專利名稱：快速純化細菌莢膜多糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種能夠從細菌發(fā)酵液中去除污染物，純化莢膜多糖的方法。
背景技術：
肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌是威脅人類生命的重要致病菌。開發(fā)疫苗來預防這些病菌的感染是醫(yī)學界多年奮斗的目標。自上世紀60年代，通過實驗手段發(fā)現(xiàn)這些細菌有一個共同的形態(tài)學結構特點，就是細胞膜表面包裹著一 層莢膜，這層莢膜是由多糖包裹在每一個細胞膜表面形成，故稱莢膜多糖。在人體內，莢膜對于這些細菌致病性起著決定性作用，因為，通過防止抗體吸附到細菌膜上，莢膜能夠干擾免疫細胞對細菌的吞噬作用，使得細菌能夠在體內繁殖而致病。研究發(fā)現(xiàn)，細菌莢膜多糖作為疫苗具有很好的免疫原性，可以刺激具有健全的免疫功能的成人產(chǎn)生抗體來抵抗具有莢膜多糖細菌的感染；但是，由于2歲以下兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對莢膜多糖沒有免疫應答，而這一人群是受這些致病菌威脅最為嚴重人群，開發(fā)能夠保護這一人群的疫苗是醫(yī)學界的重點課題。自上世紀80年代，研究發(fā)現(xiàn)，當莢膜多糖以共價鍵和蛋白質結合，如破傷風類毒素、白喉類毒素或者CRM197 (變異白喉無毒毒素)后，形成多糖-蛋白結合疫苗，可在2歲以下嬰幼兒體內產(chǎn)生針對于莢膜多糖的免疫應答反應，自此，一種以細菌莢膜多糖聯(lián)接至蛋白載體的合成疫苗誕生。目前，在市場上用于預防成年人肺炎球菌球菌感染的有23價肺炎球菌多糖疫苗，以及預防兒童的7價、10價和13價肺炎球菌多糖結合疫苗在全球范圍廣泛使用。另外，傷寒(vi)多糖疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗、4價流行性腦膜炎多糖結合疫苗也已經(jīng)應用多年。從化學結構上來看，不同的細菌具有不同的莢膜多糖，而同一種細菌不同血清型細菌也有不同的莢膜多糖，如肺炎球菌有90種不同血清型，腦膜炎球菌有A、B、C、W135和Y群，它們都具有不同化學結構的莢膜多糖。研究發(fā)現(xiàn)，每種莢膜多糖具有嚴格的重復性化學結構，這個化學結構可由一個單糖單位或含有最多達7-8單糖殘基組成的寡聚糖組成。這種重復性單位可為線性或含有非碳水化合物取代基團的分叉結構，這些非碳水化合物取代基團可為O-乙?；?Ο-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)；另外，肺炎球菌一些莢膜多糖可能含有不常見的單糖殘基，如二氨基(diamino-)，脫氧和分叉鏈糖等。這種細菌多糖結構的多樣性，給純化這些多糖方法帶來了挑戰(zhàn)和困難。用莢膜多糖來制備疫苗，包括多糖疫苗或多糖結合疫苗，都需要用符合一定質量標準的莢膜多糖作為原料來制備。為了獲得高純度的莢膜多糖，可用富有營養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)液來發(fā)酵細菌，進而從發(fā)酵液中純化莢膜多糖，純化過程中要去除的主要污染物包括細菌蛋白，核酸和培養(yǎng)基成分，如果是制備肺炎球菌莢膜多糖時，還需要控制C-多糖的污染。細菌莢膜多糖純化工藝的建立經(jīng)歷了多年的發(fā)展過程，傳統(tǒng)方法純化莢膜多糖過程中，去除多糖溶液中的核酸污染以達到疫苗制劑所需純度要求比較困難，由于不同細菌的莢膜多糖的化學特性不同，每種細菌莢膜多糖需要用特殊方法來去除核酸污染，沒有一種方法能夠純化其它細菌的莢膜多糖。有些細菌莢膜多糖需要通過大量的乙醇來進行沉淀，同時，要用不同的有機溶劑萃取，如乙醚等，來幫助純化。乙醇沉淀通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，并將其濃度降低至比較低的水平；但是，難以降低到用于注射用的疫苗要求的水平，包括采用有機溶劑氯仿和丁醇混合溶劑或者苯酚，和多糖溶液混合，震搖4-6小時，然后，用低速離心，聚集在水相和有機相之間的變性蛋白能夠與水相中的多糖分離。