專利名稱：鉤端螺旋體內(nèi)存在的具有重復(fù)性細(xì)菌ig樣(big)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼鉤端螺旋體(Leptospira sp.)細(xì)菌中的具有重復(fù)性細(xì)菌Ig樣(Big)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)BigL1、BigL2和BigL3的三種分離DNA分子以及它們在診斷、治療和疫苗應(yīng)用中的用途。依照本發(fā)明，編碼BigL1、BigL2和BigL3蛋白質(zhì)的分離分子被用于診斷和預(yù)防能在人類和其它哺乳動物體內(nèi)引起疾病的鉤端螺旋體感染，包括在獸醫(yī)學(xué)方面的用途。
背景技術(shù)：
螺旋菌是可運動的螺旋狀細(xì)菌，包括鉤端螺旋體屬(leptospira)、疏螺旋體屬(Borrelia)和密螺旋體屬(Treponema)三個屬，它們是人類和其它動物的病原體。疏螺旋體和密螺旋體是包括萊姆病、回歸熱、梅毒和雅司病在內(nèi)的疾病的病因。鉤端螺旋體由8種致病的遺傳相異類型和四種非致病的腐生種類組成(1，2)。鉤端螺旋體還按血清變型情況進行了分類-已鑒定出200個以上的致病血清變型。脂多糖部分的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性看上去似乎是血清變型中觀察到的大量抗原變異的基礎(chǔ)(1，2)。
鉤端螺旋體病是一種動物傳染性疾病通過接觸家養(yǎng)的或野生的動物宿主或被它們尿液所污染的環(huán)境而傳播給人。感染產(chǎn)生了各種類型的臨床表現(xiàn)。疾病的早期特征為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛和嚴(yán)重的肌痛。在臨床感染中有5-15％的病人病情發(fā)展至產(chǎn)生諸如黃疸、腎機能不全和出血現(xiàn)象等嚴(yán)重的多系統(tǒng)并發(fā)癥(1-4)。嚴(yán)重的鉤端螺旋體病死亡率為5-40％。
鉤端螺旋體病廣泛的分布于世界各地。由于大范圍的動物物種可作為其宿主，所以它被認(rèn)為是最普遍的人獸互傳疾病(1)。鉤端螺旋體病傳統(tǒng)上是發(fā)生在諸如軍人、農(nóng)夫、礦工、污水和垃圾清理工、獸醫(yī)和屠宰場工人等高危人群中的重要職業(yè)病(1-3)。不過，最近已出現(xiàn)了新的疾病傳播模式，突出顯示了鉤端螺旋體病正成為公共健康問題的嚴(yán)重性。在發(fā)達國家，鉤端螺旋體病已成為消遣性活動(1)和體育運動(1、4、5)相關(guān)性疾病發(fā)作的原因。在巴西和其它發(fā)展中國家，貧困狀況已造成了高死亡率鉤端螺旋體病在城市內(nèi)廣泛傳播(4、5)。
除了其對公眾健康的影響外，鉤端螺旋體病作為牲畜和家養(yǎng)動物中疾病的成因而成為主要的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)(2)。鉤端螺旋體病在牛、豬、綿羊、山羊、馬和狗等動物中造成了流產(chǎn)、死產(chǎn)、不育、不生長、奶產(chǎn)量降低和死亡，在牲畜中誘發(fā)了致病鉤端螺旋體的慢性感染和傳播(2)，并由于目前的國際和國內(nèi)檢疫規(guī)定而成為畜牧業(yè)經(jīng)濟損失的另一原因。
目前適當(dāng)診斷工具的缺乏阻礙了對人和動物鉤端螺旋體病的控制。標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)檢測、鏡檢凝集檢測(MAT)不適于急性病例的鑒別，因為它只能在少數(shù)鑒定實驗室中進行且需要做配對血清分析以達到足夠的靈敏度(1、2)。正如在多項研究中所見到的，對MAT的依賴導(dǎo)致耽誤了疾病發(fā)作起因的確定(1、2)。已發(fā)展了基于全細(xì)胞鉤端螺旋體抗原制品的酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)和其它快速血清學(xué)檢測法用作篩選鉤端螺旋體傳染病的可選方法，盡管仍需要進行MAT以確認(rèn)病例(1、2)。基于重組抗原的血清學(xué)檢測法被廣泛用于篩查萊姆病和梅毒等螺旋體傳染病，但對于利用重組蛋白質(zhì)進行鉤端螺旋體病的血清診斷還未有廣泛的研究。最近公開了一種用于牛鉤端螺旋體病血清診斷的重組鞭毛抗原免疫捕捉檢測法(6)。重組熱休克蛋白Hsp58顯示了與少數(shù)人類病例的血清樣品有高度ELISA反應(yīng)性(7)。不過，將重組抗原用于鉤端螺旋體病的血清診斷的應(yīng)用還未進行廣泛的研究加以確認(rèn)。
此外，目前尚未有可使用的有效干預(yù)方法可控制或預(yù)防鉤端螺旋體病。環(huán)境調(diào)控的方法難以執(zhí)行，因為致病鉤端螺旋體在土壤和水中長期存活，并且野生及家養(yǎng)動物宿主眾多(1、3)。研究方向集中于開發(fā)預(yù)防性的免疫接種法作為對鉤端螺旋體病的干預(yù)。目前可供利用的疫苗基于的是致病鉤端螺旋體的滅活全細(xì)胞或膜制品，顯示出通過誘導(dǎo)抗鉤端螺旋體脂多糖的抗體而引起了保護性的反應(yīng)(1、3)。不過，這些疫苗沒有誘發(fā)針對感染的長期防護。此外，它們沒有提供針對未包括在此疫苗制品中的鉤端螺旋體血清變型的交叉保護免疫性。致病血清變型的數(shù)目眾多(＞200)和生產(chǎn)多血清變型疫苗的成本已成為開發(fā)以全細(xì)胞或膜制品為基礎(chǔ)的有效疫苗這一策略的主要局限性。
如同在萊姆病和梅毒等螺旋體疾病中一樣，鉤端螺旋體病的發(fā)病機理依賴于感染早期病原體在宿主內(nèi)廣泛散布的能力(2)。膜相關(guān)性鉤端螺旋體蛋白質(zhì)被認(rèn)為介導(dǎo)了使其能穿過并散布于宿主組織間的相互作用。推測的表面相關(guān)毒力因子是可用作疫苗開發(fā)的候選分子，誘發(fā)對這些因子的反應(yīng)從而阻斷在宿主內(nèi)的散布。此外，膜相關(guān)蛋白質(zhì)在宿主感染期間可引發(fā)免疫反應(yīng)，因此構(gòu)成了通過抗體依賴型吞噬作用和補體介導(dǎo)型致死作用等機制而進行免疫保護的靶分子。以重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)這些抗原靶分子是開發(fā)亞單位疫苗用于鉤端螺旋體病保護性免疫接種的一種低廉方法。此外，選擇致病鉤端螺旋體中保守的表面相關(guān)靶分子可以避免目前獲得的全細(xì)胞疫苗制品中所遇到的局限性。
鉤端螺旋體病領(lǐng)域內(nèi)的一個主要局限性在于用常規(guī)生化和分子方法鑒定表面相關(guān)性和宿主表達的蛋白質(zhì)。從螺旋體布氏疏螺旋體的基因組序列中鑒別出了100種以上的表面相關(guān)脂蛋白。從基因組的大小和其生命周期的生物學(xué)推斷，預(yù)計鉤端螺旋體具有數(shù)目大得多的表面相關(guān)性靶分子。目前，通過膜提取物的分離、這些提取物中蛋白質(zhì)的純化和定性以及這些蛋白質(zhì)靶分子的分子克隆，僅鑒定出不到10種表面相關(guān)蛋白質(zhì)(8-14)(12)。用幾種已鑒定靶分子的重組蛋白質(zhì)LipL32、OmpL1和LipL41進行免疫接種，誘發(fā)了部分但不是完全的保護性反應(yīng)(11、12)。
為了對鉤端螺旋體蛋白質(zhì)的表達進行更全面的了解，我們利用人類鉤端螺旋體病中的體液免疫應(yīng)答作為感染期間表達的蛋白質(zhì)抗原的指示器。感染期間所表達的鉤端螺旋體抗原的確定對于開發(fā)新的血清診斷和免疫保護方法具有潛在的重要意義。來自鉤端螺旋體病患者的血清被用于鑒別來自鉤端螺旋體基因組DNA噬菌體文庫且表達免疫反應(yīng)性多肽的克隆。已發(fā)現(xiàn)這些克隆的一部分編碼一個新的膜相關(guān)鉤端螺旋體蛋白質(zhì)家族。這些多核苷酸和多肽的鑒定以及它們在診斷鉤端螺旋體病和誘發(fā)對致病螺旋體的免疫應(yīng)答中的應(yīng)用是本發(fā)明的基礎(chǔ)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鉤端螺旋體中的DNA分子以及它們所編碼的具有重復(fù)細(xì)菌Ig樣結(jié)構(gòu)域的多肽。本發(fā)明描述了對最初來源于L.krischneri和問號狀鉤端螺旋體的三種DNA分子的分離，這三種DNA分子分別編碼此處稱為“BigL1”、“BigL2”和“BigL3”的蛋白質(zhì)基于這些多肽的預(yù)計氨基酸序列，它們的分子量分別為110、205和205kDa。這三種蛋白質(zhì)具有12-13個約90個氨基酸長的串聯(lián)重復(fù)序列。來自BigL1、BigL2和BigL3的重復(fù)序列相互間高度相關(guān)(＞90％的氨基酸序列同一性)，且屬于細(xì)菌病原體毒力因子中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌Ig樣(Big)結(jié)構(gòu)域家族。
編碼具有Big結(jié)構(gòu)域、本文稱為“bigL1”、“bigL2”和“bigL3”的鉤端螺旋體蛋白質(zhì)的DNA分子可作為異源DNA插入用于生產(chǎn)肽和多肽的表達載體中。重組多肽可從用所說表達載體轉(zhuǎn)化的代用宿主內(nèi)純化。BigL1、BigL2和BigL3衍生多肽是活躍感染和感染后的血清學(xué)標(biāo)志，因為來自鉤端螺旋體病患者和用致病鉤端螺旋體感染或免疫的動物的血清識別分離的多肽。
而且，來自重組或天然抗原制品的BigL1、BigL2和BigL3多肽是有免疫原性的。從用純化的重組BigL1、BigL2和BigL3多肽所免疫的實驗動物中獲得的抗體識別來自鉤端螺旋體的天然抗原，可用于檢測疑似感染的受試者樣品中的致病螺旋菌。
此外，BigL1、BigL2和BigL3多肽會誘發(fā)抗致病螺旋菌的免疫反應(yīng)。BigL1、BigL2和BigL3衍生多肽、抗這些多肽的抗體和編碼BigL1、BigL2和BigL3的多核苷酸均可單獨或與藥用可接受載體聯(lián)合用于治療或預(yù)防鉤端螺旋體的感染。由于Big結(jié)構(gòu)域也存在于其它細(xì)菌病原體中與毒性相關(guān)的蛋白質(zhì)中，所以上述部分也可用于治療或預(yù)防與鉤端螺旋體所引發(fā)疾病無關(guān)的感染。
在第一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的DNA分子bigL1、bigL2和bigL3以及由這些DNA分子編碼或具有功能等同序列的多肽。此外，還提供了產(chǎn)生含有bigL1、bigL2和bigL3多核苷酸的表達載體和獲得來源于這些序列的基本上純化的多肽的方法。
本發(fā)明的第二個實施方案提供了用于在受試者中誘發(fā)針對致病螺旋菌的免疫反應(yīng)的藥物組合物，其中包括在藥用可接受賦形劑中、選自BigL1、BigL2、BigL3和具有功能等同序列的多肽中的一種或多種免疫有效量的抗原。
在第三個實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定結(jié)合BigL1、BigL2、BigL3多肽或含功能等同序列的多肽的化合物的方法，包括將含此化合物和BigL1、BigL2、BigL3多肽或具有功能等同序列的多肽在內(nèi)的組分一起保溫，保溫條件要求足以允許這些組分相互作用，并檢測所說的化合物與BigL1、BigL2、BigL3多肽或含功能等同序列的多肽的結(jié)合。優(yōu)選的，本發(fā)明方法是利用來自有鉤端螺旋體或其它相關(guān)細(xì)菌病原體活躍感染或感染后的受試者的血清進行血清診斷的方法。
第四個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中病原體的方法，包括將懷疑含致病螺旋菌的樣品與結(jié)合該病原體的特異性細(xì)胞組分的試劑接觸，并檢測所述試劑與所說組分的結(jié)合。在一方面，結(jié)合病原體特異性細(xì)胞組分的試劑是用于鑒定bigL1、bigL2和bigL3多核苷酸的寡核苷酸。在另一方面，結(jié)合病原體特異性細(xì)胞組分的試劑是抗BigL1、BigL2、BigL3多肽或其功能等同序列的多肽的抗體。
在第五個實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測BigL1、BigL2、BigL3多肽或其功能等同序列的多肽；bigL1、bigL2和bigL3多核苷酸；或與BigL1、BigL2、BigL3多肽或其功能等同序列的多肽結(jié)合的抗體的試劑盒。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢可以從以下詳述中顯而易見。不過，應(yīng)當(dāng)理解為，在簡述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時，詳述和具體實施例都只是說明的方式，因為對于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員來說顯而易見可以從此詳述中在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)對其進行各種改變和修飾。
附圖簡述

圖1A和B顯示了鉤端螺旋體中bigL基因序列Southern印跡分析結(jié)果。用NsiI消化來自問號狀鉤端螺旋體菌株Fiocruz L1-130(泳道1)、L.kirschneri菌株Rm52(泳道2)和L.biflexi菌株P(guān)atocI(泳道3)的基因組DNA(3mcg/泳道)并進行瓊脂糖凝膠電泳。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后，分別用編碼BigL重復(fù)結(jié)構(gòu)域(BigL3的第四至第六個重復(fù)結(jié)構(gòu)域，圖1A)的DNA片段和bigL1、bigL2和bigL3的C末端區(qū)域探測印跡(圖1B)，所說的C末端區(qū)對于這些基因各自來說是獨一無二的。
圖2顯示了編碼L.kirschneri中BigL1和BigL3蛋白質(zhì)的區(qū)域的基因組結(jié)構(gòu)示意圖。BigL1蛋白質(zhì)會包含一信號肽(陰影框)和13個90個氨基酸長的細(xì)菌免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(實心框)。BigL3蛋白質(zhì)包含一信號肽、12個90個氨基酸長的細(xì)菌免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和793個氨基酸的羧端(C-末端)結(jié)構(gòu)域。顯示了2156bp區(qū)域中有100％DNA序列同一性的位置。所述區(qū)域的構(gòu)成在問號狀鉤端螺旋體和L.kirschneri中是保守的。
圖3顯示了來自鉤端螺旋體5個致病種菌株的DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增。簡并引物是基于編碼相應(yīng)于第46-65位氨基酸的BigL3區(qū)域的L.kirschneri和問號狀鉤端螺旋體序列設(shè)計的。PCR反應(yīng)是用來自5種致病菌(L.kirschneri、博氏鉤端螺旋體(L.borg petersenii)、問號狀鉤端螺旋體(L.interrogans)、圣地羅斯鉤端螺旋體(L.santarosai)和野口氏鉤端螺旋體(L.noguchi))和兩種非致病菌(雙曲鉤端螺旋體(L.biflexi)和沃爾氏鉤端螺旋體(L.wolbachin))的純化DNA進行的。
圖4顯示了用bigL1、bigL2和bigL3特異性引物對L.kirschneri的RNA提取物進行RT-PCR的擴增產(chǎn)物。用培養(yǎng)鉤端螺旋體的RNA提取物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(泳道“+”)，然后用與bigL1、bigL2和bigL3中獨特序列結(jié)合的引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增步驟。用基于lipL45內(nèi)序列的引物進行擴增，作為對照反應(yīng)，同樣對未經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄步驟的樣品進行的PCR反應(yīng)作為對照。
圖5顯示了從感染了致病鉤端螺旋體的病人和動物宿主以及用全問號狀鉤端螺旋體抗原制品免疫的實驗室動物中收集的血清合并物對重組BigL3蛋白質(zhì)(rBigL3)的免疫印跡反應(yīng)性。用純化的rBigL3(1mcg/泳道，泳道3)進行蛋白質(zhì)印跡分析。用來自鉤端螺旋體病患者的血清(泳道A)、健康個體的血清(泳道B)、定居了問號狀鉤端螺旋體的被俘獲大鼠(泳道C)、未定居問號狀鉤端螺旋體的被俘獲大鼠(泳道D)、用體外培養(yǎng)問號狀鉤端螺旋體全抗原制品免疫的實驗室大鼠(泳道E)和免疫接種前收集的實驗室大鼠免疫前血清(泳道F)探測膜。對問號狀鉤端螺旋體全抗原制品(泳道1)和重組LipL32蛋白(rLipL32，泳道2)的反應(yīng)性均列出作為對照。左邊的數(shù)字顯示了參照分子量標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen)的位置和相對遷移率(kDa)。
