒童精神運(yùn)動發(fā)育，在女童中的發(fā)病率為1/10000-1/15000; Rett綜合征是僅次于21三體 綜合癥引起散發(fā)性嚴(yán)重智力障礙的主要原因之一;典型的Rett的臨床特癥為:嬰幼兒出生 后6~18個月生長發(fā)育基本正常，隨后出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育停滯或倒退，喪失已獲得的技能（如手 的功能、語言等），頭圍增長緩慢，呼吸異常，出現(xiàn)手的刻板動作（如搓手、絞手、吃手等），伴 有孤獨(dú)癥樣行為;此外，驚厥發(fā)作也是Rett綜合癥常見的癥狀之一，而且到了 Rett綜合癥后 期，患病兒童還可能會出現(xiàn)骨骼改變、脊柱側(cè)彎及強(qiáng)直等一系列的癥狀;臨床上Rett綜合癥 分為典型和不典型二大類:典型的Rett綜合癥病程通常分為4個時期，即發(fā)育停滯期、快速 倒退期、假性靜止期和運(yùn)動惡化期;不典型的Rett綜合癥病程通常分5種類型，即早發(fā)驚厥 型、保留語言變異型、先天型、頓挫型和晚發(fā)退化型。
[0003] 1999年相關(guān)研究首次公布Rett于MECP2基因突變連鎖，已證實(shí)40%~80%的典型 Rett患兒存在該基因突變，但Rett家族和非典型Rett患兒該基因突變的檢出率相對較低， 分別為20%~29%和10%~50%;人類MECP2基因位于Xq28,基因全長76kb，包括5端非翻譯 區(qū)、4個外顯子以及3端非翻譯區(qū);MECP2蛋白的表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性，在腦、肺、脾的 表達(dá)水平最高，目前有限出現(xiàn)于成熟神經(jīng)元中；MECP2蛋白在DNA甲基化調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄過程 中起著重要作用，是一種高度的染色質(zhì)結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)，但MECP2基因突變卻僅引起神 經(jīng)系統(tǒng)特異的發(fā)育性疾病;利用基因敲除技術(shù)造成小鼠 MECP2基因完全缺失或選擇性腦組 織缺失，均出現(xiàn)與人類Rett類似的表型，且突出表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，這提示發(fā)育的中 腦比其他組織更依賴MECP2蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用，推測致病機(jī)制為MECP2基因突變導(dǎo)致蛋白 結(jié)構(gòu)和功能異常，使胚胎發(fā)育時期應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)錄靜止的基因繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，而這種"轉(zhuǎn)錄噪音"對神 經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育具有致病作用;在典型的Rett患兒中，已報道了近200種MECP2基因突變， 包括點(diǎn)突變、缺失、插入，其突變多發(fā)生于外顯子3和4,其中熱點(diǎn)突變是位于8個CpG位點(diǎn)的C >T(約占70 % )，MBD區(qū)以錯義突變?yōu)橹?，TRD、C末端以無義突變和移碼突變?yōu)橹?RTT的主要 致病基因是MECP2,近年來在不典型Rett的中還發(fā)現(xiàn)了⑶KL5和F0XG1基因突變，這提示著 CDKL5和F0XG1基因可能與MECP2基因一樣共同在Re 11的致病過程中發(fā)揮作用。
[0004] 目前，對于Rett綜合癥的診斷多是通過臨床表現(xiàn)進(jìn)行判斷，然而僅僅通過臨床表 現(xiàn)進(jìn)行診斷難免沒有說服性，因此建立基因測定輔助臨床早期確診Rett患者是十分必要 的；現(xiàn)階段對于Rett的基因檢測大部分是關(guān)于MECP2基因突變的檢測，主要通過普通PCR擴(kuò) 增及一代測序的方法進(jìn)行，一次可檢測的樣本及位點(diǎn)少，靈敏度低，耗時長，操作繁瑣；因此 我們采用高通量測序?qū)σ伤芌ett患者進(jìn)行MECP2、CDKL5以及F0XG1基因突變檢測，一次可檢 測多個突變位點(diǎn)、靈敏度高、操作簡便、用時短，可快速進(jìn)行Rett綜合癥的早期輔助診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種通過高通量測序檢測待測樣本中 MECP2、CDKL5以及F0XG1基因中熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)的試劑盒，用以輔助診斷Rett綜合癥的方法;該 試劑盒檢測通量高、靈敏度高、特異性強(qiáng)，一次檢測能夠覆蓋數(shù)百個熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明為了解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種基于二代測序檢測Rett綜 合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒能夠一次性檢測Rett綜合癥致病基因 MECP2、 CDKL5以及F0XG1的共57個SNP位點(diǎn)，
[0007] 其中，所述MECP2的24個SNP位點(diǎn)：c.98dupA、c.316C>T、c.317G>A、c.378delT、 c.397C>T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、 c.582C>T、c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、 c. 763C>T、c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C;
[0008] 所述 CDKL5 的 18 個 SNP 位點(diǎn)：c.ll9C>T、c.l75C>T、c.l83delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T;
[0009] 所述F0XG1 的 15個SNP位點(diǎn)：c. 256C>T、c. 256dupC、c.460dupG、c.460dupG、 c.552dupC、c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、 c.969delC、c.1200C>G、c.1248C>G。
[0010]其中，SNP:單核苷酸多態(tài)性指的是由單個核苷酸一A，T，C或G的改變而引起的DNA 序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。
[0011] 3即位點(diǎn)的表示方法：如(：.31601'表示核酸的第316位置上的堿基由(：變成了1'; c. 98dupA表示核酸第98位置上的堿基A重復(fù)出現(xiàn)了； 806delG表示核酸第806位置上的堿基G 缺失。
