本發(fā)明涉及蟎類鑒定和蟎類監(jiān)測領(lǐng)域，具體涉及一種輔助鑒定兩種捕食蟎，馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法及其專用引物對。

背景技術(shù)：
螨類是屬于蛛形綱Arachinida、蜱螨亞綱Acari的一大類群微小節(jié)肢動物。多生活在倉儲物、糧食儲藏和加工廠、中藥材、枯枝落葉等場所。儲糧螨類分布廣泛，種類繁多，粉螨亞目、輻螨亞目、革螨亞目和甲螨亞目螨類是儲糧螨類的重要組成部分。儲糧螨類中既有危害儲糧品質(zhì)的害螨，也有捕食害螨和害蟲的捕食螨。普通肉食螨和馬六甲肉食蟎是糧庫中分布廣、數(shù)量多的最常見捕食螨種類，主要以植食性蟎(如粉蟎、食酪蟎等)，小型昆蟲(如書虱)和儲糧害蟲的卵和低齡幼蟲為食，在一定程度上可以利用其進行生物防治。國內(nèi)外研究中，已經(jīng)有利用普通肉食螨和馬六甲肉食蟎控制倉儲害蟲/蟎的相關(guān)報道，對粉蟎、害蟎、土耳其扁谷盜、赤擬谷盜和嗜卷書虱等均有一定的防治作用，能達到“以蟎治蟎，以蟎治蟲”的效果。糧食的貿(mào)易、調(diào)運可能促進儲藏物蟎類的擴散和傳播，從糧庫或倉儲物中所獲得的蟎類以及在國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)疫情監(jiān)測中所誘捕到的蟎類樣品，需對其進行快速、準確的種類鑒定。捕食蟎體型微小，肉眼很難觀察到，且有些蟎類存在雌雄異型現(xiàn)象，傳統(tǒng)的蟎類鑒定技術(shù)是以成蟲形態(tài)特征為依據(jù)，運用形態(tài)特征分類方法對其種類進行鑒定，尤其是一些近緣種的鑒定，缺乏清晰可鑒的特征，且一些分類特征一直備受爭議，如馬六甲肉食蟎與強壯肉食蟎和轉(zhuǎn)開肉食蟎的鑒定等，僅依靠須肢脛節(jié)爪上齒的個數(shù)、足I跗節(jié)支持毛和感棒w1的長短比例，蟎類基于形態(tài)特征的鑒定其分類系統(tǒng)中一直不夠完善。因此隨著分子技術(shù)的發(fā)展和完善以及DNA條形碼的提出和應(yīng)用，蟎類的鑒定也在嘗試分子技術(shù)的方法。Osakabe&Sakagami(1994)運用RFLP技術(shù)對全爪螨屬的幾種蟎類進行了鑒定，Owain等(1997)借助RAPD譜帶分析技術(shù)，鑒別區(qū)分出三種不同的盲走螨品系。近幾年來，南昌大學(xué)夏斌教授的研究團隊運用分子技術(shù)，對幾種常見的肉食蟎的系統(tǒng)發(fā)育進行了研究報道，分別運用18SrRNA、28SrRNA、線粒體COI和12SrRNA基因?qū)?種肉食蟎(馬六甲肉食蟎、強壯肉食蟎、轉(zhuǎn)開肉食蟎及磷翅觸足蟎及中華真扇毛螨)的系統(tǒng)關(guān)系進行分析，并基于線粒體COI序列分析中國東南地區(qū)馬六甲肉食螨的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)，認為馬六甲肉食蟎與強壯肉食蟎為同物異名種。目前還沒有針對捕食蟎設(shè)計的特異引物的報道，怎么從倉儲蟎類中快速、準確、經(jīng)濟的區(qū)分捕食蟎是利用其防治害蟲/蟎的第一步。運用常規(guī)的分子技術(shù)進行鑒定，需要對獲得的蟎類樣品提取基因組DNA、PCR擴增(這里需要測試目標基因如線粒體COI或核糖體RNA基因的可行性)、測序、序列的校正、比對和分析。這個過程需要有一定分子技術(shù)背景的人員操作，同時測序需要較大的資金，后期對序列的處理分析也需要時間，是一個費時耗財?shù)倪^程。設(shè)計捕食蟎的特異引物，并形成試劑盒，僅需提取基因組DNA和PCR擴增兩個過程便能快速準確鑒定，為捕食蟎檢測和應(yīng)用的奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的輔助鑒定兩種捕食蟎，即馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的引物。本發(fā)明的第二個目的是提供快速、準確、使用方便的輔助鑒定馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的PCR鑒定試劑盒。