本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多環(huán)芳烴高效降解菌劑的制備及其在廢水生物處理和污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
石油是一種含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴)及少量其他有機物(硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類等)的復(fù)雜混合物。隨著石油開采和使用量的增加，大量的石油及其加工品進入環(huán)境，在其開采、運輸、煉制和使用過程中不可避免的對環(huán)境造成了污染。石油及石油產(chǎn)品中普遍含有多環(huán)芳烴(Polycyclicaromatichydrocarbons,簡稱PAHs)和酚類等有毒物質(zhì)，PAHs是環(huán)境中普遍存在的一類有機污染物，它通常是指一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)，以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，具有熔點和沸點較高、疏水性強、蒸汽壓小、正辛醇-水分配系數(shù)高等特性。PAHs具有生物積累性和環(huán)境持久性，并且有致癌、致畸、致突變(三致)作用，對自然界生物安全和人類健康構(gòu)成巨大威脅。目前，美國環(huán)保局(USEPA)已將16種未帶分支的PAHs列入了環(huán)境優(yōu)先污染物的黑名單。環(huán)境中PAHs絕大多數(shù)積累于土壤中，在適宜的情況下它們可能遷移到其他環(huán)境介質(zhì)中，擴大污染范圍并改變暴露途徑。農(nóng)田中的PAHs多由污灌所致，它可以通過農(nóng)作物以生物鏈的形式傳遞，將其積累于人體內(nèi)，造成人體的損傷。多環(huán)芳烴農(nóng)田污染土壤修復(fù)，尤其是強化長期污染土壤的修復(fù)顯得十分重要和迫切。在污染環(huán)境中比較常見，難以降解的多環(huán)芳烴中，芘由于它的酮類代謝物比母體毒性更大且有致突變性，所以芘常被作為監(jiān)測多環(huán)芳烴污染的指示物和其它多環(huán)芳烴生物降解的模型分子，成為多環(huán)芳烴中的代表物。利用微生物處理法解決環(huán)境中的PAHs污染問題已被廣泛接受，其優(yōu)點在于效果好、費用低、二次污染少等，是一類低耗高效和環(huán)境安全的生物修復(fù)技術(shù)。目前，人們通過人工富集培養(yǎng)等技術(shù)，已經(jīng)分離得到很多能降解或轉(zhuǎn)化某種多環(huán)芳烴的微生物。然而，這些游離微生物加入到修復(fù)現(xiàn)場中時可能由于土著菌的惡性競爭或難以適應(yīng)環(huán)境而導致往往不能很好地應(yīng)用于原位污染土壤的修復(fù)，故研制出一種可以克服這些弊端的多環(huán)芳烴高效降解菌劑已經(jīng)成為目前污染環(huán)境治理和修復(fù)研究的熱點問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種多環(huán)芳烴降解微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的多環(huán)芳烴降解微生物菌劑，其有效成分包括：微黃分支桿菌(Mycobacteriumgilvum)CP13；真菌綠色木霉；生物表面活性劑；所述生物表面活性劑為鼠李糖脂。本發(fā)明的微黃分支桿菌(Mycobacteriumgilvum)CP13，于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.7963。該菌株已經(jīng)在公開號為CN102824897A的專利中公開，屬于現(xiàn)有技術(shù)。微黃分支桿菌的培養(yǎng)基成分為：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pΗ為7.0-7.2；綠色木霉的培養(yǎng)基成分為：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pΗ7.0-7.2。