不過這種方法的缺點是在萃取過程中，多糖會被降解，斷裂或者失去其原始空間構象，純化出來的多糖已經(jīng)不是有效的免疫原。由于不同細菌多糖結構的多變性限制了這些分離方法的有效性。由此，得出結論是早期的傳統(tǒng)方法中沒有一種方法能夠有效地純化不同細菌的莢膜多糖。盡管如此，有幾種純化出高純度和保存有其免疫原性的不同細菌莢膜多糖方法被 發(fā)明，特別是在純化不同血清型肺炎球菌莢膜多糖時，這些方法能夠有效地純化出包括24種血清型莢膜多糖。包括 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并用于配制23價肺炎球菌多糖疫苗的莢膜多糖原料。1980 年，美國 American Cyanamid Company 公司的專利 US4242501 闡述了一種純化肺炎球菌莢膜多糖方法，在這一專利基礎上，隨后該公司又于1987年注冊了另一個專利US4686102，用以純化23個不同的血清型肺炎球菌莢膜多糖。該專利的基本工藝途徑是肺炎球菌發(fā)酵后，加入脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)溶解細菌，將菌體上的莢膜多糖釋放至發(fā)酵液中，離心去除了細胞碎片后，用乙醇沉淀兩次，這一步驟能夠去除包括蛋白質在內的大量污染物；加入十六烷基三甲基溴化銨至乙醇沉淀后的多糖溶液，進一步去除污染物。通過控制十六烷基三甲基溴化銨濃度，能夠吸附沉淀大部分血清型多糖沉淀下來，這些沉淀多糖隨后能夠溶解于氯化鈉溶液，離心去除那些不溶解的大分子污染物。不過，有四種血清型多糖不能夠和十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀，加入十六烷基三甲基溴化銨的作用是沉淀污染物，離心去除這些污染物。隨后，再加入乙醇以去除十六烷基三甲基溴化銨。離心去除沉淀后，加入活性炭吸附殘留的污染物，如蛋白和核酸。最后，通過透析獲得純化莢膜多糖。從工藝過程可見，盡管該方法建立了一個肺炎球菌莢膜多糖的純化平臺，用同一種方法能夠純化出不同血清型多糖，但是步驟繁雜，不宜掌握；其中還包括了多步乙醇沉淀、離心，費時，設備費用高昂；而且不宜擴大生產(chǎn)。十六烷基三甲基溴化銨沉淀步驟技術復雜，不同血清型處理方法不同。另外，最終純化出來的多糖僅僅能夠滿足制備23價肺炎多糖疫苗的質量標準，即蛋白和核酸含量低于2%-7%，無法滿足現(xiàn)有的肺炎球菌多糖結合疫苗對多糖原料中蛋白和核酸含量低于I%的質量要求。至1998 年，美國 American Home Products 公司的專利 US5714354 提出了一種無乙醇沉淀來純化肺炎球菌莢膜多糖的改進方法。該方法是通過用十六烷基三甲基溴化銨來沉淀23種肺炎球菌血清型中的20個莢膜多糖，然后用活性炭過濾、羥基磷酸灰質鹽(Hydroxyapatite)色譜法和陰離子交換色譜法來進一步分離多糖中的污染物,該純化工藝步驟能夠純化出大部分血清型莢膜多糖。而其它3個不能夠和十六烷基三甲基溴化銨沉淀的血清型(血清型7F、14和33F)的純化，是采用修飾方法來進行純化，包括陰離子交換樹脂色譜法。和前一專利純化工藝比較，這一純化工藝能夠節(jié)省75%純化時間，費用也降低，不需要特殊設備。該方法純化出來的所有23個血清型莢膜多糖的質量達到多糖疫苗的質量指標。同在1998年，美國Merck公司的專利US5847112也發(fā)布一種純化肺炎莢膜多糖的方法?；痉椒橛靡掖紒矸謨刹綇陌l(fā)酵破菌液中分離多糖；第一步是用低百分比的乙醇來沉淀細胞碎片和污染物，如C-多糖，保留多糖于溶液中；接下來，加入高濃度的乙醇來沉淀莢膜多糖，將留在溶液中的其它污染物丟棄。將沉淀多糖溶解后，再用常規(guī)方法，比如核酸和蛋白酶消化，或者有機溶劑，進一步來去除污染的蛋白和核酸，粗制多糖由乙醇沉淀和凍干獲得。隨后，通過陰離子交換色譜純化獲得精制的全多糖或者部分水解多糖。用以上兩種方法純化出來的多糖盡管能夠達到較高的純度標準，但是，步驟仍然繁雜，工藝條件控制要求高。