本發(fā)明的第三個目的是提供一種輔助鑒定馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一組輔助鑒定馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的引物，包括用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對和用于鑒定普通肉食蟎的引物對，具體如下：用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對的核苷酸序列如下(靶序列長度約為403bp；因個體差異性靶序列長度處于380-420bp范圍內(nèi))：Cma-F:5’-AGATTAAGATTTATCATCCGTAGC-3’(SEQIDNO：1)；Cma-R:5’-GAGATGAAATTGATAGATGAAATG-3’(SEQIDNO：2)。用于鑒定普通肉食蟎的引物對的核苷酸序列如下(靶序列長度約為421bp；因個體差異性靶序列長度處于400-450bp范圍內(nèi))：Cer-F:5’-ACATCCCATGCCATTATTATAATC-3’(SEQIDNO：3)；Cer-R:5’-AAAGAGAGTAAAAGAAGGATAGTG-3’(SEQIDNO：4)。進一步地，本發(fā)明提供一種輔助鑒定馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的PCR鑒定試劑盒，所述試劑盒具有如下(a)和/或(b)所述的功能：(a)輔助鑒定馬六甲肉食蟎和/或普通肉食蟎；(b)輔助鑒定兩種形態(tài)相似的肉食蟎，馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎。具體地，該試劑盒包括上述用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對和用于鑒定普通肉食蟎的引物對，進一步，該試劑盒還包括完成PCR反應(yīng)所需的PCR緩沖液(含Mg2+)、dNTPs、DNA聚合酶、DEPC水等。其中上述組分可以單獨包裝，也可以根據(jù)需要任意組合。本發(fā)明還提供了一種輔助鑒定馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法：(1)提取待測蟎類的基因組DNA，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的商業(yè)化試劑盒或方法進行提??；(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)；其中所述PCR擴增反應(yīng)使用的引物如序列表中SEQIDNO：1至SEQIDNO：4所示，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2為用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對，序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4為用于鑒定普通肉食蟎的引物對；進一步地，PCR擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃變性30sec、60℃退火和延伸1min，30個循環(huán)；60℃5min；(3)結(jié)果判定，用所述馬六甲肉食蟎引物對進行PCR擴增，如果得到380-420bp的PCR擴增產(chǎn)物，例如403bp，所述待測蟎類為候選的馬六甲肉食蟎；用所述普通肉食蟎特異引物對進行PCR擴增，如果得到400-450bp的PCR擴增產(chǎn)物，例如421bp，所述待測蟎類為候選的普通肉食蟎；如果沒有得到目標片段的PCR擴增產(chǎn)物，所述待測蟎類為候選的非馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎。在本發(fā)明中，所述待測蟎類為普通肉食蟎Cheyletuseruditus,Schrank、馬六甲肉食蟎CheyletusmalaccensisOudemans、粗腳粉蟎AcarussiroL.、腐食酪蟎Tyrophagusputrescentiae(Schrank)、線嗜酪蟎TyroborusliniOudemans、橢圓食粉蟎Aleuroglyphusovatus(Troupeau)、害嗜鱗蟎Lepidoglyphusdestructor(Schrank)、家食甜蟎Glycyphagusdomesticus(DeGeer)、拱殖嗜渣蟎Chortoglyphusarcuatus(Troupeau)、甜果蟎Carpoglyphuslactis(L.)。