培養(yǎng)細菌以提高莢膜多糖產(chǎn)率的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，其利用不同的進料溶液和供料策略來提高莢膜多糖(CP)生產(chǎn)。
【專利說明】培養(yǎng)細菌以提高莢膜多糖產(chǎn)率的新方法
[0001]簡述:
[0002]莢膜多糖是在細菌表面發(fā)現(xiàn)的各種細菌疾病中所涉及的重要免疫原。這一特征導致它們成為疫苗設計中的重要成分。已經(jīng)證明了它們在引發(fā)免疫響應中是有用的，尤其是結(jié)合載體蛋白時。
[0003]通常，使用在復合培養(yǎng)基中的分批培養(yǎng)來生產(chǎn)莢膜多糖[參考Shen等，2001Vaccine 19:850-61 ;Palazzi 等 2004 J.1nfect.Dis.190:558-64 ；Merritt 等，2000J.B1tech.81:189-97 ；Dassy&Fournierl996 Infect.Tmmunol.64:2408-14；Suarez 等(2001)Appl.Env.Microb1l.67:969-71 ;Wicken 等(1983) J.Bact.153:84-92]。傳統(tǒng)的營養(yǎng)素供料的DO-stat控制只是簡單地基于營養(yǎng)素限制或耗盡時的DO升高/尖峰的概念(由于碳基質(zhì)的減少或氧消耗或呼吸的停止)。所述DO-stat控制試圖當DO升至高于設定點時通過提高營養(yǎng)素進料速率以及當DO降至低于設定點時通過降低營養(yǎng)素進料速率使培養(yǎng)物維持在限度內(nèi)的恒定DO水平(D0設定點)。DO-stat策略通常適用于確定成分培養(yǎng)基，其中營養(yǎng)素耗盡導致快速的DO升高。然而，DO-stat方法在補充了豐富的復合營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中常常失敗，所述復合營養(yǎng)素如酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白氨基酸或Hy-Soy。豐富的復合營養(yǎng)素能夠通過氨基酸分解代謝來支持細胞維持和呼吸，使得DO水平保持低的(即，沒有明顯的DO尖峰)，甚至于在碳源限制或耗盡的情況下。
[0004]當將復合培養(yǎng)基用于培養(yǎng)物生長時，pH-stat策略可能比DO-stat更合適，因為一旦碳源被耗盡，培養(yǎng)物pH趨于升高。以與DO-stat控制相似的方式,該pH-stat方法通過在PH升至高于設定點時提高營養(yǎng)素進料速率以及當pH降至低于設定點時降低營養(yǎng)素進料速率來維持恒定培養(yǎng)物pH大約在設定點。然而，由于營養(yǎng)素耗盡時培養(yǎng)物pH的變化的響應性低于D0,因此當與DO-stat相比時,通過pH-stat的供料控制相對緩慢。
[0005]大部分研究使用了分批培養(yǎng)系統(tǒng),其中生長速率、營養(yǎng)素水平和代謝濃度在培養(yǎng)過程中發(fā)生變化。在這樣的系統(tǒng)中，一個因素的改變會導致與生長相關(guān)的其他因素的變化，這會不可預知地影響產(chǎn)率。連續(xù)培養(yǎng)允許研究者分離和限定分批培養(yǎng)生長過程中互相依賴的參數(shù)，如生長速率、營養(yǎng)素以及產(chǎn)物濃度和細胞密度。在連續(xù)培養(yǎng)過程中，將新鮮培養(yǎng)基以固定的速率加入到培養(yǎng)物中，并且以維持恒定培養(yǎng)體積的速率移出細胞和培養(yǎng)基。
[0006]在灌注培養(yǎng)中，將新鮮培養(yǎng)基以固定速率加入到培養(yǎng)物中，并且以維持恒定培養(yǎng)體積的速率移出無細胞的用過的培養(yǎng)基。然而，連續(xù)和灌注培養(yǎng)易于產(chǎn)生菌株穩(wěn)定性問題和污染，并且由于培養(yǎng)基和營養(yǎng)素的連續(xù)進料，其費用稍高。因此，為了克服上述與連續(xù)培養(yǎng)相關(guān)的問題，需要尋找一種用于高產(chǎn)率生產(chǎn)莢膜多糖的連續(xù)培養(yǎng)的備選方案。
[0007]WO 2007/052168中例示了一種克服了連續(xù)培養(yǎng)缺陷的方法。已經(jīng)研發(fā)了一種復合補料分批發(fā)酵方法以維持對Cps生產(chǎn)有利的營養(yǎng)環(huán)境和生長速率。這種方法結(jié)合了分批和連續(xù)技術(shù)的優(yōu)點，由于指數(shù)生長期的延長以及發(fā)酵過程中控制基質(zhì)添加的條件，產(chǎn)生了高細胞密度。然而，該復合補料分批技術(shù)使用帶有復雜算法的軟件來操縱發(fā)酵。
[0008]另一種方法公開于WO 20100272755中。研發(fā)了一種用于培養(yǎng)細菌的方法,其中所述培養(yǎng)包括兩次瞬時的酵母提取物添加，接著葡萄糖的線性添加。每次添加在指定的OD水平下開始。因此，不需要算法的碳源的線性添加是優(yōu)于之前的復合補料分批發(fā)酵的改進。然而，這是一種非常繁重的方法，需要連續(xù)測量0.D.。此外，其未能考慮生物體的恒定變化需求(微環(huán)境)。