[0012] 引物:為正向引物及反向引物等所有引物的統(tǒng)稱，所述引物是人工合成的兩段寡 核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與感興趣區(qū)域 另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ);在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中，已知一段目的基因的核 苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因 DNA受熱變性后解鏈為單 鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸 后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。
[0013] 其檢測方法，包括以下具體步驟：
[0014] 1、樣品DNA提?。?br>[0015]抽取10例Rett綜合癥病患和10例健康人的血液樣本各lml，共20例，將抽取的血液 樣本分別置于20個1.5ml、加入抗凝劑的離心管中，后通過采用特異性結(jié)合DNA的離心吸附 柱系統(tǒng)進(jìn)行血液樣本DNA的提取，得到含有DNA的DNA溶液;提取完后再對DNA溶液中的DNA進(jìn) 行完整性、濃度及純度測定；測定過程中，如電泳條帶無彌散，則證明所提取的DNA是完整 的、未降解的；另外，采用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，通常情況下，高純度的DNA 的0D26Q/0D28()應(yīng)介于1.8~2.0之間，后將所測定過的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶 液放置于_20°C的環(huán)境中備用；
[0016]所述離心吸附柱系統(tǒng)提取DNA的原理:在離心吸附柱內(nèi)使用一種特殊的硅基質(zhì)濾 膜，這種濾膜在低PH值、高濃度鹽存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白質(zhì)和其它 雜志不會被吸附。再通過一系列漂洗、離心等步驟將殘留的雜質(zhì)蛋白以及細(xì)胞中的其它有 機(jī)化合物去除，最后用低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將DNA從濾膜上洗脫下來;得到含有DNA的 DNA溶液；
[0017] 2、DNA模板多重PCR反應(yīng)：
[0018] 在新的PCR管中加入如下試劑：提取好的DNA溶液4.5ul、PCR緩沖液4ul、 MgChl. 5ul、DNA聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，將上述混合物 混勻后放入PCR儀中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，上述擴(kuò)增反應(yīng)程序步驟為:95 °C反應(yīng)3min，后95 °C反 應(yīng)15s，后60 °C反應(yīng)30s，最后72 °C反應(yīng)20s，上述反應(yīng)從95 °C反應(yīng)3min到72 °C反應(yīng)20s共反應(yīng) 13個循環(huán)，13個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后即得:經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液;所述經(jīng)過多重PCR反應(yīng) 的DNA溶液用于測序文庫的構(gòu)建；
[0019] 其中，PCR:又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高 溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具 有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點(diǎn)；它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分 析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方；另外，PCR又稱為無細(xì)胞分子 克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)；
[0020] 多重PCR擴(kuò)增:一般PCR僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用 于單一致病因子等的鑒定.多重PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系 里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作 過程與一般PCR相同；
[0021] 3、測序文庫構(gòu)建：
[0022] (1)、DNA 片段化：
[0023] 將上述經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液放入超聲波破碎儀中進(jìn)行DNA的破碎，經(jīng)過超 聲波破碎儀破碎后的DNA變成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA;
[0024] 超聲波破碎儀:是一種利用強(qiáng)超聲在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng)，對物質(zhì)進(jìn)行超聲處理 的多功能、多用途的儀器，能用于多種動植物細(xì)胞、病毒細(xì)胞的破碎，DNA以及RNA的剪切，以 及用來乳化、分離、提取、消泡、清洗及加速化學(xué)反應(yīng)等等。現(xiàn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、 微生物學(xué)、藥物化學(xué)、動物學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域。此處我們主要是通過超聲波破碎儀將DNA剪切成 150-400bp小片段，得到片段化的DNA，用于測序文庫的構(gòu)建；
[0025] (2)、DNA 末端修復(fù)：
[0026]將上述片段化的DNA進(jìn)行5,末端以及3,末端的修復(fù)，在新的PCR管中配制加入如下 試劑：片段化的DNA溶液2ul、末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液10ul、末端修復(fù)酶3ul、 10mMrATP10ul、ddH 20補(bǔ)足到50ul;使用移液器吹打，充分混勻上述溶液后，將混合溶液置入 PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng):22°C反應(yīng)lOmin，后再72°C反應(yīng)lOmin，上述反應(yīng)結(jié)束后靜置4°C 保溫，得到末端修復(fù)的DNA溶液；
