mPEG-聚(L-谷氨酸-γ-酰肼)-PDMAPMA三嵌段共聚物及其合成方法和應用的制作方法
【專利摘要】mPEG-聚(L-谷氨酸-γ-酰肼)-PDMAPMA三嵌段共聚物的合成方法及其合成方法和應用，首先對端甲氧基聚乙二醇進行胱胺化改性，然后引發(fā)γ-芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐開環(huán)聚合反應，接著利用碳二亞胺法將小分子RAFT聚合鏈轉(zhuǎn)移劑鍵接于得到的兩嵌段共聚物上，最后，以N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺為單體實施RAFT聚合，再經(jīng)肼解脫除芐基，得到聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-酰肼)-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)三嵌段共聚物。本發(fā)明合成方法可靈活控制各段聚合物分子量和鏈長度、反應條件溫和、原料易得，其裝載阿霉素后呈兩親性的特點可使嵌段共聚物自組裝成納米粒，且能夠同時裝載化療藥物和基因藥物，藥效高，毒副作用大大降低。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰 肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物及其合成方法和應用。 mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物及 其合成方法和應用

【背景技術(shù)】
[0002] 化療是臨床腫瘤治療的基本策略，它是利用細胞毒藥物殺死腫瘤細胞而達到治 療腫瘤目的的。目前，常用化療藥物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、 10-羥基喜樹堿、長春堿和長春新堿等。這些細胞毒藥物不僅體內(nèi)半衰期很短，難溶于水， 選擇性差，造成生物利用度低，而且對正常組織/細胞存在嚴重的毒副作用。因此，提高療 效、降低毒副作用一直是腫瘤化療基礎研究和臨床應用所追求的目標。為實現(xiàn)這一目標，基 于生物高分子材料的藥物遞送體系近年受到極大關(guān)注，現(xiàn)已取得很大進展，部分體系已用 于臨床，如聚乙二醇修飾的多柔比星脂質(zhì)體（商品名Doxil)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇（商品 名abraxane)、膠束化紫杉醇（商品名Genexol-PM，采用聚丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物實 現(xiàn)膠束化）等。這些體系均在一定程度上提高了療效或采用了更理想的劑型。然而這些體 系在粒徑和穩(wěn)定性方面有待提高。目前，已開發(fā)出形形色色的藥物遞送體系，如單分子膠 束、兩親性嵌段共聚物膠束、星形高分子、納米粒、脂質(zhì)體、樹形高分子、納米囊泡和納米凝 膠等，這些體系追求的主要性質(zhì)包括良好的穩(wěn)定性、高載藥量、簡單的制備工藝、較長的循 環(huán)壽命等。這些體系多采用生物聚酯、丙烯酸酯類/丙烯酰胺類聚合物作為載體材料，它們 分別通過水解/酶降解或響應環(huán)境pH/溫度等因素實現(xiàn)藥物釋放。
[0003] 近幾年，聚氨基酸材料在藥物/蛋白質(zhì)遞送和組織工程方面的應用研究受到重 視，因為此類材料具有許多優(yōu)點，如良好的生物相容性和生物可降解性、無毒、無免疫原性、 降解產(chǎn)物為近中性的氨基酸等。目前，研究主要集中于陰離子型聚谷氨酸和陽離子型聚賴 氨酸，但它們是水溶性的，通常只能以水凝膠或聚電解質(zhì)復合物形式應用，這大大限制了其 應用范圍。然而，利用三光氣法制備聚氨基酸的方法近年受到關(guān)注，可獲得不同親/疏水性 和不同化學成分的聚氨基酸材料，在藥物遞送領(lǐng)域前景廣闊。
[0004] 目前，人們已認識到腫瘤屬于基因病。因此，針對癌細胞的基因治療就成為新的研 究熱點，它有望從源頭上克服腫瘤多藥耐藥性，被認為是攻克癌癥最有效的途徑之一。其 中，siRNA已成為一種新型高效的癌癥治療方法。然而，裸露的siRNA呈負電性，存在易被核 酸酶降解、細胞膜穿透能力差、非特異性免疫刺激等不足，在血漿中的半衰期僅為幾分鐘， 這些問題極大地限制了 siRNA體內(nèi)治療作用。目前已開發(fā)的電穿孔法等由于缺乏靶向性和 高效性，療效不理想。利用納米載體遞送siRNA被視為很有前景的技術(shù)手段。目前，基因載 體包括病毒和非病毒兩類。雖然病毒類載體轉(zhuǎn)染率高，但存在安全性和免疫反應等問題。 而非病毒載體可克服這些缺點，已成為主要研究方向。最常用的非病毒載體是陽離子聚合 物，多為樹狀或超支化的聚酰胺-胺、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚賴氨酸、聚（β-氨基酯）、 殼聚糖等，它們通過靜電作用與基因藥物形成復合物，既可保護基因藥物，又利于內(nèi)涵體逃 逸，發(fā)揮基因治療效果。大量研究和臨床實踐表明，癌癥是一種非常復雜的疾病，具有異質(zhì) 性和耐藥性，單一藥劑不太可能取得理想的治療效果。而臨床癌癥化療方案中通過不同作 用機制藥物的序貫聯(lián)合，已在克服耐藥性、增加療效方面取得了令人鼓舞的進展，但其應用 受到配伍性、穩(wěn)定性及方案復雜等問題的制約。因此，開發(fā)基于同一納米載體的聯(lián)合治療， 有望使癌癥治療取得新的突破。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共 聚物及其合成方法和應用。本發(fā)明合成方法可靈活控制各段聚合物分子量和鏈長度、反應 條件溫和、原料易得，其載阿霉素后呈兩親性的特點可使嵌段共聚物自組裝成納米粒，且 能夠同時裝載基因藥物，藥效高，毒副作用大大降低。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-酰肼）-聚（N-(3-二甲 胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物的合成方法，包括如下步驟：
[0007] l)mPEG-PBLG兩嵌段共聚物的合成：
[0008] 向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入無水有機溶劑，然后在氮氣氛下加入 Y -芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐，溶解后于25°C?40°C反應48小時?72小時，得到 的產(chǎn)物用冷乙醚沉淀和洗滌，得到mPEG-PBLG兩嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧 基聚乙二醇和芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的質(zhì)量比為（1 :1)?（1 :3);
[0009] 2) mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成：
[0010] 將除水后的mPEG-PBLG兩嵌段共聚物溶于無水有機溶劑中，在氮氣氛下加入帶一 個羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4-二甲氨基吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺，然后于室溫反應24小時? 72小時，再用干燥的冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分 子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑；其中，除水后的mPEG-PBLG兩嵌段共聚物、帶一個羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、 4_二甲氨基吡啶以及二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1 : (2?20) :1 : (4?40);
