專利名稱：一種快速制備糖肽的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于食品領域，涉及蛋白改性以及制備糖肽的方法，特別涉及一種多肽糖基化接枝的方法。
背景技術(shù)：
大部分天然蛋白質(zhì)都帶有共價鍵相連的多糖側(cè)鏈，糖蛋白以各種形式廣泛存在于動植物和某些微生物中，它在生物體中起著很關(guān)鍵的作用，諸如細胞信號識別、生長調(diào)控、 細胞間的信息傳達，及免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能。因此，糖蛋白引起了人們的廣泛關(guān)注。但分離純化糖蛋白很困難，靠基因工程技術(shù)制備也很受限制，所以在生化，免疫細胞生物學及醫(yī)學研究中必須通過化學合成糖蛋白的部分結(jié)構(gòu)——糖肽來作為模型分子，以供活性和構(gòu)效關(guān)系研究，糖肽合成也就應運而生。除此之外，糖肽具有明顯的抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、 抗缺氧、促進多種細胞因子、抗乙肝病毒的產(chǎn)生和改善某些老年性疾病癥狀等作用。由于肽鏈較短，糖肽比糖蛋白有更優(yōu)越的乳化性質(zhì)，乳化穩(wěn)定性更好，可用作乳化劑、穩(wěn)定劑等。另外，作為一種生理活性肽，糖肽引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。近幾年生命科學家強烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與pH、離子強度和溶液組成等因素一樣用于研究生物大分子，加入擁擠物質(zhì)逐漸成為一種研究大分子的途徑，從而加深對分子間相互作用的了解。采用“大分子擁擠環(huán)境”作為溫和的反應體系，將生命科學領域的擁擠理論應用于糖基化接枝反應中，當體系中存在高濃度的生物大分子時，大分子之間的反應遵循分子排斥容積理論，反應向溶質(zhì)總體積減小的方向移動，即朝結(jié)合方向移動。大分子擁擠環(huán)境能夠使蛋白分子在水溶液中同樣處于非聚集或者較少聚集的反應狀態(tài)，同時，促進蛋白質(zhì)與多糖的反應向著共價結(jié)合的方向進行，所得產(chǎn)物具有優(yōu)越的功能性，有良好的工業(yè)應用前景。作為一種新的有效的方法，解決了傳統(tǒng)方法的弊端(申請?zhí)?201010237456. 1)。比如干熱法，干熱處理前原料水分含量應較低，需要干燥，而且在反應過程中需要保持恒定的溫度和濕度，通常是在60°C反應1 3周，實驗條件不容易控制，固相反應中反應物接觸不均勻，反應不充分，產(chǎn)物通常帶有淺黃或淺棕的顏色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多肽糖基化接枝方法。本發(fā)明模擬生命科學領域的大分子擁擠體系，體系中的擁擠試劑可以是惰性高聚物或葡聚糖。該法具有操作方便、反應時間短、所得糖肽功能性優(yōu)越等優(yōu)點，克服了現(xiàn)有蛋白質(zhì)糖基化接枝改性方法難以實現(xiàn)工業(yè)化的缺陷，產(chǎn)品在食品工業(yè)中具有規(guī)?；膽们熬?。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種快速制備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)模擬生命科學領域的大分子擁擠體系，將擁擠試劑置于反應裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；
(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟O)的溶液中，充分攪拌池后，加入 0. 02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過夜后，50_70°C攪拌l_8h，反應結(jié)束后迅速冷卻至低于 25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述多肽與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質(zhì)量比為 1 0. 5 1 4。優(yōu)選地，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白。優(yōu)選地，步驟(1)所述酶為酸性蛋白酶、復合蛋白酶或中性蛋白酶，所述酸性蛋白酶優(yōu)選胃蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH < 2.0。優(yōu)選地，所述酶解程度控制是將蛋白配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質(zhì)量比為1 100。所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物，優(yōu)選聚蔗糖70、聚乙二醇2000或葡聚糖。優(yōu)選地，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性淀粉中的一種或者一種以上。優(yōu)選地，所述反應裝置為帶恒溫加熱攪拌裝置的密閉容器。優(yōu)選地，所述緩沖溶液是pH5. 5 7. 5的磷酸鹽緩沖液。上述方法制備的糖肽應用于營養(yǎng)品、抗氧化劑、乳化劑或穩(wěn)定劑等食品添加劑行業(yè)。在食品工業(yè)中，高效率是一個重要的因素，縮短反應時間可以更好的促進反應的進行，提高生產(chǎn)效率。蛋白質(zhì)分子中加入酶制劑可以打開肽鏈促進接枝反應的進行，從而大大縮短反應時間。采用蛋白酶水解蛋白，能夠有效地打開蛋白大分子的三級空間結(jié)構(gòu)，同時將蛋白的長肽鏈切斷成中長鏈，使更多的氨基基團暴露出來，通過酶解蛋白再進行糖基化接枝，此時的產(chǎn)物是糖肽。相對于球蛋白來說，更多的肽鏈上氨基基團與多糖的還原性羰基末端結(jié)合，使蛋白與多糖的Maillard反應共價結(jié)合更為有效的進行，縮短了反應時間，所得糖肽比糖蛋白復合物的功能性更加優(yōu)越。糖肽同時具有促進能量代謝，減肥，抗疲勞，增強肌肉爆發(fā)力、促進雙歧桿菌繁殖、降膽固醇、抗過氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生理活性功效。本發(fā)明利用蛋白適度酶解成多肽，再利用生命科學領域中大分子擁擠環(huán)境作為反應介質(zhì)，添加擁擠試劑，使多肽和多糖發(fā)生Maillard反應，得到具有優(yōu)越的功能性的糖肽共價結(jié)合物，該發(fā)明反應時間短，操作方便。通過接枝改性，共價鍵合的蛋白質(zhì)-多糖復合物既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能，與以次級力結(jié)合的蛋白質(zhì)-多糖體系相比，對于環(huán)境條件具有較高的適應性，其結(jié)合不受熱或PH值的影響。就乳化性能而言，這種復合物具有優(yōu)越的乳化性質(zhì)，因此在反應過程中選用乳化活性作為檢測指標。乳狀液中粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，也是評價樣品乳化性的重要指標，乳狀液粒子越大，乳析的速率越快，乳化活性越差。乳化活性采用D[4』來表征，D[4』越小，粒徑越小，乳化活性越強，反之亦然。本發(fā)明利用蛋白適度酶解成多肽，后采用“大分子擁擠環(huán)境”作為生成糖基化蛋白的反應體系，使多肽與多糖的反應向著共價結(jié)合的方向進行，得到功能性糖肽結(jié)合物。作為功能性糖肽的新的有效的制備方法，具有如下的優(yōu)點
