馬鈴薯栽培種J3相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求提交于2013年5月2日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)。61/818,752的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該臨時(shí)專利申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。

背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種名為J3的新型馬鈴薯栽培種，并且涉及該馬鈴薯品種生成的塊莖、植物、植物部分、組織培養(yǎng)物和種子。本發(fā)明還涉及由馬鈴薯栽培種J3制成的食品，例如炸薯?xiàng)l、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪花片和馬鈴薯顆粒。本申請(qǐng)中引用的所有出版物均以引用的方式并入本文。馬鈴薯為世界上第四大最重要的糧食作物以及目前為止最重要的蔬菜。當(dāng)前美國(guó)幾乎每個(gè)州均商業(yè)種植馬鈴薯。在美國(guó)每年的馬鈴薯產(chǎn)量超過(guò)一千八百萬(wàn)噸，整個(gè)世界有3億噸。馬鈴薯的普及主要源自其多功能性以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。馬鈴薯可新鮮、冷凍或干燥使用，或者可加工成面粉、淀粉或酒精。它們含有復(fù)雜的碳水化合物并且富含鈣、煙酸和維生素C。在食品產(chǎn)業(yè)中馬鈴薯的品質(zhì)受兩個(gè)關(guān)鍵因素的不利影響：(1)馬鈴薯含有大量的天冬酰胺，其在煎炸或烘培時(shí)會(huì)快速氧化而形成丙烯酰胺(一種致癌物)的非必需游離氨基酸；以及(2)馬鈴薯十分易受酶促褐變和變色的影響，受酶促褐變和變色是在多酚氧化酶從擦傷的馬鈴薯的受損質(zhì)體泄露出來(lái)時(shí)發(fā)生的不期望事件。在細(xì)胞質(zhì)中，該酶使酚氧化，后者然后快速聚合而產(chǎn)生暗色素。塊莖含有大量的磷酸化淀粉，在存儲(chǔ)期間一些磷酸化淀粉降解而產(chǎn)生葡萄糖和果糖。這些還原糖在高于120℃的溫度下加熱時(shí)會(huì)與氨基酸反應(yīng)生成包含丙烯酰胺的美拉德產(chǎn)物。參與淀粉磷酸化反應(yīng)的兩種酶是水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。褐變也因?yàn)榈矸鄄糠纸到獬善咸烟呛凸嵌苑敲复俚姆绞接|發(fā)。迄今為止，尚沒(méi)有可產(chǎn)生具有低的丙烯酰胺含量、增加的黑斑擦傷耐受性以及降低的衰老甜化的塊莖的馬鈴薯植物品種。因而，需要開(kāi)發(fā)具有降低水平的毒性化合物的馬鈴薯品種，但不使用未知或外來(lái)的核酸。本發(fā)明滿足這種需求。上述的相關(guān)領(lǐng)域?qū)嵗约芭c其相關(guān)的局限性旨在是示例性的以及非排他性的。在閱讀本說(shuō)明書(shū)后相關(guān)領(lǐng)域的其他局限性對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
下面的實(shí)施例及其各方面與系統(tǒng)、工具以及方法結(jié)合描述的，所述系統(tǒng)、工具和方法意在是示例性的，不限制范圍。在多個(gè)實(shí)施例中，已減少或消除了上述問(wèn)題中的一者或多者，而其他實(shí)施例則針對(duì)其他改善。為此，本發(fā)明提供了用核酸序列轉(zhuǎn)化的新型馬鈴薯品種J3，所述核酸序列是馬鈴薯植物基因組天然的并且不包含外來(lái)DNA、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)DNA、病毒標(biāo)志物或載體骨架序列。更確切地說(shuō)，插入馬鈴薯品種J3基因組的DNA是馬鈴薯、野生馬鈴薯、與馬鈴薯性親和的植物的天然非編碼多核苷酸，其使參與表達(dá)黑斑擦傷、天冬酰胺積聚和衰老甜化的基因沉默。因而，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種植物載體，稱為pSIM278，其包含：第一沉默盒，第一沉默盒含有兩個(gè)拷貝的DNA片段，所述兩個(gè)拷貝的DNA片段以反義取向包含天冬酰胺合成酶-1基因(fAsn1)片段和多酚氧化酶-5基因的3'-非翻譯序列；和第二沉默盒，第二沉默盒含有兩個(gè)拷貝的DNA片段，所述兩個(gè)拷貝的DNA片段以反義取向包含馬鈴薯磷酸化酶-L(pPhL)基因片段和馬鈴薯R1基因片段。該pSIM1278載體包含：一9,511bp骨架區(qū)，其在植物轉(zhuǎn)化之前支持植物DNA的維持并且在植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化后不轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞中；和一10,147bpDNA插入?yún)^(qū)，其包含天然的DNA，在轉(zhuǎn)化后該天然的DNA穩(wěn)定整合進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中。在一不同的實(shí)施例中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的植物載體的植物細(xì)胞。在一另外的實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種馬鈴薯植物品種，其包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的載體的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該馬鈴薯植物品種表達(dá)所述載體的兩個(gè)沉默盒中的至少一者，并且所述沉默盒的表達(dá)導(dǎo)致天冬酰胺合成酶-1基因和多酚氧化酶-5基因在該轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的(intragenic)植物的塊莖中下調(diào)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，表達(dá)至少一個(gè)沉默盒的所述馬鈴薯植物品種的塊莖展現(xiàn)出兩種或更多種期望的性狀，所述性狀不存在于相同品種的未轉(zhuǎn)化植株的塊莖中。在本發(fā)明的最優(yōu)選的方面中，所述兩種或更多種期望的性狀選自低的天冬酰胺積聚、降低的黑斑擦傷以及降低的熱誘導(dǎo)的丙烯酰胺形成。在本發(fā)明的一個(gè)不同方面，該馬鈴薯植物品種表達(dá)所述植物DNA載體的兩個(gè)沉默盒，并且所述沉默盒的表達(dá)導(dǎo)致天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因和二激酶R1基因在該馬鈴薯植物品種的塊莖中下調(diào)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，表達(dá)所述植物DNA載體的兩個(gè)沉默盒的所述馬鈴薯植物品種的塊莖展現(xiàn)出兩種或更多種期望的性狀，所述性狀不存在于相同品種的未轉(zhuǎn)化植株的塊莖中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述兩種或更多種期望的性狀選自低的天冬酰胺積聚、降低的黑斑擦傷、儲(chǔ)存期間降低的還原糖積聚以及降低的熱誘導(dǎo)的丙烯酰胺形成。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)植物DNA載體的兩個(gè)沉默盒的馬鈴薯植物品種是AtlanticJ3品種。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了名為J3的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)種屬的新馬鈴薯栽培種。本發(fā)明因此涉及馬鈴薯栽培種J3、馬鈴薯栽培種J3的塊莖、馬鈴薯栽培種J3的植株、馬鈴薯栽培種J3的種子、由馬鈴薯栽培種J3制成的食品、通過(guò)將馬鈴薯栽培種J3自交或通過(guò)將馬鈴薯栽培種J3與其他馬鈴薯栽培種雜交生成馬鈴薯植株的方法、以及通過(guò)馬鈴薯栽培種J3的突變或轉(zhuǎn)化而引起的變體形成。因此，任何此類使用栽培種J3的方法均是本發(fā)明的實(shí)施例：自交、回交、雜交生產(chǎn)、雜交產(chǎn)生群體等等。使用馬鈴薯栽培種J3作為至少一個(gè)親本生成的所有植株在本發(fā)明的范圍內(nèi)。有利的是，可將該馬鈴薯栽培種用于與其他的、不同的馬鈴薯植株雜交以產(chǎn)生具有優(yōu)異特性的第一代(F1)馬鈴薯雜種塊莖、種子和植株。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了馬鈴薯栽培種J3的單個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)化植株。在一個(gè)實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)移基因可以是顯性的或隱性的等位基因。在一些實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)移基因?qū)①x予諸如除草劑抗性、昆蟲(chóng)抗性、對(duì)細(xì)菌性、真菌性或病毒性病害的抗性、雄性能育性、雌性能育性、增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、均一性以及淀粉及其他碳水化合物的濃度增加、擦傷趨勢(shì)降低以及淀粉轉(zhuǎn)化為糖的速率降低之類的性狀。該基因可以是自然存在的馬鈴薯基因或通過(guò)遺傳工程技術(shù)、回交或突變而引入的轉(zhuǎn)基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于馬鈴薯栽培種J3的組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該組織培養(yǎng)物將能夠再生具有上述馬鈴薯植物的全部生理和形態(tài)特性的植株，以及能夠再生具有與上述馬鈴薯植株基本相同的基因型的植株。在一些實(shí)施例中，這種組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞將是胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、雌蕊、子葉、下胚軸、根、根尖、花、種子、葉柄、塊莖、芽眼或莖。另外，本發(fā)明提供由本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的馬鈴薯植株。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了由馬鈴薯植株品種AtlanticJ3的塊莖制得的食品。優(yōu)選地，該食品為經(jīng)熱處理的產(chǎn)品。更優(yōu)選地，該食品為炸薯?xiàng)l、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪花片或馬鈴薯顆粒。除了上述示例性的方面和實(shí)施例以外，通過(guò)研究如下說(shuō)明，另外的方面和實(shí)施例將變得顯而易見(jiàn)。附圖說(shuō)明圖1示出了pSIM1278轉(zhuǎn)化載體。左邊的載體骨架區(qū)為9,511bp長(zhǎng)，在位置9,957bp處開(kāi)始并在位置19,468bp處結(jié)束。該骨架DNA主要由細(xì)菌DNA組成，在植物轉(zhuǎn)化之前該細(xì)菌DNA支持DNA插入物的維持。DNA插入?yún)^(qū)(右邊)(包括旁側(cè)邊界序列)為10,147bp長(zhǎng)(從19,469bp到19,660bp以及從1bp到9,956bp)。該DNA插入物僅由天然的DNA組成并且在轉(zhuǎn)化時(shí)穩(wěn)定地整合進(jìn)馬鈴薯基因組中。圖2提供了插入pSIM1278轉(zhuǎn)化載體中的DNA插入物中的沉默盒的示意圖。每個(gè)沉默盒含有由間隔序列分開(kāi)的兩個(gè)拷貝的二基因片段。包含四個(gè)靶標(biāo)基因(即Asn-1、Ppo-5、Phl和R1)的片段的兩個(gè)拷貝的DNA片段作為反向重復(fù)插入在兩個(gè)會(huì)聚啟動(dòng)子(標(biāo)為Pro)之間，該啟動(dòng)子主要在塊莖中有活性。含有所得的沉默盒的植物在塊莖中產(chǎn)生多樣的并且未多聚腺苷酸化的大量RNA分子，其動(dòng)態(tài)地且有力地使預(yù)期的靶基因沉默。該RNA分子的大小通常小于所采用的兩個(gè)啟動(dòng)子之間的距離，因?yàn)闀?huì)聚轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致碰撞轉(zhuǎn)錄。具體實(shí)施方式在隨后的說(shuō)明和表中，使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了清晰和一致地理解本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)(包括給予這些術(shù)語(yǔ)的范圍)，提供了以下定義：等位基因。等位基因?yàn)榛虻囊环N或多種備選形式中的任一者，這些備選形式與一種性狀或特性相關(guān)。在二倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對(duì)同源染色體上的對(duì)應(yīng)基因座。氨基酸序列。如本文所用，包括從植物分離的、植物天然的或植物中自然存在的，或者以合成方式制備但包含內(nèi)源對(duì)應(yīng)物的核酸序列的寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)以及它們的片段。人為操縱。如本文所用，“人為操縱”意指通過(guò)手或通過(guò)機(jī)械手段或重組手段，例如通過(guò)遺傳工程技術(shù)，移動(dòng)、布置、操作或控制植物或植物細(xì)胞，以便產(chǎn)生與未經(jīng)操縱的自然存在的對(duì)應(yīng)物相比具有不同生物學(xué)、生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)或生理學(xué)表型和/或基因型的植物或植物細(xì)胞。無(wú)性繁殖。通過(guò)從葉切片、莖切片、根切片、塊莖芽眼、匍匐莖、單植物細(xì)胞原生質(zhì)體、愈傷組織等生成整株植株來(lái)產(chǎn)生子代，不涉及配子融合。骨架。不包括打算轉(zhuǎn)移的DNA插入序列的二元載體的核酸序列?；亟??；亟粸橛N者反復(fù)地將雜種子代返回去與其中一個(gè)親本雜交，例如，第一代雜種F1與該F1雜種的親本基因型中的一者雜交。細(xì)菌環(huán)腐病。細(xì)菌環(huán)腐病是一種由細(xì)菌密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibactermichiganense)亞種引起的疾病。細(xì)菌環(huán)腐病的名字來(lái)源于塊莖內(nèi)維管束環(huán)的特征性破壞。該環(huán)通常以乳黃色到淺褐色干酪質(zhì)腐爛出現(xiàn)。在馬鈴薯的外表面，嚴(yán)重染病的塊莖可能會(huì)顯示出稍微凹陷的干裂區(qū)域。受感染塊莖的維管組織中的細(xì)菌環(huán)腐病癥狀較于上述可能較不明顯，僅僅以斷裂的、零星出現(xiàn)的暗色線條或以連續(xù)的泛黃的污點(diǎn)出現(xiàn)。黑斑擦傷。存在于擦傷的塊莖組織中的黑斑是稱為黑色素的顏料引起的，黑色素在細(xì)胞損傷后產(chǎn)生并且使組織具有褐色、灰色或黑色外觀。黑色素在苯酚底物和適當(dāng)?shù)拿敢驗(yàn)榧?xì)胞損壞而彼此形成接觸時(shí)形成。該損壞不要求破裂的細(xì)胞。然而，底物和酶的混合必須出現(xiàn)，通常在組織受到碰撞時(shí)。黑斑主要是在剛好在維管環(huán)下面的髓周組織中出現(xiàn)，但可以大到足以包括皮層組織的一部分。邊界樣序列。“邊界樣”序列分離自所選擇的待修飾的植物物種，或分離自與待修飾的植物物種性親和的植物，并且像農(nóng)桿菌的邊界序列一樣發(fā)揮功能。也就是說(shuō)，本發(fā)明的邊界樣序列促進(jìn)和有利于其所連接的多核苷酸的整合。本發(fā)明的DNA插入物優(yōu)選含有邊界樣序列。DNA插入物的邊界樣序列長(zhǎng)度介于5-100bp之間、長(zhǎng)度介于10-80bp之間、長(zhǎng)度介于15-75bp之間、長(zhǎng)度介于15-60bp之間、長(zhǎng)度介于15-50bp之間、長(zhǎng)度介于15-40bp之間、長(zhǎng)度介于15-30bp之間、長(zhǎng)度介于16-30bp之間、長(zhǎng)度介于20-30bp之間、長(zhǎng)度介于21-30bp之間、長(zhǎng)度介于22-30bp之間、長(zhǎng)度介于23-30bp之間、長(zhǎng)度介于24-30bp之間、長(zhǎng)度介于25-30bp之間或者長(zhǎng)度介于26-30bp之間。DNA插入物左邊界序列和右邊界序列分離自待修飾的植物的基因組和/或?qū)Υ揎椀闹参锏幕蚪M而言是天然的。DNA插入物邊界樣序列在核苷酸序列方面與任何已知的農(nóng)桿菌衍生的T-DNA邊界序列不同一。因而，DNA插入物邊界樣序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)不同于來(lái)自農(nóng)桿菌物種如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的T-DNA邊界序列的核苷酸。也就是說(shuō)，本發(fā)明的DNA插入物邊界序列或邊界樣序列與來(lái)自農(nóng)桿菌物種如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA邊界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％序列同一性，但不是100％序列同一性。如本文所用，描述性術(shù)語(yǔ)“DNA插入物邊界”和“DNA插入物邊界樣”是可互換的。邊界樣序列可分離自植物基因組并且可經(jīng)修飾或突變以改變其能夠?qū)⒑塑账嵝蛄姓线M(jìn)另一核苷酸序列中的效率。其他多核苷酸序列可添加或摻入進(jìn)本發(fā)明的邊界樣序列內(nèi)。因而，DNA插入物左邊界或DNA插入物右邊界可經(jīng)修飾以具有5’-和3’-多克隆位點(diǎn)，或額外的限制性位點(diǎn)。DNA插入物邊界序列可經(jīng)修飾以增加來(lái)自伴隨載體的骨架DNA不整合進(jìn)植物基因組中的可能性。基本上由…組成。“基本上由某些元件組成”的組合物局限于包括那些元件，以及局限于不實(shí)質(zhì)地影響本發(fā)明組合物的基本特性和新特性的那些元件。因而，只要組合物不影響本發(fā)明的基本特性和新特性，即不含有不來(lái)自于所選擇植物物種或與所選擇的植物物種性親和的植物的外來(lái)DNA，則該組合物可視為通過(guò)語(yǔ)言“基本上由…組成”表征的本發(fā)明組合物的組分。子葉。子葉為種子葉子的一種類型。子葉含有種子的食物儲(chǔ)藏組織。簡(jiǎn)并引物?！昂?jiǎn)并引物”為含有足夠核苷酸變異的寡核苷酸，在與相似但非完全同源的序列雜交時(shí)該變異可適應(yīng)堿基錯(cuò)配。雙子葉植物。其胚具有兩片子葉的顯花植物。雙子葉的例子包括但不限于煙草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿和大豆)、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹(shù)、楓樹(shù)、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜屬植物、雛菊和仙人掌。