特別是多步驟的沉淀分離步驟耗時長。美國Wyeth公司的專利US20060228381提出了一種更加簡潔的純化肺炎球菌莢膜多糖的方法。基本途徑是用豆類培養(yǎng)基發(fā)酵肺炎球菌后，加入脫氧膽酸鈉來溶解菌體，然后加酸調節(jié)溶液PH至5. 5以下來沉淀脫氧膽酸鈉和大部分可溶性蛋白，通過離心過濾和超濾去除溶液中的細胞碎片和沉淀物。由此獲得的粗制多糖仍然需要傳統(tǒng)方法進一步純化，包括用活性炭過濾、羥基磷灰石柱吸附殘留的雜質，以及超濾洗濾來獲得精制多糖。這樣純 化方法的特點在于通過酸化破菌發(fā)酵液這一步來將大部分的污染物，如蛋白、核酸、內毒素等，和溶液中的莢膜多糖分離，簡化了后續(xù)工藝，縮短了純化時間。但是，由于是使用的用脫氧膽酸鈉溶菌液來進行純化，有些血清型的細胞壁中含有的C-多糖被釋放出來，由于C-多糖和莢膜多糖的化學特性相似，不易在隨后的純化工藝過程中被去除，造成了純化多糖中C-多糖含量過高。本發(fā)明通過總結了現(xiàn)有的細菌莢膜多糖的純化方法，提出了一種更為快速的純化方法，所獲得的純化莢膜多糖的各項標準都達到了現(xiàn)有的WHO質量標準。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種快速純化細菌莢膜多糖的方法，它能從指定細菌發(fā)酵液中快速去除其中的污染物，保留純化的莢膜多糖溶液。本發(fā)明包括如下步驟步驟一，在裝有細菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出生產(chǎn)莢膜多糖的細菌；步驟二，離心和/或微濾發(fā)酵液中的菌體，收集無不溶顆粒含有莢膜多糖的溶液；步驟三，用超濾膜濃縮和洗濾含莢膜多糖的微濾液；步驟四，加酸至濃縮液，來調節(jié)含有莢膜多糖溶液pH值彡5范圍來沉淀雜質；步驟五，離心和/或微濾去除溶液中的沉淀物；步驟六，超濾洗濾多糖溶液，獲得含雜質含量極低的莢膜多糖溶液。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，所述細菌包括肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌和傷寒桿菌。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，在步驟四中所加的酸是磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的任意一種。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，在步驟四中pH值的范圍是3. O 5. O。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，微濾所用微濾膜的膜孔徑為O. 22，O. 45，O. 65,1. O μ m中的任意一種。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，超濾所用的超濾膜是分子量為5kD至500kD范圍內的任意一種。在上述快速純化細菌莢膜多糖的方法中，洗濾所用溶液為純水、緩沖液或者鹽溶液或它們的混合液。通過上述純化工藝過程所獲得的莢膜多糖溶液中，包括可溶性蛋白和核酸雜質含量都顯著地降低。 本發(fā)明可用于從含有莢膜多糖細菌中純化多糖，此處只是舉例，而不限于這些細菌，如肺炎球菌不同血清型，包括 1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌，以及傷寒桿菌。在本發(fā)明中，步驟四加酸沉淀雜質是核心，即通過加入磷酸將濃縮液pH調節(jié)至3. 0-5. O之間，用此方案來沉淀蛋白和核酸。在本發(fā)明中，采用離心分離、微濾和超濾濃縮三步法來去除步驟二發(fā)酵液中的沉淀物和不溶性顆粒效果更好，根據(jù)細菌種類不同，或者肺炎球菌的血清型不同，選用O. 22，O. 45，O. 65或者I. Oym膜來微濾獲得的離心上清液，去除溶液中殘留的細胞顆粒和碎片，以及不溶顆粒；也可以省略離心這一步驟，而直接將發(fā)酵液進行微濾，以去除發(fā)酵液中的菌體和細胞碎片；用30至500kD膜對微濾液進行超濾濃縮，并用去離子水或者緩沖液來超濾清洗溶液，去除小分子污染物，通過這些步驟的純化處理，可以去除莢膜多糖溶液中的90-98%蛋白和95-99%核酸，使發(fā)酵液中的沉淀物去除更徹底。