[0027] (3)、接頭連接：
[0028]在上述完成末端修復(fù)的DNA溶液的PCR管中接著加入以下試劑：快速連接緩沖液 l〇ul、連接酶2ul、接頭2.5ul，得到的PCR管中溶液總體積為64.5ul;用移液器吹打上述混合 溶液，待混合溶液充分吹打混勻后，再將上述混合溶液置于PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng):22 °C反應(yīng)15min，最終得到連接了接頭的DNA溶液；
[0029] 其中，接頭:在基因工程技術(shù)中，使兩個DNA分子或一個DNA分子的兩端經(jīng)酶切可以 配對再經(jīng)連接酶共價連接的序列；
[0030] (4)、連接產(chǎn)物純化：
[0031] 1)、向上述64.5ul已經(jīng)連接接頭的PCR管中繼續(xù)加入35.5ul超純水，使PCR管中溶 液體積增至l〇〇ul，
[0032] 2)、取90ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入純化磁珠的混 合溶液吹打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min，
[0033] 其中，磁珠分離純化DNA原理:磁珠是由具有超順磁性的磁核表面包裹二氧化硅等 材料構(gòu)成，利用這些磁珠可以實(shí)現(xiàn)核酸提取以及純化的自動化操作，磁珠可以特異性地吸 附DNA，通過洗滌，去除DNA以外的RNA、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)，再用洗脫液解離吸 附在磁珠上的DNA，得到純度很高的DNA，可用于PCR模板、基因工程等；
[0034] 3)、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中對上 述加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到上層液相雜質(zhì)及下層固相磁珠，，移液器移除 上層液相雜質(zhì)，
[0035] 4)、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜 置孵育30s后，再次得到上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移液器 移除上層的液相雜質(zhì)，
[0036] 5)、為了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的雜質(zhì)，完成上述步驟以后重復(fù)步驟4);
[0037] 6)、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有 殘留液，移液器吸盡PCR管中殘留液；
[0038] 7)、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中， 打開PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為1 Omin;
[0039] 8)、10min后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附 于磁珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置 于離心機(jī)中離心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA 的混合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所 得上層無菌超純水和DNA的混合溶液即為連接接頭的純化DNA溶液，
[0040] (5)、PCR 富集：
[0041 ]再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反應(yīng)試劑：連接接頭的純化DNA溶液 23ul、PCR反應(yīng)混合液25ul、接頭引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充 分混勻后，將上述PCR管放入PCR儀中進(jìn)行溫度反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:98°C反應(yīng)30s，后98°C反 應(yīng)10s，后65°C反應(yīng)30s，后72°C反應(yīng)30s，上述反應(yīng)中98°C反應(yīng)30s需要一個循環(huán)，從98°C反 應(yīng)10s，后65°C反應(yīng)30s，后72°C反應(yīng)30s共反應(yīng)6-15個循環(huán)，最后再72°C反應(yīng)lmin-個循環(huán)， [0042]其中，當(dāng)起始DNA量為lyg時，PCR循環(huán)數(shù)為6個循環(huán);起始DNA的量為50ng時，10個循 環(huán);起始DNA的量為5ng時，建15個循環(huán);PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行優(yōu)化，得到富集的 PCR產(chǎn)物；
[0043] (6)、PCR 產(chǎn)物純化：
[0044] 將上述富集的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下：
[0045] 1)、取45ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入磁珠的混合溶 液吹打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min，
[0046] 2)、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架對加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到新的上層液相雜質(zhì)及下層固相磁 珠，移液器移除上層液相雜質(zhì)，
[0047] 3)、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜 置孵育30s后，再次得到新的上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移 液器移除上層的液相雜質(zhì)，
[0048] 4)、為了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的雜質(zhì)，完成上述步驟以后再重復(fù)步驟3);
[0049] 5)、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有 殘留液，移液器吸盡PCR管中殘留液；
[0050] 6)、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中， 打開PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為1 Omin;