圖6顯示了在鉤端螺旋體病急性發(fā)作階段(泳道A)和康復(fù)階段(泳道B)受試者病人對rBigL3的血清反應(yīng)性的ELISA測定結(jié)果。將來自4個鉤端螺旋體病患者(實線)和4個健康個體(虛線)、稀釋度為1∶50、1∶100和1∶200的血清與RBigL3(25-200ng/孔)一起保溫。分別用綴合了辣根過氧化物酶的Mu和γ鏈特異抗體測定IgM和IgG血清反應(yīng)性。圖中顯示了平均吸收值(OD450nm)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖7顯示了來自29個鉤端螺旋體病患者在病情急性發(fā)作階段(泳道2)和康復(fù)階段(泳道3)的血清以及28個健康個體的血清(泳道1)的rBigL3 IgM(A欄)和IgG(B欄)反應(yīng)性。用血清(1∶50稀釋度)和綴合了辣根過氧化物酶的Mu和γ鏈特異抗體測定反應(yīng)性。實心柱代表平均吸收值(OD450nm)。
圖8顯示了鉤端螺旋體病患者個體在病情急性發(fā)作(泳道6-9)和康復(fù)階段(泳道10-13)對rBigL3的免疫印跡反應(yīng)性。用純化的rBigL3(1mcg/泳道，泳道3)進行蛋白質(zhì)印跡分析。用1∶100稀釋的血清探測膜。用綴合了堿性磷酸酶的γ鏈特異抗體測定對于BigL3區(qū)域1(第2至第6個Big重復(fù)結(jié)構(gòu)域)的58kD重組蛋白的反應(yīng)性。測定對于rLipL32(1mcg/泳道)的反應(yīng)性作為對照。分別用Ponceau-S和考馬斯藍染色后顯示純化rBigL32和rLipL32(泳道14)以及分子量標(biāo)準(zhǔn)(泳道15)的遷移率。
圖9顯示了大鼠抗rBigL3抗血清對rBigL3和來自問號狀鉤端螺旋體裂解產(chǎn)物的天然抗原的免疫印跡反應(yīng)性。用純化的rBigL3(1mg/泳道；泳道3、5、7、9)和來自人工培養(yǎng)的鉤端螺旋體的全抗原制品(108個鉤端螺旋體/泳道；泳道2、4、6和8)進行免疫印跡。用從表達問號狀鉤端螺旋體bigL3克隆DNA片段的大腸桿菌中得到的rBigL3免疫大鼠后收集的合并血清(稀釋度1∶500[泳道4和5]、1∶100[泳道6和7]和1∶2500[泳道8和9])探測膜。免疫前血清是第一次免疫前獲得的，用于免疫印跡分析中作為對照(泳道2和3)。分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率(kDa)如圖左側(cè)所顯示。
圖10顯示了兔抗rBigL3抗血清對來自鉤端螺旋體菌株裂解產(chǎn)物的天然抗原的免疫印跡反應(yīng)性。用以下培養(yǎng)菌株的全抗原制品(108個鉤端螺旋體/泳道)進行免疫印跡測定泳道1，問號狀鉤端螺旋體波莫納血清變型(kennewicki型)菌株RM211，低傳代；泳道2，問號狀鉤端螺旋體犬血清變型菌株CDC Nic1808，低傳代；泳道3，問號狀鉤端螺旋體波莫納血清變型菌株P(guān)O-01，高傳代；泳道4，問號狀鉤端螺旋體布拉迪斯拉發(fā)血清變型菌株AS-05，高傳代；泳道5，L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株RM52，低傳代；泳道6，L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株P(guān)8827-2，低傳代；泳道7，L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株86-89，低傳代；泳道8，L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株Moskva V，高傳代；泳道9，L.kirschneri sv mozdok菌株5621，高傳代；泳道10，L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株RM52，高傳代。利用從用表達L.kircshneri bigL3克隆DNA片段的大腸桿菌所表達的rBigL3免疫的兔子得到的血清探測膜，用從重組L.kirschneri GroEL蛋白免疫的兔子得到的血清作為對照檢測樣品。相應(yīng)于BigL3和GroEL的天然抗原的位置和分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率(kDa)分別如圖左側(cè)和右側(cè)所示。
發(fā)明詳述為了方便理解，將說明書、實施例和附屬權(quán)利要求書中所用的某些術(shù)語和詞組的含義解釋如下。除非另外說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。
BigL-是具有串聯(lián)重復(fù)序列的鉤端螺旋體菌多肽，由于它們的序列同源性，每個所述重復(fù)序列都與細(xì)菌免疫球蛋白樣(Big)結(jié)構(gòu)域類似。Big結(jié)構(gòu)域存在于細(xì)菌蛋白質(zhì)中，并在諸如大腸桿菌、耶爾森氏菌屬(Yersinia)和博德特氏菌(Bordetella)等細(xì)菌病原體中表達，具有宿主細(xì)胞粘附等毒性功能。
參照序列-是通過從天然生物體中分離或通過遺傳工程獲得的新序列，具有準(zhǔn)確的生物學(xué)功能，所說的功能是本發(fā)明的特征。
功能等同序列-是與參照序列相關(guān)，并且由于變異性，即序列中所有的自發(fā)或誘發(fā)的修飾，包括核苷酸或氨基酸的取代和/或刪除和/或插入、和/或在某一端序列的延伸和/或縮短所得到的、但未導(dǎo)致參照序列的特征性功能發(fā)生改變的序列。功能等同序列包括其片段和類似物。換而言之，功能等同的序列是與參照序列“基本上相同”或“基本上同一”的序列，如與參照的氨基酸或核酸序列具有至少80％同源性的多肽或核酸序列。通常用進行序列分析的軟件系統(tǒng)(遺傳學(xué)計算機組序列分析軟件包，Wisconsin大學(xué)生物工程中心，1710，University Avenue，Madison，Wis，53705)測定同源性。
正如我們前文中所提及的，宿主感染期間表達的鉤端螺旋體抗原在診斷測試的靶目標(biāo)和疫苗的鑒定中是重要的。LipL32蛋白是這些靶目標(biāo)中的一個，它是通過自然感染期間的免疫體液反應(yīng)而鑒定為免疫顯性抗原的。不過，基于檢測鉤端螺旋體病急性發(fā)作階段患者血清中抗LipL32抗體的血清學(xué)測試的靈敏度是有限的(參閱，F(xiàn)lannery，B“用于鉤端螺旋體病血清診斷且以重組鉤端螺旋體抗原為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附檢測的評估(Evaluation of recombinant Leptospira antigen-basedEnzyme-linked Immunosorbent Assays for the serodiagnosis ofLeptospirosis)J.Clin.Microbiology 2001；39(9)3303-3310；WO9942478)。
本發(fā)明基于的是與螺旋體菌種屬、包括屬于鉤端螺旋體的那些種類相關(guān)的蛋白質(zhì)BigL家族的鑒定。
依照本發(fā)明，BigL蛋白質(zhì)家族被認(rèn)為是宿主體液免疫反應(yīng)的靶目標(biāo)，它是在致病鉤端螺旋體感染期間或用致病鉤端螺旋體或重組BigL多肽免疫期間產(chǎn)生的。BigL多肽和編碼這些多肽的多核苷酸可在診斷測試中用于鑒定包括人和動物宿主在內(nèi)的不同物種中天然存在的感染。與標(biāo)準(zhǔn)診斷測試或已發(fā)表的文獻中所用的方法相比，基于那些蛋白質(zhì)的診斷測試具有更高的靈敏度和特異性。在初始階段鑒定鉤端螺旋體病。此外，在用于免疫接種的藥物組合物中使用時，BigL多肽可以誘發(fā)免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明中，三種BigL多肽的分子量是128.4kD、201.3kD和200.4kD，這依據(jù)的是根據(jù)編碼這些多肽的分離多核苷酸bigL1、bigL2和bigL3所推斷的氨基酸序列。BigL多肽的氨基酸序列具有信號序列和基本上符合螺旋體脂盒(lipbox)的推斷的信號肽酶切割位點；因此BigL多肽是膜相關(guān)的脂蛋白。128.4kD、201.3kD和200.4kD的多肽分別被稱為“BigL1”、“BigL2”和“BigL3”。
盡管本發(fā)明的BigL多肽最初分離自鉤端螺旋體種屬，但它們并非只可用于誘發(fā)抗致病生物鉤端螺旋體的免疫反應(yīng)，而是還可以誘發(fā)抗其它螺旋體菌和具有含Big結(jié)構(gòu)域的因子的病原體的免疫反應(yīng)。此外，BigL多肽可用于診斷由鉤端螺旋體、其它致病螺旋菌和細(xì)菌病原體造成的感染。
結(jié)合了現(xiàn)有技術(shù)方法學(xué)的幾種方法可用于獲得編碼BigL多肽的多核苷酸序列。這些方法包括但不局限于用基因組文庫與探針的雜交探測同源核苷酸序列進行的DNA分離；篩選抗體表達文庫來檢測具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段；用能使目的DNA序列重組的起始子進行基因組DNA內(nèi)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；以及以計算機為基礎(chǔ)在序列數(shù)據(jù)庫中搜索與bigL多核苷酸相似的序列。
本發(fā)明中抗原的鑒定是以對培養(yǎng)期間(體外)和宿主感染期間(體內(nèi))鉤端螺旋體抗原差異表達的了解為基礎(chǔ)的。鉤端螺旋體抗原的差異表達被認(rèn)為在感染期間宿主適應(yīng)性的改變中是重要的。我們使用一種策略來鑒定免疫反應(yīng)性抗原以及相應(yīng)地在宿主感染期間表達的抗原。致病鉤端螺旋體感染患者的血清被用于從λ噬菌體內(nèi)的基因組鉤端螺旋體DNA文庫中選擇出編碼免疫反應(yīng)性多肽的多核苷酸序列。
本發(fā)明鑒定和分離了具有相應(yīng)于SEQ ID No1、SEQ ID No2和SEQID No3的核苷酸序列的三種多核苷酸，以及這些多核苷酸編碼的相應(yīng)多肽BigL1、BigL2和BigL3的氨基酸序列。
步驟1-陽性克隆的篩選主要由以下步驟組成(a)用適當(dāng)?shù)拿盖懈钪虏°^端螺旋體的DNA并連接入λ噬菌體基因組中的特異位點。用噬菌體感染宿主細(xì)菌，對產(chǎn)生的在IPTG誘導(dǎo)后表達重組多肽的克隆進行免疫印跡分析，其中將菌落溶解產(chǎn)物印跡膜與實驗室證實患鉤端螺旋體病的患者的血清一起保溫，然后與綴合了辣根過氧化物酶的、可識別人Ig的二抗保溫。通過指示劑反應(yīng)探測陽性克隆，即以顏色的產(chǎn)生為基礎(chǔ)檢測抗原-抗體復(fù)合物。
(b)用噬菌體載體特異序列作為測序反應(yīng)的起始物測定克隆并分離的多核苷酸的序列?？寺⌒蛄械姆治龊鸵锊叫胁呗缘膽?yīng)用鑒定出了編碼BigL1、BigL2和BigL3的基因的全部核苷酸序列。
(c)大部分獲得的陽性克隆包含編碼熱休克蛋白Hsp58和DanK以及外膜蛋白LipL41的基因，不過，根據(jù)與蛋白質(zhì)家族(Pfam)數(shù)據(jù)庫的比較，發(fā)現(xiàn)有編碼含90個氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)區(qū)的基因的克隆，所述重復(fù)區(qū)類似細(xì)菌型免疫球蛋白(Big)。通過克隆序列的分析，鑒定出三種基因，其中bigL1含12個串聯(lián)重復(fù)片段，而bigL2和bigL3中含13個串聯(lián)重復(fù)片段。
步驟2-蛋白質(zhì)的亞克隆表達和純化-根據(jù)兩種BigL蛋白質(zhì)序列確定兩條寡核苷酸-從那些寡核苷酸PCR擴增編碼重復(fù)區(qū)域部分的原始BigL部分-對擴增產(chǎn)物進行測序-對測序產(chǎn)物的編碼區(qū)進行亞克隆-重組蛋白質(zhì)的表達
-重組蛋白質(zhì)的純化免疫印跡分析證實了來自鉤端螺旋體病患者和致病鉤端螺旋體感染了的嚙齒動物宿主的血清產(chǎn)生主要針對BigL多肽BigL結(jié)構(gòu)域重復(fù)片段的抗體，表明它們是感染期間所識別的主要抗原區(qū)。
相對于本發(fā)明的多肽而言，它們包含DNA、cDNA或RNA序列(和其互補核酸序列)以及它們的功能等同序列，即，編碼完整或部分BigL1、BigL2和BigL3多肽、但由于變應(yīng)性而并非完全相同的那些序列。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸由BigL1、BigL2和BigL3以及編碼這些多肽的多核苷酸組成；不過它們還另外包括具有功能等同序列的多肽和多核苷酸。
在本發(fā)明中，多核苷酸和多肽都可以是天然、合成或重組來源的，且具有保證它們生物學(xué)活性所必需的純度。
本發(fā)明還涉及編碼BigL1、BigL2和BigL3的多核苷酸，它們用于PCR反應(yīng)中以獲得bigL多核苷酸的完整或部分?jǐn)U增DNA片段，其目的是為了檢測樣品中的鉤端螺旋體或表達重組BigL多肽。在將起始子用于本發(fā)明中多核苷酸擴增的情況下，它們是由兩個或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核酸制成的天然或合成的寡核苷酸。
優(yōu)選將各個起始子構(gòu)建成與待擴增靶序列鏈的側(cè)翼區(qū)基本上相似。在此意義上，如果相應(yīng)的聚合物對于所考慮應(yīng)用或用途來說能產(chǎn)生相同(并非完全一樣)的作用，則該起始子就可稱為其功能等同物。
本發(fā)明的多核苷酸序列還可插入諸如質(zhì)粒、病毒或用于重組克隆的其它載體等表達載體中，所說的載體通過插入或摻入編碼BigL1、BigL2和BigL3的完整或部分核苷酸序列或其功能等同序列而得以利用。這樣的表達載體含有方便載體所插入的宿主中由遺傳序列有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。所說的宿主可以包括原核或真核生物，包括酵母等微生物或昆蟲和哺乳動物。這些用于表達載體構(gòu)建和重組序列表達的方法，嚴(yán)格的說，是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)專家眾所周知的。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生與BigL1、BigL2和BigL3完整或部分多肽或其功能等同序列可結(jié)合的抗體的方法。這樣的抗體可在一般螺旋菌感染的有關(guān)研究和診斷中用作研究和診斷工具，更具體而言是用于開發(fā)鉤端螺旋體病的治療或預(yù)防性的診斷或治療方法。這些抗體可以單獨施用或作為藥物組合物的一部分施用，所說的藥物組合物利用這些抗體和制藥學(xué)上可接受的載體作為抗螺旋體療法的一部分。
本發(fā)明涉及利用BigL多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的藥物組合物作為疫苗，或者作為預(yù)防疾病的疫苗，用于誘發(fā)對于致病螺旋菌感染或集落化的免疫保護性反應(yīng)，或者作為提供有益效果的治療疫苗，用于縮短致病螺旋菌感染患者臨床病情發(fā)作的持續(xù)時間或嚴(yán)重性，或減弱諸如豬、牛、大鼠或狗等致病螺旋菌載體長期含有或排泄致病螺旋菌的宿主狀態(tài)。所說的組合物可以用賦形劑和添加劑或輔助劑中的免疫有效量的分別抗BigL1、BigL2和BigL3的抗體制備，或用分離自鉤端螺旋體病原體的BigL1、BigL2和BigL3中的一種或多種或重組BigL多肽或其功能等同序列制備。
本發(fā)明另一實施方案涉及用于在受試者中誘發(fā)對于致病螺旋菌，尤其是鉤端螺旋體的免疫反應(yīng)的藥物組合物，包括在藥用可接受載體中的免疫學(xué)有效量的BigL1、BigL2和BigL3或其功能等同序列。對于“受試者”一詞，我們是指任何哺乳動物，包括人、嚙齒動物、家養(yǎng)和實驗室動物和牲畜。對于“免疫學(xué)有效量”一詞，我們是指在受試者中誘發(fā)抗鉤端螺旋體或任何其它致病螺旋菌或細(xì)菌病原體所必需的BigL多肽抗原的量。本發(fā)明進一步提供了試劑盒，用于1.-檢測BigL1、BigL2和BigL3多肽或其功能等同序列之一；2.-檢測編碼BigL1、BigL2和BigL3或其功能等同序列的核酸；3.-檢測針對這些BigL1、BigL2和BigL3多肽或其功能等同序列的抗體。
用于檢測BigL多肽的試劑盒包括使用含有一個或多個接收器的載體的類型，其中第一接收器包含與BigL1、BigL2和BigL3或其功能等同序列連接的試劑。
用于檢測編碼BigL多肽的多核苷酸的試劑盒包括使用含有一個或多個接收器的載體的類型，其中第一接收器包含與編碼BigL1、BigL2和BigL3或其功能等同序列的核酸序列雜交的多核苷酸。
用于檢測抗BigL多肽的抗體的試劑盒包括使用含有一個或多個接收器的載體的類型，第一接收器包含BigL1、BigL2和BigL3多肽或其功能等同序列多肽。
現(xiàn)在將用實施例對本發(fā)明進行說明，它們不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
實施例1實施例1A細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基Leptospira kirschneri流感傷寒血清變型菌株RM52是1983年在豬流產(chǎn)發(fā)作期間分離的。問號狀鉤端螺旋體copenhageni血清變型菌株Fiocruz(L1-130)分離自人鉤端螺旋體病患者的血流。L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株RM52和其它鉤端螺旋體菌株獲自國家鉤端螺旋體病鑒定中心(國家動物疾病中心，農(nóng)業(yè)研究局，美國農(nóng)業(yè)部，Ames，Iowa)。鉤端螺旋體菌株在30℃培養(yǎng)于Johnson-Harris牛血清白蛋白-Tween80培養(yǎng)基(Bovuminar PLM-5微生物培養(yǎng)基，Intergen)(2)。將RM52分離物的低代數(shù)樣本或者保存于液氮中，或者在液體培養(yǎng)基中傳代至少200次以得到高代數(shù)形式的菌株。高代數(shù)菌株不管任何劑量都不能在倉鼠內(nèi)產(chǎn)生致命的感染，只能以107的劑量通過腹膜內(nèi)接種感染倉鼠。
