專利名稱：一種鉤端螺旋體dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種鉤端螺旋體DNA疫苗。
背景技術(shù)：
鉤端螺旋體病簡(jiǎn)稱鉤體病，是一種世界分布廣、嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的、常見(jiàn)的人獸共患病，中國(guó)是鉤體病主要流行國(guó)家之一。鉤體疫苗是預(yù)防鉤體病的重要手段，目前應(yīng)用的鉤體滅活疫苗及試用的外膜疫苗雖然具有很好的預(yù)防同型鉤體感染的效果，但二者都不能有效地預(yù)防多種不同血清型鉤體的感染，而且免疫持續(xù)時(shí)間短，導(dǎo)致保護(hù)效果不甚理想(Min Lin，0m Surujballi，KlausNielsen，et al，Infection and Immunity，1997，4355-4359)。DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價(jià)維持時(shí)間長(zhǎng)和交叉保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)。此外DNA疫苗還具有以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)能誘發(fā)體液及細(xì)胞全方位免疫應(yīng)答，起到預(yù)防作用；(2)能將免疫佐劑CpG序列整合入DNA疫苗內(nèi)，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平而無(wú)需另加佐劑；(3)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運(yùn)方便。
DNA疫苗的作用機(jī)理為將克隆的鉤端螺旋體抗原(FlaB)基因重組入真核表達(dá)質(zhì)粒載體，注射于肌肉組織，使其在肌細(xì)胞中表達(dá)鉤體抗原，經(jīng)過(guò)抗原提呈過(guò)程，可激活體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預(yù)防鉤端螺旋體的入侵；而激活的細(xì)胞免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)，攻擊已被感染的細(xì)胞，消除隱藏的鉤端螺旋體(游自立，戴保民，陳莊等，華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999；30(2)128～132)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是用一種中國(guó)特有的血清型鉤體56609株的抗原FlaB基因構(gòu)建鉤端螺旋體DNA疫苗。
FlaB是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致病性鉤體的重要保守性抗原成分，位于鉤體運(yùn)動(dòng)器官的鞭毛。本發(fā)明所采用的56609株鉤體是中國(guó)特有的血清型鉤體，也是我國(guó)一套15群15型鉤體參考株之一，屬于流感傷寒群臨海型，其基因型分類尚無(wú)歸屬，有關(guān)該血清型鉤體的保守性抗原基因FlaB的克隆一直未見(jiàn)報(bào)道。我們將其中的保守性的抗原FlaB基因進(jìn)行克隆、分析，并將其插入真核表達(dá)載體pVAX，構(gòu)建成鉤端螺旋體DNA疫苗pVAX-FlaB。
本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達(dá)載體的基本骨架為pVAX(購(gòu)自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見(jiàn)該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過(guò)程以及制備過(guò)程中，質(zhì)粒擴(kuò)增所用的宿主菌為DH5α(購(gòu)自GIBCO公司)；插入的外源基因?yàn)橹袊?guó)特有的血清型鉤體56609株的抗原FlaB基因，其結(jié)構(gòu)描述如下(1)56609株鉤體的抗原FlaB基因a)序列特征長(zhǎng)度852bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型DNAc)來(lái)源鉤體菌株，流感傷寒群臨海型臨6株，中藥檢代號(hào)56609，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌苗2室。
d)序列描述SEQ ID NOflaB1ATGATTATCA ACCACAACCT GAGTGCGGTG AATGCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAA61 CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAAGCTCTG TCTTCCGGTA TGCGGAGTAA TTCGTCTGCG121 GACGACGCTT CCGGACTTGC AGTGTCCGAA AAGCTGAGAA CGCAAGTAAA CGGTTTGCGT181 CAAGCGGAAA GGAATACTGA AGACGGAATG AGTTTTATTC AAACTGCCGA AGGATTTCTG241 GAGCAGACGT CTAACATCAT TCAAAGAATC CGGGTGCTCG CCATCCAGAC TTCGAATGGT301 ATCTACAGTA ATGAAGATAG GCGGCTCGTG CAGGTGGAAG TATCTGCGCT GGTGGATGAA361 GTCGATCGAA TTGCTTCTCA GGCTGAATTT AATAAGTTCA AACTTTCTGA AGGCCGATTC421 GCTAGAGGTT