專利名稱：Atrp法構(gòu)建以多糖為骨架的生物可還原高效陽離子基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ATRP法構(gòu)建一系列以多糖為骨架，其中包括葡聚糖、環(huán)糊精、普羅蘭，具有高效基因轉(zhuǎn)染效率的生物可還原陽離子多糖基因載體。
背景技術(shù)：
基因治療在攻克人類癌癥、遺傳疾病及心血管等重大疾病方面起到舉足輕重的作用，未來的醫(yī)療是將正常的或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入靶細胞來干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進程，從而達到治療的目的?；蛑委熡腥齻€重要環(huán)節(jié)，即目的基因的尋找、基因載體的研制和目的基因在細胞中的特異性表達。其中，基因?qū)胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)，缺乏安全而高效的基因載體是目前制約基因治療實施的主要瓶頸?；蜉d體是作為基因?qū)爰毎墓ぞ撸梢园涯康幕蛩腿氚屑毎麅?nèi)，從而發(fā)揮目的基因的特定功能。應(yīng)用于基因治療的載體主要分為病毒載體(viral vector)和非病毒載體(non-viral vector)。病毒載體主要為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒及單純皰疹病毒，其優(yōu)點是轉(zhuǎn)染率高，缺點是缺乏安全性，可能引起致癌作用與不希望的自身免疫反應(yīng) (unexpected immune response)和白細胞的病毒變化，甚至可能造成病人多器官衰竭導(dǎo)致死亡。此外病毒載體還會引起插入突變的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致宿主細胞的惡行轉(zhuǎn)化，而且病毒載體攜帶DNA的能力有限，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。由于它的上述弱點，目前科學(xué)界已經(jīng)研究重心轉(zhuǎn)向非病毒技術(shù)的研究與開發(fā)。與病毒性載體相比，非病毒載體安全性高，并且具有低免疫原性、能夠攜帶大量DNA分子、容易大批量生產(chǎn)及費用低廉等優(yōu)點，是一個有潛力的替代路線，故人們愈來愈重視人工合成的非病毒載體的研究。陽離子聚合物是目前研究最廣泛的人工合成非病毒載體。陽離子聚合物能夠自發(fā)與帶負電荷的基因通過電荷相互作用，可形成帶正電荷納米級的復(fù)合體(complex)，從而協(xié)助基因穿過帶負電的細胞膜。此外，陽離子聚合物載體也能夠保護質(zhì)粒，避免被核酸酶降解，加速基因的細胞轉(zhuǎn)染。近年來，隨著活性/可控自由聚合(living/controlled radical polymerization, LRP)研究的快速發(fā)展，LRP技術(shù)在制備具有新穎特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大發(fā)展。LRP集活性可控聚合與自由基聚合的優(yōu)點為一身，不但可得到相對分子量分布極窄、相對分子量可控、結(jié)構(gòu)明晰的高分子，而且可聚合的單體多，反應(yīng)條件溫和易控制。所以，LRP技術(shù)具有極高的實用價值，受到了高分子化學(xué)家們的重視。迄今為止，已有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atom transfer radical polymerization,ATRP)、穩(wěn)定自由 SMilSf^SiMiS (nitroxide mediated free radical polymerization，NMI P) 禾口可逆力口成一裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 等LRP體系問世。其中，ATRP近幾年得到了迅速發(fā)展并有著重要應(yīng)用價值。其所用引發(fā)劑一般為鹵代烷烴，基本原理是通過一交替的“活化-去活”可逆反應(yīng)使體系中游離基濃度極低，迫使不可逆終止反應(yīng)降低到最低程度，而鏈增長反應(yīng)仍可進行，從而實現(xiàn)“活性”聚合。ATRP反應(yīng)溫度適中，適用單體范圍廣，甚至可以在少量氧存在下進行，對高分子材料的分子設(shè)計不需復(fù)雜的合成路線，是現(xiàn)有NMRP、RAFT等其它活性聚合方法無法比擬的，因此可以說ATRP技術(shù)的出現(xiàn)開辟了活性聚合的新領(lǐng)域。隨著高分子科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等多門學(xué)科的相互交融、相互滲透和迅速發(fā)展，高分子基因載體材料進入一個快速發(fā)展的時期。目前，文獻中報道一系列非病毒陽離子聚合物載體，包括聚-L-賴氨酸(poly (L-Iysine)，PLL)、 聚乙二胺樹枝狀聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N- 二甲氛基乙酉旨(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate), PDMAEMA)、聚乙煉亞胺 (polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率，是陽離子非病毒載體中公認的“金標”。