一種多環(huán)芳烴降解微生物菌劑的制備方法，將微黃分支桿菌(Mycobacteriumgilvum)CP13和綠色木霉分別培養(yǎng)得到的菌液混合，同時添加硅藻土與改性花生殼的復(fù)合載體以及鼠李糖脂，進行微生物固定化，即制微生物菌劑。以復(fù)合載體質(zhì)量計，混合后的菌液中還加入1％的苯甲酸，1％的玉米淀粉，1％的羧甲基纖維素鈉和2％的甘油。所述鼠李糖脂與復(fù)合載體的重量比為1:200。固定化后的載體上微黃分支桿菌的數(shù)量至少為6×108個/g，綠色木霉的數(shù)量至少為6×108個/g，兩菌株數(shù)量比為0.5～1。所述改性花生殼是用氫氧化鈉和雙氧水改性的花生殼，硅藻土與改性花生殼的質(zhì)量比為1:1。本發(fā)明的多環(huán)芳烴降解微生物菌劑在降解水及土壤中多環(huán)芳烴中應(yīng)用，所述的多環(huán)芳烴主要為芘。在降解污水時，菌劑的培養(yǎng)液為含多環(huán)芳烴的MSM培養(yǎng)液，菌劑的接種量以復(fù)合載體計算占污水重量的2％，降解時間為5天以上；在降解土壤時，菌劑的接種量以復(fù)合載體計算占污染土壤重量的2％，降解時間為36天以上。所述菌劑降解多環(huán)芳烴的溫度為30℃，pH值為4.0～9.0。所述MSM培養(yǎng)液的配方為：100mg/L(NH4)2SO4，20mg/LMgSO4·7H2O，10mg/LCaCl2·2H2O；微量元素：1.2mg/LFeSO4·7H2O，0.3mg/LMnSO4·H2O，0.3mg/LZnSO4·7H2O，0.1mg/LCoSO4·7H2O，0.1mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O；磷酸鹽緩沖溶液：2.5g/LK2HPO3，0.77g/LKH2PO4，pH值為7.2～7.4。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)采用農(nóng)業(yè)廢棄物作為載體，菌劑制備的成本得到降低，成本低至0.24元/kg，花生殼作為載體可以為微生物的生長提供大量碳源，可實現(xiàn)花生殼的“變廢為寶”。此外，花生殼經(jīng)過改性后表面形成多孔結(jié)構(gòu)，便于微生物吸附，二次增殖，具有很高的生物活性。菌劑中加入的真菌可在土中繁殖菌絲，可蓬松土壤，為細菌的生長及繁殖提供有利的環(huán)境。(2)本發(fā)明菌劑適應(yīng)的PH值范圍很廣，對多環(huán)芳烴污染具有超強去除能力，可用于石油污染水體和土壤的生物修復(fù)及含多環(huán)芳烴工業(yè)廢水的生物處理。(3)本菌劑成本低至0.24元/kg，且易于儲存運輸，有效保藏的時間很長，常溫下貨架期可達半年之久。(4)由本發(fā)明的微生物菌劑由降解多種三環(huán)PAHs和四環(huán)PAHs的安全的微黃分枝桿菌CP13和綠色木霉等2個菌種組成。具有去除水及土壤中多種多環(huán)芳烴的能力，適合南方水稻土、菜園土、紅壤等土壤類型，具有修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的顯著效果。附圖說明圖1室溫保藏時間對本發(fā)明菌劑降解芘的影響圖。圖2不同pH值對本發(fā)明菌劑降解芘的影響圖。圖3本發(fā)明生物菌劑對芘污染土壤的修復(fù)過程中，土壤中芘殘留量變化圖。圖4本發(fā)明生物菌劑對含芘污水中的芘的降解率圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。實施例1本發(fā)明的微黃分枝桿菌CP13菌株的培養(yǎng)方法：將CP13菌株分別劃線接種于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基上，28-30℃培養(yǎng)48h，然后分別接入500mL三角瓶，在30℃，150r/min下，培養(yǎng)12h。然后按5％接種量接入到5L種子罐中，在180r/min，pH7.5，通氣量5L/min下，培養(yǎng)24h。營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，成分及用量(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaC15，瓊脂20，調(diào)整pΗ7.0-7.2。