一種高效的河蟹組織保存與rna提取的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及河蟹組織野外采集組織樣本的保存W及高效提取RNA的方法，屬于技 術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 河蟹，學(xué)名中華絨馨蟹化riocheir sinensis)，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物口（Arthropoda)、 甲殼綱（Crus1:acca)、十足目（Decapoda)、方蟹科(Grapsidae )，絨馨蟹屬巧riocheir)，在我 國(guó)廣泛分布于南北沿海各地湖泊，主要分布于長(zhǎng)江、迂河W及臨江流域，是我國(guó)最為重要的 水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象和經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)之一。近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展和養(yǎng)殖集約化程度的不斷加 大，中華絨馨蟹種質(zhì)的退化、爆發(fā)性疾病的發(fā)生、性早熟出現(xiàn)頻率的加快等在帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì) 損失的同時(shí)，也嚴(yán)重制約著其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。運(yùn)用新一代的高通量測(cè)序技術(shù)，W轉(zhuǎn)錄組 為平臺(tái)，在全基因組范圍內(nèi)更深、更透徹地研究中華絨馨蟹的各項(xiàng)分子機(jī)制，對(duì)健康養(yǎng)殖、 病害防治和遺傳育種具有很重要的實(shí)踐意義。然而，在對(duì)中華絨馨蟹進(jìn)行運(yùn)些研究時(shí)，經(jīng)常 需在野外進(jìn)行采樣。由于受時(shí)間、運(yùn)輸條件、樣本重要性因素影響，不能對(duì)全部活體帶回實(shí) 驗(yàn)室進(jìn)行采樣，而只能采取部分組織保存后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RNA等分析。若保存不當(dāng)，會(huì)造 成后續(xù)RNA提取不成功或提取的得率很低，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。因而，開(kāi)發(fā)有效的組織保存 方法，對(duì)于后續(xù)RNA的提取十分重要。
[0003] 此外，發(fā)明人在較長(zhǎng)時(shí)期的河蟹RNA提取試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是新鮮組織還是經(jīng)過(guò)一 段時(shí)間保存的組織，其難度均高于其它水產(chǎn)動(dòng)物。具體表現(xiàn)在RNA提取得率低、降解速度快、 易受DNA污染，難W滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。由此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)河蟹高質(zhì)量的RNA提取方法是十分 重要的。另一方面，中華絨馨蟹常年棲息于淡水湖泊河流，但繁殖期間必須回到河口半咸水 域，而繁殖期間在河口半咸水域采集的組織樣本無(wú)法快速提取RNA，運(yùn)就需要有效的河蟹 RNA保存和提取方法。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明人在近年來(lái)對(duì)中國(guó)各水系河蟹RNA提取的不斷摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)完善 組織樣本的保存方式及其提取后的純化過(guò)程，可極大的提高提取RNA純度，使其不受DNA、蛋 白質(zhì)和無(wú)機(jī)試劑的污染，且可使提取的RNA完整性高，可適應(yīng)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)等要求。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種河蟹組織保存和RNA高效提取的方法，是申請(qǐng)者在研 究實(shí)踐中發(fā)展起來(lái)的穩(wěn)定技術(shù)。使用該方法可保障組織樣本保存的良好性和RNA提取的高 效性，提取的RNA純度高、完整性佳、質(zhì)量好，能滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等高要求RNA。本發(fā)明不僅在 科學(xué)技術(shù)上，且在河蟹分子生物學(xué)的研究上具有十分重要的意義和價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種高效的河蟹組織保存與RNA提取的方法，包括下列 步驟： (1)組織樣本保存：用無(wú)菌剪刀將短期新鮮組織樣本剪成組織塊，迅速浸于裝在1.5ml 離屯、管中的化izol試劑中保存;或者將野外河蟹活體組織樣本剪成組織塊，按照1:10(質(zhì)量 :體積）的比例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入-20°C或-80°C中長(zhǎng)期保存； (2)總RNA的提取，步驟如下： a. 將保存的樣本拿出，取適量組織放入Trizol中，用組織研磨器研磨，縱滿(mǎn)振蕩； b. 離屯、，取上清液，加入氯仿;離屯、，取上清液再加入氯仿； C.離屯、，取上清液加入異丙醇； d.離屯、，棄上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精;離屯、，棄上清液，沉淀RNA后加入100%的 酒精。
[000引 e.離屯、后棄掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-打ee水溶解。
[0009] 其進(jìn)一步包括總RNA的純化，步驟如下： a.向上步提取的RNA溶液中加入適量DNA酶，室溫解育。
[0010] b.向所得溶液中加入0-琉基乙醇和無(wú)水乙醇，放入吸附柱中，離屯、，棄廢液。
[0011] C.向吸附柱中加入無(wú)水乙醇，離屯、;棄廢液，空離屯、5min。
[001^ d.向吸附柱中加入適量RNase-free水，離屯、即得。
[0013] 優(yōu)選地，在第(1)步中組織材料需要剪成2mm的組織塊。