本發(fā)明還要求保護上述引物或試劑盒在輔助鑒定馬六甲肉食蟎或普通肉食蟎中的應(yīng)用。本發(fā)明還要求保護上述引物或試劑盒在輔助鑒定待測儲藏物，如糧食及其產(chǎn)品，中藥材等是否存在馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎中的應(yīng)用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)實現(xiàn)了兩種捕食滿(馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎)快速鑒定，解決了其非成蟲態(tài)樣品的鑒定問題，開辟了兩種形態(tài)相似肉食蟎(馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎)鑒定的新途徑；(2)操作簡便，經(jīng)濟易行，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法一般需要玻片標本制作技能，對樣品完整性等要求高，而特異引物分子鑒定方法可標準化，操作簡便，便于無專業(yè)分類學(xué)知識背景的工作人員操作與運用，在實際工作中容易推廣應(yīng)用；(3)檢測靈敏度高，耗時短，且所需費用較低。附圖說明圖1為馬六甲肉食蟎特異引物對特異性檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為普通肉食蟎特異引物對特異性檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為馬六甲肉食蟎特異引物對靈敏度檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道M對應(yīng)DNA相對分子量標準，泳道1-5依次對應(yīng)DNA稀釋液75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，泳道6對應(yīng)陰性對照。圖4為普通肉食蟎特異引物對靈敏度檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道M對應(yīng)DNA相對分子量標準，泳道1-5依次對應(yīng)DNA稀釋液75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，泳道6對應(yīng)陰性對照。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、特異引物對的設(shè)計一、實施過程首先收集糧庫及倉儲物上常見的蟎類樣品，其中包括形態(tài)相似的馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎。通過基因組DNA提取和PCR擴增獲取其線粒體細胞色素氧化酶亞基I條形碼(mtDNACOIbarcode)序列，同時收集BOLD數(shù)據(jù)庫和GenBank中螨類的mtDNACOI條形碼基因序列。在此基礎(chǔ)上，采用DNAMAN軟件對不同種的mtDNACOI條形碼進行比對分析，查找馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的特異序列區(qū)段。采用人工設(shè)計馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎的特異引物對，并用Oligo軟件和Blast程序?qū)σ镞M行評估檢查。在標準的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，對特異引物進行篩選，僅對該引物所對應(yīng)的目標種——馬六甲肉食蟎或普通肉食蟎為陽性反應(yīng)(產(chǎn)生特異性條帶)，對其余種類均為陰性反應(yīng)(無特異性條帶產(chǎn)生)的引物即為馬六甲肉食蟎或普通肉食蟎的特異引物對。二、結(jié)果用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對的核苷酸序列如下(靶序列長度約為403bp；因個體差異性靶序列長度處于380-420bp范圍內(nèi))：Cma-F:5’-AGATTAAGATTTATCATCCGTAGC-3’(SEQIDNO：1)；Cma-R:5’-GAGATGAAATTGATAGATGAAATG-3’(SEQIDNO：2)。