DNA插入物。根據(jù)本發(fā)明，待插入進(jìn)植物基因組中的DNA插入物包含該植物天然的多核苷酸序列或者具有該植物天然的遺傳元件。在一個(gè)例子中，例如，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3的DNA插入物是10,147bp的非編碼多核苷酸，該非編碼多核苷酸對(duì)于馬鈴薯、野生馬鈴薯、與馬鈴薯性親和的植物而言是天然的，在轉(zhuǎn)化后穩(wěn)定整合進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中，并且使參與表達(dá)黑斑擦傷、天冬酰胺積聚和衰老甜化的基因沉默。DNA插入物優(yōu)選包含兩個(gè)表達(dá)盒并且插入進(jìn)稱為pSIM1278轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)化載體中。第一表達(dá)盒包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)二者的片段，所述片段在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動(dòng)子與顆粒結(jié)合合酶基因(Gbss)的Gbss啟動(dòng)子之間以反向重復(fù)排列。這些啟動(dòng)子主要在塊莖中有活性。第二表達(dá)盒的功能是使淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子沉默。該表達(dá)盒由淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的片段構(gòu)成，所述片段有效連接至與第一表達(dá)盒相同的Agp和Gbss啟動(dòng)子。這些表達(dá)盒不含外來(lái)DNA，并且僅由來(lái)自所選植物物種或來(lái)自與所選植物物種性親和的植物的DNA組成。胚。胚是成熟種子內(nèi)所含的未成熟植株。外來(lái)的。關(guān)于核酸的“外來(lái)的”意指該核酸源自非植物生物體，或者源自與待轉(zhuǎn)化的植物物種不同的植物，或者不源自與待轉(zhuǎn)化的植物不可雜交的、不屬于目標(biāo)植物的物種的植物。根據(jù)本發(fā)明，外來(lái)DNA或RNA代表自然存在于真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物、魚(yú)或鳥(niǎo)的遺傳組成中、但不天然存在于待轉(zhuǎn)化植物中的核酸。因而，外來(lái)核酸為編碼例如不由轉(zhuǎn)化植物自然產(chǎn)生的多肽的核酸。外來(lái)核酸不必編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，所需的轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的植物是不含有任何整合進(jìn)其基因組中的外來(lái)核酸的植物。基因。如本文所用，“基因”是指編碼區(qū)并且不包括該區(qū)5’或3’的核苷酸序列。功能基因是與啟動(dòng)子或終止子有效連接的編碼區(qū)?；蚩衫棉D(zhuǎn)化或各種育種方法引入進(jìn)物種的基因組中，無(wú)論是從不同物種還是從相同物種引入?；蜣D(zhuǎn)換的(轉(zhuǎn)換)?；蜣D(zhuǎn)換的(轉(zhuǎn)換)植物是指通過(guò)稱為回交的植物育種技術(shù)開(kāi)發(fā)的植物，其中除了通過(guò)該回交技術(shù)、通過(guò)遺傳工程改造或通過(guò)突變轉(zhuǎn)移進(jìn)一品種中的一個(gè)或多個(gè)基因外，該品種的基本上所有的所需形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性得以恢復(fù)。還可以轉(zhuǎn)移一個(gè)或多個(gè)基因座。遺傳重排。是指可體內(nèi)以及體外自發(fā)發(fā)生的遺傳元件的重新組合，其引入了遺傳物質(zhì)的新組織。例如，在植物發(fā)育和有性重組過(guò)程中不同染色體基因座處的多核苷酸剪接在一起可在體內(nèi)自發(fā)發(fā)生。因此，體外通過(guò)非自然的遺傳修飾技術(shù)的遺傳元件重組近似于也可通過(guò)體內(nèi)有性重組發(fā)生的重組事件。金線蟲(chóng)。馬鈴薯金線蟲(chóng)(Globoderarostochiensis)(通稱為金線蟲(chóng))是影響馬鈴薯植物的根和塊莖的植物寄生線蟲(chóng)。癥狀包括植物生長(zhǎng)差、萎蔫、水脅迫和營(yíng)養(yǎng)缺乏。下胚軸。下胚軸是胚或籽苗介于子葉與根之間的部分。因此，其可視為介于苗與根之間的過(guò)渡區(qū)。框內(nèi)。核苷酸三聯(lián)體(密碼子)在植物細(xì)胞中翻譯成所需重組蛋白質(zhì)的新生氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明設(shè)想在閱讀框內(nèi)連接至第二核酸的第一核酸，其中第一核苷酸序列為基因而第二核苷酸為啟動(dòng)子或類似的調(diào)控元件。整合。是指來(lái)自所選植物物種、或來(lái)自物種與所選植物相同的植物、或來(lái)自與所選植物物種性親和的植物的核酸序列插入進(jìn)所選植物物種的細(xì)胞的基因組中?！罢稀笔侵竷H天然的遺傳元件摻入進(jìn)植物細(xì)胞基因組中。為了整合天然遺傳元件，例如通過(guò)同源重組，本發(fā)明可“利用”非天然DNA作為這種方法中的一個(gè)步驟。因而，本發(fā)明在特定DNA分子的“利用”與特定DNA分子“整合”進(jìn)植物細(xì)胞基因組中之間做了區(qū)分。引入。如本文所用，是指核酸序列通過(guò)包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的方法插入進(jìn)細(xì)胞中。分離的?！胺蛛x的”是指與其正常的天然環(huán)境物理分離的任何核酸或化合物。分離的物質(zhì)可維持在含有例如溶劑、緩沖劑、離子或其他組分的合適溶液中，并且可以是以純化的、或不純化的形式。前導(dǎo)序列。基因之前(或基因5’)的轉(zhuǎn)錄但未翻譯的序列。基因座。基因座可賦予一個(gè)或多個(gè)性狀，例如雄性不育性、除草劑耐性、抗蟲(chóng)性、抗病性、蠟質(zhì)淀粉、改良的脂肪酸代謝、改良的植酸代謝、改良的碳水化合物代謝以及改良的蛋白質(zhì)代謝。性狀可以例如由通過(guò)回交、天然的或誘導(dǎo)的突變引入進(jìn)品種的基因組中的自然存在的基因賦予，或由通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)引入的轉(zhuǎn)基因賦予?；蜃砂趩蝹€(gè)染色體位置處整合的一個(gè)或多個(gè)等位基因。商品產(chǎn)量。商品產(chǎn)量是直徑介于2到4英寸的所有收獲的塊莖的重量。商品產(chǎn)量以cwt(百分比重量)測(cè)量，其中cwt＝100磅。單子葉植物。其胚具有一片子葉的顯花植物。單子葉植物的例子包括但不限于草皮草、玉蜀黍、水稻、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾屬植物、百合、洋蔥和棕櫚樹(shù)。天然的?！疤烊坏摹边z傳元件是指天然存在于、起源于或?qū)儆诖D(zhuǎn)化植物的基因組的核酸。因而，分離自待轉(zhuǎn)化植物或植物物種的基因組或分離自與待轉(zhuǎn)化植物物種性親和或可雜交的植物或物種的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子對(duì)所述植物物種而言是“天然的”，即原生的。換句話講，天然遺傳元件代表植物育種者可及以通過(guò)經(jīng)典的植物育種改善植物的所有遺傳物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明天然核酸的任何變體也視為“天然的”。就此而論，“天然的”核酸也可分離自植物或其性親和物種并且經(jīng)修飾或突變以便所得的變體在核苷酸序列上與分離自植物的未經(jīng)修飾的、天然核酸具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性。天然核酸變體也可在核苷酸序列上具有少于約60％、少于約55％或少于約50％的相似性。分離自植物的“天然”核酸也可編碼從該核酸轉(zhuǎn)錄并翻譯的自然存在的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的變體。因而，天然核酸可編碼在氨基酸序列上與在分離該核酸的植物中表達(dá)的未經(jīng)修飾的、天然蛋白質(zhì)具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性的蛋白質(zhì)。天然遺傳元件。根據(jù)本發(fā)明可將“天然遺傳元件”摻入和整合進(jìn)所選擇的植物物種基因組中。天然遺傳元件分離自屬于所選擇的植物物種的植物或分離自與所選擇的植物物種性親和的植物。例如，摻入進(jìn)栽培馬鈴薯(Solanumtuberosum)中的天然DNA可源自栽培馬鈴薯的任何基因型或與栽培馬鈴薯性親和的野生馬鈴薯物種(例如S.demissum)的任何基因型。自然存在的核酸。自然存在的核酸存在于所選擇的植物物種的基因組中并且可以是DNA分子或RNA分子。可將通常存在于植物物種的基因組中的限制性位點(diǎn)序列工程改造進(jìn)外源DNA分子(例如載體或寡核苷酸)中，即使該限制性位點(diǎn)不與該基因組物理分離。因而，本發(fā)明允許合成產(chǎn)生核苷酸序列，例如限制性酶識(shí)別序列，只要該序列自然存在于所選擇的植物物種的基因組中或者自然存在于與所選擇的待轉(zhuǎn)化的植物物種性親和的植物中。有效連接。將兩個(gè)或更多個(gè)分子以使得它們?cè)诮M合中在植物細(xì)胞中正常發(fā)揮功能的方式組合。例如，當(dāng)啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，則該啟動(dòng)子有效連接至該結(jié)構(gòu)基因。植物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括但不限于被子植物和裸子植物如馬鈴薯、番茄、煙草、苜蓿、萵苣、胡蘿卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉蜀黍、草坪草、小麥、水稻、大麥、高粱、燕麥、橡樹(shù)、桉樹(shù)、胡桃和棕櫚樹(shù)。因而，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。如本文所用，單詞“植物”還涵蓋植物細(xì)胞、種子、植物子代、繁殖體(無(wú)論是通過(guò)有性生殖生成的還是通過(guò)無(wú)性生殖生成的)以及這些中任一者的后代，例如扦插物或種子。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物可以處于各種成熟階段并且可以在液體或固體培養(yǎng)中生長(zhǎng)，或者在罐子、溫室或田地中的土壤或合適介質(zhì)中生長(zhǎng)。引入的前導(dǎo)序列、尾部序列(trailer)或基因序列在植物中的表達(dá)可以是暫時(shí)的或永久的?！斑x擇的植物物種”可以是但不限于這些“植物”中的任一者的物種。植物部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物部分”(或馬鈴薯植物，或其部分)包括但不限于原生質(zhì)體、葉、莖、根、根尖、花藥、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、下胚軸、花、塊莖、芽眼、組織、葉柄、細(xì)胞、分生組織細(xì)胞等等。植物物種。屬于各種官方命名的植物物種的植物群體，其展現(xiàn)出至少某些性親和性。植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)。廣義地指將植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾并轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)闹参锱囵B(yǎng)基以進(jìn)行維持、進(jìn)一步生長(zhǎng)和/或進(jìn)一步發(fā)育的過(guò)程。精確育種。是指通過(guò)將核酸，例如分離自所選擇的植物物種、或分離自物種與所選擇的植物相同的另一植物、或分離自與所選擇的植物物種性親和的物種的天然基因或調(diào)控元件引入進(jìn)獨(dú)立植物細(xì)胞中，并隨后使這些經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞再生成整株植物來(lái)改良植物。因?yàn)闆](méi)有未知的或外來(lái)的核酸被永久地?fù)饺脒M(jìn)植物基因組中，所以本發(fā)明技術(shù)利用也可通過(guò)常規(guī)植物育種可及的相同遺傳物質(zhì)。子代。如本文所用，子代包括由兩株馬鈴薯植株雜交生成的F1馬鈴薯植株，其中至少一株植株包括馬鈴薯栽培種J3，并且子代還包括但不限于與回歸親本品系的后續(xù)F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9和F10世代雜交。數(shù)量性狀基因座(QTL)。數(shù)量性狀基因座(QTL)是指在一定程度上控制通常連續(xù)分布的可用數(shù)字代表的性狀的遺傳基因座。重組的。如本文所用，廣義地描述借此可以克隆基因、可以對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序以及可制備蛋白質(zhì)產(chǎn)物的各種技術(shù)。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)還描述已在基因轉(zhuǎn)移進(jìn)植物宿主系統(tǒng)的細(xì)胞中后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。再生。再生是指從組織培養(yǎng)物發(fā)育植株。調(diào)控序列。是指標(biāo)準(zhǔn)的且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可包括在表達(dá)載體中以增加和/或最大化植物系統(tǒng)中所關(guān)注基因的轉(zhuǎn)錄或所得的RNA的翻譯的那些序列。這包括但不限于啟動(dòng)子、肽輸出信號(hào)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。用于修飾核酸構(gòu)建體以增加在植物中的表達(dá)水平的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如Rogersetal.,260J.Biol.Chem.3731-38,1985(Rogers等人，《生物化學(xué)雜志》，第260卷，第3731-38頁(yè)，1985年)；Cornejoetal.,23PlantMol.Biol.567：81,1993)(Cornejo等人，《植物分子生物學(xué)》，第567卷，第23期，第81頁(yè)，1993年)。在工程改造植物系統(tǒng)以影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄速率時(shí)，本領(lǐng)域已知的各種因素(包括調(diào)控序列如正向作用或負(fù)向作用序列、增強(qiáng)子和沉默子，以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu))可具有影響。本發(fā)明提供，這些因素中的至少一者可用于工程改造植物以表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的調(diào)控序列是天然遺傳元件，即分離自所選擇的待修飾的植物物種。可選標(biāo)記?！翱蛇x標(biāo)記”通常是編碼賦予某種類型的針對(duì)抗生素、除草劑或毒性化合物的抗性的蛋白質(zhì)的基因，并且用于鑒定轉(zhuǎn)化事件?？蛇x標(biāo)記的例子包括編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(spt)基因、將甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi)基因、編碼卡那霉素和遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因、編碼磺酰脲類除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(als)基因、編碼針對(duì)用于抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑如草丁瞵或basta的抗性的基因(例如bar基因)、或本領(lǐng)域已知的其他類似基因。有義抑制。通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的內(nèi)源基因的全部或部分來(lái)減少該基因的表達(dá)。比重。如本文所用，“比重”是密度的表現(xiàn)并且為馬鈴薯品質(zhì)的量度。在塊莖比重與淀粉含量和干物質(zhì)或總固形物的百分比之間存在高的相關(guān)性。較高的比重促成較高的回收率以及較好的加工品品質(zhì)。T-DNA樣?！癟-DNA樣”序列為分離自所選擇的植物物種、或分離自與所選擇的植物物種性親和的植物，并且與農(nóng)桿菌物種T-DNA具有至少75％、80％、85％、90％或95％但非100％序列同一性的核酸。T-DNA樣序列可含有一個(gè)或多個(gè)邊界或邊界樣序列，其各自能使核苷酸序列整合進(jìn)另一多核苷酸中?？偖a(chǎn)量?？偖a(chǎn)量是指全部收獲的塊莖的總重量。尾部序列?；蛑?或基因3’)的轉(zhuǎn)錄但未翻譯的序列。轉(zhuǎn)錄的DNA。既含有基因又含有與該基因相關(guān)的非翻譯前導(dǎo)序列和尾部序列的DNA，其通過(guò)前面的啟動(dòng)子的作用轉(zhuǎn)錄為單條mRNA。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。DNA穩(wěn)定整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組中的過(guò)程。“穩(wěn)定”是指多核苷酸在細(xì)胞基因組中永久或非暫時(shí)的保留和/或由細(xì)胞基因組永久或非暫時(shí)的表達(dá)。因而，穩(wěn)定整合的多核苷酸是這樣一種核苷酸：其為轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組內(nèi)的固定物并且可以復(fù)制和遺傳到該細(xì)胞或所得的轉(zhuǎn)化植株的后續(xù)子代。轉(zhuǎn)化可使用本領(lǐng)域熟知的各種方法在天然或人工條件下進(jìn)行。轉(zhuǎn)化可依靠任何已知的用于將核酸序列插入進(jìn)原核或真核宿主細(xì)胞中的方法，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化規(guī)程、病毒感染、晶須法(whiskers)、電穿孔、熱休克、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、聚乙二醇處理、顯微注射和粒子轟擊。轉(zhuǎn)基因。將要插入進(jìn)宿主基因組中的基因，包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)。在本發(fā)明的上下文中，包含轉(zhuǎn)基因的元件分離自宿主基因組。轉(zhuǎn)基因植物。