[0014] 優(yōu)選地，所述的縱滿(mǎn)振蕩是將保存的樣本于離屯、管中縱滿(mǎn)振蕩45s，室溫靜置2分 鐘。
[0015] 優(yōu)選地，在第（1)步中，將河蟹活體長(zhǎng)期野外組織樣本剪成2mm的組織塊，按照1:10 (質(zhì)量:體積）的比例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入-20°C或-80°C中長(zhǎng)期保存。
[0016] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：上述方法中，所保存的河蟹各組織可用于RNA提取，且用此 方法提取的RNA純度好、質(zhì)量高、完整性好。本發(fā)明可有效保存河蟹各組織樣本，解決了野外 采集組織樣本RNA提取困難的問(wèn)題;通過(guò)此方法提取的組織RNA質(zhì)量好，可適用于RNA需求量 大的多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，尤其是轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，解決了保存樣本RNA提取得率低、質(zhì)量差 的難題。該方法為河蟹多種分子機(jī)制的研究提供一項(xiàng)技術(shù)手段，具有重大的科學(xué)意義和實(shí) 用價(jià)值。
[0017]
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明提取的河蟹各組織RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0019] 圖2為RNAstore保存樣本提取的RNA電泳圖。 圖3為本發(fā)明提取的河蟹肝膜腺RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。 圖4為本發(fā)明提取的河蟹眼柄RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。 圖5為本發(fā)明提取的河蟹觸RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。 圖6為本發(fā)明提取的河蟹肌肉RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。 圖7為本發(fā)明提取的河蟹卵巢RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。 圖8為本發(fā)明提取的河蟹精巢RNA的Agilent 2100檢測(cè)結(jié)果。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】如下。
[0022] 一、 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1.5mL離屯、管若干、70%乙醇溶液、碎冰、Tr i ZO1試劑、RNAstore試劑、氯仿、異丙醇、0- 琉基乙醇、RNase-Free Spin Columns CR2(TIANGEN)、4°C離屯、機(jī)、活體中華絨馨蟹 二、 河蟹各組織的采集 1.短期新鮮樣本的保存:在1.5mL離屯、管中加入ImL化izol試劑，將活體中華絨馨蟹 的各組織采集后立即放入Trizol中，轉(zhuǎn)入-80°C冰箱儲(chǔ)存。
[002：3] 2.野外樣本的長(zhǎng)期保存:取無(wú)菌RNase-free離屯、管，用無(wú)菌的剪刀、綴子將要保 存的組織剪成2mm左右的組織塊，然后按照1:10(質(zhì)量:體積）的比例，加入RNAstore,于4°C 浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入-20°C或-80°C可W長(zhǎng)期保存，不影響RNA的提取。
[0024] S、總RNA的提取 1.在離屯、管中加入0.SmlTrizol溶液，將保存的樣本拿出，取適量組織放入Trizol中， 用組織研磨器研磨，在加入0.5ml化izol溶液，將離屯、管在縱滿(mǎn)振蕩器上震蕩45s，使溶液 中各成分充分混合均勻，室溫下放置2分鐘。
[00劇 2.放入提前遇冷的4°C離屯、機(jī)，13500轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、5分鐘。
[00%] 3.小屯、取上清液到另一離屯、管中，加入300UL的氯仿，用手劇烈搖晃15秒，使其充 分乳化，室溫靜置5分鐘待其分層。
[0027] 4.放入4°C的離屯、機(jī)中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、15分鐘。
[0028] 5.吸取上清500uL到另一離屯、管中，加入300uL的氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置2 分鐘，放入4°C的離屯、機(jī)中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、5分鐘。
[0029] 6.小屯、吸取200UL的上清液到另一離屯、管中，加入等體積異丙醇上下顛倒混勻30 秒，室溫靜置10分鐘。
[0030] 7.放入4。(：的離屯、機(jī)中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、10分鐘。
[0031] 8.棄掉上清液，向離屯、管中加入ImL的75%乙醇洗涂沉淀RNA，并用槍頭輕柔吹打， 使RNA沉淀懸浮在乙醇溶液中。
[00創(chuàng) 9.放入4。(：的離屯、機(jī)中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、2分鐘。
[0033] 10.棄掉上清液，向離屯、管中加入ImL的100%乙醇洗涂沉淀RNA，并用槍頭輕柔吹 打，使RNA沉淀懸浮在乙醇溶液中。
[0034] 11.放入4。(：的離屯、機(jī)中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、5分鐘。
[0035] 12.小屯、棄掉上清液，于室溫靜置2分鐘干燥RNA沉淀。
[0036] 13.加入50化的RNase-free d地20溶解，立即進(jìn)行RNA純化。
[0037] 四、RNA純化 1.向提取的RNA溶液中加入2.5ul的DNaseI儲(chǔ)存液，室溫下解育10分鐘。
[0038] 2.將所得溶液中加入3.加 L的0-琉基乙醇和250uL的無(wú)水乙醇，充分混勻。
[0039] 3.將溶液放入RNase-Free Spin Colu皿S CR2離屯、柱的吸附住中，12000轉(zhuǎn)/分鐘 離屯、，棄掉收集管中的廢液。