大腸桿菌XL1-Blue MRF’#mcrA(183#mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacIqZ#M15 Tn10(Tetr)](Stratagene)和大腸桿菌PLK-F’(endA1 gyrA96 hsdR17lac-recA1 relA1 supE44 thi-1[F’lacIqZ#M15])被用作分別以λZapII(Stratagene)和λTriplEx(Clontech)載體感染的宿主細(xì)胞。大腸桿菌SOLR(e14-[mcrA]，#[mcrCB-hsdSMR-mrr]171 sbcC recB recJumuC∷Tn5[Kanr]uvrC lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 λr，[F’proABlacIqZ#M15]，Su-[非抑制性的]和大腸桿菌BM25.8(supE44 thi#lac-proAB[F’traD36 proAB+lacIqZ#M15]λimm434(Kanr)P1(camr)hsdR(rK12-mK12-))分別用于pBluescript和pTriplEx噬菌粒的體內(nèi)切割。BLR(DE3)pLysS[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm_(srl-recA)306∷Tn10(TcR)(DE3)pLysS(CmR)](Novagen)被用作pRSET表達載體(Invitrogen)的宿主菌株。將大腸桿菌菌株培養(yǎng)于補充了100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml羧芐青霉素或25μg/ml氯霉素的LB中，根據(jù)需要選擇合適的抗生素?？股刭徸許igma。
實施例1BbigL基因的分離和定性此實施例描述了bigL基因的鑒定和分離。用Yelton和Charon的方法(15)從毒性、低傳代L.kirschneri流感傷寒血清變型菌株RM52制備基因組DNA。用基因組DNA專用試劑盒(Qiagen)從問號狀鉤端螺旋體血清變型copenhageni菌株Fiocruz L1-130的臨床分離物中制備基因組DNA。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)獲取純化的DNA。用Tsp509I部分消化基因組DNA，并按照所提供的說明書(Clontech)連接入λTriplEx臂中。用Gigapack III Gold Packaging Extract(Stratagene)試劑盒將已消化并連接的基因組DNA包裝入λ噬菌體的頭部。通過感染大腸桿菌XL1-Blue測定文庫的噬菌體滴度。
為了篩選基因組文庫，將約103pfu滴度的噬菌體鋪于大腸桿菌XL1-Blue菌苔上，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Schleicher&Schuell)，用IPTG致敏并按文獻所推薦的方法處理(Schleicher&Schuell)。用配制于含0.05％Tween-20的Tris-緩沖鹽水(pH7.8)(TBST)或含0.05％Tween-20的磷酸緩沖鹽水(pH7.4)(PBST)中的5％脫脂奶封閉硝酸纖維素濾膜，與來自經(jīng)實驗室證實患鉤端螺旋體病的患者并1∶50稀釋的合并血清保溫1小時。自1996年和1999年之間巴西城市流行病中所鑒定的患者在康復(fù)階段收集血清，并在使用前與大腸桿菌溶解產(chǎn)物一起預(yù)吸附以去除抗大腸桿菌的抗體。用TBST或PBST洗膜三次，然后與綴合了堿性磷酸酶(Sigma)且1∶1000稀釋的兔或山羊抗人免疫球蛋白抗體保溫1小時以上。用NBT(0.3mg/ml)和BCIP(0.15mg/ml)檢測或用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑(Amersham)呈色并對Hyperfilm(Amersham)曝光，由此鑒定含抗原-抗體復(fù)合物的噬菌斑。
將各陽性噬菌斑于4℃保存于1ml SM(0.1M NaCl，8mM MgSO4，50mMTris-HCl pH7.5；0.01％明膠，加1-2滴氯仿)中。對與合并血清反應(yīng)的λ噬菌斑克隆再另外進行兩步純化。如供應(yīng)商(分別為Stratagene和Clontech)所述通過用λ克隆感染大腸桿菌SOLR或BM25.8菌株來切下插入λ噬菌體的基因組DNA片段。
用連接到插入片段相鄰區(qū)的載體特異引物獲得了插入片段的頭500-700個核苷酸序列。對于131個克隆的核苷酸序列分析鑒定出其中13個具有編碼約90個氨基酸長的串聯(lián)重復(fù)區(qū)的DNA插入片段。隨后在Pfam6.6(http//pfam.wustl.edu/)中鑒定出各重復(fù)序列屬于細(xì)菌免疫球蛋白樣(Big)結(jié)構(gòu)域的Big2家族。
為了鑒定符合預(yù)期氨基酸序列的全長蛋白質(zhì)的編碼序列，將通過引物步行法和嵌套缺失體測序的組合獲得的受試者序列裝配成克隆的核苷酸序列。通過去除從插入片段內(nèi)部延伸至插入片段側(cè)翼的多克隆位點內(nèi)的限制性片段，由質(zhì)?？寺〉玫饺笔w。寡核苷酸合成并獲自GIBCOBRL或Operon。進行反向PCR(iPCR)，以獲得含剩余基因和側(cè)翼DNA的序列。UCLA核心測序研究室、耶魯/Keck核心DNA測序研究室和加州大學(xué)伯克利分校測序研究室均進行此測序反應(yīng)。
已發(fā)現(xiàn)兩種L.kirschneri克隆和四種問號狀鉤端螺旋體克隆編碼我們稱為細(xì)菌免疫球蛋白樣鉤端螺旋體蛋白1即bigL1的基因。L.kirschneri bigL1的完整核苷酸序列和基因產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所示。發(fā)現(xiàn)6種L.kirschneri克隆編碼我們稱為bigL2的第二種基因。L.kirschneri bigL2的完整核苷酸序列如SEQ ID NO3中所示。L.kirschneri bigL2看來似乎是假基因，在第1011位核苷酸處有一個額外的腺嘌呤殘基，導(dǎo)致了移碼突變和下游的TAG終止密碼子。不過，用合并的病人血清進行抗體篩選能鑒定到含有編碼bigL2基因產(chǎn)物的DNA片段的λ克隆，大概是克隆片段沒有移碼突變并以允許表達可被病人血清識別的產(chǎn)物的方向插入所致沒有移碼突變的L.kirschneri bigL2基因產(chǎn)物的預(yù)計氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。發(fā)現(xiàn)第五個問號狀鉤端螺旋體克隆編碼最初被認(rèn)為屬于BigL1的幾個Big重復(fù)片段。不過發(fā)現(xiàn)此第五個問號狀鉤端螺旋體克隆的上游編碼DNA與bigL1的上游序列不同。對bigL1基因側(cè)翼區(qū)的測序顯示此第五個問號狀鉤端螺旋體克隆相應(yīng)于bigL1下游的第三種基因，被稱為bigL3(圖2)。自L.kirschneri DNA獲得bigL3的完整核苷酸序列并如SEQ ID NO5中所示。L.kirschneri bigL3基因產(chǎn)物的預(yù)計氨基酸序列如SEQ ID NO6中所示。
正如前文所述，所有三種bigL基因均編碼信號肽和基本上符合螺旋體脂盒(lipobox)的推定的信號肽酶切割位點(Haake，D.A.2000年，螺旋體的脂蛋白以及發(fā)病機理Spirochetal lipoproteins andpathogenesis。Microbiology。1461491-1504)。已知螺旋體脂蛋白的序列比較顯示對螺旋體脂盒的限制比大腸桿菌脂盒要寬松的多。例如，大部分大腸桿菌脂蛋白在相對于半胱氨酸的-3位置是亮氨酸，而螺旋體的脂蛋白在此位置卻還可以具有許多其它的疏水氨基酸，包括纈氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸。包括對半胱氨酸之后的氨基酸進行定位誘變的大腸桿菌實驗顯示酸性殘基引起了脂蛋白分類至細(xì)胞質(zhì)膜上。鉤端螺旋體脂蛋白的序列分析表明相似的分類信號存在于這些細(xì)菌中。例如，LipL31是唯一一種在半胱氨酸之后的頭兩個氨基酸中具有非對立性負(fù)電荷的脂蛋白，也是唯一一種被專門分揀至細(xì)胞質(zhì)膜的脂蛋白。象外膜脂蛋白LipL32和LipL41一樣，BigL蛋白在+2和+3位置具有不帶電荷的氨基酸，表明它們會被分揀至外膜上。
在它們的信號肽之后，所有三種蛋白質(zhì)都包含一系列約90個氨基酸長的串聯(lián)重復(fù)片段。成熟的BigL1蛋白質(zhì)幾乎完全由13個重復(fù)片段組成，而與之大不相同的是，BigL2和BigL3包含12個重復(fù)片段及隨后的大羧基端結(jié)構(gòu)域。盡管在三種蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的31種獨一無二的重復(fù)片段具有高度序列差異，所有這些重復(fù)片段都通過Pfam數(shù)據(jù)庫的比對被鑒定為細(xì)菌免疫球蛋白樣Big蛋白質(zhì)家族，其E-值低至4xe-30。
bigL1、bigL2和bigL3的問號狀鉤端螺旋體和L.kirschneri形式高度相關(guān)，DNA和氨基酸序列同一性大于90％。在兩個物種中都具有包括bigL1和bigL3 5’末端在內(nèi)的DNA序列同一區(qū)(圖2)。在兩種基因中，序列同一區(qū)都從ATG起始密碼子開始延伸至1890bp的位置。bigL1和bigL3之間大段的DNA序列同一區(qū)導(dǎo)致了BigL1(SEQ ID NO2)和BigL3(SEQ ID NO6)頭630個氨基酸(第1-630位)的氨基酸序列完全相同。此相同區(qū)域相應(yīng)于頭6個BigL結(jié)構(gòu)域重復(fù)片段。
實施例2實施例2AbigL基因的定性和bigL DNA和RNA的檢測此實施例描述了鉤端螺旋體屬各種中多拷貝bigL基因的分布和用于檢測樣品中bigL DNA和RNA的方法。
DNA印跡分析進行DNA印跡分析以鑒定問號狀鉤端螺旋體菌株Fiocruz L1-130、L.kirschneri菌株RM52和雙曲鉤端螺旋體菌株P(guān)atocI基因組DNA中的多拷貝bigL基因。DNA限制和修飾酶購自New England Biolabs。用血液和細(xì)胞培養(yǎng)物試劑盒(Qiagen，Valencia，Calif.)從培養(yǎng)7天的500ml鉤端螺旋體細(xì)胞培養(yǎng)物提取基因組DNA。用5-20個單位的NsiI消化約3mcg DNA過夜，終體積50mcl。然后用酚∶氯仿∶異戊醇純化DNA并用100％冷乙醇和3M乙酸鈉沉淀，用70％乙醇洗滌。然后用5-20個單位的PacI再消化經(jīng)純化的DNA過夜，終體積為25mcl。在0.8％瓊脂糖凝膠中20V分離雙消化的DNA過夜。然后將此膠在變性緩沖液(1.5M NaCl，0.5NNaOH)中保溫2次30分鐘，在中和緩沖液(1M Tris(pH7.4)1.5M NaCl)中保溫兩次30分鐘。按照Southern所述的方法將基因組DNA轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Ind.)上。
用PCR Dig探針合成試劑盒(Roche，Manheim，德國)合成探針。按制造商說明書在終體積50mcl中進行反應(yīng)。擴增的溫度循環(huán)是94℃5分鐘，94℃30秒、57℃30秒和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最終延伸時間為7分鐘。探針序列如下為了擴增編碼BigL重復(fù)結(jié)構(gòu)域的bigL DNA片段，選擇相應(yīng)于BigL3重復(fù)結(jié)構(gòu)域4-6編碼區(qū)的bigL3 DNA序列，BigL3_395gat-ttt-aaa-gtt-aca-caa-gc和BigL3_573aaa-ccg-gac-tac-tta-cct-ttc-c；而為了擴增特異于各bigL基因的bigL DNA片段，選擇編碼BigL基因產(chǎn)物C-末端區(qū)的序列BigL1.2078p，tta-cgg-cta-cag-gta-ttt-tta-cg和BigL1.2691p att-gga-aga-ttt-cca-agt-aac-c，BigL2.5121p tat-cta-cgc-tgc-aaa-tgg和BigL2.5865p ttg-ttg-gcg-ata-cgt-ccg，BigL3.5071p cat-aac-tct-cct-cat-aac-a和BigL3.5548p tat-gta-gag-ata-aga-tcc。
將UV交聯(lián)膜在Dig簡易雜交溶液(Roche)中42℃預(yù)雜交1小時。在雜交前，將Dig標(biāo)記探針煮沸10分鐘并迅速冰置5分鐘。將變性探針與雜交溶液混合并與膜一起在42℃保溫過夜。雜交后，在室溫用2×SSC(NaCl，檸檬酸鈉)、0.1％SDS洗膜兩次5分鐘。然后在42℃用0.1×SSC、0.1％SDS洗膜兩次30分鐘。將膜對Biomax ML膜(Eastman Kodak，Rochester，紐約)曝光1-3分鐘，以檢測化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物。
圖1A和B顯示了Southern印跡的結(jié)果。相應(yīng)于編碼BigL重復(fù)片段的DNA序列的探針與L.kirschneri和問號狀鉤端螺旋體中的多個DNA片段雜交(圖1A)。相反，用來自非致病雙曲鉤端螺旋體的經(jīng)消化基因組DNA則未鑒定到雜交。基于問號狀鉤端螺旋體各bigL基因產(chǎn)物特異C-末端區(qū)編碼序列的探針與已消化的問號狀鉤端螺旋體基因組DNA中的一個獨特片段雜交，因此證實了存在各一拷貝的實施例1中所鑒定的三種bigL基因(圖1B)。這些結(jié)果闡明了以檢測非致病鉤端螺旋體中未發(fā)現(xiàn)的DNA片段為基礎(chǔ)特異鑒定致病鉤端螺旋體的方法。
實施例2B鉤端螺旋體基因組DNA中bigL基因序列的PCR檢測此實施例說明了bigL基因在致病鉤端螺旋體中的分布。為了檢測在其它鉤端螺旋體屬種中的bigL基因，以實施例1中所鑒定的來自L.kirschneri菌株RM52和問號狀鉤端螺旋體菌株Fiocruz L1-130的bigL基因的序列對比為基礎(chǔ)設(shè)計簡并引物。被稱為BigL-1up的“上游”引物的序列是相應(yīng)于bigL1和bigL3(SEQ ID NO1和5)中相對于起始密碼子的A來說為第46-65位的5’-(GC)AAAGTTG(TC)(AG)(TC)G(TG)CTTGGCC-3’。被稱為BigL-2dn的“下游”引物的序列是相應(yīng)于bigL1和bigL3(SEQ ID NO1和5)中相對于起始密碼子的A來說為第506-487位的5’-(GC)(AT)ACC(AG)TC(CT)GAAAA(AG)AT(AT)CC-3’。各引物長為20個核苷酸。將這些引物設(shè)計成與bigL2中相對于bigL2起始密碼子的A來說為第97-116和590-571位的位點(SEQ ID NO3)退火。
用來自高傳代和低傳代鉤端螺旋體菌株的純基因組DNA進行PCR反應(yīng)。圖3中，經(jīng)PCR反應(yīng)鑒定了擴增的DNA片段，并對所有4種致病種屬菌株的基因組DNA進行了評估。片段具有基于bigL1/bigL3(461bp)和bigL2(494bp)序列預(yù)計的電泳遷移率。在被評估的兩種非致病鉤端螺旋體種中未鑒定到擴增的DNA片段。因此此實施例舉例說明了此PCR方法在特異性鑒定樣品內(nèi)來自致病鉤端螺旋體的DNA中的應(yīng)用。
實施例2C鉤端螺旋體bigL RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測法此實施例舉例說明了樣品中bigL RNA的檢測法。將L.kirschneri菌株RM52培養(yǎng)至晚指數(shù)生長期，用熱-酚方法從1×1010個鉤端螺旋體細(xì)胞中提取總RNA，酒精沉淀后重懸浮于水中(ref)。用6個單位的DNaseI(Ambion)在70μl DNaseI緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5，25mM MgCl2，1mM CaCl2，在來自Ambion的1×RNA保護液中)中37℃消化約2μg鉤端螺旋體RNA30分鐘。為了滅活DNaseI，加入25mM EDTA 1.75μl終止反應(yīng)，在70℃加熱5分鐘使酶熱失活。如說明書所述(Qiagen)用約200ng鉤端螺旋體RNA和Omniscript逆轉(zhuǎn)錄酶進行RT-PCR。以下引物用于引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)bigL1，5′-CGCAGAAATTTTAGAGGAACCTACAG-3′bigL2，5′-TTTGACTCCAAGACGCAGAGGATGAT-3′bigL3，5′-ATTTTCAAGATTTGTTCTCCAGATTT-3′；lipL45，5′-ATTACTTCTTGAACATCTGCTTGAT-3′.