CCAGGCTTGC ATCCATGTGG TTTCATATGG GTCCAAACCA AAATCAGCGT481 GAAAGATTTT ACATAGGCAC GATGACTTCA AAGGCTCTGA AGCTTGTAAA AGCGGACGGG541 AGGCCGATCG CGATCTCTTC TCCGGGAGAG GCTAACGACG TGATCGGTCT GGCAGATGCC601 GCCCTTACGA AGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGAG CTTATTATAA TAGGCTTGAA661 TATACCGCAA AGGGTCTGAT GGGTGCGTAT GAAAATATGC AGGCATCTGA ATCTAGAATT721 CGAGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTTGTACAG781 AGTGGTACGG CAATGTTGGC GCGGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCAGTTCT CAAACTTCTG841 CAGCACATCT GA鉤體的抗原FlaB基因克隆方案采用PCR的方法進(jìn)行，該方法的大致流程為根據(jù)該基因的兩端序列設(shè)計(jì)PCR引物，然后以56609株鉤體的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段，再將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序即可。具體方法及其反應(yīng)體系參見(jiàn)《分子克隆》(科學(xué)出版社，1992年出版)相關(guān)章節(jié)。


圖1含F(xiàn)laB抗原基因的質(zhì)粒圖譜圖2 DNA疫苗pVAX-FlaB的構(gòu)建流程3 DNA疫苗pVAX-FlaB在BALB/c小鼠體內(nèi)的表達(dá)量曲線圖4 DNA疫苗pVAX-FlaB誘發(fā)小鼠血清抗體效價(jià)的時(shí)間曲線圖5 DNA疫苗pVAX-FlaB對(duì)豚鼠不同型鉤體攻擊的交叉保護(hù)作用圖6 DNA疫苗pVAX-FlaB對(duì)仔豬同型鉤體攻擊的免疫保護(hù)作用
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的制備方法及作用進(jìn)行詳細(xì)描述。
一、DNA疫苗pVAX-FlaB的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建及制備本DNA疫苗的結(jié)構(gòu)是以真核表達(dá)載體——pVAX為骨架的重組質(zhì)粒DNA分子，大體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。全長(zhǎng)約3.9kb(千堿基對(duì))，除含有pMBl ori質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因Kanamycin等元件外，還包含了一個(gè)完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元。真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元含有真核轉(zhuǎn)錄翻譯所必需的元件真核巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子PCMV、相應(yīng)的編碼基因flaB及3′端的多聚腺苷酸BGH pA。總體上說(shuō)，本疫苗是一個(gè)可在真核細(xì)胞中表達(dá)FlaB抗原并可激活淋巴細(xì)胞的重組質(zhì)粒DNA。
1、構(gòu)建工程菌DH5α(pVAX-FlaB)(見(jiàn)圖2)從56609株鉤體提取基因組DNA，將培養(yǎng)好的鉤端螺旋體離心洗滌后，加入pH為8.5的TE溶液，其中含有1mg/ml的溶菌酶，37℃消化1小時(shí)，然后加入終濃度為1％的SDS和100μg/ml的蛋白酶K及20μg/ml的RNA酶，37℃消化1小時(shí)后，分別用酚、酚/氯仿、氯仿抽提，取抽提液4μl為模板，以引物15’-CTGGGATCC ATTATCAACCACAA-3’和引物25’-ACAGAATTC GATGTGCTGCAGAAGTT-3’擴(kuò)增鉤端螺旋體基因組DNA，860bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以BamH I和EcoR I酶切，暴露粘性末端。同時(shí)以BamH I/EcoR I雙酶切載體pVAX，電泳回收載體大片段。將以上兩片段連接成pVAX-FlaB質(zhì)粒后，再用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選獲得陽(yáng)性重組子，即獲含有重組質(zhì)粒pVAX-FlaB的工程菌DH5α(pVAX-FlaB)。(具體反應(yīng)體系及實(shí)驗(yàn)方案參見(jiàn)前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)2、制備DNA疫苗pVAX-FlaB本發(fā)明DNA疫苗用上述工程菌株DH5α(pVAX-FlaB)制備。培養(yǎng)擴(kuò)增及精制可通過(guò)常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒擴(kuò)增和純化方法進(jìn)行(詳見(jiàn)前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)。