[0051 ] 7)、10min后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附 于磁珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置 于離心機(jī)中離心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA 的混合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得 到純化的PCR產(chǎn)物，即為測序文庫；
[0052] (7)、測序文庫質(zhì)量檢測：
[0053] 富集后的PCR產(chǎn)物在進(jìn)行高通量測序之前需要進(jìn)行質(zhì)量檢測，制備好的測序文庫 可用瓊脂糖凝膠電泳、全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測測序文庫中的片段長度分布范圍；
[0054] (8)、高通量測序：
[0055]將制備好的測序文庫置于高通量測序儀上進(jìn)行測序，讀長250BP，測序深度3000X， 每個樣本產(chǎn)生90M的數(shù)據(jù)量，數(shù)據(jù)量等于傳統(tǒng)測序的3000次克隆測序的覆蓋，測序的深度保 證結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以測出比例非常低的突變位點(diǎn)，高通量測序完成以后對結(jié)果進(jìn)行生物 信息學(xué)分析；
[0056]測序深度:測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一 個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M;
[0057]其檢測方法中，所述基因 SNP位點(diǎn)對應(yīng)PCR正向及反向引物序列如下：

[0061]其中，所述試劑盒包含以下試劑：
[0062] (1)、用于從所述樣品DNA提取的試劑，包括:緩沖液GE、緩沖液GB、漂洗液PW、洗脫 液TB、吸附柱等；
[0063] (2)、利用所述引物對進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的試劑，包括:PCR緩沖液、MgCl2、DNA聚合 酶、正向及反向引物等；
[0064] (3)、用于處理擴(kuò)增產(chǎn)物以使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測序技術(shù)中的試劑，包括： 磁珠、末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液、末端修復(fù)酶、快速連接緩沖液、連接酶、接頭等。
[0065] 其中，所述D N A測序文庫構(gòu)建的接頭如下：5'_ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '（SEQ ID N0·25)和
[0066] 5 '-TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'(SEQ ID NO.26)；
[0067] 其中，NNNNNN:表示用于區(qū)分樣本的序列，該序列為A、T、C和G隨機(jī)組合的6堿基，根 據(jù)不同的組合方式確定不同的樣本，主要有以下20種組合，用于區(qū)分20個樣本ATCACG、 CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC、CTTGTA、 ACTACG、TTACGG、AGACTG、CATCGA、GATGCA、GCTACG、TCGGTA、TGACAC 〇
[0068] 所述測序文庫構(gòu)建的接頭引物為：
[0069] 5，-AATGATACGGCGACCACC-3，（SEQIDN0.27#P
[0070] 5，-CAAGCAGAAGACGGCATA-3，（SEQ ID N0.28)。
[0071] 本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于:通過高通量測序檢測待測樣本中MECP2、⑶KL5以及F0XG1 基因中熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)：（1 )、檢測通量高，一次反應(yīng)可以檢測數(shù)個易感位點(diǎn)；（2)、靈敏度高； (3)、特異性強(qiáng):針對特定SNP設(shè)計引物，獲得MECP2、⑶KL5以及F0XG1基因特定位置附近的全 部堿基序列，特異性極強(qiáng)；（4)、操作簡便且安全，整個體系不包含有毒有害物質(zhì)，對試驗(yàn)人 員以及環(huán)境都無危害;而且本發(fā)明能夠更迅速、更準(zhǔn)確、更全面的得到關(guān)于RTT患者基因突 變的相關(guān)信息，以更加準(zhǔn)確的輔助篩查、診斷Rett綜合癥。
【附圖說明】
[0072] 圖1是本發(fā)明的檢測流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0073]下面結(jié)合【附圖說明】就【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施方式僅 用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本 發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0074]為了理解本發(fā)明，下面對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0075] 一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒能夠 一次性檢測Rett綜合癥致病基因 MECP2、CDKL5以及F0XG1的共57個SNP位點(diǎn)，
[0076] 其中，所述MECP2的24個SNP位點(diǎn)：c.98dupA、c.316C>T、c.317G>A、c.378delT、 c.397C>T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、 c.582C>T、c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、 c. 763C>T、c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C，
[0077] 所述 CDKL5 的 18 個 SNP 位點(diǎn)：c.ll9C>T、c.l75C>T、c.l83delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T，
[0078] 所述F0XG1 的 15個SNP位點(diǎn)：c. 256C>T、c. 256dupC、c.460dupG、c.460dupG、 c.552dupC、c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、 c.969delC、c.1200C>G、c.1248C>G。