但是上述陽離子聚合物仍具有相當高的毒性，大大限制了它們的應(yīng)用。這樣，開發(fā)低毒而高效陽離子聚合物是研究非病毒基因載體的核心內(nèi)容。目前較為流行的方案是在陽離子聚合物中插入生物相容的成份，最常見的是聚乙二醇(PEG)。另一種常見的思路是多糖陽離子化，包括殼聚糖(chitosan)、環(huán)糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)等。但是上述報道的非病毒載體的性能(比如安全性和轉(zhuǎn)染效率)與實際應(yīng)用的要求還有相當大的距離。當前，已經(jīng)商品化的基因載體只有脂質(zhì)體lipfect2000，但其高昂的成本讓其無法成為癌癥患者的選擇，使得基因載體在臨床治療中無能為力。近幾年研究者致力于ATRP理論和應(yīng)用的研究工作，在ATRP合成生物材料以及 ATRP技術(shù)的生物材料應(yīng)用方面開展了廣泛的研究，取得了一定的研究成果。對多種單體 (包括DMAEMA、PEGEEMA, PEGMA以及GMA)的ATRP進行了系統(tǒng)的研究，積累了豐富的經(jīng)驗， 促進了活性可控聚合在醫(yī)用生物高分子中的應(yīng)用。多糖(polysaccharide)是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6HltlO5)η表示，在自然界廣泛分布，并且在免疫調(diào)節(jié)和抗病毒抗癌方面有著出色的表現(xiàn)。葡聚糖(Dextran)作為一種多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、調(diào)節(jié)腸胃、幫助組織結(jié)構(gòu)再生或修復(fù)、促進傷口愈合及預(yù)防心腦血管和糖尿病等方面均具有突出表現(xiàn)，對肝炎、腫瘤、心血管、糖尿病、降血脂、抗衰老等方面均有獨特的生物活性。其特有的靶向性特點，能鎖定休眠期、耐藥性及亞臨床病灶的“殘存病毒細胞”，從而“同步”減毒增效，極大限度的保障臨床治療效果。同時，葡聚糖可以快速激活機體自身的免疫監(jiān)管和識別機制，從而增強它們的戰(zhàn)斗力，使自身免疫系統(tǒng)達到最佳平衡狀態(tài)，保持肌體的健康。普魯蘭多糖(Pullulan)是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖，它除了具備其他多糖所具有的優(yōu)點之外，其本身帶有一定的腫瘤靶性， 因而近幾年在廣泛應(yīng)用于腫瘤治療方面的研究。環(huán)糊精(Cyclodextrin，簡稱CD)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱， 通常含有6 12個D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子具有略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在其空洞結(jié)構(gòu)中，外側(cè)上端(較大開口端)由C2和C3的仲羥基構(gòu)成，下端(較小開口端)由C6的伯羥基構(gòu)成，具有親水性，而空腔內(nèi)由于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū)。 早期的研究僅限于將CD及其小分子衍生物引入基因轉(zhuǎn)染體系中。然而電荷中性的環(huán)糊精小分子，如β -⑶，HP β -⑶和 Μβ-CD等并不能與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，轉(zhuǎn)染水平比DNA 本身只有微小的提高，所以研究重點更多轉(zhuǎn)移到環(huán)糊精陽離子聚合物上。胱胺(Cystamine，CA)，是一種有機二硫化物。由胱氨酸受熱脫羧反應(yīng)后形成。它是一種不穩(wěn)定的液體，一般使用其二鹽酸鹽C4H12Nj2 · 2HC1。胱胺最主要的特性表現(xiàn)在它作為一種二硫化物所具有的雙硫鍵。放置或還原劑還原時，二硫化物會分解為相應(yīng)的硫醇。 親核試劑的進攻也會打斷二硫鍵，形成兩個新的硫醇/硫醚此類型的氧化還原反應(yīng)在生物體內(nèi)及醫(yī)藥上都有很重要的用途。含有SS鍵的聚合物在模擬生理環(huán)境(pH 7. 4，150mM PBS, 37°C )中很穩(wěn)定；但當加入2.5mM DTT(二硫蘇醇)后迅速被還原，這與細胞內(nèi)的還原環(huán)境(ρΗ7· 4，[R-SH] = 5mM, 37°C )非常類似。并且可以有效地將DNA凝結(jié)成納米級(< 200nm)并使它在中性條件下帶正電荷(> +20mV)。因而使得含有SS鍵的聚合物具有可剪切性。綜上所述，盡管在利用活性可控自由基聚合法制備多糖基因載體方面已經(jīng)做了很多工作，但是在技術(shù)方面還有以下問題需要解決1、在制備高性能多糖基因載體時，隨著單體不斷的接枝到多糖骨架上，陽離子基因載體的分子量隨之增大，細胞內(nèi)吞作用增大，轉(zhuǎn)染效率增加，但是細胞的毒性也隨之增大，如何最大限度的降低基因載體的毒性成為需要解決的問題。2、在制備高性能多糖基因載體時，接枝不同單體，可以得到不同性能的陽離子聚合物，但是不同單體的質(zhì)子化能力不同，導(dǎo)致載體的轉(zhuǎn)染效率高低不同，如何篩選出具有高效高性能的單體是需要考慮的問題。