含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因的經(jīng)遺傳修飾的植物。變體。如本文所用，“變體”理解為意指偏離特定基因或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)的或給定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“同等型”、“同種型”和“類似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“變體”形式。通過(guò)添加、移除或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行變更的氨基酸序列，或核苷酸序列的改變可視為“變體”序列。變體可具有“保守”改變，其中置換的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如用異亮氨酸替代亮氨酸。變體可具有“非保守”改變，例如用色氨酸替代甘氨酸。類似的微小變異還可包括氨基酸缺失或插入或這二者。確定哪個(gè)氨基酸殘基可以被置換、插入或缺失的指導(dǎo)可使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序如VectorNTISuite(InforMax,MD)軟件找到。藤成熟度。藤成熟度是指植物繼續(xù)利用碳水化合物和進(jìn)行光合作用的能力。藤成熟度在1至5的范圍內(nèi)打分，其中1＝死藤，而5＝藤綠色，仍開(kāi)花。所需性狀插入進(jìn)馬鈴薯植物的基因組中是特別困難的，因?yàn)轳R鈴薯是四倍體的、高度雜合的并且對(duì)近交衰退敏感。因此，在通過(guò)常規(guī)育種進(jìn)行加工的過(guò)程中，很難有效培育出可生成較少丙烯酰胺和較少有害美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，所述美拉德反應(yīng)產(chǎn)物包括N-亞硝基-N-(3-酮基-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺(Wangetal.,ArchToxicol70:10-5,1995(Wang等人，《毒理學(xué)文獻(xiàn)》，第70卷，第10-5頁(yè)，1995年))、5-羥甲基-2-糠醛(Janzowskietal.,FoodChemToxicol38:801-9,2000(Janzowski等人，《食品與化學(xué)品毒理學(xué)》，第38卷，第801-809頁(yè)，2000年))以及其他具有突變特性的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Shibamoto,ProgClinBiolRes304:359-76,1989(Shibamoto，《臨床與生物學(xué)研究進(jìn)展》，第304卷，第359-376頁(yè)，1989年))。已經(jīng)測(cè)試了若干方法并且正在進(jìn)行研究以通過(guò)工藝改變、右旋糖減少以及添加劑如天冬酰胺酶、檸檬酸鹽和競(jìng)爭(zhēng)性氨基酸來(lái)減少丙烯酰胺。在整個(gè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)中實(shí)施工藝改變所需的資本支出將耗費(fèi)數(shù)百萬(wàn)美元。除了費(fèi)用以外，工藝改變具有明顯的缺點(diǎn)，包括與添加劑如天冬酰胺酶或檸檬酸鹽相關(guān)的潛在不好的味道。通常，油炸食品制造商在炸薯?xiàng)l加工的過(guò)程中添加右旋糖來(lái)產(chǎn)生所需的金黃色，但右旋糖還可通過(guò)美拉德反應(yīng)增加丙烯酰胺的形成。在該過(guò)程中僅省去右旋糖，會(huì)使丙烯酰胺顯著減少；但標(biāo)志性的金黃色稍后必須通過(guò)一些其他方式形成(例如通過(guò)添加色素如胭脂樹(shù)紅)。替代性色素的使用導(dǎo)致缺少通過(guò)那些褐變反應(yīng)形成的典型味道。使用添加劑來(lái)減少像天冬酰胺之類的反應(yīng)物的另一挑戰(zhàn)是冷凍保存期間發(fā)生的水分遷移，結(jié)果是天冬酰胺返回至表面而增加丙烯酰胺。最后，在馬鈴薯擦傷后發(fā)生的變黑影響在加工炸薯?xiàng)l和薯片過(guò)程中的品質(zhì)和回收率。在加工之前必須對(duì)損壞和擦傷的馬鈴薯進(jìn)行修整或不要，從而導(dǎo)致質(zhì)量挑戰(zhàn)或經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明的“天然技術(shù)”策略通過(guò)減少多酚氧化酶-5(PPO-5)(其為造成黑斑擦傷的原因)的表達(dá)、天冬酰胺合成酶-1(Asn-1)(其為造成天冬酰胺積聚的原因，天冬酰胺為丙烯酰胺形成的前體)的表達(dá)和/或磷酸化酶-L和激酶-R1(它們?yōu)榕c還原糖積聚相關(guān)的酶，還原糖通常與氨基酸如天冬酰胺反應(yīng)，并形成毒性美拉德產(chǎn)物，包括丙烯酰胺)的表達(dá)解決了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對(duì)改善馬鈴薯農(nóng)藝特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的需要。塊莖中這些基因的部分沉默或完全沉默可降低產(chǎn)生丙烯酰胺的可能性。使用本發(fā)明的天然技術(shù)使得能通過(guò)僅僅用“天然”遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化有商業(yè)價(jià)值的馬鈴薯植物品種而使所需性狀摻入進(jìn)該馬鈴薯的基因組中，所述“天然”遺傳物質(zhì)是從馬鈴薯植物或與馬鈴薯植物性親和的植物獲得的遺傳物質(zhì)，其僅含有非編碼調(diào)控區(qū)，沒(méi)有任何外來(lái)遺傳物質(zhì)整合進(jìn)該植物的基因組中。所需的性狀包括對(duì)碰撞誘導(dǎo)的黑斑擦傷的高耐受性、丙烯酰胺前體天冬酰胺形成減少以及還原糖積聚減少(伴隨后續(xù)的毒性美拉德產(chǎn)物(包括丙烯酰胺)的積聚降低)、改善的品質(zhì)和食品顏色控制。這些所需性狀摻入進(jìn)現(xiàn)有的馬鈴薯品種中不可能通過(guò)傳統(tǒng)的育種來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)轳R鈴薯為四倍體、高度雜合的，并且對(duì)近交衰退敏感。本發(fā)明中所用的非編碼馬鈴薯植物DNA插入序列是馬鈴薯植物基因組天然的并且不含有任何農(nóng)桿菌DNA。DNA插入物優(yōu)選包含兩個(gè)表達(dá)盒并且插入進(jìn)稱為pSIM1278轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)化載體中。第一表達(dá)盒包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)二者的片段，所述片段在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動(dòng)子與顆粒結(jié)合合酶基因(Gbss)的Gbss啟動(dòng)子之間以反向重復(fù)排列。這些啟動(dòng)子主要在塊莖中有活性。第二表達(dá)盒的功能是使淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子沉默。該表達(dá)盒由淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的片段構(gòu)成，所述片段有效連接至與第一表達(dá)盒相同的Agp和Gbss啟動(dòng)子。這些表達(dá)盒不含外來(lái)DNA，并且僅由來(lái)自所選植物物種或來(lái)自與所選植物物種性親和的植物的DNA組成。用于本發(fā)明的有商業(yè)價(jià)值的馬鈴薯植物品種是Atlantic。Atlantic植株為中等大小，具有直立的粗莖和輕微膨脹、疏生短柔毛的節(jié)點(diǎn)。其葉為亮到中綠色，葉面光滑，被適度短柔毛，帶突出翼瓣，包括大的不對(duì)稱一級(jí)葉片以及多個(gè)二級(jí)和三級(jí)葉片。其花具有被短柔毛的綠色錐形萼裂片、淡紫色花冠、橙色花藥和豐富的可育花粉。Atlantic栽培種可抗瘡痂病和黃萎病，抗粉紅芽眼，并且高度抗A型金線蟲(chóng)、病毒、塊莖網(wǎng)形壞死病和黑斑擦傷。Atlantic的塊莖易于發(fā)生內(nèi)部熱壞死，尤其是在溫暖干燥季節(jié)的砂質(zhì)土壤中。在一些生長(zhǎng)區(qū)域，較大直徑塊莖(>0.83mm)的空心病可能會(huì)很嚴(yán)重。塊莖為橢圓形至圓形，并具有輕度到重度的鱗狀網(wǎng)格薯皮、適度淺的芽眼和白色薯肉，并且塊莖休眠期為中等長(zhǎng)度。Atlantic具有高產(chǎn)潛力、高比重以及均勻的塊莖大小和形狀，是來(lái)源于田地或儲(chǔ)存期極短的用于炸片加工的標(biāo)準(zhǔn)品種(Webb等人，1978)。該品種是可育的，主要生長(zhǎng)在東北和東南地區(qū)，專用于生產(chǎn)薯片。本發(fā)明提供了具有重要市場(chǎng)價(jià)值的馬鈴薯品種，即Atlantic，其使用轉(zhuǎn)化載體pSIM1278轉(zhuǎn)化而成，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)而不是標(biāo)記鑒定，并成功繁殖。還提供了由本發(fā)明的馬鈴薯植物品種J3的塊莖制成的食品。馬鈴薯栽培種J3具有由經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)認(rèn)證的以下唯一植物品種標(biāo)識(shí)符：使用天然DNA實(shí)現(xiàn)的定向基因沉默降低了馬鈴薯植物品種J3的塊莖中靶標(biāo)基因的RNA轉(zhuǎn)錄物水平。Asn1和Ppo5基因沉默足以顯著減少丙烯酰胺形成二到四倍而不另外抑制淀粉相關(guān)基因激酶R1(R1)和磷酸化酶-L(PhL)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種J3的塊莖摻入了高度期望的性狀，包括較低比率的游離酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺，這與煎炸或烘培后減少的丙烯酰胺形成相關(guān)。具體地講，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3的特征在于游離天冬酰胺的含量降低至1/2到少于1/4。此外，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3在儲(chǔ)存期間顯示出淀粉降解為還原糖(葡萄糖和果糖)的延遲。淀粉向糖轉(zhuǎn)化的削弱還可降低衰老甜化和丙烯酰胺形成并可限制熱誘導(dǎo)的褐變。因此，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3在馬鈴薯工業(yè)和食品市場(chǎng)中極具價(jià)值，這是因?yàn)槠鋲K莖在熱加工后產(chǎn)生的丙烯酰胺大大減少并且不攜帶任何可能有害的外來(lái)基因。實(shí)例本發(fā)明技術(shù)使用天然技術(shù)來(lái)使天然非編碼DNA整合進(jìn)所選擇的馬鈴薯植物品種的基因組中以開(kāi)發(fā)新的轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種。該方法包括性狀鑒定、載體設(shè)計(jì)、載體摻入農(nóng)桿菌中、選擇受體馬鈴薯品種、植物轉(zhuǎn)化、開(kāi)放閱讀框缺少的證據(jù)以及確認(rèn)新馬鈴薯植物品種僅含有該天然DNA。本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3形成丙烯酰胺的可能性較小，并且與其未轉(zhuǎn)化的對(duì)應(yīng)物相比蔗糖含量較低。實(shí)例1.pSIM1278轉(zhuǎn)化載體用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體pSIM1278源自pSIM106，pSIM106通過(guò)這樣產(chǎn)生：將一0.4kb馬鈴薯植物DNA片段(以GenBank登錄號(hào)AY566555保藏)與pCAMBIA1301(CAMBIA，澳大利亞堪培拉市(Canberra,Australia))的一5.9kbSacII-SphI片段連接，該SacII-SphI片段攜帶來(lái)自質(zhì)粒pVS1和pBR322的細(xì)菌復(fù)制起始區(qū)，以及細(xì)菌抗卡那霉素的nptIII基因。將一表達(dá)盒作為一2.6kbSacII片段引入該載體骨架中(Rommens等人，2004)，該表達(dá)盒包含前接Ubi-3啟動(dòng)子(Garbarino和Belknap,1994)并且后接Ubi-3終止子的農(nóng)桿菌ipt基因。將攜帶兩個(gè)沉默盒的一天然10kbDNA片段插入進(jìn)pSIM106的DNA插入物中，得到pSIM1278。該載體用于全部轉(zhuǎn)化。pSIM1278載體圖譜示于圖1.載體骨架區(qū)為9,511bp，在位置9,957bp處開(kāi)始并在位置19,468bp處結(jié)束。該骨架DNA主要由細(xì)菌DNA組成并且在植物轉(zhuǎn)化之前支持DNA插入物的維持。骨架部分未轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞中。該骨架的各元件在表1中描述。表1實(shí)例2.植物DNA插入物及其開(kāi)放閱讀框(ORF)用于pSIM1278中的DNA插入?yún)^(qū)(包括旁側(cè)邊界序列)為10,147bp長(zhǎng)，從19,469bp到19,660bp以及從1bp到9,956bp。該DNA插入物僅由天然DNA組成并且穩(wěn)定地整合進(jìn)馬鈴薯基因組中。該DNA插入物及其功能性部分為載體pSIM1278中整合進(jìn)本發(fā)明的馬鈴薯植物品種中的唯一遺傳物質(zhì)。該DNA插入物示于下面的圖2和表2中。表2用于構(gòu)建本發(fā)明的馬鈴薯品系J3的表2所示DNA插入物不激活相鄰基因，并且不會(huì)對(duì)馬鈴薯植物品種J3的表型造成不利影響。此外，本發(fā)明的馬鈴薯植物品種J3未產(chǎn)生與DNA插入物編碼的開(kāi)放閱讀框相關(guān)的新型蛋白質(zhì)。實(shí)例3.農(nóng)桿菌菌株和轉(zhuǎn)染通過(guò)精確地缺失超毒力質(zhì)粒pTiBo542的轉(zhuǎn)移DNA而發(fā)展出C58衍生的農(nóng)桿菌菌株AGL1(Lazo等人，1991)。常見(jiàn)重組基因(recA)中的轉(zhuǎn)座子插入使諸如pSIM1278的重組質(zhì)粒載體穩(wěn)定(圖1)。AGL1表現(xiàn)出針對(duì)羧芐青霉素和利福平的抗性，并且用特美汀(timentin)將其從轉(zhuǎn)化的馬鈴薯組織消除。Atlantic品種的母株維持在裝有40ml半強(qiáng)度M516培養(yǎng)基的Magenta盒子中，該培養(yǎng)基包含3％蔗糖和2g/lgelrite(繁殖培養(yǎng)基)。從四周齡植物切取4到6毫米的馬鈴薯節(jié)間節(jié)段，用攜帶pSIM1278的農(nóng)桿菌AGL1菌株感染，并轉(zhuǎn)移至含有3％蔗糖和6g/l瓊脂的組織培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基)。兩天后，將感染的外植體轉(zhuǎn)移至含有3％蔗糖、6g/l瓊脂和150mg/l特美汀的M404培養(yǎng)基(無(wú)激素培養(yǎng)基)以消除農(nóng)桿菌。該方法的細(xì)節(jié)在Richael等人(2008)中有所描述。一個(gè)月以后，將感染的外植體轉(zhuǎn)移至缺少任何合成激素的新鮮培養(yǎng)基并在Percival生長(zhǎng)室中在16小時(shí)光周期下于24℃溫育，其中它們開(kāi)始形成苗。許多苗表達(dá)ipt基因并表現(xiàn)出細(xì)胞分裂素過(guò)度產(chǎn)生表型；這些苗不考慮用于進(jìn)一步分析。PCR基因型分析證明，其余苗的約0.3至1.5％含有P-DNA的至少一部分而同時(shí)缺少ipt基因。因而，沒(méi)有標(biāo)記被用于選擇轉(zhuǎn)化植物。有關(guān)基于ipt的無(wú)標(biāo)記植物轉(zhuǎn)化的細(xì)節(jié)已在Richael等人(2008)中公布。消除農(nóng)桿菌的過(guò)程在外植體感染后兩天開(kāi)始。為此，使組織經(jīng)受抗生素特美汀(150mg/L)處理直到證明沒(méi)有活的農(nóng)桿菌。證據(jù)通過(guò)將轉(zhuǎn)化事件的莖節(jié)段在營(yíng)養(yǎng)肉湯-酵母提取液(NBY培養(yǎng)基)上于28℃溫育2周(重復(fù)兩次)獲得。根據(jù)97CFRPart340，僅在沒(méi)有活的農(nóng)桿菌時(shí)將轉(zhuǎn)化的植物運(yùn)送并種植于田地中。通過(guò)DNA凝膠印跡分析對(duì)馬鈴薯植物品種J3進(jìn)行分析，以確定整合的DNA插入序列的結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)并證實(shí)載體骨架序列的缺失。此外，將分子表征用于確定該DNA插入物旁側(cè)的接合點(diǎn)的序列以及顯示插入的DNA的穩(wěn)定性。接合點(diǎn)的測(cè)序信息提供了用以針對(duì)轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種J3開(kāi)發(fā)特異性PCR測(cè)試的基礎(chǔ)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯栽培種J3包含在左邊界側(cè)反向連接的一個(gè)近乎完整的DNA插入物和一個(gè)部分拷貝的DNA插入物，其中缺失LB區(qū)和相鄰AGP啟動(dòng)子的一部分，如當(dāng)各種DNA消化物與AGP、ASN、PHL和GBS分子探針雜交時(shí)從雜交結(jié)果推導(dǎo)出的那樣。實(shí)例4.缺少載體骨架DNA的證據(jù)與許多商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物不同，本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3被證實(shí)不含用于轉(zhuǎn)化的由農(nóng)桿菌衍生的DNA序列，例如載體骨架DNA，采用了如下三種不同方法：1)首先，確定異戊烯異構(gòu)酶(ipt)負(fù)可選標(biāo)記基因在載體骨架中的存在與否，因?yàn)橐馔鈴霓r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移包含ipt基因表達(dá)盒的骨架DNA至植物細(xì)胞將引發(fā)ipt基因表達(dá)，并因此引發(fā)細(xì)胞分裂素類型激素異戊烯腺苷的形成，2)然后將DNA印跡雜交用于已通過(guò)第一個(gè)篩選方法的轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物以確認(rèn)骨架DNA的不存在，以及3)然后設(shè)計(jì)PCR來(lái)擴(kuò)增可指示DNA插入物邊界區(qū)與旁側(cè)骨架DNA之間的接合點(diǎn)或骨架DNA內(nèi)處于DNA插入物旁側(cè)的區(qū)域的片段。該方法的功效通過(guò)將pSIM1278DNA用作陽(yáng)性對(duì)照來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3未產(chǎn)生指示載體骨架DNA的存在的PCR條帶。實(shí)例5.