具體實施例方式一種快速純化細菌莢膜多糖的方法，和傳統(tǒng)的從破菌/或者溶菌后的細菌發(fā)酵液中來進行純化方法的主要的不同之處是，本發(fā)明是通過將溶液中的污染物快速而簡便地去除，保留溶液中的完整分子量的莢膜多糖。本發(fā)明可用于，如肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌莢膜多糖的純化，純化后的多糖溶液中雜蛋白和核酸含量可降低90-98%。目前采用的莢膜多糖純化工藝繁雜，含有多步的沉淀分離步驟，不易工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，需要大量貴重的設備的投入和人力來進行操作。細菌莢膜多糖的純化工藝經(jīng)過半個世紀的發(fā)展變遷，隨著新型生物材料不斷推出，大分子純化技術也隨之改善，以適應對生物制劑質量不斷提高的標準。對于用細菌莢膜多糖來制備的疫苗，如肺炎球菌多糖疫苗和多價肺炎球菌多糖結合疫苗，b型流感嗜血桿菌結合疫苗，流行性腦膜炎多糖疫苗和多糖結合疫苗，以及傷寒Vi多糖疫苗和Vi多糖結合疫苗，其莢膜多糖的質量標準也在不斷的提高，以多糖中的雜質蛋白含量容許標準為例，從上世紀80年代23價肺炎球菌多糖疫苗的質量標準之一是要求雜質蛋白和核酸標準低于2-7%，到2000年的各種不同細菌多糖結合疫苗所用的莢膜多糖原料質量標準是低于1%。細菌莢膜多糖的純化工藝也從早期的多達16道工藝，改進到目前正在采用的10道主要工藝步驟，縮短了純化需要的時間和成本，同時，在質量上也達到了現(xiàn)代的多糖疫苗制劑要求的標準。本發(fā)明是在對現(xiàn)有的細菌莢膜多糖純化工藝環(huán)節(jié)的中間產(chǎn)物進行檢測和評估的基礎上，進一步優(yōu)化而建立的純化工藝平臺，能夠快速、簡便地純化出不同細菌的莢膜多糖，步驟如下本發(fā)明包括如下步驟步驟一，在裝有細菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出生產(chǎn)莢膜多糖的細菌；步驟二，離心和/或微濾發(fā)酵液中的菌體，收集無不溶顆粒含有莢膜多糖的溶液；
步驟三，用超濾膜濃縮和洗濾含莢膜多糖的微濾液；步驟四，加酸至濃縮液，來調節(jié)含有莢膜多糖溶液pH值彡5范圍來沉淀雜質；步驟五，離心和/或微濾去除溶液中的沉淀物；步驟六，超濾洗濾多糖溶液，獲得含雜質含量極低的莢膜多糖溶液。通過以上六個純化工藝步驟，能夠將溶液中的主要雜質，如蛋白和核酸，的含量降低90-98%，同時，純化出來的莢膜多糖的免疫原性、分子的完整性都優(yōu)于或等同于現(xiàn)有的純化方法所獲得的多糖。步驟七，采用現(xiàn)有技術對細菌莢膜多糖進行后續(xù)純化。本發(fā)明提出的純化細菌莢膜多糖的方法的設計原理及試驗條件的控制如下(一 )、細菌發(fā)酵過程的控制要純化出高純度的莢膜多糖，需要對多糖生產(chǎn)過程中的各個可能造成污染的環(huán)節(jié)加以控制，特別是在發(fā)酵環(huán)節(jié)上應該盡量減少污染物進入到用于純化多糖的發(fā)酵液中，其中，由于菌體破碎而釋放出來的雜質污染物，如蛋白和核酸，以及培養(yǎng)基中含有的雜質，包括蛋白，核酸和雜質多糖等是污染物的主要來源。以肺炎球菌為例，該細菌是革蘭氏陽性菌，能夠耐受氧氣，其形態(tài)具有多樣性的特點，可以在光滑(Transparent)和粗糙(Opaque)菌落形態(tài)間轉化。在處于光滑菌態(tài)時，細菌表面只具有少量的莢膜多糖，是人體鼻腔內寄生菌落存在的形態(tài)；而處于粗糙菌態(tài)的細菌表面含有大量的莢膜多糖，是人體血液中的肺炎球菌存在的形態(tài)，莢膜多糖的存在能夠阻止宿主免疫細胞吞噬作用，使得細菌能夠存活下來并繁殖。