lipL45，5’-ATTACTTCTTGAACATCTGCTTGAT-3’用Taq聚合酶(Qiagen)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的DNA PCR。在PCR前，將以下引物加入反應(yīng)液中
bigL1，5′-CTGCTACGCTTGTTGACATAGAAGTA-3′bigL2，5′-TAGAACCAACACGAAATGGCACAACA-3′bigL3，5′-ATCCGAAGTGGCATAACTCTCCTCAT-3′lipL45，5′-TGAAAAGAACATTACCAGCGTTGTA-3′.
根據(jù)為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)添加的引物，預(yù)期得到500bp、479bp、440bp和438bp的PCR產(chǎn)物。為了進行PCR，將反應(yīng)混合物放入Techne Progene熱循環(huán)儀中。起始變性步驟是95℃1分鐘，然后進行30個循環(huán)的反應(yīng)，每個循環(huán)為95℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒。最后在72℃再保溫30秒。
圖4中的結(jié)果顯示RT-PCR方法可檢測BigL3轉(zhuǎn)錄物和對照LipL46轉(zhuǎn)錄物。BigL1和BigL2轉(zhuǎn)錄物未能檢測到，這表明BigL3表達于鉤端螺旋體中，而BigL1和BigL2可能不在其中表達。此外，這些結(jié)果證明了RT-PCR方法在鑒定樣品內(nèi)特異BigL基因轉(zhuǎn)錄物中的應(yīng)用。
實施例3重組BigL蛋白質(zhì)的表達和純化此實施例舉例說明了bigL基因的DNA序列在表達和純化重組BigL多肽中的用途。設(shè)計兩對寡核苷酸用于表達問號狀鉤端螺旋體BigL3的兩個區(qū)域。第一個區(qū)域是BigL3內(nèi)相應(yīng)于第2至第6重復(fù)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，相當(dāng)于L.kirschneri BigL3 DNA序列中SEQ ID NO6第131-649位。基于實施例1所鑒定的λ問號狀鉤端螺旋體BigL3克隆的序列設(shè)計寡核苷酸，它們的序列是45B-1 5′-ATGGGACTCGAGATTACCGTTACACCAGCCATT-3′45B-2 5′-ATTCCATGGTTATCCTGGAGTGAGTGTATTTGT-3′用寡核苷酸45B-1和45B-2以及純化的問號狀鉤端螺旋體基因組DNA進行PCR擴增，獲得DNA片段。用XhoI和NcoI酶(New Biolabs)消化這些片段，然后連接入pRSETA表達載體(Invitrogen)(16)。用載體特異引物和引物步行法對克隆產(chǎn)物進行測序，1557bp長的產(chǎn)物序列如SEQ ID NO7中所示。所編碼的519個氨基酸長且被稱為BigL3區(qū)域1多肽的預(yù)計序列如SEQ ID NO8中所示。
選擇第二個用于表達的區(qū)域，其中包含問號狀鉤端螺旋體BigL3 C-末端區(qū)域最后的200個氨基酸。此區(qū)域相應(yīng)于L.kirschneri BigL3中SEQ ID NO6的第1687-1886位氨基酸。用于克隆此區(qū)域的寡核苷酸是BIGLCTERM1 5′aac-ctc-gag-cat-aac-tct-cct-cat-aac 3′BIGLCTERM2 5′ttc-gaa-ttc-tta-ttg-att-ctg-ttg-tct-g 3′用寡核苷酸BIGLCTERM1和BIGLCTERM2以及純化的問號狀鉤端螺旋體基因組DNA進行PCR擴增，獲得DNA片段。用XhoI和EcoRI酶(NewBiolabs)消化這些片段，然后連接入pRSETA表達載體(Invitrogen)(16)。用載體特異引物和引物步行法對克隆產(chǎn)物進行測序，600bp長的產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO9中所示。所編碼的200個氨基酸長且被稱為BigL3區(qū)域2多肽的預(yù)計序列如SEQ ID NO10中所示。
在BL21(DE3)pLysogen(Invitrogen)中表達重組蛋白質(zhì)rBigL區(qū)域1和2。將異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG；終濃度2mM，LifeTechnologies)加入用編碼鉤端螺旋體DNA片段的pRSET質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)培養(yǎng)物中，以表達His6-融合蛋白。用6M鹽酸胍溶解培養(yǎng)物沉淀并用Ni2+-次氮基三乙酸-瓊脂糖(Qiagen和Pharmacia)通過親和層析純化His6-融合蛋白。通過凝膠電泳并用考馬斯亮藍染色來評估洗脫的His6融合蛋白的純度。用PBS、10％(體積比)甘油、0.025％(重量/體積)疊氮化鈉透析蛋白質(zhì)。透析后，用bicinchoninic acid測定蛋白質(zhì)的濃度(42)。純化的BigL3區(qū)域1轉(zhuǎn)移后的Ponceau-S(Sigma Chem Co)-染色硝酸纖維素膜如圖7中所示。純化BigL3的相對遷移率與約58kD的預(yù)計分子量相似，所說的分子量是根據(jù)重組蛋白質(zhì)的預(yù)計氨基酸序列計算的。
實施例4實施例4A針對重組BigL蛋白質(zhì)的抗體的檢測此實施例舉例說明了用BigL多肽檢測受試者樣品中抗體的幾種方法中的兩種。此外，此實施例提供了用血清診斷試劑盒確定疑似感染的受試者中感染存在情況的方法。
在受感染測試者的樣品中免疫印跡檢測抗BigL多肽抗體如前所述(17)，將純化的重組BigL3區(qū)域2多肽(1mcg/泳道)(實施例3)在不連續(xù)緩沖體系中進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺12％凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Osmomics)上。用含5％脫脂奶的TBST封閉硝酸纖維素濾膜，并與以下類型的合并血清一起保溫1小時以上實驗室證實患鉤端螺旋體病的患者血清、其尿和腎培養(yǎng)物對致病鉤端螺旋體呈陽性且為鉤端螺旋體宿主的俘獲大鼠(Rattusnorvegicus)血清、和用問號狀鉤端螺旋體血清變型copenhageni菌株Fiocruz L1-130總裂解物免疫的實驗性實驗室大鼠和兔子血清。作為對照實驗，將封閉后的膜與以下來源的血清一起保溫健康巴西受試者、無培養(yǎng)物或血清學(xué)證據(jù)顯示存在鉤端螺旋體感染的俘獲大鼠以及免疫接種前的實驗室大鼠和兔子。臨用前將血清1∶100稀釋。漂洗后，將膜與綴合了堿性磷酸酶且1∶1000稀釋的山羊抗人γ鏈抗體(Sigma)一起保溫1小時以上。通過NBT(0.3mg/ml)和BCIP(0.15mg/ml)進行顏色反應(yīng)來檢測抗原-抗體復(fù)合物。來自鉤端螺旋體病患者和感染了致病鉤端螺旋體的俘獲大鼠的合并血清強烈地識別純化的重組BigL3區(qū)域1蛋白質(zhì)。不過，用完整鉤端螺旋體裂解物免疫的大鼠則沒有與BigL3多肽發(fā)生可觀察到的結(jié)合，表明盡管BigL3于人工培養(yǎng)的鉤端螺旋體中表達(實施例2，圖4)，但可能存在bigL3基因的差異表達。體外可能不存在足夠量的天然BigL3蛋白質(zhì)，而在天然感染期間，鉤端螺旋體在體內(nèi)產(chǎn)生了足夠量的BigL3，從而誘發(fā)強免疫反應(yīng)。此外，本實施例說明了一系列的動物在感染期間產(chǎn)生抗BigL3的免疫反應(yīng)，以及對此免疫反應(yīng)的檢測和對針對重組BigL3多肽的抗體的檢測可用作鑒定受試者中感染存在與否的方法。
為了進一步說明抗重組BigL3多肽抗體檢測方法的用途，用實驗室證實患有鉤端螺旋體病的患者、巴西和美國健康個體以及住院或門診診斷非鉤端螺旋體病患者的血清進行免疫印跡評估。用微量凝集試驗和培養(yǎng)物分離法證實臨床疑似患者中鉤端螺旋體病的診斷(5)。在巴西城市Salvador進行的5年鉤端螺旋體病監(jiān)測期間采集來自鉤端螺旋體病患者的血清。對照個體的血清采集獲自巴西Salvador住院和門診及健康個體的預(yù)存血清庫以及通過美國疾病控制和預(yù)防中心贈送。所用血清的清單如表1中所示。按上述方法分析1∶100稀釋的血清。在免疫印跡中發(fā)現(xiàn)1mcg重組BigL3區(qū)域1多肽的任何可見色帶都被認(rèn)為是陽性反應(yīng)。
圖8說明了來自受試鉤端螺旋體病患者的血清與重組BigL3反應(yīng)。表1總結(jié)了證明鉤端螺旋體病患者中90％以上的住院病人和約70％的門診病人在活躍感染期與rBigL3反應(yīng)的有關(guān)發(fā)現(xiàn)。所有的(100％)鉤端螺旋體病患者在其康復(fù)期都與rBigL3反應(yīng)。表2用標(biāo)準(zhǔn)診斷試驗比較了對rBigL3的血清反應(yīng)性。在疾病的始發(fā)階段，rBigL3血清反應(yīng)性比標(biāo)準(zhǔn)診斷試驗所觀察到的高。美國健康受試者和88％的巴西健康受試者不與rBigL3反應(yīng)，證明了此對于rBigL3的反應(yīng)是特異的。當(dāng)以健康巴西受試者中IgM血清反應(yīng)性的頻率為基礎(chǔ)進行計算時，反應(yīng)的特異性增加到了100％。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)說明，此方法可作為活性感染的血清學(xué)標(biāo)志，而且是可用于鉤端螺旋體病診斷的試劑盒的基礎(chǔ)。
表1還總結(jié)了在鉤端螺旋體病高危的地方性病區(qū)內(nèi)rBigL3血清反應(yīng)性的有關(guān)發(fā)現(xiàn)。居住于這些區(qū)域的人口中25％被證實為rBigL3 IgG血清陽性，表明此反應(yīng)可能是鑒定已過去的感染的有效標(biāo)志。在證實患鉤端螺旋體病的患者中，56％的病人在感染鉤端螺旋體病后的兩年期間仍呈現(xiàn)抗rBigL3的血清反應(yīng)性(表2)。在感染鉤端螺旋體病后2-4年期間，18％的病人被證實有rBigL3血清反應(yīng)性。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)說明基于免疫印跡法的試劑盒可檢測已過去的鉤端螺旋體病感染。
實施例4B已感染受試者樣品中抗BigL多肽抗體的基于ELISA的檢測本實施例說明了ELISA方法可用于檢測抗BigL多肽抗體以及確認(rèn)疑似感染人群中的鉤端螺旋體病患者。用懸浮于0.05M碳酸鈉，pH9.6中的His6-融合rBigL3在4℃包被平底聚苯乙烯微量滴定板(Corning)過夜，0.5-100ng/孔。用蒸餾水洗平板兩次，用PBS、0.05％(v/v)Tween20(PBST)洗3次。平板用封閉溶液(PBST/1％[重量/體積]牛血清白蛋白)室溫保溫2小時，用PBST漂洗4次后，-20℃保存待用。將孔與50-200倍稀釋于封閉液中的50μl血清室溫攪拌保溫1小時。用PBST洗4次后，將孔與綴合了辣根過氧化物酶且5000-20000倍稀釋的抗人μ或γ-鏈山羊抗體(Sigma)50μl室溫邊攪拌邊保溫1小時。然后，平板用PBST洗兩次，用PBS洗三次，并在室溫黑暗的條件下與底物緩沖液(0.03％[v/v]過氧化氫，25mM檸檬酸，50mM Na2HPO4，pH5.0)中的0.01％(重量/體積)3，3’，5，5’-N-四甲聯(lián)苯胺以50μl/孔一起保溫20分鐘。加入25μl 2N H2SO4終止顏色反應(yīng)并在Emax微量平板讀數(shù)儀(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)中測定在405nm波長的吸收值。
進行初始試驗，以確定能最好地區(qū)別來自實驗室證實患鉤端螺旋體病病例(n＝4)和來自巴西鉤端螺旋體病地方性病區(qū)健康受試者(n＝4)的血清樣品ELISA反應(yīng)的抗原濃度(mcgg/孔)。用50、100或200倍血清稀釋液和25、50、100和200ng/孔的抗原濃度進行棋盤滴定。圖6說明了與對照個體相比，對于鉤端螺旋體病患者來說在所有血清稀釋度和rBigL3多肽濃度都觀察到了顯著增高的吸收值。
在隨后確定靈敏度和特異性的檢測中，用50ng rBigL3包被平板。分別用50和10000倍稀釋的初始血清和二抗綴合物進行保溫。測試雙份平行試樣的受試者血清樣品，計算兩份測定的平均值供分析。對配對測定值之間的差異超過10％的樣品重新測定。在各平板上均包括與所有重組抗原均反應(yīng)的陽性對照血清樣品和陰性對照血清樣品，均為雙份，作為測定的質(zhì)量對照。圖7說明，與對照受試者相比，急性發(fā)作期的鉤端螺旋體病患者的IgM和IgG血清反應(yīng)性吸收值顯著增加(圖7)。在比較疾病康復(fù)期病人的吸收值時，這些差異有所增大。這些實驗說明用基于ELISA的方法檢測抗rBigL3多肽抗體對于鑒定鉤端螺旋體病的感染是有效的，可以用作診斷試劑盒。
實施例5在受試者中誘導(dǎo)抗鉤端螺旋體的免疫反應(yīng)本實施例闡明了可通過用重組BigL蛋白質(zhì)的免疫接種來誘發(fā)抗BigL蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。用實施例3中所述的方法獲得來源于問號狀鉤端螺旋體的純化重組BigL3多肽。用配制于弗氏佐劑(Sigma)中的40mcgrBigL3皮下接種免疫實驗室大鼠(Wistar株)。在第3周和第6周用20mcgrBigL3進行補充免疫。初次免疫后7周采集血液并處理成血清。按實施例4所述用rBigL3(1mcg/泳道)進行免疫印跡測定。圖9顯示了rBigL3-免疫大鼠的血清反應(yīng)性。rBigL3是一種有效免疫原，在共3次免疫后，可以高于1∶2500的滴度誘發(fā)免疫印跡rBigL3血清反應(yīng)性。此外，針對rBigL3多肽的抗體能識別完整鉤端螺旋體裂解物(108鉤端螺旋體/泳道)中的天然抗原(圖9)。在免疫印跡中相對遷移率為200kD處的帶呈弱染色，而較低相對遷移率處的帶則染色較強，可能代表了200kD或高分子量BigL蛋白質(zhì)的降解。針對這些天然抗原的血清反應(yīng)性是特異的，因為在免疫前血清中未觀察到有反應(yīng)。
用來自L.kirschneri的純化重組BigL多肽進行免疫原性實驗。將純化的重組蛋白質(zhì)加樣于制備型12％SDS-PAGE凝膠上，并通過電泳使其遷移進入分離膠。從膠上切下含100-200smcg重組蛋白質(zhì)的帶，干燥脫水，碾成粉末，溶于1ml水中，與1ml完全弗氏佐劑(Sigma)混合，皮下和肌肉內(nèi)注射接種無鉤端螺旋體抗體的新西蘭白兔(Harlan SpragueDawley)。此初次免疫后第4和第8周用粉末形式丙烯酰胺凝膠中相似量的融合蛋白混合不完全弗氏佐劑(Sigma)進行額外免疫接種。初次免疫后10周采集兔子的血液并處理成血清(Harlow，1988)。如前所述(Guerreito等，Infect Immun 2001年)用108個鉤端螺旋體/泳道的濃度進行免疫印跡測定。
圖10說明了用來自L.kirschneri的rBigL3免疫接種誘發(fā)了針對L.kirschneri和諸如問號狀鉤端螺旋體等其它致病鉤端螺旋體中天然BigL3多肽的高抗體滴度?？偠灾?，這些發(fā)現(xiàn)說明用rBigL多肽進行免疫接種誘發(fā)了除了針對用于設(shè)計此重組rBigL多肽的種類外的其它致病螺旋菌的免疫反應(yīng)。而且，此免疫接種方法產(chǎn)生的抗體可用于檢測樣品中的致病螺旋菌。
最后，本實施例證實了在有毒力的低傳代株系中觀察到天然BigL多肽的存在，而在無毒力的減毒高傳代株系中則未觀察到(圖10)。來自rBigL3-免疫兔子的血清可識別有毒力株系鉤端螺旋體完整裂解物中相當(dāng)于BigL3的預(yù)計200kDa的片段，而在無毒力的減毒株系中則沒有。此實施例說明BigL蛋白質(zhì)是毒性的標(biāo)志，且抗BigL蛋白質(zhì)的抗體可用于鑒定致病力強的株系。既然BigL本身可能是一毒性因子，如實施例中所證實的，誘發(fā)針對BigL蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)將可作為疫苗應(yīng)用。