插入的DNA的穩(wěn)定性使用DNA凝膠印跡雜交和性狀評(píng)價(jià)二者，在初始的轉(zhuǎn)化株中并然后再在繁殖的植物材料中評(píng)價(jià)了DNA插入物的穩(wěn)定性。進(jìn)行這些研究以確保轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的事件以一致且可靠的方式表達(dá)摻入的性狀。不穩(wěn)定性可通過(guò)罕見(jiàn)的重組事件引發(fā)或者也可由甲基化引起。因?yàn)轳R鈴薯通常是無(wú)性繁殖，因此用于有性繁殖作物的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估不是直接適用的，將塊莖而不是種子用于定義后代。DNA印跡雜交的結(jié)果證明，在多個(gè)世代中存在連續(xù)的條帶，從而表明了穩(wěn)定性。通過(guò)在第一代和第二代塊莖種子中確認(rèn)性狀功效獲得了穩(wěn)定性的進(jìn)一步證據(jù)。通過(guò)提取并評(píng)價(jià)來(lái)自體外繁殖并且從未在土壤中種植的植物的葉子的DNA，在初始轉(zhuǎn)化的材料(G0)中證明了DNA插入物穩(wěn)定性。對(duì)于第一代(G1)分析，將來(lái)自各轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的品種的兩株繁殖植物和來(lái)自各對(duì)照的一株植物種植于溫室中；將從各植物收獲的塊莖中的一者進(jìn)行種植以從G1植物獲得葉子，將該葉子用于分離DNA并評(píng)價(jià)G1代。再次種植來(lái)自該代的塊莖，將所得的G2植物的葉子用于進(jìn)行該世代的表征。在所有泳道中，從本發(fā)明的Atlantic馬鈴薯栽培種J3分離出的DNA與GBS探針的雜交顯示具有三根共有條帶(8.6kb、7.8kb和7.1kb)，并且與AGP探針的雜交顯示具有四根條帶(7.2kb、5.0kb、2.0kb和1.4kb)。這些條帶可指示未經(jīng)修飾的基因組的DNA片段。從所有轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的材料分離出的DNA中三根額外條帶(其中一根為2.2kb的條帶，指示內(nèi)部DNA插入片段；另外兩根表示DNA插入物連接片段(在與GBS的雜交中，為5.9kb和約13kb；在與AGP的雜交中，為1.6kb和5.7kb))的存在指示初始轉(zhuǎn)化株(G0)的插入物在第一無(wú)性世代G1和第二無(wú)性世代G2中保持穩(wěn)定。AtlanticG2塊莖不能使用兒茶酚檢測(cè)法分析Ppo活性，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)化的Atlantic品種的切割塊莖表面在暴露于兒茶酚時(shí)不能顯影棕色沉淀劑。可能的是，未轉(zhuǎn)化的Atlantic馬鈴薯不產(chǎn)生催化多酚氧化的酶。取而代之的是，通過(guò)PCR分析來(lái)證明插入的DNA的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，J3塊莖包含擴(kuò)增的0.8kb產(chǎn)物并且未表現(xiàn)出G2塊莖中的不穩(wěn)定性，所述產(chǎn)物是Asn1/Ppo5基因的一部分。實(shí)例6.接合點(diǎn)分析和品種特異性檢測(cè)至少一個(gè)DNA插入物/旁側(cè)植物DNA接合點(diǎn)用接頭連接介導(dǎo)的PCR或熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR進(jìn)行了測(cè)序。使用連接序列設(shè)計(jì)馬鈴薯栽培種J3的引物，并且這些引物被應(yīng)用于品種特異性的基于PCR的檢測(cè)方法?？墒褂靡飻U(kuò)增464kb的J3特異性DNA片段，得到用于品種J3的品系特異性測(cè)試方法。將開(kāi)發(fā)的方法用于監(jiān)測(cè)田地和儲(chǔ)存中的植物和塊莖以確認(rèn)塊莖或加工的食品中轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的材料的不存在，以及確保有機(jī)種植的純凈。實(shí)例7.基因沉默的功效和組織特異性利用基因沉默方法降低Asn1、Ppo5、PhL和R1天然蛋白質(zhì)的活性，并評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄物水平而不是蛋白質(zhì)含量，以將新的表型性狀與分子水平的變化相關(guān)聯(lián)。因?yàn)樯婕叭~子和莖中的ASN(天冬酰胺)形成的Asn1基因的強(qiáng)沉默可能會(huì)不利地影響生長(zhǎng)，所以將Agp啟動(dòng)子和Gbss啟動(dòng)子(其為塊莖特異性啟動(dòng)子和匍匐莖特異性啟動(dòng)子并且在光合作用活躍組織和根中活性低很多)用于驅(qū)動(dòng)塊莖和匍匐莖中的基因沉默。通過(guò)RNA印跡分析確定植物品種J3及其未轉(zhuǎn)化的對(duì)應(yīng)物的不同組織中的四個(gè)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄物水平。在未轉(zhuǎn)化的對(duì)照的塊莖中，對(duì)于Asn1、PhL和R1基因，轉(zhuǎn)錄物水平“高”(可通過(guò)RNA印跡雜交容易地檢測(cè))，對(duì)于Ppo5基因轉(zhuǎn)錄物水平“低”。將RNA印跡分析進(jìn)行比較表明，在來(lái)自溫室和田間的塊莖中Asn1、Ppo5和PhL以相似水平表達(dá)。相比之下，在溫室培養(yǎng)的對(duì)照塊莖中比在來(lái)自田間的塊莖中R1基因得到稍微更有效的沉默。品種J3的塊莖中Asn1和Ppo5基因的轉(zhuǎn)錄物水平大幅降低與產(chǎn)生丙烯酰胺的低可能性相關(guān)聯(lián)。品系J3的塊莖中PhL基因的轉(zhuǎn)錄物水平部分降低。該變化與葡萄糖和果糖的量降低相關(guān)聯(lián)。J3塊莖中的R1轉(zhuǎn)錄物部分減少(“降低”)，有助于限制淀粉降解成糖。在未轉(zhuǎn)化的植物的匍匐莖中Asn1、Ppo5和R1基因以低水平表達(dá)。相比之下，對(duì)照中的高轉(zhuǎn)錄物水平與PhL基因相關(guān)。在轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的品種J3的匍匐莖中，PhL基因的表達(dá)也被下調(diào)。品種J3的匍匐莖中的R1基因的轉(zhuǎn)錄物含量輕微減少(“降低”)。該分子改變有助于限制淀粉降解成糖。品系J3與其未轉(zhuǎn)化的對(duì)應(yīng)物的葉組織中的Asn1基因轉(zhuǎn)錄物水平類似。在所有情況下，均未檢測(cè)到用于Ppo5基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物水平，而PhL基因的含量在初始品種Atlantic和轉(zhuǎn)化后的衍生物J3中始終較高。與其對(duì)照相比，品種J3中的R1基因的轉(zhuǎn)錄物水平保持不變。在莖組織中，事件J3與其對(duì)照的Asn1基因轉(zhuǎn)錄物水平類似。在本發(fā)明的品種J3中，Ppo5基因的轉(zhuǎn)錄物水平降低。品系J3與其對(duì)照的PhL基因表達(dá)非常類似，并且R1基因表達(dá)未降低。在品種J3的根組織中，Asn1和Ppo5基因的轉(zhuǎn)錄物水平均降低。這些結(jié)果表明，用于驅(qū)動(dòng)沉默的啟動(dòng)子在地下組織中具有部分功能。本發(fā)明的品種J3的花組織中的Asn1基因轉(zhuǎn)錄物水平比初始品種Atlantic低。未檢出Ppo5基因的轉(zhuǎn)錄物，并且PhL和R1基因的表達(dá)水平與對(duì)照類似。這些結(jié)果表明，馬鈴薯品種J3的塊莖和匍匐莖中的Asn1和Ppo5基因的表達(dá)水平被下調(diào)，并且R1和PhL基因在品種J3的塊莖和匍匐莖中至少部分地沉默。沉默在塊莖和匍匐莖中最有效。所選馬鈴薯品種J3在Asn1和Ppo5基因的表達(dá)水平方面受到的影響比在R1和PhL基因的表達(dá)水平方面受到的影響強(qiáng)。這些結(jié)果與本發(fā)明人的如下意圖相一致：(1)以最大可能的程度防止Ppo蛋白和游離ASN的形成，以及(2)僅僅部分阻斷淀粉向葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)錄物水平在除了塊莖和匍匐莖之外的組織中的偶爾改變證明了塊莖/匍匐莖特異性啟動(dòng)子有一定滲漏。還有可能的是，塊莖中通過(guò)沉默盒的表達(dá)產(chǎn)生的小RNA遷移進(jìn)其他組織中，尤其是根和莖中(Molnar等人，2010)。在除了塊莖和匍匐莖之外的組織中表達(dá)水平改變的大多數(shù)情形中，差異較小。在轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的馬鈴薯栽培種J3的特定組織中的下調(diào)轉(zhuǎn)錄物水平匯總示于表3中。在表3中，A＝Asn1，P＝Ppo5，L＝PhL，R＝R1。表3中帶下劃線的字母指示下調(diào)基因表達(dá)水平。表3品種塊莖匍匐莖根莖葉花J3APLRAPRAPLRA實(shí)例8.田間表現(xiàn)和塊莖評(píng)價(jià)2009、2010和2011年的試驗(yàn)用機(jī)械化種植以方便收獲并且確保轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的馬鈴薯保持與未修飾材料分離。對(duì)于2009年的評(píng)價(jià)，將來(lái)自每個(gè)事件和對(duì)照品種的“核心種子(nuclearseed)”微型種薯(minituber)用于種植四到五個(gè)單行樣區(qū)(single-rowplot)(20個(gè)微型種薯/樣區(qū))，其中樣區(qū)隨機(jī)分布在整個(gè)田地的區(qū)組內(nèi)。該隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)(RCB)對(duì)于新馬鈴薯品種和事件而言是典型的。在2010年和2011年進(jìn)行的方法是每個(gè)點(diǎn)每個(gè)事件和對(duì)照使用三個(gè)隨機(jī)樣區(qū)，還使用了重復(fù)數(shù)(每個(gè)事件的樣區(qū)數(shù))等于區(qū)組數(shù)的RCB。2010年的每個(gè)樣區(qū)包括三行、每行20個(gè)種子片，均來(lái)自2009年在內(nèi)布拉斯加州切里縣(CherryCounty,NE)生產(chǎn)的Atlantic的“核心種子”微型種薯。用于2011年試驗(yàn)的Atlantic種子是2010年在內(nèi)布拉斯加州切里縣(CherryCounty,NE)生產(chǎn)的第一代(G1)。在所有試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)入雜交親和物種基因的品系的種子類似于其未經(jīng)修飾的對(duì)照進(jìn)行處理。田間生長(zhǎng)的塊莖比微型種薯更合適作為種子，因?yàn)樗鼈兩筛谢盍η腋坏漠a(chǎn)生更高塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)的植物。針對(duì)對(duì)昆蟲(chóng)、病害和環(huán)境脅迫的差異性響應(yīng)對(duì)每個(gè)樣塊進(jìn)行定性評(píng)價(jià)(在一些情形中使用標(biāo)準(zhǔn)化的監(jiān)測(cè)尺度)，所述環(huán)境脅迫不是人工誘導(dǎo)的而是在生長(zhǎng)季節(jié)期間可能自發(fā)出現(xiàn)的。在2009、2010和2011年剛好在早期行鋪滿(rowclosure)和開(kāi)花之前或在早期行鋪滿和開(kāi)花期間(對(duì)于大多數(shù)試驗(yàn)在六月到七月，弗羅里達(dá)的試驗(yàn)除外，其在四月進(jìn)行評(píng)價(jià))進(jìn)行季節(jié)中期監(jiān)測(cè)，以評(píng)估植物活力、葉顏色、葉尺寸、葉卷曲、病害癥狀(存在/不存在)，以及昆蟲(chóng)相關(guān)的植物損害。在2011年，對(duì)生長(zhǎng)區(qū)域普通的特定昆蟲(chóng)、病害和非生物脅迫因素進(jìn)行評(píng)價(jià)。在季節(jié)中期和晚期期間病害和昆蟲(chóng)壓力通常是最高的，但從七月到九月(對(duì)于弗羅里達(dá)的試驗(yàn)是從三月到五月)針對(duì)病原體和昆蟲(chóng)引起的癥狀對(duì)植物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在殺藤(旨在確保塊莖成熟和季節(jié)晚期表皮長(zhǎng)好(skinset)的過(guò)程)之前進(jìn)行藤成熟度和病害的季節(jié)晚期監(jiān)測(cè)。藤殺死通過(guò)收割或撲打藤或通過(guò)根據(jù)制造商的建議(明尼蘇達(dá)州羅斯維爾市(Roseville,MN)的JRJohnson公司)使用批準(zhǔn)的除草劑如Reglone來(lái)誘導(dǎo)。在此時(shí)，還針對(duì)病害癥狀和昆蟲(chóng)損害對(duì)植物進(jìn)行評(píng)估。在鑒別了病害癥狀時(shí)的一些情形中，還進(jìn)行發(fā)芽測(cè)試以確認(rèn)該發(fā)現(xiàn)。使用JMP9.0.2計(jì)算了平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和90％置信區(qū)間。通過(guò)獲得實(shí)驗(yàn)中包括的所有常規(guī)品種的最小和最大平均值(年份*位置*條目(entry))生成常規(guī)品種范圍。在JMP9.0.2中，通過(guò)合并多年多個(gè)位置的數(shù)據(jù)，分析Atlantic品種的所有特性。實(shí)例9.馬鈴薯栽培種J3特征匯總馬鈴薯品種J3通過(guò)降低反應(yīng)物(即，天冬酰胺)的濃度來(lái)減少丙烯酰胺的形成，同時(shí)減少糖的形成，從而滿足了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)提高質(zhì)量的需求。馬鈴薯品種J3使用馬鈴薯植物基因組天然的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且不包含外來(lái)DNA、農(nóng)桿菌DNA、病毒標(biāo)志物或載體骨架序列。此外，進(jìn)行農(nóng)藝學(xué)研究以確保該事件以與常規(guī)對(duì)照相同的方式生長(zhǎng)，但與性狀相關(guān)的特性除外。農(nóng)藝學(xué)特性對(duì)2009年、2010年和2011年生長(zhǎng)的馬鈴薯品種J3事件和對(duì)照的農(nóng)藝學(xué)特性的評(píng)價(jià)示于表4至表7中。在可能的情況下通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法分析了結(jié)果?？傮w數(shù)據(jù)表明，在Atlantic對(duì)照與J3Atlantic事件之間沒(méi)有重大差異。表4示出了針對(duì)品種J3測(cè)試的每種特性的位點(diǎn)-年數(shù)目。J3和Atlantic對(duì)照的農(nóng)藝學(xué)特性示于表5中。其中五種農(nóng)藝學(xué)特性在J3與對(duì)照之間未檢測(cè)出統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。葉片卷曲和藤成熟度等級(jí)數(shù)據(jù)不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，因?yàn)镴3的葉片卷曲平均值與對(duì)照相同，并且J3的觀測(cè)值在常規(guī)品種總范圍之外(分別為2.89與3.00-3.50)。在J3與對(duì)照之間檢測(cè)出每株植物的莖(3.42與3.14)和衰老(52.37與47.37)存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異；然而，在兩種情況下，J3的值均在常規(guī)品種范圍內(nèi)。在表5中，每株植物的莖和最終出苗數(shù)據(jù)僅來(lái)自2011年的記錄；常規(guī)品種(ConV)范圍等于常規(guī)的Ranger、Burbank和Atlantic品種的平均值范圍；NA表示不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。J3和Atlantic對(duì)照的產(chǎn)量和等級(jí)特性示于表6中。在總產(chǎn)量、A級(jí)％、揀選率(pickouts)％或總內(nèi)部缺陷方面未檢測(cè)出統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。無(wú)法對(duì)B級(jí)％進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但J3的平均值在常規(guī)的品種范圍內(nèi)。在J3和對(duì)照之間檢測(cè)到三方面的統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異：U.S.#1(分別為84.7與87.1)、過(guò)大率％(5.4與8.3)和比重(1.094與1.092)。在這些差異方面，J3的所有值均在常規(guī)品種范圍內(nèi)。在表6中，常規(guī)品種(ConV)范圍等于常規(guī)的Ranger、Burbank和Atlantic品種的平均值范圍；NA表示不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。J3和Atlantic對(duì)照的花顏色示于表7中。對(duì)于每個(gè)條目，在不同樣區(qū)中觀察到紫色和混合的花顏色。表4表5表6表7基于表4至表7提供的關(guān)于馬鈴薯栽培種J3的數(shù)據(jù)，可以推斷出，未轉(zhuǎn)化的Atlantic品種與馬鈴薯栽培種J3之間在農(nóng)藝學(xué)特性、花顏色、產(chǎn)量和等級(jí)、以及生態(tài)相互作用方面沒(méi)有重大差異。因此，基于多年的數(shù)據(jù)，Atlantic品種J3不會(huì)因雜草性或產(chǎn)生植物害蟲(chóng)的可能性而在環(huán)境方面造成重大的持久性風(fēng)險(xiǎn)。天冬酰胺和丙烯酰胺水平天冬酰胺合成酶基因的沉默導(dǎo)致馬鈴薯品種J3中游離天冬酰胺平均減少77％。較低的天冬酰胺水平(其在美拉德反應(yīng)中與還原糖化合而形成丙烯酰胺)導(dǎo)致炸薯?xiàng)l中平均減少67％的丙烯酰胺。Atlantic對(duì)照與馬鈴薯J3在天冬酰胺和丙烯酰胺方面的差異示于表8中。在測(cè)試丙烯酰胺之前，將對(duì)照和J3制成炸薯?xiàng)l。所有結(jié)果均來(lái)自收獲不久時(shí)分析的塊莖。表8馬鈴薯栽培種J3是具有改進(jìn)質(zhì)量的Atlantic品種，其具有降低的丙烯酰胺水平。本發(fā)明的另外的實(shí)施例得到組合了上面提及的有利特性的馬鈴薯品種的研究大部分是經(jīng)驗(yàn)性的。該研究需要大量投入時(shí)間、勞力和金錢(qián)。馬鈴薯栽培種的開(kāi)發(fā)從溫室到商業(yè)利用通常耗費(fèi)八年或更久。育種始于對(duì)優(yōu)異親本的仔細(xì)選擇以將最重要的特性摻入子代中。因?yàn)樗兴栊誀钔ǔ２⒉煌ㄟ^(guò)僅一次雜交而出現(xiàn)，所以育種必須是累積的。當(dāng)前的育種技術(shù)一直是對(duì)親本克隆進(jìn)行控制授粉。通常，花粉收集于明膠膠囊中以供后面用于對(duì)母本進(jìn)行授粉。將雜種種子播種于溫室中并從數(shù)以千計(jì)的獨(dú)立籽苗收獲塊莖并保留。