氧化水解酶基因BtLPMO10B及氧化水解酶與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新型氧化水解酶化LPM010B的基因序列（來源于蘇云金芽抱桿菌 庫斯塔克亞種ACCC 10066)及其編碼的氧化水解酶的制備方法和應(yīng)用（Pr巧aration and application of a novel lytic polysaccharide monooxygenase)。本發(fā)明還提供了該氧 化水解酶的重組質(zhì)粒和重組基因工程菌株。本發(fā)明設(shè)及的氧化水解酶化LPMOIOB可應(yīng)用在 生物能源、綠色農(nóng)業(yè)、健康食品及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾下質(zhì)是一種主要來源于海洋郵蟹殼、昆蟲外殼等的等難溶性天然多糖，幾下質(zhì) 的高效生物降解在生物能源、綠色農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、材料化工等領(lǐng)域具有重要的意義。目前 可用于幾下質(zhì)生物降解的酶主要為糖巧水解酶，從其催化反應(yīng)模式上又可分為=類：內(nèi)切 型糖巧水解酶、外切型糖巧水解酶、二糖水解酶。到目前為止，已有大量的關(guān)于運些糖巧水 解酶的報道，然而由于運些難溶性天然多糖的晶體結(jié)構(gòu)難W被破壞，致使糖巧水解酶的催 化效率較低。2010年挪威生命科學(xué)大學(xué)的團隊首次報道了一種來自粘質(zhì)沙雷氏菌的幾下質(zhì) 氧化水解酶（SmCBP21)，該酶可催化位于幾下質(zhì)糖鏈Cl位上的氧化反應(yīng)，生成具有不同聚 合度的糖酸，該酶可W通過氧化破壞幾下質(zhì)表面的晶體結(jié)構(gòu)，輔助幾下質(zhì)酶高效降解幾下 質(zhì)。對于該類酶的新發(fā)現(xiàn)和深入研究對于實現(xiàn)幾下質(zhì)等多糖物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化具有重要的意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型氧化水解酶化LPM010B及其編碼基因。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備新型氧化水解酶化LPM010B的方法。 陽0化]本發(fā)明的第=個目的是提供含有所述的新型氧化水解酶化LPM010B基因的基因 工程表達體系。
[0006] 本發(fā)明的第四個目的是提供新型氧化水解酶化LPM010B在多糖降解中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的新型氧化水解酶化LPM010B，來源于蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞 種菌株（購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、，編號為ACCC 10066)，其氨基酸序列具有 如下特征之一：
[0008] 1)序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸殘基序列；
[0009] 2)將序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加后，具有降解多糖活性的蛋白質(zhì)；
[0010] 3)與序列表SEQ ID NO. 2中所限定的氨基酸序列的同源性達到90%及W上且具 有降解多糖活性的蛋白質(zhì)。 1] 本發(fā)明還提供了新型氧化水解酶化LPM010B的編碼基因（命名為化LPM010B)，具 有下述核巧酸序列特征之一： 陽01引 1)具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0013] 2)編碼SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0014] 扣具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸值NA)序列的同源性達到 90%及W上，且能編碼降解多糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸值NA)序列。
[0015] 本發(fā)明的氧化水解酶化LPM010B的氨基酸序列及其核巧酸編碼序列也可W根據(jù) 預(yù)測的化LPM010B的氨基酸序列及其核巧酸編碼序列人工合成獲得。
[0016] 制備重組酶化LPM010B的方法，是將編碼基因化LPM010B克隆入重組表達載體，導(dǎo) 入宿主細胞，獲得重組表達的氧化水解酶。
[0017] 所述的重組表達氧化水解酶化LPM010B的表達載體可W是大腸桿菌表達載體、酵 母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、隧菌體載體、絲狀真菌 表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體等。
[0018] 用于重組表達氧化水解酶化LPM010B的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，可W是大腸 桿菌宿主細胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D冊 a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等）、枯草桿菌宿主細胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI 等）、放線菌 宿主細胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如I'richoderma viride， Trichoderma reesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞（女日 Bombyx mori，Antharaea eucalypti等）或哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO,幼小 倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）。
[0019] 本發(fā)明的氧化水解酶化LPM010B對于幾下質(zhì)具有較強的結(jié)合能力，可氧化水解幾 下質(zhì)等多糖物質(zhì)，可輔助多糖水解酶提高多糖的降解效率。