培養(yǎng)方式一般為液體培養(yǎng)。少量擴(kuò)增時(shí)可用空氣搖床振蕩培養(yǎng)；工業(yè)性生產(chǎn)時(shí)需用細(xì)菌發(fā)酵罐行高密度懸浮通氣培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)源無(wú)特殊的要求，一般用LB液體培養(yǎng)基，如需高密度培養(yǎng)，則可選用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，PH7.0)或SOC液體培養(yǎng)基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化鈉、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、PH7.0)。必要時(shí)也可添加動(dòng)、植、礦物油等作為消泡劑。培養(yǎng)溫度一般為37℃，培養(yǎng)時(shí)間及收集細(xì)菌的時(shí)機(jī)決定于培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式以及通氣量條件的設(shè)置。
從擴(kuò)增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，可采用一些常規(guī)的方法。例如可用去垢劑SDS裂解菌體，利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA變復(fù)性特征的差異，通過(guò)對(duì)DNA的變性和復(fù)性的處理，將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分開(kāi)；再利用質(zhì)粒DNA與雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力等方面的區(qū)別進(jìn)行進(jìn)一步的純化，并去除內(nèi)毒素。具體地說(shuō)，存在于復(fù)性液中的質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)脫鹽處理后，可用陰離子交換樹(shù)脂(如DEAESepharose)進(jìn)行交換，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)緩沖液洗脫，即可制得高純度的質(zhì)粒DNA(具體見(jiàn)實(shí)施例)。經(jīng)PBS稀釋分裝，即可獲得透明澄清的本發(fā)明DNA疫苗純品。本品理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，可于常溫下保存與運(yùn)輸，使用前，用注射用水溶解即可。
二、DNA疫苗pVAX-FlaB的功能檢測(cè)1、本DNA疫苗的體外表達(dá)及檢測(cè)，是將所構(gòu)建的DNA疫苗通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，72小時(shí)后收獲細(xì)胞，以間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清及細(xì)胞破碎液中FlaB抗原的表達(dá)水平，結(jié)果表明有表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明DNA疫苗確可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)1)2、本DNA疫苗的體內(nèi)表達(dá)及檢測(cè)，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，用ELISA法檢測(cè)血清中的抗原水平(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明本DNA疫苗免疫動(dòng)物后，可表達(dá)FlaB抗原。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)2)3、本DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平的檢測(cè)，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，以ELISA法檢測(cè)血清中抗鉤體抗體的水平。結(jié)果DNA疫苗組可以在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高水平的抗體效價(jià)，而作為對(duì)照組的滅活疫苗(將培養(yǎng)好的鉤體經(jīng)56℃，60分鐘滅活后，經(jīng)超聲破碎后，離心去除不溶性的成分，將上清以考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白濃度調(diào)整為5mg/mL。)抗體效價(jià)自3月起則下降，亞單位疫苗組抗體效價(jià)比DNA疫苗高，但是抗體效價(jià)從3月起即開(kāi)始下降(見(jiàn)圖4)。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)3)