3、在制備高性能多糖基因載體時，接枝相同的單體，在不同的細胞包括癌細胞和普通細胞中，轉(zhuǎn)染高低不同，如何提高在確定細胞中的轉(zhuǎn)染效率是需要研究的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活性可控自由基聚合法(ATRP法)構(gòu)建的以多糖為骨架的生物可還原高效陽離子基因載體，該多糖陽離子基因載體分子量可控，分布窄、可剪切、 低毒性，高轉(zhuǎn)染效率，高效無毒的特點使其具備了投入臨床試驗的可能。在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，引發(fā)劑的合成從多糖本體開始，激活多糖本體上的官能團，將胱胺與激活的官能團反應(yīng)，使得二硫鍵接入到多糖本體上，之后通過引入溴作為大分子引發(fā)劑的引發(fā)點，得到多種多糖大分子引發(fā)劑，然后通過ATRP法將各種單體通過活性可控自由基聚合(ATRP法)接枝到多糖大分子引發(fā)劑的引發(fā)點上得到具有生物活性的多糖陽離子高效基因載體，并可對所得基因載體進行進一步后續(xù)修飾。本發(fā)明提供的聚合反應(yīng)體系由多糖大分子引發(fā)劑、有機溶劑、單體、配體、CuBr, 水組成。其中水與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 1-50范圍，優(yōu)選0. 1-45，更優(yōu)選 0. 1-40 ；單體與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 001-50范圍，優(yōu)選0. 01-45范圍，更優(yōu)選在0. 02-42范圍；配體與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 01-1范圍，優(yōu)選0. 01-0. 8 范圍，更優(yōu)選在0. 02-0. 5范圍；CuBr與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 001-1范圍，優(yōu)選0. 01-0. 9范圍，更優(yōu)選在0. 05-0. 5范圍；有機溶劑與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在 20-500范圍，優(yōu)選20-450范圍，更優(yōu)選在25-400范圍。各組分加入順序一為先將多糖大分子引發(fā)劑溶于有機溶劑，然后加入水、單體， 再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合。各組分加入順序二為將多糖大分子引發(fā)劑溶于有機溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合。
本發(fā)明聚合反應(yīng)溫度0_60°C，優(yōu)選5_55°C，更優(yōu)選10_50°C。聚合溫度升高，產(chǎn)物分子量增加。本發(fā)明聚合反應(yīng)時間為l-500min，優(yōu)選l-450min，反應(yīng)完成后加入水或者甲醇， 或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，水或者甲醇的加入量為多糖大分子引發(fā)劑質(zhì)量的100-500倍，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g，產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3- ；最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體。 本發(fā)明的聚合反應(yīng)在無氧環(huán)境下連續(xù)進行。所述的多糖大分子引發(fā)劑的結(jié)構(gòu)表示為SS-R-Br，R為骨架結(jié)構(gòu)，R上的羥基被如
下結(jié)構(gòu)式的基團取代
權(quán)利要求
1.一種以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，其具體反應(yīng)條件為該聚合反應(yīng)體系由多糖大分子引發(fā)劑、有機溶劑、單體、配體、CuBr、水組成；其中水與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 1-50范圍，優(yōu)選0. 1-45，更優(yōu)選0. 1-40 ； 單體與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 001-50范圍，優(yōu)選0.01-45范圍，更優(yōu)選在 0. 02-42范圍；配體與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 01-1范圍，優(yōu)選0. 01-0. 8范圍，更優(yōu)選在0. 02-0. 5范圍；CuBr與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在0. 001-1范圍，優(yōu)選0. 01-0. 9范圍，更優(yōu)選在0. 05-0. 