下一年，將來(lái)自每株所得籽苗的一到四個(gè)塊莖種植于田地中，其中要極其小心以避免病毒和病害傳播。從該第一年的籽苗作物，來(lái)自每個(gè)雜種個(gè)體(其通過(guò)了選擇過(guò)程)的數(shù)個(gè)“種子”塊莖被保留用于下一年的種植。在第二年之后，獲取樣品以供密度測(cè)量以及煎炸測(cè)試來(lái)確定塊莖對(duì)于商業(yè)利用的合適性。然后將到目前為止已通過(guò)選擇過(guò)程的植物以擴(kuò)大量種植第三年，以供更復(fù)雜的一系列煎炸測(cè)試和密度測(cè)定。在開(kāi)發(fā)的第四年階段，將存留下來(lái)的選擇株在數(shù)個(gè)州接受田間試驗(yàn)，以確定它們對(duì)不同生長(zhǎng)條件的適應(yīng)性。最終，將具有優(yōu)異品質(zhì)的品種轉(zhuǎn)移至其他農(nóng)場(chǎng)并將種子增加至商業(yè)規(guī)模。一般而言，到此時(shí)，已經(jīng)投入了八年或更多年的種植、收獲和測(cè)試以圖開(kāi)發(fā)新的且改良的馬鈴薯栽培種。隨著使得能對(duì)編碼特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因進(jìn)行分離和表征的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域中的科學(xué)家在工程改造植物基因組以含有和表達(dá)外來(lái)基因、或者天然或內(nèi)源基因的額外形式或修飾形式(或許通過(guò)不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))以通過(guò)特定方式改變植物的性狀方面產(chǎn)生了強(qiáng)烈的興趣。這種外來(lái)的額外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。在最后的十五到二十年間，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了若干用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，并且在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及要求權(quán)利保護(hù)的品種或品系的轉(zhuǎn)化形式。植物轉(zhuǎn)化涉及構(gòu)建將會(huì)在植物細(xì)胞中有功能的表達(dá)載體。這樣一種載體包含DNA，該DNA包含處于調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)的控制下的基因，或與調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)有效連接的基因。表達(dá)載體可以含有一個(gè)或多個(gè)這種有效連接的基因/調(diào)控元件組合。載體可以是以質(zhì)粒的形式，并且可以單獨(dú)使用或與其他質(zhì)粒組合使用，以利用下面描述的將轉(zhuǎn)基因摻入進(jìn)馬鈴薯植物的遺傳物質(zhì)中的轉(zhuǎn)化方法來(lái)提供轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物。傳統(tǒng)的植物育種通常依賴于植物染色體的隨機(jī)重組來(lái)產(chǎn)生具有新的且改良的特性的品種。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的、眾所周知的技術(shù)，包含基因和調(diào)控元件的遺傳“表達(dá)盒”插入在農(nóng)桿菌分離的轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的邊界序列內(nèi)并整合進(jìn)植物基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA物質(zhì)的轉(zhuǎn)化通常包括如下標(biāo)準(zhǔn)程序：(1)體外重組遺傳元件以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化選擇的表達(dá)盒，所述遺傳元件的至少一者是外源的，(2)將該表達(dá)盒(通常與至少一個(gè)含有外來(lái)DNA的其他表達(dá)盒一起)插入進(jìn)二元載體的T-DNA區(qū)中，所述二元載體通常由旁側(cè)為T(mén)-DNA邊界序列的數(shù)百個(gè)堿基對(duì)的農(nóng)桿菌DNA組成，(3)位于T-DNA邊界序列之間的序列(通常伴隨有來(lái)自農(nóng)桿菌的額外二元載體序列的一些或全部)轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，以及(4)選擇表現(xiàn)出所需性狀(如產(chǎn)量增加、活力改善、對(duì)病害和昆蟲(chóng)的抗性增強(qiáng)或者在脅迫下存活的能力更強(qiáng))的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。因而，遺傳改造方法依賴于引入外來(lái)的非原生核酸，包括調(diào)控元件如啟動(dòng)子和終止子，以及來(lái)自病毒、細(xì)菌和植物的涉及作為轉(zhuǎn)化株的鑒定和選擇的標(biāo)記的新性狀或功能的表達(dá)的基因。標(biāo)記基因通常源于細(xì)菌來(lái)源并且賦予抗生素或除草劑抗性。經(jīng)典的育種方法是費(fèi)力費(fèi)時(shí)的，并且新品種通常僅表型出相對(duì)適度的改善。在該“反義”技術(shù)中，將天然基因的序列反轉(zhuǎn)以沉默轉(zhuǎn)基因植物中的基因的表達(dá)。然而，反向DNA通常含有插入在啟動(dòng)子和終止子之間的新的未表征的開(kāi)放閱讀框，這些開(kāi)放閱讀框編碼外來(lái)氨基酸序列，所述氨基酸序列可能是不期望的，因?yàn)樗鼈兏蓴_植物發(fā)育和/或降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。用于馬鈴薯轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體：標(biāo)記基因表達(dá)載體包括至少一個(gè)與調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子)有效連接的遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記使得含有該標(biāo)記的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能通過(guò)負(fù)向選擇(即抑制不含該可選標(biāo)記基因的細(xì)胞的生長(zhǎng))，或通過(guò)正向選擇(即針對(duì)該遺傳標(biāo)記編碼的產(chǎn)物進(jìn)行篩選)進(jìn)行回收。用于植物轉(zhuǎn)化的許多通常使用的可選標(biāo)記基因是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域熟知的，并且包括例如編碼通過(guò)代謝使選擇性化學(xué)劑(其可以是抗生素或除草劑)解毒的酶的基因，或編碼對(duì)抑制劑不敏感的變更的靶標(biāo)物的基因。許多正向選擇方法也是本領(lǐng)域已知的。用于植物轉(zhuǎn)化的一種通常使用的可選標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)基因，其在處于植物調(diào)控信號(hào)的控制下時(shí)，賦予針對(duì)卡那霉素的抗性。Fraleyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983)(Fraley等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第80卷，第4803頁(yè)，1983年)。另一通常使用的可選標(biāo)記基因是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予針對(duì)抗生素潮霉素的抗性。VandenElzenetal.,PlantMol.Biol.,5:299(1985)(VandenElzen等人，《植物分子生物學(xué)》，第5卷，第299頁(yè)，1985年)。賦予抗生素抗性的細(xì)菌起源的其他可選標(biāo)記基因包括慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷-3'-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、博來(lái)霉素抗性決定子。Hayfordetal.,PlantPhysiol.86:1216(1988)(Hayford等人，《植物生理學(xué)》，第86卷，第1216頁(yè)，1988年)；Jonesetal.,Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)(Jones等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第210卷，第86頁(yè)，1987年)；Svabetal.,PlantMol.Biol.14:197(1990)(Svab等人，《植物分子生物學(xué)》，第14卷，第197頁(yè)，1990年)；Hilleetal.,PlantMol.Biol.7:171(1986)(Hille等人，《植物分子生物學(xué)》，第7卷，第171頁(yè)，1986年)。其他可選標(biāo)記賦予針對(duì)除草劑如草甘膦、草銨膦、溴草腈的抗性。Comaietal.,Nature317:741-744(1985)(Comai等人，《自然》，第317卷，第741-744頁(yè)，1985年)；Gordon-Kammetal.,PlantCell2:603-618(1990)(Gordon-Kamm等人，《植物細(xì)胞》，第2卷，第603-618頁(yè)，1990年)；以及Stalkeretal.,Science242:419-423(1988)(Stalker等人，《科學(xué)》，第242卷，第419-423頁(yè)，1988年)。非細(xì)菌起源的用于植物轉(zhuǎn)化的可選標(biāo)記基因包括(例如)小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholtzetal.,SomaticCellMol.Genet.13:67(1987)(Eichholtz等人，《體細(xì)胞和分子遺傳學(xué)》，第13卷，第67頁(yè)，1987年)；Shahetal.,Science233:478(1986)(Shah等人，《科學(xué)》，第233卷，第478頁(yè)，1986年)；Charestetal.,PlantCellRep.8:643(1990)(Charest等人，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第8卷，第643頁(yè)，1990年)。用于植物轉(zhuǎn)化的另一類標(biāo)記基因需要針對(duì)對(duì)毒性物質(zhì)如抗生素的抗性篩選推定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞而不是直接遺傳選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些基因尤其可用于對(duì)特定組織中基因表達(dá)的空間模式進(jìn)行定量或可視化，并且常常稱為報(bào)告基因，因?yàn)樗鼈兛扇诤现粱蚧蚧蛘{(diào)控序列以供基因表達(dá)的調(diào)查研究。用于篩選推定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的通常使用的基因包括β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、熒光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Jefferson,R.A.,PlantMol.Biol.Rep.5:387(1987)(Jefferson,R.A.，《植物分子生物學(xué)報(bào)告》，第5卷，第387頁(yè)，1987年)；Teerietal.,EMBOJ.8:343(1989)(Teeri等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第8卷，第343頁(yè)，1989年)；Konczetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:131(1987)(Koncz等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第84卷，第131頁(yè)，1987年)；DeBlocketal.,EMBOJ.3:1681(1984)(DeBlock等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第3卷，第1681頁(yè)，1984年)。用于使GUS活性可視化而不需要破壞植物組織的體內(nèi)方法是可用的。MolecularProbespublication2908,IMAGENEGREEN,p.1-4(1993)(分子探針出版物2908，IMAGENEGREEN，第1-4頁(yè)，1993年)和Nalewayetal.,J.CellBiol.115:151a(1991)(Naleway等人，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，第115卷，第151a頁(yè)，1991年)。然而，因?yàn)榈挽`敏度、高熒光背景和與使用熒光素酶基因作為可選標(biāo)記相關(guān)的局限性，這些用于可視化GUS活性的體內(nèi)方法尚未證實(shí)可用于回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。更近些時(shí)候，編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因已被用作原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的標(biāo)記。Chalfieetal.,Science263:802(1994)(Chalfie等人，《科學(xué)》，第263卷，第802頁(yè)，1994年)。GFP和GFP的突變體可用作篩選標(biāo)記。用于馬鈴薯轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子表達(dá)載體中包括的基因必須由包含調(diào)控元件例如啟動(dòng)子的核苷酸序列驅(qū)動(dòng)。數(shù)種類型的啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域熟知的，可單獨(dú)使用或與啟動(dòng)子組合使用的其他調(diào)控元件也是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域所熟知的。如本文所用，“啟動(dòng)子”包括提及處于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游并且涉及RNA聚合酶及其他蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)。“植物啟動(dòng)子”是能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。處于發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括優(yōu)先在某些組織如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子稱為“組織偏好的”。僅在某些組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為“組織特異性的”?！凹?xì)胞型”特異性啟動(dòng)子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括無(wú)氧條件或光的存在。組織特異性啟動(dòng)子、組織偏好啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成一類“非組成型”啟動(dòng)子?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動(dòng)子。A.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接。任選地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列有效連接，該信號(hào)序列與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而增加。任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明。參見(jiàn)Wardetal.,PlantMol.Biol.22:361-366(1993)(Ward等人，《植物分子生物學(xué)》，第22卷，第361-366頁(yè)，1993年)。示例性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于：響應(yīng)于銅的來(lái)自ACEI系統(tǒng)的啟動(dòng)子(Mettetal.,PNAS90:4567-4571(1993)(Mett等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第90卷，第4567-4571頁(yè)，1993年))、響應(yīng)于苯磺酰胺除草劑安全劑的來(lái)自玉蜀黍的In2基因(Hersheyetal.,Mol.GenGenetics227:229-237(1991)(Hershey等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第227卷，第229-237頁(yè)，1991年)和Gatzetal.,Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994)(Gatz等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第243卷，第32-38頁(yè)，1994年))或來(lái)自Tn10的Tet阻遏物(Gatzetal.,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)(Gatz等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第227卷，第229-237頁(yè)，1991年))。特別優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)植物通常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子。示例性的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來(lái)自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受糖皮質(zhì)類固醇激素的誘導(dǎo)。Schenaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:0421(1991)(Schena等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第88卷，第0421頁(yè)，1991年)。B.