[0079] 其檢測方法如下：
[0080] (一）、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
[00811 1、本實(shí)驗(yàn)涉及的樣本來自10例Rett綜合癥病患和10例健康人的血液，樣本采集 后，放入-80°C的冰箱中保存待用；
[0082] 2、涉及的相關(guān)試劑有：用于從所述樣品DNA提取的試劑，如：緩沖液GE、緩沖液GB、 漂洗液PW、洗脫液TB、吸附柱等；
[0083] 利用所述引物對進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的試劑，如:PCR緩沖液、MgCl 2、DNA聚合酶、正向 及反向引物等；
[0084] 用于處理擴(kuò)增產(chǎn)物以使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測序技術(shù)中的試劑，包括:磁珠、 末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液、末端修復(fù)酶、快速連接緩沖液、連接酶、接頭等。
[0085] (二）、主要儀器：
[0086] 測序儀、PCR儀、離心機(jī)、漩渦震蕩儀、冰箱、滅菌鍋等；
[0087](三）、檢測步驟：
[0088] 1、樣品DNA提?。?br>[0089]抽取10例Rett綜合癥病患和10例健康人的血液樣本各lml，共20例，將抽取的血液 樣本分別置于20個1.5ml、加入抗凝劑的離心管中，后通過采用特異性結(jié)合DNA的離心吸附 柱系統(tǒng)對上述20個離心管分別進(jìn)行血液樣本DNA的提取，在20個離心管中分別得到20例含 有DNA的DNA溶液;再分別對上述20例分別提取完的DNA溶液中的DNA進(jìn)行完整性、濃度及純 度測定;通常情況下，測定過程中，如電泳條帶無彌散，則證明所提取的DNA是完整的、未降 解的；另外，采用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，通常情況下，高純度的DNA的OD 260/ 0D28Q應(yīng)介于1.8~2.0之間，后將所測定過的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶液放置 于-20°C的環(huán)境中備用。
[0090] 2、DNA模板多重PCR反應(yīng)：
[0091] 在新的PCR管中加入如下試劑：提取好的DNA4.5ul、PCR緩沖液4ul、MgCl2l. 5ul、 DNA聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，將上述混合物混勻后置于 PCR儀中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的步驟為:95°C反應(yīng)3min，后95°C反應(yīng)15s，后 60°C反應(yīng)30s，最后72°C反應(yīng)20s，上述反應(yīng)從95°C反應(yīng)3min到72°C反應(yīng)20s共反應(yīng)13個循 環(huán)，13個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后即得:經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液;所述經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶 液用于測序文庫的構(gòu)建；
[0092] 3、測序文庫構(gòu)建：
[0093] (1)、DNA 片段化：
[0094] 將上述經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液放入超聲波破碎儀中進(jìn)行DNA的破碎，經(jīng)過超 聲波破碎儀破碎后的DNA變成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA;
[0095] (2)、DNA 末端修復(fù)：
[0096]將上述片段化的DNA進(jìn)行5,末端以及3,末端的修復(fù)，再取新的PCR管，在新的PCR管 中配制加入如下試劑:片段化的DNA溶液2ul、末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液10ul、末端修復(fù)酶 3ul、10mMrATP10ul、ddH 20補(bǔ)足到50ul;使用移液器將上述混合溶液進(jìn)行吹打，充分混勻上 述溶液后，將混合溶液置入PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng)：22°C反應(yīng)lOmin，后再72°C反應(yīng) lOmin，上述反應(yīng)結(jié)束后靜置4°C保溫，得到末端修復(fù)的DNA溶液；
[0097] (3)、接頭連接：
[0098]在上述完成末端修復(fù)的DNA溶液的PCR管中接著加入以下試劑：快速連接緩沖液 l〇ul、連接酶2ul、接頭2.5ul，得到的PCR管中溶液總體積為64.5ul;用移液器吹打上述混合 溶液，待混合溶液充分吹打混勻后，再將上述混合溶液置于PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng):22 °C反應(yīng)15min，最終得到連接了接頭的DNA溶液；
[0099] (4)、連接產(chǎn)物純化：
[0100] 1)、向上述已經(jīng)得到的連接了接頭的DNA的PCR管中繼續(xù)加入35.5ul超純水，使PCR 管中溶液體積增至lOOul，
[0101] 2)、再取90ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入磁珠的混合 溶液吹打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min，
[0102] 3)、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架對加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到上層液相雜質(zhì)及下層固相磁珠，移 液器移除上層液相雜質(zhì)，
[0103] 4)、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜 置孵育30s后，再次得到上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移液器 移除上層的液相雜質(zhì)，
[0104] 5)、完成上述步驟以后重復(fù)步驟4);
[0105] 6)、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有 殘留液，移液器吸盡PCR管中殘留液；
[0106] 7)、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中， 打開PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為1 Omin;