[0011] 3)端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-芐酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基 丙烯酰胺）三嵌段共聚物的合成：
[0012] 將mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙 烯酰胺和引發(fā)劑溶于無水無氧溶劑中，于56°C?70°C反應24小時?60小時，得到的反 應液經(jīng)濃縮后用冷乙醚沉淀，收集沉淀后真空干燥，得到端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨 酸- γ-芐酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物；其中，mPEG-PBLG 兩嵌段共聚物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺、引發(fā)劑的摩爾比 為 10 : (200 ?500) :1 ;
[0013] 4)將端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸1-芐酯）_聚（N-(3_二甲胺丙基） 甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物進行肼解脫除芐基，得到mPEG-聚（L-谷氨酸-γ-酰 肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物。
[0014] 所述的步驟1)中胱胺化端甲氧基聚乙二醇由如下步驟合成：
[0015] 1)將干燥的分子量為800?4000的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和 2, 2' -二硫代二乙基異氰酸酯溶于無水甲苯中，于85°C氮氣氣氛下反應48小時，然后在無 水正己烷中沉淀，收集沉淀，并真空干燥，得到2, 2' -二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ; 其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2, 2'-二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為 1 : (0· 02 ?0· 08) : (3 ?8);
[0016] 2)將2, 2' -二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶于蒸餾水中，于60°C反應6小時， 反應體系在蒸餾水中透析、凍干后得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
[0017] 所述的步驟1)中Y -芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的合成方法為：將L-谷 氨酸-γ -芐酯加入無水四氫呋喃中，接著在氮氣氣氛下加入三光氣，隨后于50°C反應至形 成澄清溶液，再濃縮溶劑，最后將濃縮得到的反應體系在無水正己烷中沉淀、重結(jié)晶，得到 γ-芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐；其中，L-谷氨酸-Y-芐酯與三光氣的摩爾比為1 : (0· 35 ?0· 4)。
[0018] 所述的帶一個羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑為S-1-十二烷基-S'-(a，α'-二甲 基-a 乙酸）三硫代碳酸酯、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基）硫烷基]戊酸、 4_氰基-4-(硫代苯甲酰）戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
[0019] 所述的步驟3)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或4, 4' -偶氮雙（氰基戊酸）。
[0020] 所述的步驟1)和步驟2)中無水有機溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、無水四氫呋 喃或無水二甲基甲酰胺，步驟3)中無水無氧有機溶劑為無水無氧二氧六環(huán)、無水無氧四氫 呋喃或無水無氧二甲基甲酰胺。
[0021] 所述的肼解脫除芐基的方法為：將端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-芐 酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物溶于無水二甲基甲酰胺中，滴 加無水肼后35°C?50°C反應12小時?40小時，反應結(jié)束后在質(zhì)量濃度為0. 25%的氨水中 透析，接著冷凍干燥，得到聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-酰肼）_聚（N-(3-二甲胺丙基） 甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物；其中，無水肼與端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y -芐 酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物中芐基的摩爾比為（3:1)? (10 :1)。
[0022] -種所述的方法合成的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物， 其特征在于，其化學名稱為聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-酰肼）-聚（N-(3-二甲胺丙基） 甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物，化學結(jié)構(gòu)式為：
[0023]

【權(quán)利要求】
1. mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物的合成方法，其特征在于，包 括如下步驟： 1. mPEG-PBLG兩嵌段共聚物的合成： 向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入無水有機溶劑，然后在氮氣氛下加入 Y -芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐，溶解后于25°C?40°C反應48小時?72小時，得到 的產(chǎn)物用冷乙醚沉淀和洗滌，得到mPEG-PBLG兩嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧 基聚乙二醇和芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的質(zhì)量比為（1 :1)?