實驗表明在液體培養(yǎng)基中，肺炎球菌表面包裹的部分莢膜多糖會脫落到發(fā)酵液中，能夠用來純化莢膜多糖。顯而易見，從菌體表面獲取莢膜多糖，必須將菌體破碎后獲得，這就使得細菌體內雜質蛋白、核酸等污染物都釋放至發(fā)酵液中，因而增加了純化多糖的難度。為了避免這一問題，同時，根據(jù)肺炎球菌的培養(yǎng)特性，本發(fā)明首先采用嚴格的無氧發(fā)酵，使得肺炎球菌在發(fā)酵液中以粗糙菌態(tài)為主，在此條件下，肺炎球菌會生產(chǎn)大量的莢膜多糖，部分莢膜多糖會從細菌表面釋放至培養(yǎng)液中。在控制發(fā)酵液的PH值在中性范圍內(7. 0-7. 6)，多糖能夠穩(wěn)定地存在于溶液中而不降解。另一方面，由于肺炎球菌含有溶菌酶，當細菌死亡后，會釋放出該酶自溶，因此，在細菌發(fā)酵至生長平臺期后要及時地停止發(fā)酵，進行收獲，以便減少細菌死亡，釋放出細胞內容物，污染發(fā)酵液的情況發(fā)生。目前市場上使用的肺炎疫苗，包括23價肺炎多糖疫苗和13價肺炎球菌多糖結合疫苗，以及b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗，生產(chǎn)所用的莢膜多糖原料都是由加入表面活性劑至發(fā)酵液中來溶解菌體，以釋放出細菌細胞壁上的莢膜多糖進行純化，最終莢膜多糖的來源實際上有兩途徑，即在發(fā)酵過程中從細菌表面脫落至發(fā)酵液中的多糖和溶菌后由細胞壁上釋放出來的多糖。盡管用這種方法來純化莢膜多糖時，起始多糖總量要多于僅僅從去除菌體的發(fā)酵液上清液中純化莢膜多糖的起始量；但是，溶菌發(fā)酵液中起始溶液中的雜質成分含量要遠高于發(fā)酵液上清液，這給后續(xù)純化工序增加了負擔，需要更多的步驟來進行純化，因此，一方面溶液中的多糖會在在過多的純化步驟中損失增加，其收率和從發(fā)酵上清液中進行純化相比較，并不占優(yōu)勢；另一方面，加入表面活性劑來溶菌后，盡管可釋放出更多的多糖，但是，存在于細胞壁的雜質多糖成分，比如C-多糖也被釋放出來。而C-多糖的化學特性和莢膜多糖相似，在后續(xù)的純化過程中，去除非常困難?，F(xiàn)有市場上的產(chǎn)品中C-多糖污染是一個突出的問題，因為C-多糖在檢測過程中，容易被計入莢膜多糖，但C-多糖并沒有免疫原性，不能夠刺激機體產(chǎn)生保護性抗體來殺菌。其結果是混入制劑中致使多糖疫苗的免疫效果受到影響。( 二)、發(fā)酵液除菌體過程控制在獲得含有莢膜多糖的發(fā)酵液后，可用常規(guī)的離心法來去除其中的菌體。盡管離心能夠去除大部分菌體，但是，溶液中仍然存在一些不溶的顆粒性物質，包括菌體，和細胞碎片，需要用微濾膜來進一步微濾以去除溶液中的顆粒性物質。由于現(xiàn)代的微濾技術的發(fā)展，通過條件的控制，也可以直接用微濾膜來直接微濾含菌體的發(fā)酵液，來澄清溶液，以減 少純化步驟。(三)濃縮液酸化過程的控制在獲得含有莢膜多糖的濃縮液后，將其和污染物，包括蛋白和核酸，進行分離的步驟繁雜，常用方法采用諸如乙醇沉淀、核酸和蛋白酶消化、有機溶劑和苯酚抽提以及超濾清洗步驟進一步純化，最終獲取純化多糖。本發(fā)明采用了將濃縮液進行酸化，沉淀蛋白以及核酸雜質，這一方法將大大地減少傳統(tǒng)的多步驟去除方法。根據(jù)生產(chǎn)細菌的品種不同，或者血清型的不同，當將溶液的PH調節(jié)至3. 0-5. O范圍時，能夠沉淀發(fā)酵液中90% -98%的菌體，蛋白以及核酸。酸化溶液所用的酸可為磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸，硝酸或者是這些酸溶液的不同濃度的混合液。酸化時間為10分鐘-24小時，需要根據(jù)不同的細菌或血清型來決定。酸化時發(fā)酵液溫度可為4-37°C。通過對以上條件的控制，發(fā)酵液中的菌體、蛋白和核酸等主要污染物能夠快速形成沉淀，而莢膜多糖能夠穩(wěn)定地存在于溶液中達到分離雜質的目的。