[0020] 本發(fā)明提供的氧化水解酶化LPM010B可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加和 醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有較大的生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :氧化水解酶化LPM010B的蛋白表達及純化的聚丙締酷胺凝膠電泳圖 (SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是：泳道1 :蛋白質(zhì)標識物（marker);泳道2 :發(fā)酵液上 清，上樣量10 y 1，泳道3 :5 y g純化后的化LPM010B。
[0022] 圖2 :氧化水解酶化LPM010B的底物結(jié)合實驗。A為上清中未與底物結(jié)合的蛋白， 電泳實驗的上樣量為10yL;B為沉淀中與底物結(jié)合的蛋白。1，對照度tLPMOlOB+緩沖液）； 2,化LPM010B+ a -幾下質(zhì)粉末；3,化LPM010B+ 0 -幾下質(zhì)粉末；4,化LPM010B+微晶纖維素； 5,化LPMOIOB+幾下質(zhì)珠；6, BtLPMOIOB+a -膠體幾下質(zhì)。
[0023] 圖3 :氧化水解酶化LPM010B的酶解產(chǎn)物分析。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞種的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取
[00巧]蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株（購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、，編 號為ACCC 10066)的單克隆接種到IOml液體LB培養(yǎng)基中，接著放入溫度為30°C，轉(zhuǎn)數(shù)為 15化pm的搖床培養(yǎng)16個小時，取3ml菌液，離屯、收集菌體，用于基因組DNA的提取?；蚪M DM的提取與純化方法按照試劑盒說明書操作完成。 陽0%] 實施例2BtLPM010B基因在大腸桿菌中的重組表達
[0027] W蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞種ACCC 10066基因組DNA為模板，用下述引物對進 行PCR擴增。引物設(shè)計如下：
[0028] 正向引物 P-F :5，-ggaatt雌站站gcacggttttgttgaaaagcccggta-3，；
[0029] 反向引物 P-R :5'-CCgCtC腳gcactgttttccataatgataatgca-3正向引物下戈!|線標 注的是限制性內(nèi)切酶化d I位點，反向引物下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶化O I位點。Taq DNA聚合酶購自寶生物公司，PCR反應(yīng)體系按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。PCR反應(yīng)條件： 94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性30sec-50°C退火30sec-72°C延伸Imin, 30個循環(huán)，最后 72°C延伸IOmin。將PCR產(chǎn)物用Nde I和化O I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產(chǎn) 物。將購于美國Novagen公司的產(chǎn)物祀T-23b載體用Nde I和化O I雙酶切，瓊脂糖凝膠 電泳回收酶切載體大片段。Nde I和化O I均購于寶生物公司，酶與底物反應(yīng)的體系、溫度 和時間均按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。
[0030] 將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切祀T-23b載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌ToplO菌株后涂布于含有50 Ji g/ml氨節(jié)西林的Luria-Bertani培養(yǎng)基固體平板上， 37°C培養(yǎng)12h，挑取單克隆；將單克隆接入含有50 y g/ml氨節(jié)西林的液體Luria-Bertani 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用正向引物和反向引物進行菌落PCR驗證，結(jié)果得到大小 正確的擴增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒送去上海英驗生物技 術(shù)有限公司測序，結(jié)果表明，在祀T-23b的Nde I和化O I酶切位點之間插入SEQ ID NOl 所示的化LPM010B基因，且插入方向正確，所W進一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
[0031] 將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株化21 0E3)(購自美國Novagen公司），然后按 照該公司提供的操作步驟進行氧化水解酶化LPM010B的誘導(dǎo)表達及純化，結(jié)果如圖1所示， 氧化水解酶化LPM010B的表達量較高，且W可溶的形式存在，經(jīng)過Ni柱純化后的氧化水解 酶化LPM010B在電泳膠上呈單一條帶，分子量大小為45kDa，與通過氨基酸序列預(yù)測的分子 量一致。 陽0扣](I)SEQ ID No: 1的信息（參見序列表） 陽〇3引 （a)序列特征
[0034] *長度：1245個堿基對 齡35] *類型：核酸
[0036] *鏈型：雙鏈
[0037] *拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0038] 化）分子類型：DNA
[0039] (C)假設(shè)杏
[0040] (d)反義：否
[0041] (e)最初來源：蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株ACCC 10066
[0042] (f)與核巧酸序列相關(guān)的特征關(guān)鍵詞：為"氧化水解酶" 陽0創(chuàng) 似SEQ ID NO 2:的信息（參見序列表）
[0044] (a)序列特征：
[0045] *長度：415個氨基酸殘基 陽046] *類型：蛋白
[0047] *結(jié)構(gòu)：包含1個AAlO家族氧化水解酶結(jié)構(gòu)域、2個化III結(jié)構(gòu)域和1個CBM結(jié)構(gòu) 域 W48] 化）分子類型：蛋白質(zhì)
[0049] (C)假設(shè)杏
[0050] (d)反義杏