用于鑒定普通肉食蟎的引物對的核苷酸序列如下(靶序列長度約為421bp；因個體差異性靶序列長度處于400-450bp范圍內(nèi))：Cer-F:5’-ACATCCCATGCCATTATTATAATC-3’(SEQIDNO：3)；Cer-R:5’-AAAGAGAGTAAAAGAAGGATAGTG-3’(SEQIDNO：4)。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成三、關(guān)于引物設(shè)計1.DNA提取選取天根生化科技有限公司生產(chǎn)的微量基因組DNA提取試劑盒，將蟎類樣品清洗晾干后，加入提取液，在體視顯微鏡下用研磨棒研磨，根據(jù)提取程序進行，最后在DNA的洗脫上采用TE兩次洗脫，每次為25μL。2.COI序列的篩選和獲得截至目前，沒有關(guān)于蟎類特異引物的報道，關(guān)于倉儲蟎類的DNA序列報道較少，缺乏參考數(shù)據(jù)。在獲取供試10種蟎類COI序列時，我們選取了3對通用引物見表1。發(fā)現(xiàn)LWCOI_U/LWCOI_L引物擴增400bp左右的片段，在10種蟎種差異性極小，4種蟎的該片段區(qū)域完全一致(家食甜螨、腐食酪螨和甜果螨)，無法進行特異引物設(shè)計。而引物對LCO-1490/HCO-2198在10種蟎中擴增的通用性不強，僅擴增出了馬六甲肉食蟎、粗腳粉蟎、橢圓食粉螨和家食甜螨，無法獲得所有蟎類該片段的序列，不能進行特異引物設(shè)計。引物L(fēng)EP-F1/LEP-R1對倉儲蟎類的擴增通用性好，擴增序列長度為650bp，含有各種蟎類的特異位點，適合做特異引物設(shè)計。表1本實施例中使用的COI序列引物3.特異引物設(shè)計和篩選在獲得的引物L(fēng)EP-F1/LEP-R1對擴增出的10種蟎的COI序列后，篩選出了特異位點，針對普通肉食蟎設(shè)計了5條上游引物和4條下游引物；馬六甲肉食蟎設(shè)計了4條上游引物和5條下游引物，通過各自上下游引物兩兩配對，最終篩選出普通肉食蟎P-4F/P-4R(Cer-F/Cer-R)引物對和馬六甲肉食蟎M-2F/M-5R(Cma-F/Cma-R)引物對是各自理想的特異引物。表2普通肉食蟎和馬六甲肉食蟎特異引物設(shè)計實施例2試劑盒的組成和使用該試劑盒包括實施例1設(shè)計的用于鑒定馬六甲肉食蟎的引物對(Cma-F/Cma-R)和用于鑒定普通肉食蟎的引物對(Cer-F/Cer-R)，10×PCR緩沖液(含Mg2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶和DEPC水，以上試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。試劑盒的使用：(1)提取待測蟎類的基因組DNA，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的商業(yè)化試劑盒或方法進行提?。?2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，用以上兩對引物分別進行PCR擴增反應(yīng)；反應(yīng)體系(25μL)：Taq酶(5U/μL)0.2μL、10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL、dNTPs(2.5μM)2μL、上下游引物各0.5μL(一個PCR加入引物對Cma-F/Cma-R，另一個PCR加入引物對Cer-F/Cer-R)、模板2μL、ddH2O補至25μL。(3)結(jié)果判定，用所述馬六甲肉食蟎引物對進行PCR擴增，如果得到380-420bp的PCR擴增產(chǎn)物，例如403bp，所述待測蟎類為候選的馬六甲肉食蟎；用所述普通肉食蟎特異引物對進行PCR擴增，如果得到400-450bp的PCR擴增產(chǎn)物，例如421bp，所述待測蟎類為候選的普通肉食蟎；如果沒有得到目標片段的PCR擴增產(chǎn)物，所述待測蟎類為候選的非馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎。其中，常規(guī)PCR的擴增程序一般是3步法，即94-95℃變性、退火和延伸，本研究中通過摸索創(chuàng)新，采用了2步法，即把退火和延伸設(shè)為一個溫度，結(jié)果顯示目標條帶唯一清晰，基本沒有引物二聚體和其它非特異擴增，引物特異性強。