4、本DNA疫苗的交叉保護(hù)性為了觀察疫苗對(duì)三種不同型別鉤體的交叉免疫保護(hù)情況，以鉤端螺旋體56609株及常見(jiàn)的56601株、56608株(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌苗2室)攻擊感染免疫pVAX-FlaB疫苗的豚鼠。采集心血進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗pVAX-FlaB與傳統(tǒng)的滅活苗相比，對(duì)同鉤體的攻擊感染均具有很好的保護(hù)效果，但DNA疫苗與滅活苗比較，交叉保護(hù)作用優(yōu)于滅活苗，結(jié)果見(jiàn)圖5。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)4)5、本DNA疫苗對(duì)仔豬鉤體感染的免疫保護(hù)作用，是將獲得的DNA疫苗純品免疫仔豬，10天后加強(qiáng)免疫一次，攻擊感染鉤體56609株，2天后從耳靜脈取血進(jìn)行鉤體培養(yǎng)，之后在攻擊后的第20天無(wú)菌采集腎臟標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)觀察鉤體的感染情況反映DNA疫苗對(duì)豬攻擊感染鉤體的保護(hù)性。結(jié)果，未免疫組豬與免疫豬相比，在鉤體攻擊感染后相對(duì)精神不振，被毛蓬亂、不光澤。鉤體體外培養(yǎng)血液和腎臟組織的結(jié)果相一致。該疫苗對(duì)仔豬鉤體感染具有一定的保護(hù)作用(見(jiàn)圖6)。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)5)本發(fā)明能有效地誘發(fā)仔豬的免疫應(yīng)答反應(yīng)，說(shuō)明其對(duì)動(dòng)物的鉤端螺旋體感染有一定的免疫保護(hù)作用；且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
使用本發(fā)明的工程菌制備鉤端螺旋體DNA疫苗的實(shí)施例從-80℃冰箱中取出凍存的工程菌株——DH5α(pVAX-FlaB)，于室溫融化后，用接種環(huán)蘸取少量菌液劃線接種于1.5％的LB瓊脂平板(含卡那霉素50ug/ml)上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，取單克隆接種于50ml LB液體培養(yǎng)基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，卡那霉素50ug/ml，PH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)40小時(shí)，作為種子液。按1∶20的比例將種子液接種于1升SOC液體培養(yǎng)基中(在前述成分的基礎(chǔ)上，另含卡那霉素50μg/ml)，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)；加氯霉素至終濃度為170μg/ml，于37℃劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。將菌液于4℃以6000rpm離心10分鐘；去上清，將菌體重懸于30ml的堿裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.Cl、10mmol/L EDTA PH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/L NaOH和1％SDS)，緩慢顛倒5次混勻，室溫放置5分鐘。加45ml冰預(yù)冷的溶液III(含鉀離子3mol/L、乙酸根5mol/L)，緩慢顛倒數(shù)次混勻，冰浴10分鐘；于4℃以10000r/m離心10分鐘，取上清，過(guò)500ml G25柱除鹽后，上20ml DEAE Sepharose陰離子交換柱，待結(jié)合吸附完畢后，按鹽離子(Cl-)濃度從低到高(0～1mol/L)漸進(jìn)的梯度洗脫法，用10個(gè)柱體積的PBS(PH8.0)和氯化鈉溶液緩慢清洗陰離子交換柱，收集260nm處吸收峰的洗脫液，得到DNA疫苗的粗品。然后進(jìn)一步純化，加2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，12000r/m4℃離心10分鐘，去上清，用70％的乙醇漂洗涼干后，溶于PBS(PH8.0)溶液中，即得本發(fā)明DNA疫苗的純品；用紫外分光光度法定量后，再按每份200μg/ml分裝制成成品。
本發(fā)明的預(yù)防接種方案是用成品1ml肌肉注射即可，劑量為每頭仔豬200μg。10天后追加免疫一次，即可獲得較強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。如與亞單位疫苗聯(lián)合治療則效果更佳。
實(shí)驗(yàn)1 DNA疫苗的體外表達(dá)及檢測(cè)用電穿孔的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞，穿孔條件為電容960μF，電壓為250V，質(zhì)粒40μg，COS7細(xì)胞濃度為1×107/ml，時(shí)間為16.7s。同時(shí)設(shè)空載體pVAX的對(duì)照，72h后收獲細(xì)胞。以間接ELISA法檢測(cè)FlaB抗原在COS7細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液中的表達(dá)情況，將細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液分別包被96孔酶聯(lián)板，一抗為兔抗鉤體血清(自制)，二抗為羊抗兔-HRP(購(gòu)自華美生物工程有限公司)。顯色后，以P/N比值大于1.8為陽(yáng)性，結(jié)果FlaB抗原在COS7細(xì)胞中得到了表達(dá)，上清中和細(xì)胞裂解液均為陽(yáng)性。說(shuō)明本DNA疫苗在COS7細(xì)胞中可以表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)2 免疫接種后體內(nèi)的抗原水平檢測(cè)試驗(yàn)6～8周齡的雌性BALB/c小鼠20只(平均體重20g)，隨機(jī)分成2組，每組10只，第一組免疫DNA疫苗(每只接種100μg)，第2組為PBS陰性對(duì)照。將質(zhì)粒100μg經(jīng)脛前肌注射給1組小鼠，2組小鼠則接種等體積PBS。于注射當(dāng)日注射前和注射后第3、6、9、12、15天經(jīng)尾靜脈取血，分離血清后一并檢測(cè)質(zhì)粒在血清中的表達(dá)情況。