[0051] (e)最初來源：蘇云金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株ACCC 10066 陽0巧 序列表
[0053]沈Q ID NO. 1

[0057] 實施例3氧化水解酶化LPMOIOB的生化特性分析
[0058] (1)多糖結(jié)合能力分析
[0059] 氧化水解酶化LPM010B與各種多糖的結(jié)合實驗按W下條件進行：在1.5ml的 Eppendcxrf管中將5mg各種不同多糖與0. 5mg純化后的氧化水解酶化LPM010B混合，反應(yīng) 終體積通過20mM、抑8. 0的化is-HCl緩沖液定容為1ml。酶與底物的結(jié)合在室溫下進行 24小時，為了讓酶與多糖更好的結(jié)合，利用畑-II旋轉(zhuǎn)混合儀（寧波新芝公司）。結(jié)束后， 通過離屯、分別收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，氧化水解酶 BtLPMOlOB與非晶體性質(zhì)的幾下質(zhì)（幾下質(zhì)珠和膠體幾下質(zhì)）具有較強的結(jié)合能力，而與晶 體幾下質(zhì)（a-幾下質(zhì)和0-幾下質(zhì)）結(jié)合能力較弱，與微晶纖維素的結(jié)合能力幾乎無法觀 測到。
[0060] (2)酶反應(yīng)產(chǎn)物分析
[0061] 為了分析酶反應(yīng)產(chǎn)物，將氧化水解酶化LPMOIOBQ y M)，抗壞血酸（ImM)和膠體幾 下質(zhì)（2. Omg/ml)混合在一起，反應(yīng)總體積通過抑8.0, 20mM Tris-肥1緩沖液定容為1ml。 反應(yīng)在30°C進行2地。產(chǎn)物通過MLTI T0F/T0F MS進行分析（如圖3)。結(jié)果表明氧化水 解酶化LPM010B能氧化水解膠體幾下質(zhì)，產(chǎn)生聚合度為4-7的糖酸。
【主權(quán)項】
1. 一種氧化水解酶基因 BtLPMOlOB，其核苷酸序列具有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 2) 編碼SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 3) 具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸（DNA)序列的同源性達到90% 及以上，且能編碼降解多糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸（DNA)序列。2. -種權(quán)利要求1所述的氧化水解酶基因編碼的氧化水解酶，其編碼的氨基酸序列具 有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸序列； 2) 將序列表中的SEQ ID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加后，具有降解多糖活性的蛋白質(zhì)； 3) 與序列表中SEQ ID NO. 2所限定的氨基酸序列的同源性達到90%及以上且具有氧 化水解多糖活性的蛋白質(zhì)。3. -種權(quán)利要求2所述的氧化水解酶的制備方法，其特征在于：是將權(quán)利要求1所述 的氧化水解酶基因克隆入重組表達載體，導(dǎo)入宿主細胞，獲得重組表達的氧化水解酶； 所述的重組表達氧化水解酶的表達載體，是指大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草 桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表 達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。4. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：用于重組表達氧化水解酶的重組菌或 轉(zhuǎn)基因細胞系，是指大腸桿菌宿主細胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等）、枯草桿菌宿主細胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放線菌宿主細胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞 (如Bombyx mori、Antharaea eucalypti等），哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO， 幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）中的一種。5. -種權(quán)利要求2所述的氧化水解酶在多糖氧化水解中的應(yīng)用，其特征在于：具有如 下用途之一或二種以上； 1) 氧化水解幾丁質(zhì)、殼聚糖、纖維素、半纖維素、淀粉等多糖物質(zhì)中的一種或二種以上， 可用于功能性寡糖產(chǎn)品的生產(chǎn)或生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇； 2) 通過氧化水解真菌細胞壁多糖的方式抑制真菌病害，可用于生物農(nóng)藥或生物醫(yī)藥的 制備； 3) 根據(jù)其強大的多糖結(jié)合能力，可作為多糖類物質(zhì)的識別分子。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氧化水解酶基因及其編碼的氧化水解酶的制備與應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的氧化水解酶BtLPMO10B基因來源于蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種(ACCC 10066)。本發(fā)明還提供了一種制備氧化水解酶BtLPMO10B的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該酶的基因克隆到大腸桿菌表達載體上，獲得可表達該酶的大腸桿菌重組菌株，用該工程菌株表達制備的氧化水解酶BtLPMO10B對不溶性幾丁質(zhì)具有較強的結(jié)合能力，可氧化水解多糖物質(zhì)產(chǎn)生具有不同聚合度的糖酸。本發(fā)明提供的氧化水解酶BtLPMO10B可輔助多糖水解酶，提高多糖的水解效率。
【IPC分類】C12P19/14, C12N9/02, A01P3/00, C12N15/70, C12N15/53, A01N63/02
【公開號】CN105713913
【申請?zhí)枴緾N201410720631
【發(fā)明人】趙勇, 尹恒, 張卉妍, 王文霞
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所