5范圍；有機溶劑與多糖大分子引發(fā)劑的質(zhì)量比值在 20-500范圍，優(yōu)選20-450范圍，更優(yōu)選在25-400范圍；該聚合反應(yīng)溫度0-60°C，優(yōu)選5-55°C，更優(yōu)選10-50°C ；該聚合反應(yīng)時間為l-500min，優(yōu)選l-450min，反應(yīng)完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，水或者甲醇的加入量為多糖大分子引發(fā)劑質(zhì)量的 100-500倍，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g，產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3- ；最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體；該聚合反應(yīng)在無氧環(huán)境下連續(xù)進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，聚合反應(yīng)體系所述各組分加入順序為先將多糖大分子引發(fā)劑溶于有機溶劑，然后加入水、單體，再加入配體，最后加入CuBr 引發(fā)活性可控自由基聚合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，聚合反應(yīng)體系所述各組分加入順序為將多糖大分子引發(fā)劑溶于有機溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的多糖大分子引發(fā)劑的結(jié)構(gòu)表示為SS-R-Br，R為骨架結(jié)構(gòu)，R上的羥基被如下結(jié)構(gòu)式的基團取代
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述醇類化合物選自C1-C8醇，包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、正己醇中的一種或幾種；所述的酰胺類為N，N- 二甲基甲酰胺和/或N，N- 二甲基乙酰胺；所述的砜類選自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二芐基砜、甲基苯基砜、環(huán)丁砜中的一種或幾種；所述的亞砜類選自二甲基亞砜、二乙基亞砜、二丙基亞砜、二丁基亞砜、二戊基亞砜、二己基亞砜、O-乙基)己基亞砜中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，當有機溶劑為二甲基亞砜時，聚合反應(yīng)體系的組分不包括水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，聚合反應(yīng)體系加入CuBr時可同時加入 CuBr2, CuBr 與 CuBr2 的質(zhì)量比為(3 1)-(8 1)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的制備方法，其特征在于，當使用單體甲基丙烯酸縮水甘油醚得到的以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體可進行開環(huán)反應(yīng)，得到開環(huán)的以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體，具體開環(huán)反應(yīng)條件為單體甲基丙烯酸縮水甘油醚得到的以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體，記為SS-R-PGMA，將其在30-45°C 無氧環(huán)境下，加入二甲基亞砜或者N，N-二甲基甲酰胺攪拌溶解，之后依次加入乙胺、三乙胺、胱胺引發(fā)開環(huán)反應(yīng)，其中二甲基亞砜或者N，N-二甲基甲酰胺與SS-R-PGMA的質(zhì)量比值在200-500范圍，優(yōu)選150-450，更優(yōu)選120-350 ；其中乙胺與SS-R-PGMA的質(zhì)量比值在 20-50范圍，優(yōu)選15-45，更優(yōu)選12-35 ；其中三乙胺與SS-R-PGMA的質(zhì)量比值在20-50范圍， 優(yōu)選15-45，更優(yōu)選12-35 ；其中胱胺與SS-R-PGMA的質(zhì)量比值在1_25范圍，優(yōu)選1_20，更優(yōu)選3-15;反應(yīng)1-3周以后，用乙醚沉淀聚合物直到變?yōu)檎吵頎罟腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚，之后加入去離子水溶解，加水量與聚合物的比例為100-300ml/g，然后冷凍干燥直至除去所有水分，得到開環(huán)的以多糖為骨架的生物可還原陽離子基因載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域的一種以ATRP法構(gòu)建一系列以多糖為骨架，其中包括葡聚糖、環(huán)糊精、普羅蘭，具有高效基因轉(zhuǎn)染效率的生物可還原陽離子多糖基因載體。該ATRP法聚合反應(yīng)平穩(wěn)，易于調(diào)控，并可根據(jù)需要制備出多種不同分子量系列的、窄分子量分布的高性能陽離子多糖基因載體，制得的陽離子多糖基因載體儲存穩(wěn)定性好，放置幾天或幾個月后仍可保持原有性能。并且該多糖陽離子基因載體在Hepg2、Hela、C6、Cos7、HEK293等細胞中具有高于國際上已經(jīng)投入商業(yè)化使用的脂質(zhì)體lipfect2000的轉(zhuǎn)染效率，使用方法簡單，具有商業(yè)化潛力。
文檔編號C08F120/32GK102492095SQ20111040696
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者徐福建, 朱韻, 楊鑫超, 柴明英, 王增輝, 胡楊 申請人:北京化工大學(xué)