(1)在本發(fā)明中，先將蛋白進行適度酶解，自由氨基暴露，特別是芳香族氨基酸暴露，加快了與多糖接枝反應的進程，提高了效率；(2)該發(fā)明在水溶液中攪拌加熱，克服了干熱反應中反應不均勻的缺點，不可控制的現(xiàn)象，最大程度地讓多糖和多肽充分接觸；(3)與其他接枝改性方法相比，本發(fā)明具有規(guī)模化的應用前景，工業(yè)可操作性強。
具體實施例方式實施例1將大豆蛋白配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的溶液，加熱至37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質(zhì)量=1 100)，酶解30min后，加熱到100°C保溫:3min滅酶，離心(5000rpm, 20min), 取上清液凍干，此為大豆多肽。將1. Og葡聚糖作為擁擠試劑置于密閉容器中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分溶解，將0. 5g大豆多肽和1. Og葡聚糖加入該含有擁擠試劑的溶液中，充分攪拌池后，加入2滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，5°C 靜置過夜后，60°C攪拌4h，反應結(jié)束后迅速冷卻至25°C終止反應，離心(8000rpm，20min)， 上清液冷凍干燥，得到糖肽產(chǎn)品。取上述糖肽產(chǎn)品制備乳液，分別靜置Id和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定體積平均粒徑D[4』的大小，結(jié)果見表1。對比實施例1將大豆蛋白配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的溶液，加熱到37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質(zhì)量=1 100)，酶解30min,后加熱到100°C保溫3min滅酶，離心(5000rpm, 20min)，取上清液凍干，此為大豆多肽。準確稱取0. 5g多肽，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，容器密閉，室溫攪拌后，加入2滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，置于5°C過夜后， 恒溫60°C攪拌4h。反應結(jié)束后，迅速冷卻至25°C終止反應，離心(8000rpm，20min)，上清液冷凍干燥。取上述糖肽產(chǎn)品制備乳液，分別靜置Id和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定體積平均粒徑d[4』的大小，結(jié)果見表1。表1實施例1和對比實施例1結(jié)合物的性能對比
權(quán)利要求
1.一種快速制備糖肽的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)將擁擠試劑置于反應裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟( 的溶液中，充分攪拌池后，加入0.02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過夜后，50-70°C攪拌l_8h，反應結(jié)束后迅速冷卻至低于25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質(zhì)量比為1 0. 5 1 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇 2000或葡聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白；所述酶為酸性蛋白酶、復合蛋白酶或中性蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH ^ 2. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解程度控制是將蛋白配制成質(zhì)量分數(shù)為10 %的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質(zhì)量比為 1 100。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性淀粉中的一種或者一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述反應裝置為帶恒溫加熱攪拌裝置的密閉容器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液是pH5.5 7. 5的磷酸鹽緩沖液。
9.一種快速制備的糖肽，其特征在于，該糖肽是由權(quán)利要求1 8任一項所述方法制備的。
10.權(quán)利要求9所述的糖肽應用于營養(yǎng)品、抗氧化劑、乳化劑或穩(wěn)定劑中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速制備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)將擁擠試劑置于反應裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟(2)的溶液中，充分攪拌2h后，加入0.02％w/w的NaN3防腐，5℃靜置過夜后，50-70℃攪拌1-8h，反應結(jié)束后迅速冷卻至低于25℃，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。本發(fā)明操作方便，反應時間短，反應效率高，所得產(chǎn)物——糖肽具有優(yōu)越的功能性，產(chǎn)品在食品工業(yè)中有廣泛的應用前景。
文檔編號C08B37/00GK102308904SQ20111020343
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者卓秀英, 楊曉泉, 齊軍茹 申請人:華南理工大學