[0040] 4.向吸附柱中加入500uL無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、，棄掉收集管中的廢液 5.重復(fù)上步。
[0041 ] 6.13500轉(zhuǎn)/分鐘，空離屯、5分鐘，去除殘余的液體。
[0042] 7.向吸附柱中加入適量RNase-打ee水，離屯、，所得溶液為純化后的RNA溶液。
[0043] 五、RNA檢測(cè) 1. Nano化OP 2000分光光度計(jì)檢測(cè) 取RNA溶液化L，混合均勻，用Nano化OP 2000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品。若提取的RNA溶液其 0026日/0028日比值在1.8~2.2之間，01)26日/00 23日比值在1.40~1.80之間（如表一），表明提取的 RNA受蛋白質(zhì)、DNA及其他有機(jī)試劑的污染少，可滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0044] 2.電泳檢測(cè) 取RNA溶液2.化L，用1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（電壓150V，時(shí)間ISmin )檢測(cè)，在凝膠成 像分析系統(tǒng)中觀察RNA條帶的清晰度。
[0045] 經(jīng)電泳檢測(cè)，該方法提取的RAN可清晰辨別28S、18S(兩條）W及5S四條RNA條帶，并 且沒(méi)有擴(kuò)散的其他雜帶。說(shuō)明RNA提取的完整性較好，具體如圖1所示，且用RNAstore溶液長(zhǎng) 期保存的野外樣本所提取的RNA完整性也較好，具體如圖2所示。
[0046] 3.Agilent 2100 檢測(cè) 將肝膜腺、眼柄、肌肉、觸、卵巢、精巢等河蟹各組織的RNA溶液用Agilent Bioanalyzer 進(jìn)行毛細(xì)管電泳山日9111日巧electro地oresis)，并W軟件的RIN(RNA Integrity Number) 分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)估，10為RNA完整性最好，0為最差。
[0047] 經(jīng)檢測(cè)，提取的肝膜腺、眼柄、肌肉、觸、卵巢、精巢等組織的RNA的RIN在8.0~9.5之 間（見(jiàn)表一、圖3至圖8 )，進(jìn)一步說(shuō)明RNA完整性很高。
[004引 棄一.義巧姐RNA、沈睛.nn。。。/ nn。。。前fiDncn/nri。。。估


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種河蟹組織樣本的保存和高效提取RNA的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 組織樣本保存：用無(wú)菌剪刀將短期新鮮組織樣本剪成組織塊，迅速浸于盛有Trizol 試劑中保存；或者將河蟹活體長(zhǎng)期野外組織樣本剪成組織塊，按照1:10(質(zhì)量:體積）的比 例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入_20°C或_80°C中長(zhǎng)期保存； (2) 總RNA的提取，步驟如下： a. 將保存的樣本拿出，取適量組織放入Trizol中，研磨； b. 游禍振蕩； c. 離心，取上清液，加入氯仿;離心，取上清液再加入氯仿； d. 離心，取上清液加入異丙醇； e離心，棄上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精； f.離心，棄上清液，沉淀RNA后加入100%的酒精； 離心后棄掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-free水溶解。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其進(jìn)一步包括總RNA的純化，步驟如下： a. 向上步提取的RNA溶液中加入適量DNA酶，室溫孵育； b. 向所得溶液中加入β-巰基乙醇和無(wú)水乙醇，放入吸附柱中，離心，棄廢液； c. 向吸附柱中加入無(wú)水乙醇，離心;棄廢液，空離心5min; d ·向吸附柱中加入適量RNase-free水，離心即得。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在第（1)步中組織材料需要剪成2mm的組織 塊。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的漩渦振蕩是將保存的樣本于離心管 中漩渦振蕩45s，室溫靜置2分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在第（1)步中，將河蟹活體長(zhǎng)期野外組織樣 本剪成2mm的組織塊，按照1:10 (質(zhì)量:體積）的比例，加入RNAstore，于4 °C浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn) 入-20 °C或-80 °C中長(zhǎng)期保存。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種野外保存河蟹各組織及其RNA的高效提取方法，其步驟包括：（1）組織采集和保存：用無(wú)菌剪刀將組織剪成2mm左右組織塊，加入適量RNAstore溶液，4℃浸泡過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。（2）總RNA提取：將儲(chǔ)存的組織從-80℃冰箱拿出，放入Trizol中，在冰上用組織研磨器將其研磨碎，離心取上清，加氯仿，再離心取上清，加異丙醇，再離心，棄上清液后加75%乙醇洗滌RNA，離心，干燥沉淀后用RNase-free水稀釋。（3）RNA純化：利用DNA酶去除RNA中的DNA。本發(fā)明方法可對(duì)野外采集的河蟹各組織進(jìn)行有效保存并對(duì)其RNA進(jìn)行高效提取。提取的RNA質(zhì)量好、完整性強(qiáng)、純度高，可用于各種分子生物學(xué)分析，尤其在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面，有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15/10, A01N1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105713897
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510579433
【發(fā)明人】陳曉雯, 王軍, 王成輝
【申請(qǐng)人】上海海洋大學(xué)