專利名稱：Epstein Barr病毒肽表位、多表位及其輸送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Epstein Barr病毒的免疫原性肽。尤其，本發(fā)明涉及衍生自Epstein Barr病毒LMP1蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。本發(fā)明還提供了含有一個(gè)或多個(gè)Epstein Barr病毒細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的藥物組合物，多表位，基于腺病毒的疫苗輸送系統(tǒng)和治療與Epstein Barr病毒相關(guān)的疾病的方法，這些疾病例如有何杰金氏病和/或鼻咽癌但不限于此。本發(fā)明還提供了一種鑒定Epstein Barr病毒細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的方法。
背景技術(shù)：
Epstein Barr病毒(EBV)不僅是分布最廣的人類病毒之一，有些矛盾的是，它也和一些腫瘤有關(guān)(Anagnostopoulos 1996)。這包括各種B細(xì)胞及T細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及一些淋巴上皮瘤狀癌，其典型即為鼻咽癌(NPC)。這些腫瘤與EBV的關(guān)系，以及EBV在體外的致癌潛力已有文獻(xiàn)記載(Rickinson 1996；Khanna 2000)。CD8+T細(xì)胞活性在控制EBV感染中扮演重要角色，這是通過(guò)識(shí)別衍生自被MHC I型分子呈遞到表面的被感染的細(xì)胞的小分子肽實(shí)現(xiàn)的。EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)制劑可通過(guò)刺激來(lái)自健康病毒攜帶者的外周血的記憶T細(xì)胞在體外制得，該攜帶者含有被自身EBV轉(zhuǎn)化的淋巴芽細(xì)胞系(LCL)細(xì)胞(Khanna1992；Murray 1992)。在一種LCL中，EBV表達(dá)六個(gè)核抗原(EMNAs1，2，3A，3B，3C和LP)，以及兩個(gè)潛伏型膜蛋白(LMP1及LMP2)。其中，EBNA3家族(EBNA 3A，3B，3C)在CTL對(duì)許多人類白細(xì)胞抗原(HLA)的應(yīng)答中為免疫顯性(Khanna 1992；Murray等1992)。
何杰金氏病以及鼻咽癌的腫瘤細(xì)胞皆會(huì)表達(dá)病毒蛋白，已知是為CTL提供靶表位。這兩種惡性腫瘤表達(dá)核抗原EBNA1，BARF0，LMP1和LMP2。EBNA1包括一個(gè)甘氨酸-丙氨酸重復(fù)(GAr)，此抗原在蛋白酶體降解中用做順式抑制信號(hào)，并從而阻斷該抗原內(nèi)的CTL表位內(nèi)源性呈遞(Levitskaya 1995)。BARF0表位的CTL呈遞被病毒轉(zhuǎn)錄體的差別剪接所影響，結(jié)果產(chǎn)生了CTL決定簇被去除了的顯性蛋白質(zhì)同種型(Kienzle 2000)。和EBNA1及BARF0相反，LMP1和LMP2兩者都是EBV特異性CTL的強(qiáng)靶的，因此許多注意力皆集中在鑒別這兩種抗原內(nèi)的靶表位(Lee 1997；Khanna 1998；Meij 2002)。
LMP1為一跨膜蛋白，其胞質(zhì)N末端及C末端結(jié)構(gòu)域被6個(gè)跨膜區(qū)段分隔開(kāi)。LMP1已經(jīng)被認(rèn)為是最重要的潛伏型蛋白之一，用于EBV介導(dǎo)的正常B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并能在轉(zhuǎn)基因鼠中獨(dú)特地誘導(dǎo)惡性腫瘤生成和增生(Kulwichit 1998)。而且，還已知LMP1對(duì)B細(xì)胞的細(xì)胞表型呈現(xiàn)出多效性，其中包括活化抗原的誘導(dǎo)(Wang 1990)，程序性細(xì)胞死亡抑制因子的表達(dá)(Henderson 1991；Laherty 1992)，以及經(jīng)由TRAF信號(hào)傳遞途徑的NF-κB活化(Hammarskiold 1992；Mosialos 1995)。先前的研究顯示LMP1的作用為一種結(jié)構(gòu)上活化的受體樣分子，與配體的結(jié)合無(wú)關(guān)。LMP1的C末端通過(guò)C末端活化劑區(qū)域(是指CTAR1，氨基酸194-231及CTAR2，氨基酸332-386及CTAR3，氨基酸275-330)引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)。CTAR1和CTAR2區(qū)域與NF-κB的誘導(dǎo)有關(guān)，CTAR2為主要NF-κB活化劑位點(diǎn)，而CTAR3結(jié)構(gòu)域最近被報(bào)導(dǎo)與Janus激酶3結(jié)合(Gires 1999)。