以間接ELISA法檢測(cè)血清中FlaB的水平，將小鼠血清1∶20稀釋后包被96孔酶聯(lián)板，一抗為兔抗鉤體血清(自制)，二抗為羊抗兔-HRP(購(gòu)自華美生物工程有限公司)。陰性對(duì)照為未注射疫苗的空白小鼠血清。顯色后，以檢測(cè)孔與陰性對(duì)照孔的OD450比值P/N＞1.5為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)圖3。
從圖中可以看出，疫苗在小鼠體內(nèi)所檢測(cè)到的抗原水平在第三天最高，以后逐漸下降，到第15天時(shí)，含量極微。
實(shí)驗(yàn)3 DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平的檢測(cè)為比較DNA疫苗pVAX-FlaB體液免疫應(yīng)答的維持時(shí)間，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，第1組為DNA疫苗組，每只小鼠注射pVAX-FlaB疫苗100μg，第2組為亞單位疫苗組，每只小鼠注射蛋白100μg(GST-FlaB亞單位疫苗為本室自制含融合表達(dá)質(zhì)粒的菌種，經(jīng)熱誘導(dǎo)后超聲破碎，包涵體經(jīng)1％Triton X-100，2M，4M尿素逐級(jí)洗滌，再以8M尿素溶解，3M尿素復(fù)性，飽和硫酸胺沉淀，溶于PBS。)，第3組為滅活疫苗組(將培養(yǎng)好的鉤體經(jīng)56℃，60分鐘滅活，經(jīng)超聲破碎后，離心去除不溶性的成分，將上清以考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白濃度調(diào)整為5mg/mL。)，每只小鼠皮下注射滅活鉤體108條，第4組為PBS對(duì)照組。在注射的當(dāng)天和注射后的兩個(gè)月內(nèi)每半月取血1次，以后每月取血一次，取血部位是尾靜脈。DNA疫苗組和滅活組觀察至1年，亞單位疫苗組6月。以間接ELISA法檢測(cè)血清中抗鉤體抗體的水平，以純化的GST-FlaB包被酶聯(lián)板，加入待檢的血清后，再加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗(購(gòu)自華美生物工程有限公司)，顯色反應(yīng)后在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，以P/N大于2為陽(yáng)性。
結(jié)果DNA疫苗組可以在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高水平的抗體效價(jià)，滅活疫苗抗體效價(jià)自3月起則下降，亞單位疫苗組抗體效價(jià)比DNA疫苗高，但是抗體效價(jià)從3月起即開(kāi)始下降。(見(jiàn)圖4)實(shí)驗(yàn)4 DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生交叉保護(hù)性的試驗(yàn)為了觀察DNA疫苗對(duì)豚鼠攻擊感染鉤體的保護(hù)情況，將豚鼠分為3組，第1組10只為PBS對(duì)照組，第2組30只為滅活苗組，經(jīng)皮下途徑注射，第3組30只為pVAX-FlaB組。其中2、3組又分為三組，分別攻擊感染鉤體56609株、56601株和56608株(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌苗2室)。免疫劑量為100μg/200μl，在首次免疫接種后第5天加強(qiáng)免疫1次，在首次接種后的第21天攻擊鉤體病原體，接種部位為豚鼠后腿部肌肉。在攻擊后第2天采集心臟血，第7天殺死豚鼠，無(wú)菌采集腎臟分別接種至切氏培養(yǎng)基中，每種標(biāo)本皆接種雙管。心血28℃培養(yǎng)2周有鉤體生長(zhǎng)說(shuō)明培養(yǎng)陽(yáng)性，疫苗組以2/3豚鼠培養(yǎng)陰性判定為疫苗有效，對(duì)照組皆應(yīng)為陰性。腎臟培養(yǎng)一直觀察3月無(wú)鉤體生長(zhǎng)判為陰性。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗pVAX-FlaB與傳統(tǒng)的滅活苗相比，對(duì)同型鉤體的攻擊感染均具有很好的保護(hù)效果，但DNA疫苗與滅活苗比較，交叉保護(hù)作用優(yōu)于滅活苗(x2檢驗(yàn)，p＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖5。
實(shí)驗(yàn)5 DNA疫苗對(duì)仔豬鉤體感染的免疫保護(hù)作用檢測(cè)將仔豬隨機(jī)分為2組，每組10只，第1組肌肉注射DNA疫苗pVAX-FlaB200μg/ml/頭，10天后加強(qiáng)免疫一次；第2組為PBS對(duì)照組。在初次免疫的第20天攻擊感染鉤體56609株，每頭109條鉤體，攻擊感染2天后從耳靜脈取血進(jìn)行鉤體培養(yǎng)，之后在攻擊后的第20天無(wú)菌采集腎臟標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果疫苗組對(duì)仔豬的鉤體感染具有一定的保護(hù)作用，兩組之間有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)，見(jiàn)圖6。未免疫組豬與免疫組相比，在鉤體攻擊感染后精神不振，被毛蓬亂，不光澤。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明，本發(fā)明DNA疫苗pVAX-FlaB能有效地誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)仔豬預(yù)防鉤端螺旋體感染起到很好的免疫保護(hù)作用。