PCR擴增2步法的循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30sec、60℃退火和延伸1min，30個循環(huán)；60℃5min。實施例3、特異性實驗普通肉食蟎Cheyletuseruditus,Schrank、馬六甲肉食蟎CheyletusmalaccensisOudemans、粗腳粉蟎AcarussiroL.、腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae(Schrank)、線嗜酪螨TyroborusliniOudemans、橢圓食粉螨Aleuroglyphusovatus(Troupeau)、害嗜鱗螨Lepidoglyphusdestructor(Schrank)、家食甜螨Glycyphagusdomesticus(DeGeer)、拱殖嗜渣螨Chortoglyphusarcuatus(Troupeau)、甜果螨Carpoglyphuslactis(L.)：保存于國家糧食局科學(xué)研究院。一、實驗樣本10種倉儲螨類樣本均采集于我國和捷克糧庫，其中馬六甲肉食蟎來源于我國海南海口糧庫，其余蟎類樣品均來自于捷克，樣品于2012年收集后于-80℃條件下保存在無水乙醇中，其中普通肉食蟎和馬六甲肉食蟎為實驗室飼養(yǎng)活蟲，具體信息見表2。表2本實施例中使用的10種蟎類樣本二、特異引物對的特異性將10種螨類，普通肉食蟎和馬六甲肉食蟎各8頭樣品(5頭成蟲，3頭卵)，其余種類各5頭樣本分別進行如下實驗：1、提取單頭蟎的基因組DNA，同實施例1。2、以步驟1的基因組DNA為模板，參照實施例2對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR擴增采取2步法，的循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30sec、60℃退火和延伸1min，30個循環(huán)；60℃5min。3、取5μL擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠系統(tǒng)中觀察并成像分析。馬六甲肉食蟎的結(jié)果見圖1，泳道M對應(yīng)DNA相對分子量標準(D2000)，泳道1-2為馬六甲肉食蟎(成蟲)，3-4為馬六甲肉食蟎(卵)，5-6為普通肉食蟎(5為成蟲，6為卵)，7-8為粗腳粉蟎，9-10為腐食酪螨，11-12為線嗜酪螨，13-14橢圓食粉螨，15-16害嗜鱗螨，17-18家食甜螨，19-20拱殖嗜渣螨，21-22甜果螨，23-24陰性對照。普通肉食蟎的結(jié)果見圖2，泳道M對應(yīng)DNA相對分子量標準(D2000)，泳道1-2為普通肉食蟎(成蟲)，3-4為普通肉食蟎(卵)，5-6為馬六甲肉食蟎(5為成蟲，6為卵)，7-8為粗腳粉蟎，9-10為腐食酪螨，11-12為線嗜酪螨，13-14橢圓食粉螨，15-16害嗜鱗螨，17-18家食甜螨，19-20拱殖嗜渣螨，21-22甜果螨，23為陰性對照。馬六甲肉食蟎無論是成蟲還是卵，均在380bp-420bp之間顯示一條特異性條帶；普通肉食蟎無論是成蟲還是卵，均在400bp-450bp之間顯示一條特異性條帶，其它蟎均不顯示所述特異性條帶。4、回收各個特異性條帶并進行測序驗證，馬六甲肉食蟎各個特異性條帶均為403bp，普通肉食蟎各個特異性條帶均為421bp。實施例4、靈敏度實驗1、提取表2中的樣本1的基因組DNA。2、將步驟1提取的基因組DNA用TE緩沖液進行系列稀釋，得到5種稀釋液；稀釋液1至稀釋液5中的基因組DNA濃度依次為：75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL。3、分別以每種稀釋液為模板(水為陰性對照)，參照實施例2對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。4、取5μL擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠系統(tǒng)中觀察并成像分析。馬六甲肉食蟎和普通肉食蟎結(jié)果分別見圖3和圖4，泳道M對應(yīng)DNA相對分子量標準，泳道1-5依次對應(yīng)稀釋液1至稀釋液5，泳道6對應(yīng)陰性對照。結(jié)果表明，針對兩種捕食蟎，只要模板中DNA濃度為1ng/μL以上，均可顯示所述特異性條帶，普通肉食蟎DNA濃度到達一定高度后，所述特異性條帶亮度不隨其濃度的升高而增加。所設(shè)計的兩種捕食蟎的特異引物擴增靈敏度高，能夠檢測到模板濃度為1ng/μL及以上樣品。