表1.按蛋白質(zhì)印跡法進行的鉤端螺旋體病患者血清和對照組血清中抗rBigL和rLipL32的IgG和IgM抗體的檢測
表2.針對鉤端螺旋體病的以rBigL3和rLipL32為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)印跡測定與標(biāo)準(zhǔn)診斷測試的比較
α急性期血清樣品在得到醫(yī)院準(zhǔn)許的前提下采集。
對本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員來說顯而易見的是，可以對本發(fā)明的化合物和方法進行各種修飾和改變。所以，本發(fā)明意圖涵蓋這些修飾和改變，只要它們在本發(fā)明權(quán)利要求和其等同內(nèi)容的范圍內(nèi)。因而，本發(fā)明只受以下權(quán)利要求的限制。
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17.Guerreiro H、Croda J、Flannery B等人，Leptospiral proteinsrecognized during the humoral immune response to leptospirosisin humans即人體中針對鉤端螺旋體病的體液免疫應(yīng)答過程中識別的鉤端螺旋體蛋白質(zhì)，Infect Immun，2001，69(8)4958-68。
序列表1)一般信息I.a)申請人FIOCRUZ和KO，Albert I.；HAAKE，David A.；REIS，Mitermayer Galvao；MATSUNAGA，James；CRODA，Julio Henrique Rosa；SIQUNEIRA，Isadora Cristina；RILEY，Lee W.；BAROCCHI，Michele；YOUNG，Tracy Ann.
I.b)地址Centro de Pesquisas Goncalo MonizFundacao Oswaldo Cruz/MSRua Waldemar Falcao，121Salvador，Bahia 40295-001巴西II)發(fā)明名稱“鉤端螺旋體種中存在的具有重復(fù)性細(xì)菌Ig樣(Big)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族”III)序列數(shù)目10IV)計算機可讀形式IV.a)介質(zhì)類型軟盤IV.b)計算機IBM PC兼容機IV.c)操作相同PC-DOS/MS-DOS2)序列的一般信息I.a)序列編號SEQ ID NO1II)序列特征II.a)長度3672堿基對II.b)類型DNAII.c)鏈單鏈II.d)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)在基因組中的位置III.a)生物體Leptospira kirschneri
III.b)名稱/關(guān)鍵詞CDSIII.c)在圖譜中的位置(0)-(3672)ATGAAGAGAACATTTTGTATTTCGATTCTTCTTTCGATGTTTTTTCAAAGTTGTATGTCTTGGCCACTTTTAACCAGTCTCGCGGGTTTAGCAGCTGGTAAAAAAAGTAATGGGCTGCCCTTTTTCCACCTTCTATTAAGTAACTCTGATCCAGTTATTACAAGGATCGAGCTCAGTTATCAAAATTCTTCCATCGCAAAAGGTACAAGTACAACTCTCGAAGTCACCGCAATCTTTGATAACGGAACAAATCAGAATATTACGGATTCGACATCTATCGTTTCCGATGCCCAATCAATCGTTGACATTCAAGGTAACAGAGTCAGAGGAATCGCTTCTGGTTCTTCCATTATAAAAGCTGAATACAACGGGATGTATTCTGAACAAAAAATTACGGTTACACCAGCCACGATAAACTCAATTCAAGTTACGAGTTTAGATGACGGTATATTACCTAAAGGTACAAATCGTCAATTTGCTGCCATCGGTATCTTTTCGGATGGTTCTCATCAAGATATTTCCAACGATCCATTGATCGTTTGGTCTTCCAGTAATATAGATTTAGTTCGAGTAGATGATTCCGGTTTGGCCTCAGGTATCAATTTAGGAACGGCTCATATTCGTGCATCCTTTCAATCAAAACAAGCCTCCGAAGAGATAACTGTTGGTGACGCTGTTCTTTCTTCTATCCAAGTAACTTCCAACAGTCCAAATATTCCTCTCGGAAAAAAACAAAAACTCACAGCTACTGGAATTTATTCGGATAACTCTAACAGGGATATTTCCTCTTCTGTTATCTGGAATTCTTCTAATTCCACTATCGCTAATATTCAGAATAACGGAATATTAGAAACAGCTGATACTGGAATTGTTACTGTTTCTGCTTCTAGAGGTAATATAAATGGTTCCATAAAACTAATCGTCACTCCTGCTGCCTTAGTTTCTATTTCTGTTTCTCCTACAAATTCTGCAGTAGCAAAAGGTTTACAAGAAAACTTTAAAGCTACAGGGATCTtTACAGATAATTCGAACTCAGATATTACAGATCAAGTTACTTGGGATTCTTCTAATCCGGATATTCTTTCCATTTCCAATGCAAGTGATAGCCACGGGTTAGCTTCCACACTCAACCAAGGAAATGTTAAGGTCACCGCTTCCATCGGTGGAATACAAGGATCCACTGATTTTAAAGTTACACAAGAGGTATTAACTTCCATCGAAGTTTCTCCAGTTTTACCTTCAATTGCAAAAGGACTAACTCAGAAATTTACGGCGATCGGGATTTTTACGGATAACTCCAAAAAAGATATTACAAATCAAGTCACTTGGAATTCTTCTTCAGCAATCGCAAGCGTGTCTAACTTAGATGATAATAAAGGTCTGGGAAAAGCTCACGCTGTTGGAGACACGACTATTACCGCTACTTTAGGAAAAGTTTCAGGTAAAACTTGGTTTACTGtAGTTCCTGCGGTTCTCACTTCTATTCAAATCAATCCTGTAAATCCTTCTCTTGCAAAAGGGTTAACTCAAAAATTTACGGCTACTGGGATCTACTCTGACAACTCTAACAAGGACATTACTTCCTCCGTTACTTGGTTCTCATCCGATTCTTCAATCGCAACAATTTCAAACGCCAAAAAAAATCAAGGAAACTCTTACGGAGCAGCTACAGGAGCAACGGATATTAAAGCCACATTCGGAAAGGTAAGTAGTCCAGTTTCTACGTTATCCGTTACTGCTGCAAAACTTGTTGAAATACAAATCACACCGGCCGCTGCTTCCAAAGCAAAGGGAATTTCCGAAAGATTTAAAGCAACCGGTATTTTTACAGACAACTCTAATTCCGATATTACAAATCAGGTCACTTGGAGTTCATCTAATACAGATATTCTTACCGTTTCCAATACAAACGCCAAACGCGGGTTAGGTTCCACTTTAAAACAAGGAACTGTTAAAGTTATCGCTTCCATGGGTGGAATCGAAAGTTCTGTAGATTTTACCGTCACACAGGCTAATTTGACTTCGATCGAAGTCTCTCCAACTCGCTCTTCGATTGCAAAAGGACTAACTCAAAAATTTACCGCTATAGGTATTTTTACGGATCATTCTAAGAAGGATATTACAGAGCAAGTTACTTGGAAGTCTTCTTCGAAAGTATTAAATATGTTGAATGCATCCGGTGAAGAAGGAAGAGGTAAGGCAATTTCAGTCGGGAAAGCGACCATTACTGCAACCTTAGAAAAACTTTCCGGGAAAGCTGATATTACAGTTACTCCCGCGGTTCTTACTTCAATTCAAATCAGTCCTGTGAAACCTTCTCTTGTAAAAGGGTTAACAGAAAATTTTTCTGCTACAGGTATCTACTCTGATAATTCCAGCAAGGACATAACTTCCTCCGTTACATGGCATTCGTTCAACAACTCTGTTGCAACGATCTCGAACACGAAAAATTACCATGGACAAGCTCACGCAACCGGTACAGGGATAGTGGGTATTAAAGCGACATTGGGAAATGTAAGCAGCCCAGTTTCCAAATTATCCGTTACCGCAGCAGAACTGGTTGAGATTGTGTTAAATCCTACTTTATCTCACAAGGCCAAGGGACTTACTGAAAATTTTAAAGCGACCGGCGTATTTACGGACAATTCGACAAAAGATATTACCGACCAGGTTACTTGGAAATCTTCCAATACTGCCTACGCAGAAATTTCAAACGCAACTGGAAGTAAAGGGGTTGTTAATGCACTCTCGAAGGGAACGAGTCACATTTCCGCTACCTTAGGTTCAATTTCAAGTGCAAATGCGACATTCCAAGTTACTCCAGCAAAAATAGCTTCGATCGAAATAACACCAAATAATTTCTTCTTGATCAAAAAACTTAGTTATCCATTTAAAGCAATTGGAATCTATACGGATAATACAAAGACACACATTACAAAACAAGTTTCCTGGTCTTCCTCTGATCCGAATGTTGCA
TCGATCGATAACACATTTTCATTGGCTGGCTCAGCTACCGCAATCGATGATGGAAAAACGAACATCACTGCAACGTTATCCGACTCTATGTCCGCTTCCACTACTTTGTATGTCACTTCTGCTACGCTTGTTGACATAGAAGTAAAACCTAGTATCTTCGTTCTGAGTGAAGGTCTTACACTACAACTGACCGCTACCGGCATCTATTCGGATTACTCTACCTATGATTTGACTCAGGTTGTAACGTGGACTTCCAGCGAACCATCCAACATTTCGATCGAAAATACAGCCGGTAAAAAAGGTAAAGTAACGGCTCTTGCATTTGGAGCTTCAGAATTTACGGCAACCTACGATTCTATTGAAAGTAATCGAGCTTGGATATTTGTCAATGACGAGAAATTTGTAAACATAACCATTAGTTCTTCTCAAGTTTTGACAGACAAGGGCTTGACTCAACAATTCAAAGCAATCGGAACTTTCGAAAAAGGTAGCGAACTTGACCTTACGGATCTTGTAACCTGGAAGTCCTCTGATTCTAAGGTAGCTTCTATCGGTAACTCTAATGATGACAGAGGTTTAATAACACCGCTTTCTGTAGGTTCCTCTAAAATTTCTGCGACTTACAATTCTATCCATAGTAACTCTATTGATTTTGAAGTAACTCCAGAAATATTAGCCTCTATTAAAACGAAGCCGI.b)序列編號SEQ ID NO2II)序列特征II.a)長度1224II.b)類型氨基酸II.c)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)類型肽IV)來源N-末端至C-末端部分MKRTFCISILLSMFFQSCMSWPLLTSLAGLAAGKKSNGLPFFHLLLSNSDPVITRIELSYQNSSIAKGTSTTLEVTAIFDNGTNQNITDSTSIVSDAQSIVDIQGNRVRGIASGSSIIKAEYNGMYSEQKITVTPATINSIQVTSLDDGILPKGTNRQFAAIGIFSDGSHQDISNDPLIVWSSSNIDLVRVDDSGLASGINLGTAHIRASFQSKQASEEITVGDAVLSSIQVTSNSPNIPLGKKQKLTATGIYSDNSNRDISSSVIWNSSNSTIANIQNNGILETADTGIVTVSASRGNINGSIKLIVTPAALVSISVSPTNSAVAKGLQENFKATGIFTDNSNSDITDQVTWDSSNPDILSISNASDSHGLASTLNQGNVKVTASIGGIQGSTDFKVTQEVLTSIEVSPVLPSIAKGLTQKFTAIGIFTDNSKKDITNQVTWNSSSAIASVSNLDDNKGLGKAHAVGDTTITATLGKVSGKTWFTVVPAVLTSIQINPVNPSLAKGLTQKFTATGIYSDNSNKDITSSVTWFSSDSSIATISNAKKNQGNSYGAATGATDIKATFGKVSSPVSTLSVTAAKLVEIQITPAAASKAKGISERFKATGIFTDNSNSDITNQVTWSSSNTDILTVSNTNAKRGLGSTLKQGTVKVIASMGGIESSVDFTVTQANLTSIEVSPTRSSIAKGLTQKFTAIGIFTDHSKKDITEQVTWKSSSKVLNMLNASGEEGRGKAISVGKATITATLEKLSGKADITVTPAVLTSIQISPVKPSLVKGLTENFSATGIYSDNSSKDITSSVTWHSFNNSVATISNTKNYHGQAHATGTGIVGIKATLGNVSSPVSKLSVTAAWLVEIVLNPTLSHKAKGLTENFKATGVFTDNSTKDITDQVTWKSSNTAYAEISNATGSKGVVNALSKGTSHISATLGSISSANATFQVTPAKIASIEITPNNFFLIKKLSYPFKAIGIYTDNTKTDITKQVSWSSSDPNVASIDNTFSLAGSATAIDDGKTNITATLSDSMSASTTLYVTSATLVDIEVKPSIFVLSEGLTLQLTATGIYSDYSTYDLTQVVTWTSSEPSNISIENTAGKKGKVTALAFGASEFTATYDSIESNRAWIFVNDEKFVNITISSSQVLTDKGLTQQFKAIGTFEKGSELDLTDLVTWKSSDSKVASIGNSNDDRGLITPLSVGSSKISATYNSIHSNSIDFEVTPEILASIKTKPI.c)序列編號SEQ ID NO3II)序列特征II.a)長度5863個堿基對II.b)類型核酸II.c)鏈單鏈II.d)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