發(fā)明概述本申請(qǐng)的發(fā)明人采用了一種新的基于IFN-γ的分析，在多組病毒攜帶者中進(jìn)行廣泛的LMP1特異性T細(xì)胞應(yīng)答的序列分析。該方法與功能性細(xì)胞毒性分析相結(jié)合以評(píng)定LMP1特異性CTL溶解被EBV感染的靶細(xì)胞的能力。
概括地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種衍生自LMP1的新的和有效的EBV肽，其潛在地適用對(duì)包括B細(xì)胞和T細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病及如鼻咽癌(NPC)這樣的淋巴上皮瘤狀癌在內(nèi)的腫瘤的免疫治療。
本發(fā)明還提供了一種基于腺病毒的疫苗輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)當(dāng)用于輸送EBV多表位結(jié)構(gòu)時(shí)尤其有效。
因此，本發(fā)明中提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含了LMP1蛋白的至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，其中所述EBV CTL肽不是YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)，ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)或YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)。
第一方面，本發(fā)明提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列QRH(SEQ ID NO4)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)QRHSDEHHH(SEQ ID NO9)；(ii)GQRHSDEHH(SEQ ID NO10)；(iii)YYHGQRHSD(SEQ ID NO11)；和(iv)WMYYHGQRH(SEQ ID NO12)。
在第一方面的其它實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)YYHGQRHSDEHH(SEQ ID NO13)；(ii)IWMYYHGQRHSD(SEQ ID NO14)；和(iii)LIWMYYHGQRHSDEHHH(SEQ ID NO15)第二方面，本發(fā)明提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列AGNDG(SEQ ID NO5)。
在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)AGNDGGPPQ(SEQ ID NO16)；和(ii)PSDSAGNDG(SEQ ID NO17)。
在第二方面的其它實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)SDSAGNDGGPPQ(SEQ ID NO18)；(ii)DSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO19)；和(iii)PHSPSDSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO20)。
第三方面，本發(fā)明提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列QNW(SEQ ID NO6)，特別地，其中不包括序列YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)。
在第三方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)IALYLQQNW(SEQ ID NO21)；(ii)ALYLQQNWW(SEQ ID NO22)；(iii)QNWWTLLVD(SEQ ID NO23)；和(iv)LYLQQNWWT(SEQ ID NO24)。
在第三方面的其它實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)IALYLQQNWWTL(SEQ ID NO25)；(ii)YLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO26)；和(iii)LIIALYLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO27)。
第四方面，本發(fā)明提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列VLYS(SEQ ID NO7)。
在其中的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)ALLVLYSFAL(SEQ ID NO28)；