[0107] 8)、10min后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附 于磁珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置 于離心機(jī)中離心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA 的混合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所 得上層無菌超純水和DNA的混合溶液即為連接接頭的純化DNA溶液，
[0108] (5)、PCR 富集：
[0109] 再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反應(yīng)試劑：連接接頭的純化DNA溶液 23ul、PCR反應(yīng)混合液25ul、接頭引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充 分混勻后，將上述PCR管放入PCR儀中進(jìn)行溫度反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:98°C反應(yīng)30s，后98°C反 應(yīng)10s，后65°C反應(yīng)30s，后72°C反應(yīng)30s，上述反應(yīng)中98°C反應(yīng)30s需要一個循環(huán)，從98°C反 應(yīng)10s，后65 °C反應(yīng)30s，后72 °C反應(yīng)30s共反應(yīng)6-15個循環(huán)，最后再72 °C反應(yīng)lmin-個循環(huán)， 最終得到富集的PCR產(chǎn)物；
[0110] (6)、PCR 產(chǎn)物純化：
[0111] 將上述富集的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下：
[0112] 1)、取45ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入磁珠的混合溶 液吹打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min，
[0113] 2)、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架對加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到新的上層液相雜質(zhì)及下層固相磁 珠，移液器移除上層液相雜質(zhì)，
[0114] 3)、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜 置孵育30s后，再次得到新的上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移 液器移除上層的液相雜質(zhì)，
[0115] 4)、為了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的雜質(zhì)，完成上述步驟以后再重復(fù)步驟3);
[0116] 5)、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有 殘留液，移液器吸盡PCR管中殘留液；
[0117] 6)、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中， 打開PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為1 Omin;
[0118] 7)、lOmin后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附 于磁珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置 于離心機(jī)中離心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA 的混合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得 到純化的PCR產(chǎn)物，即為測序文庫；
[0119] 4、測序文庫質(zhì)量檢測：
[0120] 富集后的PCR產(chǎn)物在進(jìn)行高通量測序之前需要進(jìn)行質(zhì)量檢測，制備好的測序文庫 可用瓊脂糖凝膠電泳、全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測測序文庫中的片段長度分布范圍；為了 得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，需要對測序文庫進(jìn)行精確定量，首先推薦使用實(shí)時熒光定量PCR (Real-time PCR)方法對測序文庫進(jìn)行絕對定量;此外，還可使用熒光染料法。制備好的測 序文庫可用瓊脂糖凝膠電泳、全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測測序文庫中的片段長度分布范 圍。
[0121] 5、高通量測序：
[0122] 將制備好的測序文庫置于高通量測序儀上進(jìn)行測序，讀長250BP，測序深度3000X， 每個樣本產(chǎn)生90M的數(shù)據(jù)量，高通量測序完成以后對結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析;數(shù)據(jù)量等于 傳統(tǒng)測序的3000次克隆測序的覆蓋，測序的深度保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以測出比例非常低 的突變位點(diǎn)，為篩查輔助診斷RTT相關(guān)致病基因突變提供一種非常先進(jìn)的方法。
[0123] 6、測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析：
[0124] 測試數(shù)據(jù)處理分析包括測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、拼接、質(zhì)控和突變位點(diǎn)分析等過程，通過 數(shù)據(jù)的處理最終獲得Rett綜合癥患者和健康人檢測樣本中相關(guān)基因 SNP位點(diǎn)的信息；參考 基因組hgl9是人類(Homo sapiens)標(biāo)準(zhǔn)參考基因組(GRCh37/hgl9)，是國際通用作為篩選 目標(biāo)序列突變位點(diǎn)或SNP位點(diǎn)的參考基因序列，根據(jù)軟件分析的結(jié)果，篩選出與參考基因組 hg 19不同的位點(diǎn);通過比對設(shè)計的引物pane 1和位點(diǎn)信息，篩選出MECP2、⑶KL5以及F0XG1基 因上SNP位點(diǎn)（如下表所示）；結(jié)果顯示本發(fā)明檢測結(jié)果與臨床檢測結(jié)果一致，Rett綜合癥患 者在表中的熱點(diǎn)SPN位點(diǎn)上有突變，而正常人群則沒有；因此本發(fā)明可以較好地作為Rett綜 合癥早期發(fā)現(xiàn)和治療的輔助手段。