(四)、離心和/或微濾過程的控制通過常規(guī)方法，如離心和/或者微濾來去除沉淀，在本發(fā)明的純化平臺程序中，首先用在線離心機來離心酸化后的細菌發(fā)酵液，以去除大顆粒的沉淀。離心溫度為4-25°C。離心時間在30分鐘-120分鐘。隨后，通過微濾來進一步去除溶液中的小顆粒不溶物，微濾膜的分子量范圍在O. 22至I μ m。收集含有莢膜多糖的澄清濾溶液，丟棄微濾回流液。(五)、超濾濃縮和洗濾過程的控制本發(fā)明純化技術平臺程序中對微濾液進行超濾濃縮并清洗采用的超濾膜分子量可為5、10、30、50、100或者500Kd中的任何一種，需要根據(jù)細菌種類或者特定血清型來決定。濃縮最終溶液體積范圍為原溶液的2-10倍，根據(jù)細菌種類或者血清型不同而定。超濾洗濾濃縮液工藝步驟時采用純水、緩沖液、鹽溶液或者酸化鹽溶液中的任何一種，需要更不同血清型多糖的穩(wěn)定性來決定。通過以上純化工藝過程，溶液中的雜質含量逐步降低，下表為肺炎球菌部分血清型莢膜多糖溶液經(jīng)過純化后雜質濃度測定結果[ 0058]
權利要求
1.快速純化細菌莢膜多糖的方法，包括以下步驟 步驟一，在裝有細菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出生產(chǎn)莢膜多糖的細菌； 步驟二，離心和/或微濾發(fā)酵液中的菌體，收集無不溶顆粒含有莢膜多糖的溶液； 步驟三，用超濾膜濃縮和洗濾含莢膜多糖的微濾液； 步驟四，加酸至濃縮液，來調節(jié)含有莢膜多糖溶液PH值< 5范圍來沉淀雜質； 步驟五，離心和/或微濾去除溶液中的沉淀物； 步驟六，超濾洗濾多糖溶液，獲得含雜質含量極低的莢膜多糖溶液。
2.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是所述細菌包括肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌和傷寒桿菌。
3.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟四中所加的酸是磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的任意一種。
4.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟四中PH值的范圍是3. O 5. O。
5.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是微濾所用微濾膜的膜孔徑為O. 22,0. 45,0. 65,1. O μ m中的任意一種。
6.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是超濾所用的超濾膜是分子量為5kD至500kD范圍內的任意一種。
7.根據(jù)權利要求I所述快速純化細菌莢膜多糖的方法，其特征是洗濾所用溶液為純水、緩沖液或者鹽溶液或它們的混合液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速純化細菌莢膜多糖的方法，它能從指定細菌發(fā)酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留純化的莢膜多糖，包括含莢膜多糖細菌的發(fā)酵，加酸調節(jié)發(fā)酵液的pH值沉淀發(fā)酵液中的菌體和雜質，采用微濾、超濾濃縮和洗濾獲得粗制細菌莢膜多糖溶液。本發(fā)明的基本原理是通過加酸調節(jié)發(fā)酵液pH值至3-5的范圍，以去除形態(tài)完整的菌體以及其它雜質，保持莢膜多糖在溶液中來進行純化?？捎糜诩兓窝浊蚓型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌的莢膜多糖。
文檔編號C08B37/00GK102660602SQ20121011239
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權日2012年4月17日
發(fā)明者李建平 申請人:江蘇康泰生物醫(yī)學技術有限公司