組成型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接，或者組成型啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列有效連接，該信號(hào)序列與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接。在本發(fā)明中可利用許多不同的組成型啟動(dòng)子。示例性組成型啟動(dòng)子包括但不限于：來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，例如來(lái)自CaMV的35S啟動(dòng)子(Odelletal.,Nature313:810-812(1985)(Odell等人，《自然》)，第313卷，第810-812頁(yè)，1985年)，以及來(lái)自諸如水稻肌動(dòng)蛋白的此類基因的啟動(dòng)子(McElroyetal.,PlantCell2:163-171(1990)(McElroy等人，《植物細(xì)胞》，第2卷，第163-171頁(yè)，1990年))；泛素(Christensenetal.,PlantMol.Biol.12:619-632(1989)(Christensen等人，《植物分子生物學(xué)》，第12卷，第619-632頁(yè)，1989年)和Christensenetal.,PlantMol.Biol.18:675-689(1992)(Christensen等人，《植物分子生物學(xué)》，第18卷，第675-689頁(yè)，1992年))；pEMU(Lastetal.,Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991)(Last等人，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第81卷，第581-588頁(yè)，1991年))；MAS(Veltenetal.,EMBOJ.3:2723-2730(1984)(Velten等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第3卷，第2723-2730頁(yè)，1984年))和玉蜀黍H3組蛋白(Lepetitetal.,Mol.Gen.Genetics231:276-285(1992)(Lepetit等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第231卷，第276-285頁(yè)，1992年)和Atanassovaetal.,PlantJournal2(3):291-300(1992)(Atanassova等人，《植物雜志》，第2卷，第3期，第291-300頁(yè)，1992年))。ALS啟動(dòng)子為歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3結(jié)構(gòu)基因5'的Xba1/Ncol片段(或類似于所述Xba1/Ncol片段的核苷酸序列)，其代表一特別有用的組成型啟動(dòng)子。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO96/30530。C.組織特異性啟動(dòng)子或組織偏好啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接。任選地，組織特異性啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列有效連接，該信號(hào)序列與要在馬鈴薯中表達(dá)的基因有效連接。轉(zhuǎn)化有與組織特異性啟動(dòng)子有效連接的所關(guān)注基因的植物在特定組織中僅僅或優(yōu)先產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。任何組織特異性或組織偏好啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明。示例性組織特異性或組織偏好啟動(dòng)子包括但不限于：根偏好啟動(dòng)子，例如來(lái)自菜豆素基因的啟動(dòng)子(Muraietal.,Science23:476-482(1983)(Murai等人，《科學(xué)》，第23卷，第476-482頁(yè)，1983年)和Sengupta-Gopalanetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3320-3324(1985)(Sengupta-Gopalan等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第82卷，第3320-3324頁(yè)，1985年))；葉特異性的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如來(lái)自cab或rubisco的啟動(dòng)子(Simpsonetal.,EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)(Simpson等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第4卷，第11期，第2723-2729頁(yè)，1985年)和Timkoetal.,Nature318:579-582(1985)(Timko等人，《自然》，第318卷，第579-582頁(yè)，1985年))；花藥特異性啟動(dòng)子，例如來(lái)自LAT52的啟動(dòng)子(Twelletal.,Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989)(Twell等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第217卷，第240-245頁(yè)，1989年))；花粉特異性啟動(dòng)子，例如來(lái)自Zm13的啟動(dòng)子(Guerreroetal.,Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993)(Guerrero等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第244卷，第161-168頁(yè)，1993年))或小孢子偏好啟動(dòng)子，例如來(lái)自apg的啟動(dòng)子(Twelletal.,Sex.PlantReprod.6:217-224(1993)(Twell等人，《植物有性生殖》，第6卷，第217-224頁(yè)，1993年))。用于將靶標(biāo)蛋白質(zhì)靶向至亞細(xì)胞區(qū)室的信號(hào)序列將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)運(yùn)輸至亞細(xì)胞區(qū)室如葉綠體、液泡、過(guò)氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體或者用于分泌進(jìn)質(zhì)外體中可通過(guò)將編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)有效連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。結(jié)構(gòu)基因5’和/或3’端處的靶向序列可在蛋白質(zhì)合成和加工期間決定所編碼的蛋白質(zhì)最終在哪區(qū)室化。信號(hào)序列的存在將多肽引導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或用于分泌進(jìn)質(zhì)外體。許多信號(hào)序列是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如Beckeretal.,PlantMol.Biol.20:49(1992)(Becker等人，《植物分子生物學(xué)》，第20卷，第49頁(yè)，1992年)；Close,P.S.,Master’sThesis,IowaStateUniversity(1993)(Close,P.S.，碩士論文，愛(ài)荷華州立大學(xué)，1993年)；Knox,C.,etal.,PlantMol.Biol.9:3-17(1987)(Knox,C.等人，《植物分子生物學(xué)》，第9卷，第3-17頁(yè)，1987年)；Lerneretal.,PlantPhysiol.91:124-129(1989)(Lerner等人，《植物生理學(xué)》，第91卷，第124-129頁(yè)，1989年)；Frontesetal.,PlantCell3:483-496(1991)(Frontes等人，《植物細(xì)胞》，第3卷，第483-496頁(yè)，1991年)；Matsuokaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:834(1991)(Matsuoka等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第88卷，第834頁(yè)，1991年)；Gouldetal.,J.Cell.Biol.108:1657(1989)(Gould等人，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，第108卷，第1657頁(yè)，1989年)；Creissenetal.,PlantJ.2:129(1991)(Creissen等人，《植物雜志》，第2卷，第129頁(yè)，1991年)；Kalderon,etal.,Cell39:499-509(1984)(Kalderon等人，《細(xì)胞》，第39卷，第499-509頁(yè)，1984年)；Steifel,etal.,PlantCell2:785-793(1990)(Steifel等人，《植物細(xì)胞》，第2卷，第785-793頁(yè)，1990年)。外來(lái)蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因使用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以商業(yè)量產(chǎn)生外來(lái)蛋白質(zhì)。因而，轉(zhuǎn)基因植物選擇和繁殖的技術(shù)(其為本領(lǐng)域周知的)可產(chǎn)生以常規(guī)方式收獲的許多轉(zhuǎn)基因植物，并然后可從所關(guān)注的組織或從總生物質(zhì)提取外來(lái)蛋白質(zhì)。植物生物質(zhì)中的蛋白質(zhì)提取可通過(guò)已知方法實(shí)現(xiàn)，所述已知方法在例如HeneyandOrr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)(Heney和Orr，《分析生物化學(xué)》，第114卷，第92-6頁(yè)，1981年)中有所論述。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，提供外來(lái)蛋白質(zhì)的商業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物是馬鈴薯植物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所關(guān)注的生物質(zhì)是種子或塊莖。對(duì)于數(shù)目相對(duì)較少的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以生成遺傳圖譜，主要通過(guò)常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析生成，其可鑒定整合的DNA分子大概的染色體位置。對(duì)于這一方面的示例性方法，參見(jiàn)GlickandThompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPress,BocaRaton269:284(1993)(Glick和Thompson，《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法》)，CRC出版社，博卡拉頓市，第269卷，第284頁(yè)，1993年)。有關(guān)染色體位置的圖譜信息可用于對(duì)主題轉(zhuǎn)基因植物的專有保護(hù)。如果進(jìn)行了未授權(quán)的繁殖以及與其他種質(zhì)雜交，則可將整合區(qū)的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較，以確定后者是否與主題植物具有共同的系譜(parentage)。圖譜比較將涉及雜交、RFLP、PCR、SSR和測(cè)序，所有這些均是常規(guī)的技術(shù)。同樣，借助于本發(fā)明，可在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體而言，可對(duì)植物進(jìn)行遺傳改造以表達(dá)農(nóng)藝學(xué)感興趣的各種表型。在這一方面所牽涉的示例性基因包括但不限于下面歸類的那些：1.賦予針對(duì)害蟲(chóng)或病害的抗性并編碼以下各方面的基因：A.植物抗病基因。植物防御往往由植物中的抗病基因(R)的產(chǎn)物與病原體中的相應(yīng)無(wú)毒(Avr)基因的產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？捎每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種，以工程構(gòu)建出對(duì)特定的病原體株系有抗性的植物。參見(jiàn)例如Jonesetal.,Science266:789(1994)(Jones等人，《科學(xué)》，第266卷，第789頁(yè)，1994年)(用于抵抗黃枝孢菌(Cladosporiumfulvum)的番茄Cf-9基因的克隆)；Martinetal.,Science262:1432(1993)(Martin等人，《科學(xué)》，第262卷，第1432頁(yè)，1993年)(用于抵抗丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)的番茄Pto基因編碼一種蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinosetal.Cell78:1089(1994)(Mindrinos等人，《細(xì)胞》，第78卷，第1089頁(yè)，1994年)(用于抵抗丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的擬南芥RSP2基因)。B.賦予針對(duì)害蟲(chóng)如大豆異皮線蟲(chóng)的抗性的基因。參見(jiàn)例如PCT申請(qǐng)WO96/30517；PCT申請(qǐng)WO93/19181。C.蘇云金桿菌蛋白、其衍生物或模擬其的合成多肽。參見(jiàn)例如，Geiseretal.,Gene48:109(1986)(Geiser等人，《基因》，第48卷，第109頁(yè)，1986年)，其公開(kāi)了Btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA分子可購(gòu)自弗吉尼亞州馬納薩斯市的美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)，例如以ATCC登錄號(hào)40098、67136、31995和31998。D.凝集素。參見(jiàn)例如VanDammeetal.,PlantMolec.Biol.24:25(1994)(VanDamme等人，《植物分子生物學(xué)》，第24卷，第25頁(yè)，1994年)，其公開(kāi)了多種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。E.維生素結(jié)合蛋白，如親和素。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)US93/06487，其教導(dǎo)了親和素及親和素同系物作為對(duì)抗昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的殺幼蟲(chóng)劑的用途。F.酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見(jiàn)例如Abeetal.,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(Abe等人，《生物化學(xué)雜志》，第262卷，第16793頁(yè)，1987年)(水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)；Huubetal.,PlantMolec.Biol.21:985(1993)(Huub等人，《植物分子生物學(xué)》，第21卷，第985頁(yè)，1993年)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitanietal.,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(Sumitani等人，《生物科學(xué)，生物技術(shù)與生物化學(xué)》，第57卷，第1243頁(yè)，1993年)(硝孢鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國(guó)專利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，公布于1996年2月27日)。G.昆蟲(chóng)特異性激素或信息素，如蛻皮類固醇或保幼激素、其變體、基于其的模擬物或者其拮抗劑或激動(dòng)劑。參見(jiàn)例如，Hammocketal.,Nature344:458(1990)(Hammock等人，《自然》，第344卷，第458頁(yè)，1990年)的公開(kāi)內(nèi)容，其公開(kāi)了克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的失活劑)的桿狀病毒表達(dá)。H.在表達(dá)時(shí)能破壞受影響的害蟲(chóng)的生理的昆蟲(chóng)特異性肽。例如，參見(jiàn)以下文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容：Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(Regan,J，《生物化學(xué)》，第269卷，第9頁(yè)，1994年)(表達(dá)克隆生成編碼昆蟲(chóng)利尿激素受體的DNA)和Prattetal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(Pratt等人，《生物化學(xué)與生物物理研究通訊》，第163卷，第1243頁(yè)，1989年)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鑒定出抑咽側(cè)體素)。還可參見(jiàn)頒給Tomalski等人的美國(guó)專利No.5,266,317，其公開(kāi)了編碼昆蟲(chóng)特異性麻痹性神經(jīng)毒素的基因。I.在自然界由蛇、黃蜂等產(chǎn)生的昆蟲(chóng)特異性毒液。例如，參見(jiàn)Pangetal.,Gene116:165(1992)(Pang等人，《基因》，第116卷，第165頁(yè)，1992年)，了解有關(guān)在具有編碼蝎子昆蟲(chóng)毒性肽的基因的植物中進(jìn)行異源表達(dá)的公開(kāi)內(nèi)容。J.負(fù)責(zé)單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、苯丙素衍生物或者另一具有殺昆蟲(chóng)活性的非蛋白質(zhì)分子的超量積聚的酶。K.涉及生物活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，無(wú)論是天然的還是合成的。