(ii)LLVLYSFAL(SEQ ID NO29)；(iii)ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；和(iv)VLYSFALML(SEQ ID NO31)。
在第四方面的其它實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)ALLVLYSFALML(SEQ ID NO32)；(ii)GALLVLYSFALM(SEQ ID NO33)；(iii)DWTGGALLVLYS(SEQ ID NO34)；(iv)GGALLVLYSFAL(SEQ ID NO35)；和(v)DWTGGALLVLYSFALML(SEQ ID NO36)。
第五方面，本發(fā)明提供了一種分離的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列DSNSNE(SEQ ID NO8)，特別地，其中不包括氨基酸序列ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)。
在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表位包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列(i)DSNSNEGRH(SEQ ID NO37)；(ii)SGHESDSNSNEG(SEQ ID NO38)；和(iii)TDDSGHESDSNSNEGRH(SEQ ID NO39)。
本發(fā)明還提供了一種變異體EBV CTL表位。
在特別的實(shí)施方案中，所述變異體含有如表4所示的氨基酸序列(SEQ ID NO40-50)。
第六方面，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白，該蛋白包含根據(jù)上述各方面的至少一個(gè)EBV CTL表位。
優(yōu)選，該分離的蛋白是多表位蛋白，其包含選自由ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)及IALYQQNW(SEQ ID NO21)所組成的組的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的多表位蛋白包含如表5所示的各個(gè)EBV CTL表位。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的多表位蛋白包含如SEQID NO81所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種分離的核酸，該核酸編碼上述任一方面的EBV CTL表位或多表位。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的核酸編碼如SEQ ID NO81所列的多表位氨基酸序列。
在該實(shí)施方案中，更優(yōu)選該分離的核酸編碼具有如SEQ ID NO82所列的核苷酸序列。
該方面，還提供了一種分離的核酸，該核酸編碼上述各方面的EBV CTL表位變異體。
在特別的實(shí)施方案中，所述分離的核酸包含如表4所示的一種核苷酸序列(SEQ ID NO63-65，67-69，71-76及78-80)。
第八方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)結(jié)構(gòu)，它包含可操作地連接于表達(dá)載體中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列的第六方面的分離的核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)結(jié)構(gòu)是基于腺病毒的。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述表達(dá)結(jié)構(gòu)是編碼本發(fā)明中多數(shù)EBV CTL表位的多表位結(jié)構(gòu)。
第九方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞或生物體，其包含有第八方面的表達(dá)結(jié)構(gòu)。
第十方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含根據(jù)上述任一方面的EBV CTL表位或分離的核酸或編碼其的表達(dá)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選，該藥物組合物是一種免疫療法組合物。
更優(yōu)選，該藥物組合物是一種疫苗。
第十一方面，本發(fā)明提供了一種治療與EBV相關(guān)的疾病的方法，包括對(duì)動(dòng)物施用本發(fā)明的一種或多種EBV CTL表位或編碼其的表達(dá)結(jié)構(gòu)的步驟。
此方面的方法包括施用蛋白質(zhì)以及核酸組合物，用于對(duì)與EBV相關(guān)的疾病的治療和/或預(yù)防。