[0125] 表:二代測序檢測Rett綜合癥患者SPN位點(diǎn)突變結(jié)果

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒能夠一次性檢測Rett綜合癥致病基因 MECP2、CDKL5以及F0XG1的SNP位點(diǎn)， 其中，所述MECP2的24個SNP位點(diǎn)：c · 98dupA、c · 316C>T、c · 317G>A、c · 378delT、c · 3970 T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、c.582C>T、 c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、c.763C>T、 c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C; 所述 CDKL5的18 個 SNP 位點(diǎn)：c. 119C>T、c. 175C>T、c. 183delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T; 所述F0XG1 的 15個SNP位點(diǎn)：c · 256C>T、c · 256dupC、c · 460dupG、c · 460dupG、c · 552dupC、 c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、c.969delC、 c.1200C>G、c.1248C>G。2. -種權(quán)利要求1所述的一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒的檢測方法，其特征在于，包括以下具體步驟： 2.1、 樣品DNA提?。? 抽取10例Rett綜合癥病患和10例健康人的血液樣本各lml，共20例，將抽取的血液樣本 分別置于20個1.5ml、加入抗凝劑的離心管中，后通過采用特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱系 統(tǒng)進(jìn)行血液樣本DNA的提取，得到含有DNA的DNA溶液;提取完后再對DNA溶液中的DNA進(jìn)行完 整性、濃度及純度測定；后將所測定過的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶液放置于-20°C的環(huán)境中備用； 2.2、 DNA模板多重PCR反應(yīng)： 在新的PCR管中加入如下試劑:提取好的DNA溶液4.5ul、PCR緩沖液4ul、MgCl2l. 5ul、DNA 聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，將上述混合物混勻后置于PCR 儀中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的步驟為:95 °C反應(yīng)3min，后95 °C反應(yīng)15s，后60 °C 反應(yīng)30s，最后72°C反應(yīng)20s，上述反應(yīng)從95°C反應(yīng)3min到72°C反應(yīng)20s共反應(yīng)13個循環(huán)，13 個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后即得:經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液;所述經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液用 于測序文庫的構(gòu)建； 2.3、 測序文庫構(gòu)建： (1) 、DNA片段化： 將上述經(jīng)過多重PCR反應(yīng)的DNA溶液放入超聲波破碎儀中進(jìn)行DNA的破碎，經(jīng)過超聲波 破碎儀破碎后的DNA變成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA; (2) 、DNA末端修復(fù)： 將上述片段化的DNA進(jìn)行5,末端以及3,末端的修復(fù)，再取新的PCR管，在新的PCR管中配 制加入如下試劑：片段化的DNA溶液2ul、末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液10ul、末端修復(fù)酶3ul、 10mMrATP10ul、ddH 20補(bǔ)足到50ul;使用移液器將上述混合溶液進(jìn)行吹打，充分混勻上述溶 液后，將混合溶液置入PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng):22°C反應(yīng)lOmin，后再72°C反應(yīng)lOmin，上 述反應(yīng)結(jié)束后靜置4°C保溫，得到末端修復(fù)的DNA溶液； (3) 、接頭連接： 在上述完成末端修復(fù)的DNA溶液的PCR管中接著加入以下試劑:快速連接緩沖液10ul、 連接酶2ul、接頭2.5ul，得到的PCR管中溶液總體積為64.5ul;用移液器吹打上述混合溶液， 待混合溶液充分吹打混勻后，再將上述混合溶液置于PCR儀中進(jìn)行下述溫度反應(yīng):22°C反應(yīng) 15min，最終得到連接了接頭的DNA溶液； (4) 、連接產(chǎn)物純化： 1) 、向上述已經(jīng)得到的連接了接頭的DNA的PCR管中繼續(xù)加入35.5ul超純水，使PCR管中 溶液體積增至l〇〇ul， 2) 、再取90ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入磁珠的混合溶液 吹打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min， 3) 、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中，所述磁 力架對加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到上層液相雜質(zhì)及下層固相磁珠，移液器 移除上層液相雜質(zhì)， 4) 、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇，用以 漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜置孵 育 30s后，再次得到上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移液器移除 上層的液相雜質(zhì)， 5) 、完成上述步驟以后重復(fù)步驟4); 6) 、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有殘留 液，移液器吸盡PCR管中殘留液； 7) 、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中，打開 PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為lOmin; 