[0009]本發(fā)明是基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)并且涉及一種新的供料方法，其中補料分批發(fā)酵過程中的進料培養(yǎng)基添加的速率等于用于維持預定PH的堿混合物添加的速率，導致與之前現(xiàn)有的分批發(fā)酵方法相比，CP產(chǎn)率的體積增加。
[0010]發(fā)明概述:
[0011]本發(fā)明提供了一種新的補料分批發(fā)酵策略，導致與分批模式發(fā)酵相比，莢膜多糖生產(chǎn)力提高3至5倍。
[0012]特別地，本發(fā)明的方法涉及一種培養(yǎng)用于較高體積生產(chǎn)莢膜多糖(CP)的莢膜細菌的方法，其中所述方法包括(a)提供表達CP的細菌菌株的接種物；(b)通過在pH7.2下發(fā)酵來培養(yǎng)所述菌株，其中進料培養(yǎng)基添加的速率等于用于維持預定PH的堿混合物添加的速率；c)在50-150RPM攪拌下在35-38°C下，使用0.1-0.5vvm的空氣流速發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0013]附圖簡述:
[0014]圖1:用于不同供料方法的肺炎球菌血清型I多糖(補料分批發(fā)酵)。
[0015]圖2:針對用于維持pH的堿混合物中不同比例的堿的肺炎球菌血清型I多糖產(chǎn)率(補料分批)。
[0016]圖3:與分批發(fā)酵相比，通過補料分批的肺炎球菌血清型1、5、6A、6B、7F、9V、14、19AU9F和23F多糖產(chǎn)率。
[0017]發(fā)明詳述:
[0018]本發(fā)明公開內(nèi)容提供了一種細菌培養(yǎng)方法，其中在補料分批發(fā)酵過程中的進料速率等于用于維持預定PH的堿混合物添加的速率。
[0019]本發(fā)明的另一個方面是由特定比例的NaOH和Na2C03組成的堿混合物可以用于a)維持預定pH&b)獲得較高的莢膜多糖產(chǎn)率。只使用Na2C03可以提供合適的用于生長以及PH控制的培養(yǎng)基，然而Na2C03的限制條件可以提供應激條件，以形成莢膜多糖和較高的Na2C03含量的需求。因此，當將NaOH和Na2C03的混合物用于維持pH時，由于較少的堿消耗量，生長可能較差，但具有較高的特定的多糖生產(chǎn)力以及較高的體積生產(chǎn)力。
[0020]按照本發(fā)明的方法，當葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸并且pH開始降低時，可以通過堿混合物添加來維持，同時添加葡萄糖以補充培養(yǎng)基中耗盡的葡萄糖。
[0021]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵進料組分可以由至少一種碳源、至少一種氮源、至少一種鎂源組成，所述組分可以在特定的細胞密度下以等于堿混合物添加的進料速率加入到分批發(fā)酵中。
[0022]本發(fā)明的一個實施方案在于，所述堿混合物含有至少兩種選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀和氫氧化鈣的堿。此外，選擇指定比例的氫氧化鈉和碳酸鈉來獲得較高的CP的體積生產(chǎn)。
[0023]氫氧化鈉與碳酸鈉的指定比例可以為1:1至4:1。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，當將NaOH與Na2C03 —起作為混合物用于維持pH時，其進一步增強CP的生產(chǎn)力。當只將Na2C03用于維持pH時，其提供用于生長的合適培養(yǎng)基。然而，Na2C03的限制條件提供了形成莢膜多糖的應激條件。當將NaOH和Na2C03的混合物用于維持pH時，生長較差，但提高了 CP生產(chǎn)力。
[0025]優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種在補料分批培養(yǎng)中培養(yǎng)鏈球菌的方法，其中產(chǎn)生了高產(chǎn)率的CP。優(yōu)選地，來自培養(yǎng)基的cps的產(chǎn)率為900至2000mg/L或更高。因此，與分批培養(yǎng)相比，這種補料分批方法允許以150至350%的體積產(chǎn)率增加來生產(chǎn)CP。在一些情況下，產(chǎn)率至少為使用分批培養(yǎng)產(chǎn)生的量的兩倍，更優(yōu)選是使用分批培養(yǎng)產(chǎn)生的量的4倍。
[0026]本發(fā)明的另一個實施方案在于所述進料培養(yǎng)基可以由至少一種碳源、至少一種氮源、至少一種鹽和至少一種氨基酸組成。
[0027]優(yōu)選地，所述碳源是葡萄糖。所述氮源可以選自酵母自溶產(chǎn)物、酵母氮堿、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、大豆粉、Hy-Soy、酵母提取物和胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基。所述鹽可以選自硫酸鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂及其混合物。