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO93/02197(Scott等人)，其公開(kāi)了愈創(chuàng)葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有幾丁質(zhì)酶編碼序列的DNA分子可例如以登錄號(hào)39637和67152從ATCC獲得。還可參見(jiàn)Krameretal.,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(Kramer等人，《昆蟲(chóng)生物化學(xué)與分子生物學(xué)》，第23卷，第691頁(yè)，1993年)，其提出了編碼煙草天蛾(tobaccohornworm)幾丁質(zhì)酶的cDNA的核苷酸序列；和Kawallecketal.,PlantMolec.Biol.21:673(1993)(Kawalleck等人，《植物分子生物學(xué)》，第21卷，第673頁(yè)，1993年)，其提供了歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列。L.刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如，參見(jiàn)以下文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容：Botellaetal.,PlantMolec.Biol.24:757(1994)(Botella等人，《植物分子生物學(xué)》，第24卷，第757頁(yè)，1994年)，其提供了綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列；和Griessetal.,PlantPhysiol.104:1467(1994)(Griess等人，《植物生理學(xué)》，第104卷，第1467頁(yè)，1994年)，其提供了玉蜀黍鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。M.疏水力矩肽。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO95/16776，其公開(kāi)了鱟素(Tachyplesin)的肽衍生物，該衍生物可抑制真菌植物病原體；以及PCT申請(qǐng)WO95/18855，其教導(dǎo)了合成的抗微生物肽，該肽可賦予抗病性。N.透膜酶、通道形成劑(channelformer)或通道阻斷劑。例如，參見(jiàn)Jaynes等人，PlantSci(《植物科學(xué)》)89:43(1993)的公開(kāi)內(nèi)容，其公開(kāi)了異源表達(dá)天蠶抗菌肽-β裂解肽類似物以賦予轉(zhuǎn)基因煙草植物針對(duì)青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)的抗性。O.病毒侵入性蛋白(viral-1nvasiveprotein)或由其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中積累可賦予針對(duì)由衍生該外殼蛋白基因的病毒以及相關(guān)病毒造成的病毒感染和/或病害發(fā)展的抗性。參見(jiàn)Beachyetal.,Ann.Rev.Phytopathol.28:451(1990)(Beachy等人，《植物病理學(xué)年評(píng)》，第28卷，第451頁(yè)，1990年)。外殼蛋白介導(dǎo)的抗性已被賦予轉(zhuǎn)化植物以對(duì)抗苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒。P.昆蟲(chóng)特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲(chóng)腸道中的關(guān)鍵代謝功能的抗體將會(huì)使受影響的酶失活，從而殺死昆蟲(chóng)。參閱Tayloretal.,Abstract#497,SeventhInt'lSymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(Taylor等人，第497號(hào)摘要，《第七屆分子植物-微生物相互作用國(guó)際學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)》(蘇格蘭愛(ài)丁堡)，1994年，通過(guò)產(chǎn)生單鏈抗體片段在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行酶失活)。Q.病毒特異性抗體。參見(jiàn)例如，Tavladorakietal.,Nature366:469(1993)(Tavladoraki等人，《自然》，第366卷，第469頁(yè)，1993年)，其表明表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物免于病毒攻擊。R.在自然界由病原體或寄生蟲(chóng)產(chǎn)生的發(fā)育遲滯蛋白。因此，真菌內(nèi)切-α-1,4-D-聚半乳糖醛酸酶通過(guò)溶解植物細(xì)胞壁同型-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶而有利于真菌定植和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見(jiàn)Lambetal.,Bio/Technology10:1436(1992)(Lamb等人，《生物技術(shù)》，第10卷，第1436頁(yè)，1992年)。Toubartetal.,PlantJ.2:367(1992)(Toubart等人，《植物雜志》，第2卷，第367頁(yè)，1992年)描述了編碼豆類內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。S.在自然界由植物產(chǎn)生的發(fā)育遲滯蛋白。例如，Logemannetal.,Bio/Technology10:305(1992)(Logemann等人，《生物技術(shù)》，第10卷，第305頁(yè)，1992年)已表明表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的針對(duì)真菌病害的抗性。T.涉及系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應(yīng)的基因和/或發(fā)病相關(guān)基因。Briggs,S.CurrentBiology,5(2)(1995)(Briggs,S.，《當(dāng)代生物學(xué)》，第5卷，第2期，1995年)。U.抗真菌基因。參見(jiàn)CornelissenandMelchers,PlantPhysiol.,101:709-712(1993)(Cornelissen和Melchers，《植物生理學(xué)》，第101卷，第709-712頁(yè)，1993年)；Parijsetal.,Planta183:258-264(1991)(Parijs等人，《植物》，第183卷，第258-264頁(yè)，1991年)和Bushnelletal.,Can.J.ofPlantPath.20(2):137-149(1998)(Bushnell等人，《加拿大植物病理學(xué)雜志》，第20卷，第2期，第137-149頁(yè)，1998年)。V.賦予針對(duì)疫霉枯萎病(Phytophthorablight)的基因，如R1、R2、R3、R4及其他抗性基因。參見(jiàn)Naess,S.K.,et.al.,(2000)ResistancetolateblightinSolanumbulbocastanumismappedtochromosome8.Theor.Appl.Genet.101：697-704(Naess,S.K.等人，2000年，馬鈴薯野生種(Solanumbulbocastanum)的晚疫病抗性被映射到8號(hào)染色體，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第101卷，第697-704頁(yè))和Li,X.,et.al.,(1998)AutotetraploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkers:theR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.Theor.Appl.Genet.96：1121-1128(Li,X.等人，1998年，使用常見(jiàn)AFLP標(biāo)記進(jìn)行同源四倍體和遺傳圖譜繪制：賦予致病疫霉(Phytophthorainfestans)抗性的R2等位基因被映射到馬鈴薯4號(hào)染色體，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第96卷，第1121-1128頁(yè))。2.賦予針對(duì)除草劑的抗性的基因，例如以下除草劑：A.抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，如咪唑啉酮或磺酰脲。此類別中的示例性基因編碼突變ALS和AHAS酶，分別如例如Leeetal.,EMBOJ.7:1241(1988)(Lee等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第7卷，第1241頁(yè)，1988年)和Mikietal.,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)(Miki等人，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第80卷，第449頁(yè)，1990年)中所述。B.草甘膦(抗性分別由突變的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因和aroA基因削弱)和其他膦?；衔锶绮蒌@膦(草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)PATbar基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制劑編碼基因)。參見(jiàn)例如，頒給Shah等人的美國(guó)專利No.4,940,835，其公開(kāi)了EPSP形式的能賦予草甘膦抗性的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以以ATCC登錄號(hào)39256獲得，該突變基因的核苷酸序列在頒給Comai的美國(guó)專利No.4,769,061中公開(kāi)。頒給Kumada等人的歐洲專利申請(qǐng)No.0333033和頒給Goodman等人的美國(guó)專利No.4,975,374公開(kāi)了賦予對(duì)除草劑如L-草銨膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列在頒給Leemans等人的歐洲專利No.0242246中提供。DeGreefetal.,Bio/Technology7:61(1989)(DeGreef等人，《生物技術(shù)》，第7卷，第61頁(yè)，1989頁(yè))，其描述了表達(dá)編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。賦予苯氧基丙酸和環(huán)己酮(例如拿捕凈和甲禾靈)抗性的示例性基因?yàn)锳cc1-S1、Acc1-S2和Acc2-S3基因，如Marshalletal.,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)(Marshall等人，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第83卷，第435頁(yè)，1992年)。C.抑制光合作用的除草劑，如三嗪(psbA基因和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)。Przibilaetal.,PlantCell3:169(1991)(Przibila等人，《植物細(xì)胞》，第3卷，第169頁(yè)，1991年)描述了用編碼突變型psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在頒給Stalker的美國(guó)專利No.4,810,648中公開(kāi)，含有這些基因的DNA分子可以以ATCC登錄號(hào)53435,67441和67442獲得。編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)如Hayesetal.,Biochem.J.285:173(1992)(Hayes等人，《生物化學(xué)雜志》，第285卷，第173頁(yè)，1992年)中所述。D.乙酰羥酸合酶(其已被發(fā)現(xiàn)能使表達(dá)這種酶的植物能抵抗多種類型的除草劑)已被引入到多種植物中。參見(jiàn)Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246:419,1995(Hattori等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第246卷，第419頁(yè)，1995年)。賦予除草劑抗性的其他基因包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白的基因(Shiotaetal.,PlantPhysiol.,106:17,1994(Shiota等人，《植物生理學(xué)》，第106卷，第17頁(yè)，1994年))、谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aonoetal.,PlantCellPhysiol.36:1687,1995(Aono等人，《植物細(xì)胞生理學(xué)》，第36卷，第1687頁(yè)，1995年))和各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Dattaetal.,PlantMol.Biol.20:619,1992(Datta等人，《植物分子生物學(xué)》，第20卷，第619頁(yè)，1992年))。E.原卟啉原氧化酶(protox)是葉綠素的生成所必需的，而葉綠素是所有植物存活所必需的。該protox酶充當(dāng)多種除草化合物的靶標(biāo)。這些除草劑還抑制所存在的所有不同植物物種的生長(zhǎng)，從而造成它們?nèi)繗?。具有改變的protox活性且抗這些除草劑的植物的培育在美國(guó)專利No.6,288,306、No.6,282,837、No.5,767,373和國(guó)際公布WO01/12825中有所描述。3.賦予或促成增值性狀的基因，例如以下增值性狀：A.經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如，通過(guò)用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以增加該植物的硬脂酸含量。參見(jiàn)Knultzonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2625(1992)(Knultzon等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第2625頁(yè)，1992年)。B.降低的植酸鹽含量-1)引入植酸酶編碼基因?qū)?huì)增強(qiáng)植酸鹽的分解，從而為該轉(zhuǎn)化植物增加更多的游離磷酸鹽。例如，參見(jiàn)VanHartingsveldtetal.,Gene127:87(1993)(VanHartingsveldt等人，《基因》，第127卷，第87頁(yè)，1993年)關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列的公開(kāi)內(nèi)容。2)可引入降低植酸鹽含量的基因。在玉蜀黍中，例如，這可通過(guò)克隆并然后再引入與一單個(gè)等位基因相關(guān)的DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)，該單個(gè)等位基因是造成表征為低水平植酸的玉蜀黍突變體的原因。參見(jiàn)Raboyetal.,Maydica35:383(1990)(Raboy等人，《Maydica》，第35卷，第383頁(yè)，1990年)。C.經(jīng)修飾的碳水化合物組成，例如通過(guò)用編碼可改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)Shirozaetal.,J.Bacteriol.170:810(1988)(Shiroza等人，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第170卷，第810頁(yè)，1988年)(變形鏈球菌(Streptococcusmutants)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetzetal.,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(Steinmetz等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第20卷，第220頁(yè)，1985年)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Penetal.,Bio/Technology10:292(1992)(Pen等人，《生物技術(shù)》，第10卷，第292頁(yè)，1992年)(表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifonnis)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生)；Elliotetal.,PlantMolec.Biol.21:515(1993)(Elliot等人，《植物分子生物學(xué)》，第21卷，第515頁(yè)，1993年)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；etal.,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(等人，《生物化學(xué)雜志》，第268卷，第22480頁(yè)，1993年)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)和Fisheretal.,PlantPhysiol.102:1045(1993)(Fisher等人，《植物生理學(xué)》，第102卷，第1045頁(yè)，1993年)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II)。D.通過(guò)FAD-2基因修飾使油酸升高和/或通過(guò)FAD-3基因修飾使亞麻酸減少。參見(jiàn)美國(guó)專利No.6,063,947、No.6,323,392和國(guó)際公布WO93/11245。4.控制雄性不育的基因A.引入處于毯氈層特異性啟動(dòng)子的控制下的脫乙酰酶以及應(yīng)用化學(xué)N-Ac-PPT。參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公布WO01/29237。B.引入多種雄蕊特異性啟動(dòng)子。參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公布WO92/13956和WO92/13957。C.引入barnase基因和barstar基因。參見(jiàn)Pauletal.,PlantMol.Biol.19:611-622,1992(Paul等人，《植物分子生物學(xué)》，第19卷，第611-622頁(yè)，1992年)。