盡管不限于此，與EBV相關(guān)的疾病優(yōu)選包括各種B和T細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及幾種淋巴上皮瘤狀癌，其中鼻咽癌(NPC)為特別受注目的形式。
優(yōu)選，該動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
更優(yōu)選，該動(dòng)物是人。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第十方面的方法更進(jìn)一步包括根據(jù)要接受治療的人的HLA類型來(lái)選擇一種或多種EBV CTL表位的步驟。
第十二方面，本發(fā)明提供了一種鑒定EBV CTL表位的方法，上述方法包括以下步驟(i)制備大量衍生自LMP1蛋白的不同肽；(ii)將上述一種或多種所述肽與獲自EBV血清陽(yáng)性個(gè)體的一種或多種T淋巴細(xì)胞相結(jié)合；和(iii)測(cè)量在對(duì)上述一種或多種肽的應(yīng)答中的上述一種或多種T淋巴細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)量，其中IFN-γ產(chǎn)量高于參考量即表示所述一種或多個(gè)肽具有至少一種EBV CTL表位。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方面的方法進(jìn)一步包括步驟(iv)檢測(cè)是否步驟(ii)所產(chǎn)生的上述一種或多種T淋巴細(xì)胞能溶解一種或多種被EBV感染的靶細(xì)胞。
第十三方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體能與根據(jù)本發(fā)明的上述各方面的一種或多種EBV CTL表位結(jié)合。
第十四方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)動(dòng)物是否攜帶或曾接觸過(guò)EBV的方法，所述方法包括這樣的步驟將分離自上述個(gè)體的一種或多種T細(xì)胞與本發(fā)明的一種或多種EBV肽相接觸，由此上述一種或多種T細(xì)胞對(duì)一種或多種肽中的至少一個(gè)的應(yīng)答可指示該動(dòng)物攜帶EBV或曾接觸過(guò)EBV。
優(yōu)選，該動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
更優(yōu)選，該動(dòng)物是人。
本說(shuō)明書全文，除非特別指出，各處的”包含”是指”包括在內(nèi)”而不是”排除在外”，因此所陳述的整體可以包括一個(gè)或多個(gè)其它未陳述的整體。
附圖和表格說(shuō)明表1EBV免疫的健康捐贈(zèng)者或NPC病患的HLA抗原類型(I型)被包括在本說(shuō)明書中。
表2被EBV特異性T細(xì)胞從健康病毒攜帶者所識(shí)別到的LMP1序列列表。
表3T細(xì)胞對(duì)MHCI型和MHCII型限制性LMP1表位的應(yīng)答頻率，該表位存在于不同種族的健康個(gè)體與NPC患者中。
表4由高加索人、非洲人、中國(guó)人、新幾內(nèi)亞人和印度尼西亞人分離出的存在于EBV中的HLAI型限制性LMP1表位的序列。編碼每個(gè)表位的核苷酸序列和存在于特定分離體的序列改變都被表示出來(lái)。SEQ ID NO30的肽序列變異體被表示為SEQ ID NO40。SEQID NO21的肽序列變異體被表示為SEQ ID NO41-43。肽序列變異體YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)被表示為SEQ ID NO44-48。肽序列變異體YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)被表示為SEQ ID NO49和50。編碼野生型與變異體表位的核苷序列被表示為SEQ ID NO62-80。
表5EBV多表位肽序列和HLA特異性。YLLEMLWRL(SEQ IDNO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ ID NO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNT LLSAW(SEQ ID NO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQ ID NO59)。


圖1一組健康的血清陽(yáng)性個(gè)體中的LMP1特異性T細(xì)胞應(yīng)答體內(nèi)分布圖。A用來(lái)自LMP1的重疊合成肽(10μg/ml)刺激來(lái)自健康的血清陽(yáng)性個(gè)體的PMBC，且INF-γ產(chǎn)量用如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法測(cè)量。結(jié)果被表示為每106PBMC中斑點(diǎn)形成細(xì)胞的個(gè)數(shù)(spot forming cell，SFC)。BLMP1蛋白中的T細(xì)胞活性的圖表分布。C在ELISPOT分析法中被健康的病毒攜帶者所識(shí)別的肽表位的氨基酸序列肽9(SEQ ID NO36)；肽17(SEQ IDNO60)；肽21(SEQ ID NO27)；肽24(SEQ ID NO15)；肽25(SEQ ID NO61)；肽27(SEQ ID NO39)；肽38(SEQ ID NO20)。