本發(fā)明的綠色木霉的培養(yǎng)方法：將菌株(綠色木霉GIM3.141，購自廣東省微生物菌種保藏中心)接種到PDA培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)5d。PDA培養(yǎng)基成分及用量(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，調(diào)整pΗ7.0-7.2。復(fù)合載體的制備：量取去離子水485ml和30％H2O215ml，倒入1000ml燒杯中配置成1％H2O2溶液。在1％H2O2溶液中加片狀NaOH，將溶液pH調(diào)至11～12，稱取11份10g烘干的花生殼粉末，加入溶液中，用恒溫磁力攪拌器攪拌14h。攪拌后，用6mol/LHCl調(diào)節(jié)溶液pH至6～7，用尼龍網(wǎng)過濾。最后用去離子水洗滌，放入電熱恒溫鼓風干燥箱60℃下烘干至恒重，即制得改性花生殼。硅藻土與此得到的改性花生殼按質(zhì)量比為1:1混合即得復(fù)合載體。多環(huán)芳烴降解微生物菌劑的制備：發(fā)酵完成后，將CP13菌液、綠色木霉菌液、鼠李糖脂5g和復(fù)合載體1000g混勻，使得載體上的微生物數(shù)量每種各為6×108個/g，以復(fù)合載體質(zhì)量計，混合后的菌液中還加入1％的苯甲酸，1％的玉米淀粉，1％的羧甲基纖維素鈉和2％的甘油。無菌裝袋封口，常溫保藏。實施例2將實施例1制得的菌劑在經(jīng)過一定時間的室溫保藏后，按10％(V/V)的比例將該菌劑接種至芘濃度10mg/L的MSM培養(yǎng)液中，以不含有菌劑的含芘MSM培養(yǎng)液為空白，置于30℃的搖床中，在150r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)2天后測定培養(yǎng)液中芘的剩余量。由圖1可知，本菌劑在室溫保藏170d內(nèi)對各芘初始濃度的降解率維持在60％-66％。本實施例說明該菌劑可在室溫情況下較好地有效保藏，有效保藏時間在170d以上，為多環(huán)芳烴污染環(huán)境的生物修復(fù)提供了保證。實施例3將實施例1制得的菌劑按10％(V/V)的比例接種至芘濃度10mg/L的MSM培養(yǎng)液中，以不含該菌劑的含芘MSM培養(yǎng)液為空白，置于30℃的搖床中，在150r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)2天后測定培養(yǎng)液中芘的剩余量。由圖2可知，本發(fā)明菌劑在pH4～9條件下均可有效降解多環(huán)芳烴芘，與游離菌相比具有更廣的pH適應(yīng)范圍。本實施例說明本發(fā)明多環(huán)芳烴降解微生物菌劑在酸性，中性和堿性的較寬pH范圍內(nèi)均能較好的降解芘，為其在不同pH環(huán)境中的應(yīng)用提供了保證。實施例4本發(fā)明生物菌劑對芘污染土壤的修復(fù)實驗在500ml燒杯中裝有350g已經(jīng)加入芘50mg/kg土的不滅菌土壤，土壤中加入實施例1的菌劑(CP13與綠色木霉的組合)20g/kg土壤，使得初始接種量為107個/g土。游離CP13作為對照，使用量同樣為107個/g土，在30度恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6d、12d、18d、36d后，取樣測定土壤中芘的殘留量。圖3的結(jié)果表明：使用本發(fā)明菌劑對含有芘50mg/kg的土壤修復(fù)6d、12d、18d、36d后，土壤中芘的殘留量分別達到42.31，38.03，22.18，4.95mg/kg干土，而對應(yīng)的游離菌對照的土壤中芘的殘留量分別達到43.69，41.00，37.50，28.56mg/kg干土。由此可見，本發(fā)明菌劑比游離菌對照可大幅提高土壤中的芘的降解量，提高量最高可達25mg/kg干土左右。實施例5將實施例1制得的菌劑按10％(V/V)的比例接種至芘濃度10mg/L的MSM培養(yǎng)液中，以不含該菌劑的含芘MSM培養(yǎng)液為空白，置于30℃的搖床中，在150r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)，每天測定培養(yǎng)液中芘的剩余量。由圖4可知，降解至第4d時，游離菌與本菌劑對芘的去除率分別達到70.84％和91.72％，本菌劑比游離菌的去除率提高21％。第5d時二者分別為80.00％和94.72％，本菌劑比游離菌的去除率提高14％。