[0028]按照本發(fā)明的方法，所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-500范圍內(nèi)的葡萄糖、1-7.5范圍內(nèi)的硫酸鎂、40-150范圍內(nèi)的Hy-SOya、5-50范圍內(nèi)的酵母提取物、0.002-0.005范圍內(nèi)的鹽酸硫胺素、0.2-0.5范圍內(nèi)的半胱氨酸、0.2-0.5范圍內(nèi)的氯化鈣。
[0029]此外，所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-500范圍內(nèi)的葡萄糖、5-50范圍內(nèi)的酵母提取物、0.002-0.005范圍的鹽酸硫胺素、0.2-0.5范圍內(nèi)的半胱氨酸、0.2-0.5范圍內(nèi)的氯化鈣。
[0030]或者，所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-500范圍內(nèi)的葡萄糖、0.5-7.5范圍內(nèi)的硫酸鎂、40-150范圍內(nèi)的Hy-soya和5_50范圍內(nèi)的酵母提取物。
[0031]本發(fā)明的優(yōu)選實施方案在于所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-200范圍內(nèi)的葡萄糖、1-3范圍內(nèi)的硫酸鎂、50-150范圍內(nèi)的Hy-soya和15-25范圍內(nèi)的酵母提取物。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，所述新的補料分批方法可以用于制備選自大腸桿菌(Escherichiacoli)、土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhal is)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)組A, C, W135 Y和X、牙銀卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurim)、副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、索氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、霍亂弧菌(Vibr1 cholera)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、A組鏈球菌(Streptococcus)、B組鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的莢膜多糖。
實施例
[0033]實施例1
[0034]用于肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)血清型I的補料分批研發(fā)優(yōu)化的進料方法的評價
[0035]針對供料，評價了不同的進料方法。DO-stat方法不適用于肺炎鏈球菌發(fā)酵。因為肺炎鏈球菌是一種微嗜氣性細菌，在發(fā)酵過程中只需要表面通風。在肺炎鏈球菌在分批模式發(fā)酵過程中在發(fā)酵罐中部分生長后，溶解氧大約為零。
[0036]嘗試了五種不同的供料方法用于補料分批發(fā)酵。
[0037]1.pH stat方法:通過設定pH點來控制pH stat進料,其中當培養(yǎng)物的pH升至高于設定-PH時，將所述碳源加入到培養(yǎng)基中，而當培養(yǎng)物的pH降至低于設定-pH時，停止所述碳進料。
[0038]2.恒定速率供料方法:在這種方法中，在1.61液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，以4.2ml/m給予了 11種濃縮的補料，持續(xù)4小時。
[0039]3.指數(shù)供料方法:進料速率從lml/m開始,并且隨著OD提高。對于I單位OD的增量，進料速率提高0.5ml/m。
[0040]4.恒定的葡萄糖濃度:在補料分批發(fā)酵過程中，嘗試將殘留的葡萄糖濃度維持在大約 0.5g/l。
[0041]5.pH依賴性供料方法:在這種方法中，用Na2C03維持pH。對于培養(yǎng)基中耗盡的葡萄糖，以為了維持PH在培養(yǎng)基中進料Na2C03的速率添加葡萄糖
[0042]將NBS B1flo 115和B1engineering AG發(fā)酵罐用于所有這些實驗。本研究在3 L NBS B1flo 115發(fā)酵罐模式下進行，并且擴大至30LB1engineering AG發(fā)酵罐。進一步的擴大可以在450L B1engineering發(fā)酵罐中進行。將200g/l葡萄糖和5g/l MgS04用作用于所有補料分批發(fā)酵的進料培養(yǎng)基。所有補料分批實驗的發(fā)酵條件相同。在發(fā)酵過程中，用 20% Na2C03 維持 pH。