馬鈴薯轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于植物轉(zhuǎn)化的許多方法，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化方案。參見(jiàn)例如Mikietal.，“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.(CRCPress,Inc.BocaRaton,1993)pages67-88(Miki等人，《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法》中的“將外來(lái)DNA引入植物的步驟”，Glick,B.R.和Thompson,J.E.編輯，CRC出版社，博卡拉頓，1993年，第67-88頁(yè))。另外，用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和再生植物的表達(dá)載體及體外培養(yǎng)方法是可用的。參見(jiàn)例如Gruberetal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.(CRCPress,Inc.,BocaRaton,1993)pages89-119(Gruber等人，《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法》中的“用于植物轉(zhuǎn)化的載體”，Glick,B.R.和Thompson,J.E.編輯，CRC出版社，博卡拉頓，1993年，第89-119頁(yè))。A.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化-一種用于將表達(dá)載體引入植物中的方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。參見(jiàn)例如Horschetal.,Science227:1229(1985)(Horsch等人，《科學(xué)》，第227卷，第1229頁(yè)，1985年)。根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)是在遺傳上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見(jiàn)例如Kado,C.I.,Crit.Rev.PlantSci.10:1(1991)(Kado,C.I.，《植物科學(xué)評(píng)論》，第10卷，第1頁(yè)，1991年)。有關(guān)農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法的描述由Gruber等人(出處同上)、Miki等人(出處同上)以及Moloney等人，PlantCellReports(《植物細(xì)胞報(bào)道》)8:238(1989)提供。還可參見(jiàn)1996年10月8日頒發(fā)的美國(guó)專利No.5,563,055(Townsend和Thomas)。B.直接基因轉(zhuǎn)移-已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)種植物轉(zhuǎn)化方法(統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的備選。植物轉(zhuǎn)化普遍可適用的方法是微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中在測(cè)量為1至4μm的微粒的表面上攜帶DNA。用生物射彈裝置將表達(dá)載體引入植物組織中，所述生物射彈裝置將微粒加速到300至600m/s的速度，其足以穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。Sanfordetal.,Part.Sci.Technol.5:27(1987)(Sanford等人，《顆?？茖W(xué)與技術(shù)》，第5卷，第27頁(yè)，1987年)；Sanford,J.C.,TrendsBiotech.6:299(1988)(Sanford,J.C.，《生物技術(shù)趨勢(shì)》，第6卷，第299頁(yè)，1988年)；Kleinetal.,Bio/Tech.6:559-563(1988)(Klein等人，《生物技術(shù)》，第6卷，第559-563頁(yè)，1988年)；Sanford,J.C.PhysiolPlant7:206(1990)(Sanford,J.C.，《植物生理學(xué)》，第7卷，第206頁(yè)，1990年)；Kleinetal.,Biotechnology10:268(1992)(Klein等人，《生物技術(shù)》，第10卷，第268頁(yè)，1992年)。還可參見(jiàn)1991年5月14日頒發(fā)的美國(guó)專利No.5,015,580(Christou等人))以及1994年6月21日頒發(fā)的美國(guó)專利No.5,322,783(Tomes等人)。另一種用于將DNA物理投遞至植物的方法是對(duì)靶細(xì)胞的超聲處理。Zhangetal.,Bio/Technology9:996(1991)(Zhang等人，《生物技術(shù)》，第9卷，第996頁(yè)，1991年)。作為另一種選擇，已使用脂質(zhì)體和原生質(zhì)球融合來(lái)將表達(dá)載體引入植物中。Deshayesetal.,EMBOJ.,4:2731(1985)(Deshayes等人，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第4卷，第2731頁(yè)，1985年)；Christouetal.,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:3962(1987)(Christou等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第84卷，第3962頁(yè)，1987年)。還已經(jīng)報(bào)道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或多聚-L-鳥(niǎo)氨酸來(lái)使DNA直接攝取進(jìn)原生質(zhì)體中。Hainetal.,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)(Hain等人，《分子和普通遺傳學(xué)》，第199卷，第161頁(yè)，1985年)和Draperetal.,PlantCellPhysiol.23:451(1982)(Draper等人，《植物細(xì)胞生理學(xué)》，第23卷，第451頁(yè)，1982年)。還已經(jīng)描述了原生質(zhì)體及全細(xì)胞和組織的電穿孔。Donnetal.,InAbstractsofVIIthInternationalCongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC,A2-38,p53(1990)(Donn等人，IAPTC第七屆國(guó)際植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)會(huì)議摘要，第A2-38卷，第53頁(yè)，1990年)；D’Halluinetal.,PlantCell4:1495-1505(1992)(D’Halluin等人，《植物細(xì)胞》，第4卷，第1495-1505頁(yè)，1992年)和Spenceretal.,PlantMol.Biol.24:51-61(1994)(Spencer等人，《植物分子生物學(xué)》，第24卷，第51-61頁(yè)，1994年)。轉(zhuǎn)化馬鈴薯靶標(biāo)組織后，上述可選標(biāo)記基因的表達(dá)容許優(yōu)先選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和/或植物，其中使用本領(lǐng)域中公知的再生和選擇方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。前述轉(zhuǎn)化方法通常會(huì)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品種。然后可以將轉(zhuǎn)基因品種與另一(非轉(zhuǎn)化的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的)品種雜交，以產(chǎn)生新轉(zhuǎn)基因品種?；蛘?，可以使用植物育種領(lǐng)域中公知的傳統(tǒng)回交技術(shù)將已使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)工程改造進(jìn)特定馬鈴薯品系中的遺傳性狀移入另一品系中。例如，可以使用回交方法來(lái)將工程改造的性狀從公共的、非良種品種移進(jìn)良種品種中，或者從在其基因組中含有外來(lái)基因的品種移進(jìn)不含該基因的一個(gè)或多個(gè)品種中。如本文所用，“雜交”可以指簡(jiǎn)單的X×Y雜交，或回交過(guò)程，這取決于上下文。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明的上下文中使用術(shù)語(yǔ)馬鈴薯植物時(shí)，這還包括保留了J3的關(guān)鍵區(qū)分特性的衍生品種，例如該品種的基因轉(zhuǎn)化植物或具有一個(gè)或多個(gè)摻入其中的增值基因(例如除草劑或害蟲(chóng)抗性)的轉(zhuǎn)基因衍生物?；亟环椒膳c本發(fā)明一起使用來(lái)改善該品種或?qū)⑻匦砸脒M(jìn)該品種中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“回交”是指雜種子代回過(guò)來(lái)與親本重復(fù)雜交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次。貢獻(xiàn)一種或多種所需特性的基因的親本馬鈴薯植株被稱為非回歸親本或供體親本。該術(shù)語(yǔ)是指這樣一個(gè)事實(shí)：該非回歸親本在該回交方案中使用一次并因而不回歸。轉(zhuǎn)移得到來(lái)自非回歸親本的一個(gè)或多個(gè)基因的親本馬鈴薯植物稱為回歸親本，因?yàn)樵谠摶亟环桨钢衅浔挥昧藬?shù)輪。在典型的回交方案中，將所關(guān)注的最初品種(回歸親本)與攜帶要轉(zhuǎn)移的所關(guān)注基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然后使所得到的來(lái)自該雜交的子代再次與回歸親本雜交并重復(fù)該過(guò)程直到獲得一馬鈴薯植株，在該馬鈴薯植株中，除了從非回歸親本轉(zhuǎn)移的一個(gè)或多個(gè)基因以外，另外回歸親本的基本上全部的理想形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性得到恢復(fù)。對(duì)于成功的回交程序而言，對(duì)合適回歸親本的選擇是一個(gè)重要的步驟?；亟环桨傅哪康氖歉淖兓蛑脫Q初始品種中的一個(gè)或多個(gè)性狀或特性。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將回歸品種的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行修飾或用來(lái)自非回歸親本的理想基因替代或補(bǔ)充，而同時(shí)保留初始品種的基本上其余全部所需基因、并因而保留其理想生理學(xué)和形態(tài)學(xué)組成。對(duì)特定非回歸親本的選擇將取決于回交的目的。其中一個(gè)主要目的是給植物增添某些在商業(yè)上理想的、在農(nóng)藝學(xué)上重要的性狀。精確回交方案將取決于被變更或增添以確定合適的測(cè)試方案的特性或性狀。盡管在被轉(zhuǎn)移的特性是顯性等位基因時(shí)回交方法得到簡(jiǎn)化，但可以轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在這種情況下，可能必需引入對(duì)子代的測(cè)試，以確定理想的特性是否已成功轉(zhuǎn)移。同樣，可使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的已確立的重組方法中的任一者來(lái)將轉(zhuǎn)基因引入進(jìn)植物中，例如如下方法：Gressel,1985,BiotechnologicallyConferringHerbicideResistanceinCrops:ThePresentRealities,InMolecularFormandFunctionofthePlantGenome,L.vanVloten-Doting,(ed.),PlenumPress,NewYork(Gressel，1985年，《植物基因組的分子形式和功能》中的“利用生物技術(shù)為作物賦予除草劑抗性：當(dāng)前現(xiàn)狀”，L.vanVloten-Doting編輯，Plenum出版社，紐約)；Huttner,S.L.,etal.,1992,RevisingOversightofGeneticallyModifiedPlants,Bio/Technology(Huttner,S.L.等人，1992年，經(jīng)遺傳修飾植物的修正管理，《生物技術(shù)》)；Klee,H.,etal.,1989,PlantGeneVectorsandGeneticTransformation:PlantTransformationSystemsBasedontheuseofAgrobacteriumtumefaciens,CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(Klee,H.等人，1989年，植物基因載體和遺傳轉(zhuǎn)化：基于使用根癌農(nóng)桿菌、細(xì)胞培養(yǎng)物和植物體細(xì)胞遺傳學(xué)的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng))；Koncz,C.,etal.,1986,ThePromoterofTL-DNAGene5ControlstheTissue-SpecificExpressionofChimericGenesCarriedbyaNovelTypeofAgrobacteriumBinaryVector；MolecularandGeneralGenetics(Koncz,C.等人，1986年，TL-DNA基因5的啟動(dòng)子控制新型農(nóng)桿菌二元載體所攜帶的嵌合基因的組織特異性表達(dá)，《分子和普通遺傳學(xué)》)；Lawson,C.,etal.,1990,EngineeringResistancetoMixedVirusInfectioninaCommercialPotatoCultivar:ResistancetoPotatoVirusXandPotatoVirusYinTransgenicRussetBurbank,Bio/Technology(Lawson,C.等人，1990年，工程化改造商用馬鈴薯栽培種的混合病毒感染抗性：轉(zhuǎn)基因RussetBurbank對(duì)馬鈴薯病毒X和馬鈴薯病毒Y的抗性；《生物技術(shù)》)；Mitsky,T.A.,etal.,1996,PlantsResistanttoInfectionbyPLRV.U.S.PatentNo.5,510,253(Mitsky,T.A.等人，1996年，植物的PLRV感染抗性，美國(guó)專利No.5,510,253)；Newell,C.A.,etal.,1991,Agrobacterium-MediatedTransformationofSolanumtuberosumL.Cv.RussetBurbank,PlantCellReports(Newell,C.A.等人，1991年，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯栽培種RussetBurbank的轉(zhuǎn)化，《植物細(xì)胞報(bào)告》)；Perlak,F.J.,etal.,1993,GeneticallyImprovedPotatoes:ProtectionfromDamagebyColoradoPotatoBeetles,PlantMolecularBiology(Perlak,F.J.等人，1993年，遺傳改良的馬鈴薯：防止科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng)的侵害，《植物分子生物學(xué)》)；所有這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文用于此目的。已經(jīng)鑒定了許多性狀，在新品種的開(kāi)發(fā)中不通常選用這些性狀但可通過(guò)回交和遺傳工程技術(shù)改善這些性狀。這些性狀可以是轉(zhuǎn)基因的或者可以不是轉(zhuǎn)基因的；這些性狀的例子包括但不限于：除草劑抗性；對(duì)細(xì)菌、真菌或病毒病害的抗性；昆蟲(chóng)抗性；淀粉及其他碳水化合物濃度的均一性或淀粉及其他碳水化合物濃度的增加；增加的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；塊莖擦傷趨勢(shì)降低；以及淀粉轉(zhuǎn)化成糖的速率降低。這些基因通過(guò)細(xì)胞核遺傳繼承。這些性狀中的數(shù)種在美國(guó)專利No.5,500,365、美國(guó)專利No.5,387,756、美國(guó)專利No.5,789,657、美國(guó)專利No.5,503,999、美國(guó)專利No.5,589,612、美國(guó)專利No.5,510,253、美國(guó)專利No.5,304,730、美國(guó)專利No.5,382,429、美國(guó)專利No.5,503,999、美國(guó)專利No.5,648,249、美國(guó)專利No.5,312,912、美國(guó)專利No.5,498,533、美國(guó)專利No.5,276,268、美國(guó)專利No.4,900,676、美國(guó)專利No.5,633,434和美國(guó)專利No.4,970,168中進(jìn)行了描述。保藏信息上文所公開(kāi)的及所附權(quán)利要求書(shū)所引用的辛普勞公司(J.R.SimplotCompany)專有的馬鈴薯栽培種J3的塊莖保藏物由弗吉尼亞州馬納薩斯市大學(xué)路10801號(hào)的美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(郵編20110)(AmericanTypeCultureCollection(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110)保藏。保藏日期為2013年5月23日。保藏的25瓶微型塊莖在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗掌谥叭∽杂尚疗談诠?J.R.SimplotCompany)保存的同一保藏物。在授予專利后所有限制將不可撤回的取消，并且該保藏旨在滿足37C.F.R.§§1.801-1.809的全部要求。其ATCC登錄號(hào)為PTA-120371。該保藏物將維持在保藏所三十年，或最后要求后5年，或該專利的有效期，以較長(zhǎng)者為準(zhǔn)，并且在該期間內(nèi)如有必要將進(jìn)行替換。雖然在上面已經(jīng)論述了許多示例性方面和實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到某些修改、置換、增加以及它們的子組合。因此，意圖是如下隨附的權(quán)利要求及此后引入的權(quán)利要求應(yīng)該理解為包括所有這些修改、置換、增加和子組合，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄湔嬲木窈头秶鷥?nèi)。