8) 、10min后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附于磁 珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置于離 心機(jī)中離心l〇s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA的混 合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所得上 層無菌超純水和DNA的混合溶液即為連接接頭的純化DNA溶液， (5) 、PCR 富集： 再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反應(yīng)試劑:連接接頭的純化DNA溶液23ul、PCR 反應(yīng)混合液25ul、接頭引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充分混勻 后，將上述PCR管放入PCR儀中進(jìn)行溫度反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:98°C反應(yīng)30s，后98°C反應(yīng)10s， 后65°C反應(yīng)30s，后72°C反應(yīng)30s，上述反應(yīng)中98°C反應(yīng)30s需要一個循環(huán)，從98°C反應(yīng)10s， 后65°C反應(yīng)30s，后72°C反應(yīng)30s共反應(yīng)6-15個循環(huán)，最后再72°C反應(yīng)lmin-個循環(huán)，最終得 到富集的PCR產(chǎn)物； (6) 、PCR產(chǎn)物純化： 將上述富集的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下： 1) 、取45ul渦旋震蕩混勻的磁珠至于上述PCR管中，用移液器將加入磁珠的混合溶液吹 打10次，充分混勻上述混合溶液;在18-25Γ的室溫條件下，靜置孵育5min， 2) 、5min后將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，后將離心后的PCR管置于磁力架中，所述磁 力架對加入磁珠的混合溶液進(jìn)行分離，分離后得到新的上層液相雜質(zhì)及下層固相磁珠，移 除上層液相雜質(zhì)； 3) 、保持PCR管始終置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鮮配制的80%乙醇，用以 漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗結(jié)束后，將漂洗后的溶液置于18-25Γ的室溫條件下，靜置孵 育30s后，再次得到新的上層含有乙醇的液相雜質(zhì)及下層被乙醇漂洗過的固相磁珠，移液器 移除上層含有乙醇的的液相雜質(zhì)， 4) 、完成上述步驟以后再重復(fù)步驟3); 5) 、取出置于磁力架中的PCR管，將PCR管置于離心機(jī)中離心10s，此時PCR管中會有殘留 液，移液器吸盡PCR管中殘留液； 6) 、將PCR管從離心機(jī)中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始終置于磁力架中，打開 PCR管蓋將被乙醇漂洗過的固相磁珠暴露于空氣中直至磁珠干燥;時間為lOmin; 7) 、10min后，將PCR管從磁力架中取出，將PCR管中加入25ul無菌超純水洗脫吸附于磁 珠表層的DNA，使用移液器吹打無菌超純水和DNA的混合溶液，充分混勻后，將PCR管置于離 心機(jī)中離心l〇s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上層無菌超純水和DNA的混 合溶液及下層磁珠，移液器吸取上層無菌超純水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得到純 化的PCR產(chǎn)物，即為測序文庫； 2.4、 測序文庫質(zhì)量檢測： 富集后的PCR產(chǎn)物在進(jìn)行高通量測序之前需要進(jìn)行質(zhì)量檢測，制備好的測序文庫可用 瓊脂糖凝膠電泳、全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測測序文庫中的片段長度分布范圍； 2.5、 高通量測序： 將制備好的測序文庫置于高通量測序儀上進(jìn)行測序，讀長250BP，測序深度3000X，每個 樣本產(chǎn)生90M的數(shù)據(jù)量，高通量測序完成以后對結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。3.-種權(quán)利要求2所述的一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒的檢測方法，其特征在于，所述基因 SNP位點(diǎn)對應(yīng)PCR正向及反向引物序列如下：4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒，其特征在于，所述試劑盒包含以下試劑： (1) 、用于從所述樣品DNA提取的試劑，包括:緩沖液GE、緩沖液GB、漂洗液PW、洗脫液TB、 吸附柱等； (2) 、利用所述引物對進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的試劑，包括:PCR緩沖液、MgC 12、DNA聚合酶、正 向及反向引物等； (3) 、用于處理擴(kuò)增產(chǎn)物以使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測序技術(shù)中的試劑，包括:磁珠、 末端快速修復(fù)反應(yīng)緩沖液、末端修復(fù)酶、快速連接緩沖液、連接酶、接頭等。5. -種權(quán)利要求2所述的一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒的檢測方法，其特征在于，所述測序文庫構(gòu)建的接頭序列如下：5'_ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '（SEQ ID NO·25)和 5 '-TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3 ' (SEQ ID NO.26)。6. -種權(quán)利要求2所述的一種基于二代測序檢測Rett綜合癥致病基因 SNP位點(diǎn)的試劑 盒的檢測方法，其特征在于，所述測序文庫構(gòu)建的接頭引物為： 5'-AATGATACGGCGACCACC-3'（SEQIDN0.27WP 5'-CAAGCAGAAGACGGCATA-3'（SEQ ID N0.28)。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950774SQ201610542608
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】曾驥孟, 蒙明慧, 許曉玲, 唐振洲, 胡鵬
【申請人】江蘇醫(yī)諾萬細(xì)胞診療有限公司