鉤端螺旋體DNA疫苗pVAX-FlaB的抗原基因flaB核苷酸序列如下1ATGATTATCA ACCACAACCT GAGTGCGGTG AATGCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAA61 CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAAGCTCTG TCTTCCGGTA TGCGGAGTAA TTCGTCTGCG121 GACGACGCTT CCGGACTTGC AGTGTCCGAA AAGCTGAGAA CGCAAGTAAA CGGTTTGCGT181 CAAGCGGAAA GGAATACTGA AGACGGAATG AGTTTTATTC AAACTGCCGA AGGATTTCTG241 GAGCAGACGT CTAACATCAT TCAAAGAATC CGGGTGCTCG CCATCCAGAC TTCGAATGGT301 ATCTACAGTA ATGAAGATAG GCGGCTCGTG CAGGTGGAAG TATCTGCGCT GGTGGATGAA361 GTCGATCGAA TTGCTTCTCA GGCTGAATTT AATAAGTTCA AACTTTCTGA AGGCCGATTC421 GCTAGAGGTT CCAGGCTTGC ATCCATGTGG TTTCATATGG GTCCAAACCA AAATCAGCGT481 GAAAGATTTT ACATAGGCAC GATGACTTCA AAGGCTCTGA AGCTTGTAAA AGCGGACGGG541 AGGCCGATCG CGATCTCTTC TCCGGGAGAG GCTAACGACG TGATCGGTCT GGCAGATGCC601 GCCCTTACGA AGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGAG CTTATTATAA TAGGCTTGAA661 TATACCGCAA AGGGTCTGAT GGGTGCGTAT GAAAATATGC AGGCATCTGA ATCTAGAATT721 CGAGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTTGTACAG781 AGTGGTACGG CAATGTTGGC GCGGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCAGTTCT CAAACTTCTG841 CAGCACATCT GA
權(quán)利要求
1.一種鉤端螺旋體DNA疫苗，包括真核表達(dá)載體和抗原基因flaB，其特征在于所用的抗原基因flaB來(lái)源于中國(guó)特有的血清型鉤體56609株，其核苷酸序列如下1ATGATTATCA ACCACAACCT GAGTGCGGTG AATGCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAA61 CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAAGCTCTG TCTTCCGGTA TGCGGAGTAA TTCGTCTGCG121 GACGACGCTT CCGGACTTGC AGTGTCCGAA AAGCTGAGAA CGCAAGTAAA CGGTTTGCGT181 CAAGCGGAAA GGAATACTGA AGACGGAATG AGTTTTATTC AAACTGCCGA AGGATTTCTG241 GAGCAGACGT CTAACATCAT TCAAAGAATC CGGGTGCTCG CCATCCAGAC TTCGAATGGT301 ATCTACAGTA ATGAAGATAG GCGGCTCGTG CAGGTGGAAG TATCTGCGCT GGTGGATGAA361 GTCGATCGAA TTGCTTCTCA GGCTGAATTT AATAAGTTCA AACTTTCTGA AGGCCGATTC421 GCTAGAGGTT CCAGGCTTGC ATCCATGTGG TTTCATATGG GTCCAAACCA AAATCAGCGT481 GAAAGATTTT ACATAGGCAC GATGACTTCA AAGGCTCTGA AGCTTGTAAA AGCGGACGGG541 AGGCCGATCG CGATCTCTTC TCCGGGAGAG GCTAACGACG TGATCGGTCT GGCAGATGCC601 GCCCTTACGA AGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGAG CTTATTATAA TAGGCTTGAA661 TATACCGCAA AGGGTCTGAT GGGTGCGTAT GAAAATATGC AGGCATCTGA ATCTAGAATT721 CGAGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTTGTACAG781 AGTGGTACGG CAATGTTGGC GCGGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCAGTTCT CAAACTTCTG841 CAGCACATCT GA
2.按權(quán)利要求所述的鉤端螺旋體DNA疫苗，其特征在于所說(shuō)的真核表達(dá)載體為pVAX。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種鉤端螺旋體DNA疫苗。它是采用從中國(guó)特有的血清型鉤體56609株獲取的flaB基因?yàn)榭乖?，以pVAX(購(gòu)自Invitrogen公司，其序列和物理圖譜見(jiàn)該公司的產(chǎn)品目錄)為表達(dá)載體構(gòu)建的。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1395969SQ0111339
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月12日
發(fā)明者孫樹(shù)漢, 寇志華, 郭瀛軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)