（1 :3); 2. mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成： 將除水后的mPEG-PBLG兩嵌段共聚物溶于無水有機溶劑中，在氮氣氛下加入帶一個羧 基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4-二甲氨基吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺，然后于室溫反應24小時?72 小時，再用干燥的冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分子 RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑；其中，除水后的mPEG-PBLG兩嵌段共聚物、帶一個羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、 4_二甲氨基吡啶以及二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1 : (2?20) :1 : (4?40); 3) 端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-芐酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯 酰胺）三嵌段共聚物的合成： 將mPEG-PBLG兩嵌段共聚物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰 胺和引發(fā)劑溶于無水無氧溶劑中，于56?70°C反應24小時?60小時，得到的反應液經(jīng)濃 縮后用冷乙醚沉淀，收集沉淀后真空干燥，得到端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-γ -芐 酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物；其中，mPEG-PBLG兩嵌段共聚 物大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺、引發(fā)劑的摩爾比為10 : (200? 500) ：1 ； 4) 將端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸-Y-芐酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙 烯酰胺）三嵌段共聚物進行肼解脫除芐基，得到mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA 三嵌段共聚物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物的 合成方法，其特征在于，所述的步驟1)中胱胺化端甲氧基聚乙二醇由如下步驟合成： 1) 將干燥的分子量為800?4000的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2, 2' -二 硫代二乙基異氰酸酯溶于無水甲苯中，于85°C氮氣氣氛下反應48小時，然后在無水正己烷 中沉淀，收集沉淀，并真空干燥，得到2, 2'-二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲 氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2, 2' -二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為1 : (0. 02? 0. 08) : (3 ?8); 2) 將2, 2' -二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶于蒸餾水中，于60°C反應6小時，反應 體系在蒸餾水中透析、凍干后得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物的 合成方法，其特征在于：所述的步驟1)中芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的合成方 法為：將L-谷氨酸-γ -芐酯加入無水四氫呋喃中，接著在氮氣氣氛下加入三光氣，隨后于 50°C反應至形成澄清溶液，再濃縮溶劑，最后將濃縮得到的反應體系在無水正己烷中沉淀、 重結(jié)晶，得到Y(jié) -芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐；其中，L-谷氨酸-γ -芐酯與三光氣 的摩爾比為1 :(0.35?0.4)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ-酰肼）-PDMAPMA三嵌段共 聚物的合成方法，其特征在于：所述的帶一個羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑為S-1-十二烷 基-S' _(α, α'-二甲基-α'' -乙酸）二硫代碳酸酯、4_氰基_4_ [(十二燒基硫燒基硫撰 基）硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲酰）戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物的 合成方法，其特征在于：所述的步驟3)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或4, 4'-偶氮雙（氰基戊 酸）。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-Y-酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物的合 成方法，其特征在于：所述的步驟1)和步驟2)中無水有機溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、 無水四氫呋喃或無水二甲基甲酰胺，步驟3)中無水無氧有機溶劑為無水無氧二氧六環(huán)、無 水無氧四氫呋喃或無水無氧二甲基甲酰胺。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物 的合成方法，其特征在于：所述的肼解脫除芐基的方法為：將端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷 氨酸- γ-芐酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物溶于無水二甲基 甲酰胺中，滴加無水肼后35°C?50°C反應12?40小時，反應結(jié)束后在質(zhì)量濃度為0. 25% 的氨水中透析，接著冷凍干燥，得到聚乙二醇-聚α-谷氨酸-Y-酰肼）_聚（N-(3-二甲 胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物；其中，無水肼與端甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨 酸- γ-芐酯）-聚（Ν-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物中芐基的摩爾比為 (3 :1)?（10 :1)。
8. -種如權(quán)利要求1?7中任意一項權(quán)利要求所述的方法合成的mPEG-聚（L-谷氨 酸-Y -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物，其特征在于，其化學名稱為聚乙二醇-聚（L-谷氨 酸-Y-酰肼）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）三嵌段共聚物，化學結(jié)構(gòu)式為：
9. 權(quán)利要求8所述的mPEG-聚（L-谷氨酸-γ -酰肼）-PDMAPMA三嵌段共聚物作為裝 載阿霉素和基因藥物的載體的應用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于：所述的基因藥物為Pgp siRNA、 bcl-2siRNA 或 DNA。
【文檔編號】C08F220/60GK104086721SQ201410267879
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】錢軍民, 徐明輝, 胥偉軍, 劉茸茸, 王紅潔 申請人:西安交通大學