[0043]在補料分批發(fā)酵過程中維持以下參數(shù)。溫度(36.5±0.5)、(pH7.1 + 0.2),RPM-100、氣流(表面通氣)-0.5vvm。
[0044]表1:不同供料方法的血清型I的CP產(chǎn)率
[0045]
【權(quán)利要求】
1.培養(yǎng)用于較高體積生產(chǎn)莢膜多糖(CP)的莢膜細菌的方法，其中所述方法包括(a)提供表達該CP的細菌菌株的接種物；(b)通過在PH7.2下發(fā)酵來培養(yǎng)所述菌株，其中進料培養(yǎng)基添加的速率等于用于維持預定pH的堿混合物添加的速率；c)在50-150 RPM攪拌下在35-38°C下，使用0.1-0.5vvm的空氣流速發(fā)酵所述培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌生長于補料分批培養(yǎng)物中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中與分批或連續(xù)培養(yǎng)條件相比，通過補料分批培養(yǎng)的CP產(chǎn)率的體積增加在150至400%之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中通過補料分批的CP產(chǎn)率在900mg/l和2000mg/1之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述進料培養(yǎng)基可以由至少一種碳源、至少一種氮源、至少一種鹽和至少一種氨基酸組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述氮源由以下列表中的三種或更少組成:酵母自溶產(chǎn)物、酵母氮堿、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、大豆粉、Hy-Soy、酵母提取物和胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán) 利要求5的方法，其中所述鹽可以選自硫酸鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂及其混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-500范圍內(nèi)的葡萄糖、1-7.5范圍內(nèi)的硫酸鎂、40-150范圍內(nèi)的Hy-SOya、5-50范圍內(nèi)的酵母提取物、0.002-0.005范圍內(nèi)的鹽酸硫胺素、0.2-0.5范圍內(nèi)的半胱氨酸、0.2-0.5范圍內(nèi)的氯化鈣。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-500范圍內(nèi)的葡萄糖、5-50范圍內(nèi)的酵母提取物、0.002-0.005范圍內(nèi)的鹽酸硫胺素、0.2-0.5范圍內(nèi)的半胱氨酸、0.2-0.5范圍內(nèi)的氯化鈣。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述進料培養(yǎng)基可以由以下成分(gm/1)組成:100-200范圍內(nèi)的葡萄糖、1-3范圍內(nèi)的硫酸鎂、50-150范圍內(nèi)的Hy-soya和15-25范圍內(nèi)的酵母提取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述堿混合物含有至少兩種選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀和氫氧化鈣的堿。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中選擇指定比例的氫氧化鈉和碳酸鈉來獲得CP的較高體積生產(chǎn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述比例范圍在1:4和4:1之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中氫氧化鈉的濃度在1.5和3.0 M之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中碳酸鈉的濃度在10和20%(w/v)之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌選自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、A 組鏈球菌(Streptococcus)和 B 組鏈球菌。
【文檔編號】C12P19/00GK104080904SQ201180076292
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月15日
【發(fā)明者】K·S·維納亞克, J·S·庫馬爾, A·K·斯里瓦斯塔瓦 申請人:血清研究所印度有限公司