圖2由CD4+與CD8+T細(xì)胞群體分泌的IFN-γ體內(nèi)檢測(cè)，再繼以LMP1肽的刺激。用如材料與方法中所述的抗人類CD4或CD8免疫磁性顆粒將CD4+細(xì)胞或CD8+細(xì)胞從新鮮的PBMCs中排除。將這些細(xì)胞于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸，再用DWTGGALLVLYSFALML肽(SEQ ID NO36；組A)與TDDSGHESDSNSNEGRH肽(SEQ IDNO39；組B)(10μg/ml)刺激，然后用ELISPOT分析法檢測(cè)INF-γ分泌情況。
圖3用ELISPOT分析法對(duì)最小表位序列做圖。用重疊肽(5μg/ml)刺激來(lái)自捐贈(zèng)者M(jìn)M(組A和B)，RE(組C)，LL(組D)的PBMC，且INF-γ產(chǎn)量用如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法測(cè)量。結(jié)果被表示為每106PBMC中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的個(gè)數(shù)。
圖4用ELISPOT分析法對(duì)最小表位序列做圖。用重疊肽(1μg/ml)刺激來(lái)自捐贈(zèng)者LL(組A)，MM(組B)，RE(組C和D)的PBMC，且INF-γ產(chǎn)量在如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法中測(cè)量。結(jié)果被表示為每106PBMC中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的個(gè)數(shù)。
圖5A對(duì)IALYLQQNW特異性CTL克隆MM22的HLAI型限制性分析。一些與捐贈(zèng)者M(jìn)M有相同的HLA I型等位基因的自體與異源EBV轉(zhuǎn)化的LCL和PHA胚細(xì)胞與CTL克隆MM22相接觸。PHA胚細(xì)胞用IALYLQQNW肽表位進(jìn)行預(yù)敏。與靶的比例為2∶1的效應(yīng)物被用于該分析中。B被CTL克隆MM23所識(shí)別的CTL識(shí)別IALYLQQNW表位。用一系列稀釋肽對(duì)PHA胚細(xì)胞致敏，然后暴露給IALYL QQNW特異性CTL克隆MM23。
圖6A對(duì)得自捐贈(zèng)者LL的ALLVLYSFA特異性CTL系進(jìn)行HLAI型限制性分析。在該肽存在或不存在的情況下，一些與捐贈(zèng)者LL有相同的HLAI型等位基因的自體與異源PHA胚細(xì)胞與表位特異性CTL系相接觸。與靶的比例為10∶1的效應(yīng)物被用于該分析中。B被來(lái)自于捐贈(zèng)者LL的CTL系所識(shí)別的CTL識(shí)別ALLVLY SFA表位。用一系列稀釋肽對(duì)PHA胚細(xì)胞致敏，然后暴露給ALLVLYSFA特異性CTL系。
圖7A變異體和原型HLAA2限制性LMP1表位YLLEMLWRL的CTL識(shí)別。PHA胚細(xì)胞與一系列各肽的稀釋液致敏，然后暴露給任一YLLEMLWRL特異性CTL克隆SB7。B用變異體與原型HLAA2限制性LMP1表位在T2細(xì)胞上做MHC穩(wěn)定性分析。T2細(xì)胞起初用200μl的每種肽(10μg/ml)在26℃下孵育14-16小時(shí)，接著于37℃下孵育2-3小時(shí)。HLAA2在這些細(xì)胞上的表達(dá)用HLAA2特異性單克隆抗體FACS來(lái)分析。
圖8重組腺病毒載體的結(jié)構(gòu)圖，該載體表達(dá)編碼含有13種HLAI型限制性LMP1和LMP2表位(SEQ ID NO79，也見(jiàn)于表5)的多表位蛋白的合成DNA(SEQ ID NO79)。編碼該多表位蛋白的DNA序列是使用序列特異性引物(表示為L(zhǎng)MP-A，LMP-B，LMP-C及LMP-D)和基于交互引導(dǎo)(mutual priming)與重疊延伸的技術(shù)來(lái)構(gòu)成。該片段的核酸序列編碼(從5’端)一個(gè)BamH I限制性酶切位點(diǎn)，一段Kozak序列，一個(gè)甲硫氨酸起始密碼子，13個(gè)前后相連的最小LMP1CTL表位，一個(gè)終止密碼子，以及一個(gè)在3’端的EcoR I限制性酶切位點(diǎn)。LMP多表位的插入片段是從pcDNA3.1表達(dá)載體上切下并克隆到pAdTrack表達(dá)載體中。在E.coli中擴(kuò)增和重組后，Ad5-LMPpoly載體通過(guò)轉(zhuǎn)染人類胚腎(HEK)293細(xì)胞，被包裝到轉(zhuǎn)染性腺病毒中。通過(guò)冷凍與解凍來(lái)收獲重組腺病毒。