III)在基因組中的位置III.a)生物體Leptospira kirschneriIII.b)名稱/關(guān)鍵詞CDSIII.c)在圖譜中的位置(0)-(5863)ATGCCTAAACATATCAACAAACTCAGAGATAAAAAAACGTGGCCTTTTCTTCAGTTTATTTTTATTCTTTTTCTAACATTCAGCCTATTTTTTTTGGAAAGTTGCGCGGCTTGGCCAATTTTTTCAGGCACACCTGGTTTATTAGCAGGTAAAAAAAGCGGAGCAAACAATTCACTTTGGATGCTTTTTTTAGGAATAGATAATCCGCTCGAATCGGAGCCATCCGAAGCAGAGTTAGATCGGATCGAAATTTCCGTACCGAACTCAAATTTAGCTCGAGGTACTACTTTACATCTAAACGCCACAGCCATCTATAAAGACAATACTCACCGAGATATTTCTTCGGAAGGATCCTGGTCCTCTACGGATTCGAGCATTCTCAAGCTATTAACACAATCTCAATTCAAAGGAATGAATCTAGGTTCTGGAAACGTTAATGTATCCTTTCAAGGAAAAAACGCAACTACAACGTTAACCGTTACATCCGCTGTTTTGTCCGATCTGACCGTAACTTGTGTGAACCAAGGTAGTCCATTACCTGTTGGAATCGATCGTCAATGTAAATTAGAAGGAATTTTTTCGGACGGTAGTACTCAGGTTTTAACTTCCGATCCAAGCGCGTCCTGGAACGTAACCCAATCTTCTATTGCAGGTGTAAACACCACAGGTTTAGTTTCCGGACTTTCTCCAGGTAACACTTTTATTACCACTTCTTATGGAAGTAAAACCTCCAGTTTGAATGTGACCGTAAGTGCGGCAACCCTTAGCTCGATCTCAGTGACTCCTGCCAACTCAAGTTATCCTCTTGGCAAGGTCCAACAGTACACAGCAATCGGAACCTACAGCAATCAGTCCACTCAAGATTTAACAAATCAGGTTTCCTGGGCTTCTTTAAATACTTCCGTTGCTACGATCGATAATTCTACATCCGCCAAAGGTATGCTTACTACTCAATCAACCGGTTCAGCAAACATCACGGCAACGTTAGGCGGAATTACCGGACAGACTACTAGTAAACGTCACTTCCGCAGTTCTTACTAGTATTACGATCACTCCTGCAAATCCAAGCGTAGCCAATGGAAGGACATTATATCTTACCGCCACCGGAGTTTTTTCGGATGGTACAGTTTCCGACATTACCAACCAAGTAACTTGGTCCAGTTCCTTAACAAGTGTAGCTACCGCAGATAACTCAGGCGGTTTATCCGGAAGAATTTCCGGAGTCGGAGTTGGTAGTACGAATATCACCGCCGCCATCGGTGGAGTAGATATTACGGTTTCTTTAAATGTTACCAACGCCACTTTAGAATCGATTCAAGTGGTTTCCGATTCCCATTCGATAGCTCGAGGTACGTCTACGTTTGTACAAGCGATAGGAGTCTACTCGGACGGTTCTTCTCAAAACATAAGTGATCAAGTTGCCTGGAACAGCTCTAATTCTTCAATATTACAAATATCTAATTTAAATGCAGTTCCCAAAAGAGAAATACAATCTCCTTCTTCCGGAGGCCTAGGTACAGCAAGGATCACCGCAACTTTAGAAGCAaTCTCCTCATATACCGACATCTCGGTCAATGCAGCAACTTTAGTTTCTATCGAAGTGTCACCCACAAATCCTTCGGTATCTTCAGGACTTACCGTTCCTTTTACGGCGACCGGaGTTTATACGGATGGAAGTAATCAAAATCTGACTTCTCAAGTAACTTGGAATTCCTCCAACACGAACAGAGCTACAATCAGCAACGCAAACGGAACTCAAGGAATTGCCTTGGGCTCTTCTGTCGGAACTACGAACATATCaGCAACGTTAGGTGCGGTTACTTCTTCCGCTACCACTCTTACGGTCACAAACGCGGTTTTAAATTCGATCACGATTACTCCGTCTCTTCCTTCCGTAGCAGTAGGAAGAAGTCTGAACCTTACTGCAACCGGAACTTATTCTGACGGAAGTAACCAAGATTTAACTACCTCCGTCGCTTGGACGAGTACGGATTCTTCCATCGTTTCCGTAGACAACGCCTCAGGTAGACAGGGGCAGACGACAGGTGTTGCACAAGGTAACACTCAGATCAGTGCCACATTAGGCGGAACTTCTTCTGCTATCAATTTTACGGTAAGTGCAGCGGTTTTAGATTCAATTCAAGTAACTCTGGAAGATTCTCCGATTGCAAAAGGAACTTCTACAAGAGCAATCGCGACGGGTGTTTTTTCAGACGGAAGCAATTTGAATATTAGTGATCAAGTTATTTGGGATAGTTCACAAACAAACGTGATCCAGCTAGGAGTTTTAGAAACCGGTCCTAAAAAGAAACTGATGAATTCTCCCGCAAATGGAAACAGTACCACTGGAACCTCAAGGATCACTGCAACGTTAGGAGGTGTGAGCGGATACGCCGATCTTACAGTAATCGCTCCAAGTTTAACCAGCATTCAAATCGATCCTACACATCCGAGCGTTGCCAACGGTCTGACTCAAAATTTTACTGCAACCGGAGTTTACTCAGATGGTAGCAATCAGAATCTAACCGATTCCGTTACTTGGGCGTCTTCCAATCCTGCTGTTGCCACGATCAGCAACGCTTCCGGAACCAACGGTAAAGCTACTACTCTTCAAACTGGATCCACCAATATCAGCGCGAGTCTGGGCGCCACTACTTCTGATCCAAGTGTATTAACGGTTACAAACGCAACCTTAACAAGTATCACGATCGCTCCCACCTCTTCCTTCAACATCGCAAAAGGATTAAATCAAGACTTTGTAGCGACCGGTTATTATACAGATGGTTCTTCTAGAGACCTGACCACTCAAGTCACTTGGAATTCTTCCAATACTTCTACCGCTACGATCAGCAATGCAAACGGAACTCAAGGAAGAATGGCCGCGGTCGATACTGGTTCTACAAATATCTCCGCGTCTTTAGGAGGAACGTATAGTCAGACCACAAACGTAACCGTTACATCTGCGGTTCTGAATTCGATCCAGGTTTCTCCAGCGGACATTAGTGTAGCCAAAGGAAACACCAAGGCCTACACCGCGATCGGAGTATATTCAGATTTTAGCACGTTAGACGTTACTTCTCAGGTTACCTGGACTTCTTCCAGCGTTTCGATCGCTACGATCAGCAATGCAAGCGGACACGAAGGTTTAGCTACGGCTGTAGGCACGGGAACTTCCACAATTACCGCAACTCTTGGAGGAATTTCTAATTCTACGAGTTTGACGGTTACGGCCGCCGTATTGGTTTCTCTTTCGGTAGGTCCTACCAATAGTTTTGTTTATATGACACAAACCAAAAATTTTATGGCTACTGGAACGTATTCTGACGGAACGATGCAGGATCTTACAACTCAAGTCACCTGGACTTCTTCCGATACAACCTTGGGAACAATCAGCAACGCCTTCGGAATAGAAGGTAGGGCTACAGGAATTGCTGCCGGTGCCATAACGATCACTGCGACTTTGGGAAGTATCAGCGGAAACACTTCTTTGACTATAATCTTTTTAGATACGATAGCACCTGCGATCACAAACGTAGTCGCCTTAACTCCTACTACTTTAAGAATTACATATTCCGAAAACGTAAACGAAACCCAGGCAAAAACCGCGGCCAATTACAAACTGGCTCTTACTTCTTCCGTAACCGGAAGTTGTTCAGATAACAGCAACTTTACTTCTACCTCTTCTGTGATTACTGTTTCCTCAGTGAGTGGAAGCGGATCTGTGTTTGTTCTAACTCTAGGTTCTTCACAAACGTCTAACGCACCTTATACGATTTTAGTGAATAAATCGGGAATACAAGATCTTTCTACAACCCCAAACAATTTGGGTTGTGCAAACTACGGAGACTTCTTAGGACAGGAACAAATCAAAATCGTATCCGCCTCCTGTGCAAATTCCAATTCCGTGATTTTGAATTTCTCTAAGGCTCCTAAATCTGGAAACAATGTCGCCGGTTCCGCAGAATGTACCGGTTCTGCAGAATGTTCTAATCGTTACAAAATTTCCGGAGCAAGCGATCTTGGAACAATTAACAGCGTAAAGGTGTTAGATGGAATTATTTGTAACGGAGCAACTGCAGATTCCGCAAAAGTATGCGTAATTCATAATTTAGTACAAACCGGAGCACAATATACAATCATCACTGCGGATTCCGTAGACGGAGACGGATTTGACAACTCAAGCTGGGGATCAATCCGAAATTCTTTGGATACAGAGAATCTTCAATCTTCTCCCAGAGACAGGGCTTCCTTTTTAGGATGTGGAACGTCTCCGGTCAACTTTGCAGACGGACCGATTTCCATCGATCCAAACTCATCCACGTTCGGTTATCTAATCGATTTTAACTCTAAGATCTATTCAGGACCAAACAATTCCGGGAACGGAGCGCTTCGATTTGCCTATGATGGAAGTGTTCCAGAATCAGTTCAATTCTCCTTTGAAAAAGACACAACCGTTCAAGACGGTGACGCGACTAACGTAAGTTCAAACTCAGCTTCTTCCAGAGAGAATTCGATCTCGGTTCCGCCTTACGTTACATTAGGACACTCCGGATGTACTACAAACAACGGAACTCTTTCTCTAGGATGTGGTCCGGATAACGAAAACGGAAGAGGAGTATTCGCTACTGGAATTCTTTCCAGCGTCTCCTATCTATTTGTTGCAGCTGCAAAAACCGTAGCGGACGGCCTGGGaCAATACTTATTTGATTATCTGTATTAC
TCCGCAGACACTTCTACTAATACAAGTTTCAAATATATAGATCTAGGATCGATCACCGGAACTTTAACCGCCGGAACTTCTTCGCTTACTGTACTCAATAATAGAGTGTTTGCAGGTTTTGCAAAGTCAAGCAACGACGGAATCGGATTGTTCGGAGGACTTAATGCACCCGATTTTGGATTTGTAACGTTTAACTCAGCGGACTCAGGAACTGGATTTTGTACTCCAGGCTCCAACTGCGACGCGTTTGACGGAACCAAAGGAAAAAGAATCCGGATCGATTTCCTTCCTTACTTCGGAGGACCGTCCACCGGTTTATTAGGAATTAATAATAATGCACATCCAAACTGGGCGTATTATATCGGAGTCGATTCCATGTTCGTATTTAAAAATCGTATCTATGCCGCAAACGGAGGATTACACGCGGTAGGACATAACGGTTCCATAATACGTTCTACAACTGCAGATCCAACCGCGGCTTGTACCGGACCGGACTCTTGTTCTAACTGGGTGGAAATTGGACCTAGAACCAACACGAAATGGCACAACAGTCCCACAAACAACTGGTTCTCTTTAGAGTTAAATCAATTTTACAATCTGATTCCGGGAGATAAGGCGTTTGCACAATTTGCCGAGTTCAACAATAACCTTTATGTAACTAGAACCATTTGTATTCAAAGTTCTCAAGCGACTGGAATCAGAACCAATCCAGGAACCGTAACAGGATGTACAGACGGAACAACTACAAATCGAAGGGCACAACTTTGGAAATGTGATCCTACAATTTCAGGAAACACGAGCGAATGTGATGCAGCGGATTGGTCGGTCGTAGGCGACGACGGAACCGGAATCACAAACATGGGAGATTCTACAAACCGAACGATCACCATGGTGATGAAAAACGGATCCTATCTTTACATAGGATATGATAATCCAAACGGAATCAGAATTTATAGAACCAACGTAGCCAACCCGGGATCATCCTCTGCGTCTTGGAGTCAAATCGCCGGGAACGGTCTCACAGATGCGACTAACGTTCAACAAATTTACTCGGCCGTATCCGTACCTTCCGGAAGTATCAATTATATCTACGTAAGCGCTGGAAAAAGTAACGTTTCTGTTCGGACGTATCGTCAACAAAATI.d)序列編號SEQ ID NO4II)序列特征II.a)長度1954II.b)類型氨基酸II.c)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)類型肽IV)來源N-末端至C-末端部分MPKHINKLRDKKTWPFLQFIFILFLTFSLFFLESCAAWPIFSGTPGLLAGKKSGANNSLWMLFLGIDNPLESEPSEAELDRIEISVPNSNLARGTTLHLNATAIYKDNTHRDISSEGSWSSTDSSILKLLTQSQFKGMNLGSGNVNVSFQGKNATTTLTVTSAVLSDLTVTCVNQGSPLPVGIDRQCKLEGIFSDGSTQVLTSDPSASWNVTQSSIAGVNTTGLVSGLSPGNTFITTSYGSKTSSLNVTVSAATLSSISVTPANSSYPLGKVQQYTAIGTYSNQSTQDLTNQVSWASLNTSVATIDNSTSAKGMLTTQSTGSANITATLGGITGQTTVNVTSAVLTSITITPANPSVANGRTLYLTATGVFSDGTVSDITNQVTWSSSLTSVATADNSGGLSGRISGVGVGSTNITAAIGGVDITVSLNVTNATLESIQVVSDSHSIARGTSTFVQAIGVYSDGSSQNISDQVAWNSSNSSILQISNLNAVPKREIQSPSSGGLGTARITATLEAISSYTDISVNAATLVSIEVSPTNPSVSSGLTVPFTATGVYTDGSNQNLTSQVTWNSSNTNRATISNANGTQGIALGSSVGTTNISATLGAVTSSATTLTVTNAVLNSITITPSLPSVAVGRSLNLTATGTYSDGSNQDLTTSVAWTSTDSSIVSVDNASGRQGQTTGVAQGNTQISATLGGTSSAINFTVSAAVLDSIQVTLEDSPIAKGTSTRAIATGVFSDGSNLNISDQVIWDSSQTNVIQLGVLETGPKKKLMNSPANGNSTTGTSRITATLGGVSGYADLTVIAPSLTSIQIDPTHPSVANGLTQNFTATGVYSDGSNQNLTDSVTWASSNPAVATISNASGTNGKATTLQTGSTNISASLGATTSDPSVLTVTNATLTSITIAPTSSFNIAKGLNQDFVATGYYTDGSSRDLTTQVTWNSSNTSTATISNANGTQGRMAAVDTGSTNISASLGGTYSQTTNVTVTSAVLNSIQVSPADISVAKGNTKAYTAIGVYSDFSTLDVTSQVTWTSSSVSIATISNASGHEGLATAVGTGTSTITATLGGISNSTSLTVTAAVLVSLSVGPTNSFVYMTQTKNFMATGTYSDGTMQDLTTQVTWTSSDTTLGTISNAFGIEGRATGIAAGAITITATLGSISGNTSLTIIFLDTIAPAITNVVALTPTTLRITYSENVNETQAKTAANYKLALTSSVTGSCSDNSNFTSTSSVITVSSVSGSGSVFVLTLGSSQTSNAPYTILVNKSGIQDLSTTPNNLGCANYGDFLGQEQIKIVSASCANSNSVILNFSKAPKSGNNVAGSAECTGSAECSNRYKISGASDLGTINSVKVLDGIICNGATADSAKVCVIHNLVQTGAQYTIITADSVDGDGFDNSSWGSIRNSLDTENLQSSPRDRASFLGCGTSPVNFADGPISIDPNSSTFGYLIDFNSKIYSGPNNSGNGALRFAYDGSVPESVQFSFEKDTTVQDGDATNVSSNSASSRENSISVPPYVTLGHSGCTTNNGTLSLGCGPDNENGRGVFATGILSSVSYLFVAAAKTVADGLGQYLFDYLYYSADTSTNTSFKYIDLGSITGTLTAGTSSLTVLNNRVFAGFAKSSNDGIGLFGGLNAPDFGFVTFNSADSGTGFCTPGSNCDAFDGTKGKRIRIDFLPYFGGPSTGLLGINNNAHPNWAYYIGVDSMFVFKNRIYAANGGLHAVGHNGSIIRSTTADPTAACTGPDSCSNWVEIGPRTNTKWHNSPTNNWFSLELNQFYNLIPGDKAFAQFAEFNNNLYVTRTICIQSSQATGIRTNPGTVTGCTDGTTTNRRAQLWKCDPTISGNTSECDAADWSVVGDDGTGITNMGDSTNRTITMVMKNGSYLYIGYDNPNGIRIYRTNVANPGSSSASWSQIAGNGLTDATNVQQIYSAVSVPSGSINYIYVSAGKSNVSVRTYRQQN
I.e)序列編號SEQ ID NO5II)序列特征II.a)長度5658個堿基對II.b)類型核酸II.c)鏈單鏈II.d)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)在基因組中的位置III.a)生物體Leptospira kirschneriIII.b)名稱/關(guān)鍵詞CDSIII.c)在圖譜中的位置(0)-(5658)ATGAAGAGAACATTTTGTATTTCGATTCTTCTTTCGATGTTTTTTCAAAGTTGTATGTCTTGGCCACTTTTAACCAGTCTCGCGGGTTTAGCAGCTGGTAAAAAAAGTAATGGGCTGCCCTTTTTCCACCTTCTATTAAGTAACTCTGATCCAGTTATTACAAGGATCGAGCTCAGTTATCAAAATTCTTCCATCGCAAAAGGTACAAGTACAACTCTCGAAGTCACCGCAATCTTTGATAACGGAACAAATCAGAATATTACGGATTCGACATCTATCGTTTCCGATGCCCAATCAATCGTTGACATTCAAGGtAACAGAGTCAGAGGAATCGCTTCTGGTTCTTCCATTATAAAAGCTGAATACAACGGGATGTATTCTGAACAAAAAATTACGGTTACACCAGCCACGATAAACTCAATTCAAGTTACGAGTTTAGATGACGGtATATTACCTAAAGGTACAAATCGTCAATTTGCTGCCATCGGTATCTTTTCGGATGGTTCTCATCAAGATATTTCCAACGATCCATTGATCGTTTGGTCTTCCAGTAATATAGATTTAGTTCGAGTAGATGATTCCGGTTTGGCCTCAGGTATCAATTTAGGAACGGCTCAtATTCGtGCATCCTTTCAATCAAAACAAGCCTCCGAAGAGATAACTGTTGGTGACGCTgTTCTTTCTTCTATCCAAGTAACTTCCAACAGTCCAAATATTCCTCTCGGAAAAAAACAAAAACTCACAGCTACTGGAATTTATTCGGATAACTCTAACAGGGATATTTCCTCTTCTGtTATCTGGAATTCTTCTAATTCCACTATCGCTAATATTCAGAATAACGGAATATTAGAAACAGCTGATACTGGAATTGTTACTGTTTCTGCTTCTAGAGGTAATATAAATGGTTCCATAAAACTAATCGTCACTCCTGCTGCCTTAGTTTCTATTTCTGTTTCTCCTACAAATTCTGCAGTAGCAAAAGGTTTACAAGAAAACTTTAAAGCTACAGGGATCTTTACAGATAATTCGAACTCAGATATTACAGATCAAGTTACTTGGGATTCTTCTAATCCGGATATTCTTTCCATTTCCAATGCAAGTGATAGCCACGGGTTAGCTTCCACACTCAACCAAGGAAATGTTAAGGTCACCGCTTCCATCGGTGGAATACAAGGATCCACTGATTTTAAAGTTACACAAGAGGTATTAACTTCCATCGAAGTTTCTCCAGTTTTACCTTCAATTGCAAAAGGACTAACTCAGAAATTTACGGCGATCGGGATTTTTACGGATAACTCCAAAAAAGATATTACAAATCAAGTCACTTGGAATTCTTCTTCAGCAATCGCAAGCGTGTCTAACTTAGATGATAATAAAGGTCTGGGAAAAGCTCACGCTGTTGGAGACACGACTATTACCGCTACTTTAGGAAAAGTTTCAGGTAAAACTTGGTTTACTGTAGTTCCTGCGGTTCTCACTTCTATTCAAATCAATCCTGTAAATCCTTCTCTTGCAAAAGGGTTAACTCAAAAATTTACGGCTACTGGGATCTACTCTGACAACTCTAACAAGGACATTACTTCCTCCGTTACTTGGTTCTCATCCGATTCTTCAATCGCAACAATTTCAAACGCCAAAAAAAATCAAGGAAACTCTTACGGAGCAGCTACAGGAGCAACGGATATTAAAGCCACATTCGGAAAGGTAAGTAGTCCAGTTTCTACGTTATCCGTTACTGCTGCAAAACTTGTTGAAATACAAATCACACCGGCCGCTGCTTCCAAAGCAAAGGGAATTTCCGAAAGATTTAAAGCAACCGGTATTTTTACAGACAACTCTAATTCCGATATTACAAATCAGGTCACTTGGAGTTCATCTAATACAGATATTGCTGAAATTACAAATACCAGAGGAAGCAAAGGTATTACAAATACACTCACTCCCGGATCGAGTGAAATATCCGCCGCTCTCGGTTCAATCAAAAGTTCTAAAGTAATATTGAAGGTAACTCCGGCACAATTGATTTCCATTGCAGTAACACCTACAAATCCATCAGTTGCAAAAGGTCTAATACGACAATTTAAAGCCACCGGAACATATACGGATCATTCCGTACAAGACGTGACTGCCCTAGCTACCTGGTCTTCTTCCAATCCCAGAAAAGCAATGGTTAACAACGTTACAGGTTCGGTTACAACAGTGGCTACCGGAAATACAAATATTAAAGCAACGATAGACTCCATATCCGGATCTTCCGTTTTGAATGTCACTCCTGCACTTCTTACTTCTATCGAGATAACACCGACGATTAACTCTATCACTCACGGTCTTACAAAACAATTTAAAGCGACTGGTATCTTTTCAGATAAATCTACTCAAAATTTGACTCAGCTTGTAACTTGGATTTCTTCCGATCCCTCCAAGATCAAGATCGAAAATAACTCCGGTATAGCAACAGCTTCTGCATTAGGAAGTTCGAATATTACGGCCATCTACAAATTTGTCCAAAGTTCCCCAATTCCGATCACAGTCACTGACTTAAAACTGAAAAGTATAACTATCAGTCCTTCCTCAAGTTCAATAGCCAAAGGATTGACCCAACAATTTAAAGCGATCGGAACTTTTATAGATGGTTCTGAACAAGAAATTACGAATCTTGTGACCTGGTATTCCTCCAAATCCGATATTGTTCCTATCAATAATTCTGCGGGTAAAAAAGGTTTAGCGaCCGCaCTCTCAATAGGTTCCTCCAACATCTCCGCAATTTACAATTCTATAAGCAGTAATAAAATAAATTTTAATGTAAGCGCCGCCACGTTAGATTCCATTAAAATCAATCCAGTCAACAATAACATCGCCAAGGGACTTACCCAACAATATACTGCGCTTGGCGTTTATTCAGACTCCACCATTCAGGACATCAGCGATTTAGTTACATGGTCCAGTTCCAATTCTGACTCGATCAGCATCTCCAATTCGACCGGAACCAAGGGAAAAGCGACCGCTTTACAGATTGGAAAGAGCAAAATTACCGCGACTTACAATTCCATTTCGAAAAACATAAATCTAACTGTCAGCGCAGCAACTCTCTCTTCGATTTTTATATCTCCTACCAATACAAATATAAACACCACCGTATCAAAACAATTCTTTGCAATGGGAACGTATTCGGACGGAACCAAAACGGATTTAACTTCTTCGGTTACATGGTCCAGTTCGAATCAAGCTCAAGCAAAGGTGAGTAACGCATCTGAAACGAAAGGATTGGTTACAGGGATTACTTCTGGAAATCCTATAATCACAGCGACCTACGGCTCAGTGTCGGGAAATACAATTCTCACAGTAAACAAAACCGACACGATAGCTCCGACGGTTCAATCGGTAGTTTCTTTATCACCTACTACCATCCAAGTTGTATATTCAGAATCCATAAACAATCAGGAAGCCCTTGATTTATCCAATTACAAAATAATTAATAGTTCCAATTTTTACGGACATTGTTCGGATAATACGGACTTCAATTCCAATTCTCAAACCGCAGATTTTTCTCTTAGTAGTATCAAAGGAAGTAAAAATACTTTTACGATTACACTTTCACAT
TCACAAATCTTAAACAAATCATACACACTTGTAGTCAACAAACAAGGAATTCACGATCTTTCTTCCATTCCAAATTCCTTAAGTTGTCCAAATAACTCTGATTTTATAGGAAAAGAACAACTCAAACTTACAAGTGCAGTTTGTAATTCCTTAAACCAAGTGATCGTTTCTTTTTCCAAACCTTTATATTCTGGAAAGGAAGTAACAAAATCCGTGGAATGTTCAAATCCGTCCCAATGTGAATCCAGATATAAATTTGCAGGTGTGTCTTCATTGGGAAGTATTACGAGCGTTAGAATTTTAGATGGAAAAGTATGCGGTGGAGCACCGGCAGACTCCTCGAAAATATGTTTAACACACTCCCTTCTTCAATCAGGTGGTCAATATACGATCATCGCCGCAAATGATTTGAACGGAGACGGCTTTGACAACAAATCCTGGGGAGCAATTCGAGATTCATTCGATCAAGAAAACCTACAACCTTCTCCGAAAGATAGAATCAACTTTATAGGTTGTGGAAATTCCCCTCTCAACTTTATGGATGGCCCGATCGTGTCAGATCCTTTTGGAGACGGTTCCGATTTCGGCTCTCTTGTAGATTACAACAATCAAATCTATCTAGGACCGAATGTAAAAGGAAACCAAGCAGCTCGATTCAATTACGACGGAACTTTTCCGGAATCTATTTTCTTTTCTTTTACCCAAGATAAAAATGCCACTAACCGTGCTTCTTCAAGAGATGGAGGAATTCCGGTTCCGAATTACGTTACGATCGGTCATACCGGTTGTACTCTCAATAGTGCAGACATCACTACTGGATGTGGTCCAGATAACGAAGATGGACGTGGGGTTTTTGCCACCGGATCATTAGACAAAAAATCTCATATTTTTATAGCAGGTTCAAAACCAAGGAGATTCAACTATCTCTATTATTCCTCAGATACCGATACAAACCTTAATTTTAAATATATCAGTATGGGAAAAATTACTGGATTGGCGACTGCAGGAACTTCATCTATCGCAGTTCTAGACGATCGGATCCATGTAGGTTTTGCAAAAAAAAATCAAAATCTAAACGCACCTGATTTCGGTAAAATCACCTTTAATACATCCGAGCACAATCGATGTGCAATTGTAAACAACTGTGAAGCCTCTGACGGATACCGCGGTAATCGTTTTAGAATCGATAGAATGCCTTACTTTGGCGGCGGCTCCGTGGATGCAGTCAATTATAAAACTCATAAATCTGATAATTCCTCGATCAACTGGGGTTATTATGTGGGAATAGATTCTCTATTCGTTTTTAAAGAAAAACTTTACGCCGCAAACGGAGGATTTCCAAATTCATTACATAATGGAAGTATAATACACTCTACCAGTGCAAATCCTAGTCCTTGtGAAGGAATCAATCGTTGTTCCAGTTGGAAAGACACAGCACCTAGATCCAATCCGAAGTGGCATAaCTCTCCTCATACCAATTGGTTTTCACTGGAGCTTACAAAGTATCGAGATTTAATTCCGGCGGATAAAGCATTCTCTCAATTCGCAGAATTTAACGGAAGATTGTATGTAACAAGAACGATCTGTGTAACGAAAGAAGATCACTCCGGACTCAGACAAAGTTTACAAACTTTGAAAGGTTGTACAGACGGAAGTTATACAAATCGAAGACCTCAACTTTGGAAATGTGATCCGACTCTAACCGGCGATACAACAACCTGCGAAGCAAAAGATTGGTCTTTAGTAGGAGATAATGGAACCGGGTTTACGAATTTCGGAGACGATTCCAATCACAGTATGACGATGGTAGTTGCAAGTGGATCTTATCTCTACGTAGGTTTTGACAACGAAAACGGAATTCAAATCTGGAGAACAAATCTTGAAAATCCTGGAAGTTCATCACACGACTGGGAGCCTATAGGAATAGGCGGATTAAGAGACGTTACCAATCGTCAAATTTATTCGGCTATATCCGGAATGAATTTTGGTGTAAATTTCGTATATATAAGCGTAGGAAATAAAGATCAACCGGTTAAAATTTACAGACAACAGAACCAAI.f)序列標(biāo)識編號SEQ ID NO6II)序列特征II.a)長度1886II.b)類型氨基酸II.c)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)類型肽IV)來源N-末端至C-末端部分MKRTFCISILLSMFFQSCMSWPLLTSLAGLAAGKKSNGLPFFHLLLSNSDPVITRIELSYQNSSIAKGTSTTLEVTAIFDNGTNQNITDSTSIVSDAQSIVDIQGNRVRGIASGSSIIKAEYNGMYSEQKITVTPATINSIQVTSLDDGILPKGTNRQFAAIGIFSDGSHQDISNDPLIVWSSSNIDLVRVDDSGLASGINLGTAHIRASFQSKQASEEITVGDAVLSSIQVTSNSPNIPLGKKQKLTATGIYSDNSNRDISSSVIWNSSNSTIANIQNNGILETADTGIVTVSASRGNINGSIKLIVTPAALVSISVSPTNSAVAKGLQENFKATGIFTDNSNSDITDQVTWDSSNPDILSISNASDSHGLASTLNQGNVKVTASIGGIQGSTDFKVTQEVLTSIEVSPVLPSIAKGLTQKFTAIGIFTDNSKKDITNQVTWNSSSAIASVSNLDDNKGLGKAHAVGDTTITATLGKVSGKTWFTVVPAVLTSIQINPVNPSLAKGLTQKFTATGIYSDNSNKDITSSVTWFSSDSSIATISNAKKNQGNSYGAATGATDIKATFGKVSSPVSTLSVTAAKLVEIQITPAAASKAKGISERFKATGIFTDNSNSDITNQVTWSSSNTDIAEITNTRGSKGITNTLTPGSSEISAALGSIKSSKVILKVTPAQLISIAVTPTNPSVAKGLIRQFKATGTYTDHSVQDVTALATWSSSNPRKAMVNNVTGSVTTVATGNTNIKATIDSISGSSVLNVTPALLTSIEITPTINSITHGLTKQFKATGIFSDKSTQNLTQLVTWISSDPSKIKIENNSGIATASALGSSNITAIYKFVQSSPIPITVTDLKLKSITISPSSSSIAKGLTQQFKAIGTFIDGSEQEITNLVTWYSSKSDIVPINNSAGKKGLATALSIGSSNISAIYNSISSNKINFNVSAATLDSIKINPVNNNIAKGLTQQYTALGVYSDSTIQDISDLVTWSSSNSDSISISNSTGTKGKATALQIGKSKITATYNSISKNINLTVSAATLSSIFISPTNTNINTTVSKQFFAMGTYSDGTKTDLTSSVTWSSSNQAQAKVSNASETKGLVTGITSGNPIITATYGSVSGNTILTVNKTDTIAPTVQSVVSLSPTTIQVVYSESINNQEALDLSNYKIINSSNFYGHCSDNTDFNSNSQTADFSLSSIKGSKNTFTITLSHSQILNKSYTLVVNKQGIHDLSSIPNSLSCPNNSDFIGKEQLKLTSAVCNSLNQVIVSFSKPLYSGKEVTKSVECSNPSQCESRYKFAGVSSLGSITSVRILDGKVCGGAPADSSKICLTHSLLQSGGQYTIIAANDLNGDGFDNKSWGAIRDSFDQENLQPSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGSLVDYNNQIYLGPNVKGNQAARFNYDGTFPESIFFSFTQDKNATNRASSRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNSADITTGCGPDNEDGRGVFATGSLDKKSHIFIAGSKPRRFNYLYYSSDTDTNLNFKYISMGKITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKKNQNLNAPDFGKITFNTSEHNRCAIVNNCEASDGYRGNRFRIDRMPYFGGGSVDAVNYKTHKSDNSSINWGYYVGIDSLFVFKEKLYAANGGFPNSLHNGSIIHSTSANPSPCEGINRCSSWKDTAPRSNPKWHNSPHTNWFSLELTKYRDLIPADKAFSQFAEFNGRLYVTRTICVTKEDHSGLRQSLQTLKGCTDGSYTNRRPQLWKCDPTLTGDTTTCEAKDWSLVGDNGTGFTNFGDDSNHSMTMVVASGSYLYVGFDNENGIQIWRTNLENPGSSSHDWEPIGIGGLRDVTNRQIYSAISGMNFGVNFVYISVGNKDQPVKIYRQQNQ
I.g)序列的編號SEQ ID NO7II)序列特征II.a)長度1557個堿基對II.b)類型核酸II.c)鏈單鏈II.d)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)在基因組中的位置III.a)生物體問號狀鉤端螺旋體III.b)名稱/關(guān)鍵詞CDSIII.c)在圖譜中的位置(0)-(1557)ATTACCGTTACACCAGCCATTCTTAACTCAATTCAAGTTACGAGTTTAGAGTCAGGTATACTACCTAAAGGTACTAATCGTCAATTCTCAGCCATCGGTATCTTTTCGGATGGTTCTCATCAGGATATTTCCAACGAACCACTGATCGTTTGGTCTTCCAGTAATCCTGATTTGGTTCGAGTAGATGATTCAGGGTTGGCATCAGGGATCAATTTAGGAACAGCTCATATTCGTGCATCCTTTCAATCAAAACAAGGGGCTGAAGAAATGACCGTTGGAGATGCTGTTCTCTCTCAAATCCAAGTAACTTCAAACGATCTGAATATTCCTCTCGGAAAAAAACAAAAACTAACAGCTACGGGAATCTATTCGGATAACTCTAACAGGGATATTTCCTCTTCTGTTATTTGGAATTCTTCTAATTCCACTATCGCTAATATTCAAAACAACGGAATATTAGAAACAGCTGATACTGGTATTGTCACTGTTTCTGCTTCTAGCGAGAATATAATCGGATCCGTAAAACTAATCGTTACTCCAGCAGCCTTAGTTTCTATTTCTGTTTCTCCGACAAATTCTACAGTTGCAAAAGGTTTACAAGAAAACTTTAAAGCTACAGGGATCTTTACAGATAATTCAAACTCGGATATTACCGACCAAGTTACTTGGGATTCTTCTAATACCGATATTCTCTCAATTTCCAATGCAAGTGATAGCCACGGATTAGCTTCCACACTCAACCAAGGGAATGTTAAAGTCACTGCTTCCATCGGTGGAATACAAGGATCCACTGATTTTAAAGTTACACAAGCTGCATTGACTTCCATCGAAGTCTCTCCAACTCGCACTTCCATTGCAAAAGGACTAACTCAAAAGTTTACTGCGATCGGGATTTTTACGGATAACTCTAAGAAGGATATTACGGATCAAGTCACTTGGAATTCTTCTTCAGCAATCGTAAGCGTGTCTAACTTAGACAACAATAAAGGTCTGGGAAAAACCAACTCAGTTGGAAACACGACTATTACCGCAACCTTAGGAAAAGTTTCAGGTAACACTTGGTTTACTGTAGTTCCTGCGGTTCTCACTTCTATTCAAATCAATCCTGTAAATCCTTCTCTTGCAAAAGGGTTAACTCAAAAATTTACGGCTACTGGGATCTACTCTGACAACTCTAACAAGGACATTACTTCCGCTGTTACGTGGTTCTCATCCGATTCTTCAATCGCGACGATTTCAAACGCCCAAAAAAATCAAGGAAACGCTTACGGAGCAGCTACAGGAGCAACGGATATTAAAGCCACATTCGGAAAGGTAAGTAGTCCGGTTTCTACGTTATCTGTTACAGCTGCAAAGCTTGTTGAAATCCAAATCACACCGGCTGCTGCTTCCAAAGCAAAGGGACTCACAGAAAGATTCAAGGCTACTGGTATCTTTACGGATAACTCAAATTCCGATATTACAAATCAAGTTACCTGGAATTCCTCTAATACGGATATTGCTGAAATTAAAAATACCAGTGGAAGTAAAGGTATTACAAATACACTCACTCCAGGAI.h)序列編號SEQ ID NO8II)序列特征II.a)長度519II.b)類型氨基酸II.c)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)類型肽
IV)來源N-末端至C-末端部分(0)-(519)ITVTPAILNSIQVTSLESGILPKGTNRQFSAIGIFSDGSHQDISNEPLIVWSSSNPDLVRVDDSGLASGINLGTAHIRASFQSKQGAEEMTVGDAVLSQIQVTSNDLNIPLGKKQKLTATGIYSDNSNRDISSSVIWNSSNSTIANIQNNGILETADTGIVTVSASSENIIGSVKLIVTPAALVSISVSPTNSTVAKGLQENFKATGIFTDNSNSDITDQVTWDSSNTDILSISNASDSHGLASTLNQGNVKVTASIGGIQGSTDFKVTQAALTSIEVSPTRTSIAKGLTQKFTAIGIFTDNSKKDITDQVTWNSSSAIVSVSNLDNNKGLGKTNSVGNTTITATLGKVSGNTWFTVVPAVLTSIQINPVNPSLAKGLTQKFTATGIYSDNSNKDITSAVTWFSSDSSIATISNAQKNQGNAYGAATGATDIKATFGKVSSPVSTLSVTAAKLVEIQITPAAASKAKGLTERFKATGIFTDNSNSDITNQVTWNSSNTDIAEIKNTSGSKGITNTLTPGI.i)序列編號SEQ ID NO9II)序列特征II.a)長度600個堿基對II.b)類型核酸II.c)鏈單鏈II.d)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)在基因組中的位置III.a)生物體問號狀鉤端螺旋體III.b)名稱/關(guān)鍵詞CDSIII.c)在圖譜中的位置(0)-(600)CATAACTCTCCTCATAACAATTGGTTTTCACTGGAGCTTACAAAGTATCGGAATTTAATTCCGGCGGATAAAGCATTCTCTCAATTCGCAGAATTTAACGGAAGATTGTATGTAACAAGAACGATCTGCGTAACGAAAGAAGATCACTCCGGACTCAGACAAAGTTTACAAACTGTGGAAGGTTGTACGGACGGAAGTTATACAAATCGAAGACCCCAACTTTGGAAATGTGATCCGACTCTAACCGGCGATACAACAACCTGCGAAGCAGAAGATTGGTCTTTAGTAGGAGATAACGGAACCGGATTTACAAACTTTGGAGACAATTCCAATCACAGTATGACGATGATGGTTGCAAGTGGATCTTATCTCTACATAGGTTTTGATAACGAAAACGGAATTCAAATCTGGAGAACAAATCTTGAAAATCCTGGAAGTTCATCACACAACTGGGAACCTATAGGAATAGGCGGATTAAGAGACGTTACCAATCGTCAAATTTATTCGGCTATATCCGGAATGAATTTTGGTGTAAATTTCGTATATATAAGCGTAGGAAACAAAAATAAACCGGTCAAAATTTACAGACAACAGAATCAAI.j)序列編號SEQ ID NO10II)序列特征II.a)長度200II.b)類型氨基酸II.c)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性III)類型肽IV)來源N-末端至C-末端部分(0)-(200)
HNSPHNNWFSLELTKYRNLIPADKAFSQFAEFNGRLYVTRTICVTKEDHSGLRQSLQTVEGCTDGSYTNRRPQLWKCDPTLTGDTTTCEAEDWSLVGDNGTGFTNFGDNSNHSMTMMVASGSYLYIGFDNENGIQIWRTNLENPGSSSHNWEPIGIGGLRDVTNRQIYSAISGMNFGVNFVYISVGNKNKPVKIYRQQNQ
權(quán)利要求
1.具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其功能等同序列的基本上純的多肽。
2.編碼如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其功能等同序列的分離的多核苷酸片段。
3.選自SEQ ID NO1或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
4.具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或其功能等同序列的基本上純的多肽。
5.編碼如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
6.選自SEQ ID NO3或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
7.具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列或其功能等同序列的基本上純的多肽。
8.編碼如SEQ ID NO6所示氨基酸序列或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
9.選自SEQ ID NO5或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
10.權(quán)利要求2、5或8的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列來自鉤端螺旋體(Leptospira)的種。
11.選自SEQ ID NO8或其功能等同序列的基本純的多肽序列。
12.編碼如SEQ ID NO8所示氨基酸序列或其功能等同序列的分離的多核苷酸片段。
13.選自SEQ ID NO7或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
14.選自SEQ ID NO10或其功能等同序列的基本純的多肽序列。
15.編碼如SEQ ID NO10所示氨基酸序列或其功能等同序列的分離的多核苷酸片段。
16.選自SEQ ID NO9或其功能等同序列的分離的多核苷酸。
17.可結(jié)合權(quán)利要求1、4、7、11和14中所述的基本純的多肽或其功能等同序列的抗體。
18.用于在哺乳動物受試者中誘發(fā)針對致病螺旋菌的免疫反應(yīng)的藥物組合物，它包括在藥用可接受載體中的免疫原性有效量的權(quán)利要求1、4、7、11和14所述的基本純的多肽或其功能等同序列。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述藥用可接受載體包括佐劑。
20.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述致病螺旋菌選自密螺旋體(Treponema)、疏螺旋體(Borrelia)和鉤端螺旋體(Leptospira)。
21.可用于在哺乳動物受試者中提供針對致病螺旋菌的免疫反應(yīng)的藥物組合物，它包括在藥用可接受載體中的免疫學(xué)有效量的抗體，所述抗體能結(jié)合權(quán)利要求1、4、7、11和14所述的多肽或其功能等同序列。
22.在哺乳動物受試者中誘發(fā)抗致病鉤端螺旋體感染的免疫反應(yīng)的方法，包括施用權(quán)利要求18的藥物組合物。
23.在哺乳動物受試者中誘發(fā)抗致病螺旋菌的免疫反應(yīng)的方法，包括對受試者施用權(quán)利要求19的藥物組合物。
24.檢測樣品中病原體的方法，包括將疑似含致病螺旋菌的樣品與可結(jié)合該病原體特異性的細(xì)胞組分的試劑接觸并檢測試劑與所述組分的結(jié)合。
25.依照權(quán)利要求24的方法，其中可與病原體特異性的細(xì)胞組分相結(jié)合的試劑是用于鑒定bigL1、bigL2和bigL3多核苷酸的寡核苷酸。
26.依照權(quán)利要求24的方法，其中與病原體特異性的細(xì)胞組分相結(jié)合的試劑是抗BigL1、BigL2或BigL3多肽或具有功能等同序列的多肽的抗體。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述螺旋菌特異的組分是編碼權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的多核苷酸。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所述螺旋菌特異的組分是權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列。
29.檢測樣品中抗權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的抗體的方法，它包括在允許該抗體與權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列相結(jié)合的條件下將樣品與權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列接觸，并檢測該抗體與權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的結(jié)合。
30.檢測樣品中權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的方法，包括在允許樣品中的所述多肽與抗體結(jié)合的條件下將樣品與抗權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的抗體接觸，并檢測多肽與所說抗體的結(jié)合。
31.檢測樣品中編碼BigL1、BigL2、BigL3或其功能等同序列的核酸的方法，包括使用編碼權(quán)利要求1、4、7、11和14所述多肽或其功能等同序列的多核苷酸。
32.可用于檢測BigL1、BigL2和BigL3多肽或具有功能等同序列的多肽；bigL1、bigL2和bigL3多核苷酸；或結(jié)合BigL1、BigL2、BigL3多肽或具有功能等同序列之多肽的抗體的試劑盒。
33.可用于檢測編碼BigL1、BigL2、BigL3或其功能等同序列的核酸的試劑盒，所說的試劑盒包括含一個或多個容器的載體，所述容器中包括可含有與BigL1、BigL2、BigL3核酸或其功能等同序列雜交的多核苷酸的第一容器。
34.可用于檢測抗BigL1、BigL2、BigL3核酸或其功能等同序列的抗體的試劑盒，所說的試劑盒包括含一個或多個容器的載體，所述容器中包括含有BigL1、BigL2、BigL3多肽或其功能等同序列的第一容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼鉤端螺旋體細(xì)菌中具有重復(fù)細(xì)菌Ig樣(Big)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)BigL1、BigL2和BigL3的三種分離DNA分子以及它們在診斷、治療和疫苗應(yīng)用中的用途。依照本發(fā)明，編碼BigL1、BigL2和BigL3蛋白質(zhì)的分離分子可用于診斷和預(yù)防能在人類和其它哺乳動物體內(nèi)引起疾病的鉤端螺旋體感染，包括具有獸醫(yī)學(xué)重要性的那些鉤端螺旋體的感染。
文檔編號C07K14/20GK1639570SQ02829305
公開日2005年7月13日 申請日期2002年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者A·I·科, M·加爾瓦雷斯, J·H·羅薩克羅達, I·C·斯奎拉, D·A·哈克, J·馬蘇納加, L·W·賴?yán)? M·巴羅奇, T·A·揚 申請人:奧斯瓦爾多克魯茲基金會