圖9由Ad5LMP多表位編碼的CTL表位的內(nèi)源性加工。
圖10Ad5LMP多表位的免疫原性。
圖11Ad5-LMPpoly的免疫作用對(duì)表達(dá)EL4-A2/Kb腫瘤細(xì)胞的LMP1提供保護(hù)。兩組小鼠，每組6只，分別用Ad5-LMPpoly或?qū)φ战M腺病毒(108PFU/只小鼠)免疫。免疫后21天，用EL4-A2/Kb-LMP1細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/只小鼠)對(duì)小鼠進(jìn)行皮下進(jìn)攻，并在進(jìn)攻后16天監(jiān)測(cè)腫瘤大小。腫瘤大小數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
發(fā)明詳述本說(shuō)明書描述了許多新的和意料不到的衍生自LMP1蛋白的EBV CTL表位。用一種新的基于IFN-γ分析來(lái)鑒定EBV CTL表位，并用功能性細(xì)胞毒性分析來(lái)評(píng)估LMP1特異性CTL溶解被EBV感染的靶細(xì)胞的能力。
令人驚奇地，本發(fā)明的CTL表位優(yōu)先衍生自CTAR1與LMP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，實(shí)際上并不包括CTAR2結(jié)構(gòu)域與N末端。
本發(fā)明的衍生自LMP1的EBV肽潛在地適用于治療與EBV相關(guān)的疾病的免疫療法。尤其，本發(fā)明中所考慮的與EBV相關(guān)的腫瘤包括B細(xì)胞及T細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，和例如鼻咽癌(NPC)這樣的淋巴上皮瘤狀癌。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，”分離的”意指物質(zhì)由其自然狀態(tài)被移開(kāi)或使其能夠被人類使用。分離的物質(zhì)可以完全地或基本上與其在自然狀態(tài)下所伴隨的成分相分離，或可以被操縱以使得它與其自然狀態(tài)中所伴隨的成分共存。分離的物質(zhì)可以是天然的，化學(xué)合成的或重組形式。
“蛋白質(zhì)”是指一種氨基酸聚合體，該氨基酸可以是自然的或非自然的氨基酸，D-或L-型氨基酸，或是本領(lǐng)域所熟知的化學(xué)衍生氨基酸。
“肽”是指具有不超過(guò)50個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
“多肽”是指具有超過(guò)50個(gè)以上的氨基酸的蛋白質(zhì)。
“EBV CTL表位”是指由EBV基因組編碼的一種氨基酸序列，在體外或體內(nèi)，在有MHC I型存在的情況下，當(dāng)該氨基酸序列遇到至少一種T細(xì)胞克隆型(clonotype)時(shí)，它可以通過(guò)至少一種T細(xì)胞克隆型(clonotype)引起免疫應(yīng)答。此外該定義不排除T細(xì)胞表位，例如輔助T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。
如SEQ ID NO4-9所示的共有氨基酸序列為本發(fā)明的EBV CTL肽(SEQ ID NO10-39)中最小的共同區(qū)域(列于表2)。
適合地，上述EBV CTL肽表位由至少9個(gè)但不超過(guò)20個(gè)相連的氨基酸所組成。
在某些實(shí)施例中，上述EBV CTL肽表位由9個(gè)，12個(gè)或17個(gè)相連的氨基酸所組成。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述EBV CTL肽表位具有選組如下所作成的組的氨基酸SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ IDNO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31和SEQ ID NO37。
本發(fā)明還考慮到了例如多肽或多表位蛋白這樣的分離的蛋白，其包含本發(fā)明的一種或多種，或優(yōu)選大量的EBV CTL表位。例如，所述表位可以是單獨(dú)存在或重復(fù)存在，其中也包括一前一后排列的重復(fù)表位?！伴g隔基”氨基酸也可以包括在存在于上述分離的蛋白中的一個(gè)或多個(gè)該EBV CTL表位間。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一種純化的蛋白可能由一種或多種或優(yōu)選大量的本發(fā)明EBV CTL表位所組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種純化的蛋白基本上可為由一種或多種或優(yōu)選大量的本發(fā)明EBV CTL表位所組成。
“基本上由…所組成”是指除了EBV CTL表位序列之外，每種EBV CTL肽表位具有不超過(guò)5個(gè)，或優(yōu)選不超過(guò)3個(gè)氨基酸。
就特殊的多表位蛋白而言，這些額外的氨基酸殘基可以是指”間隔基”氨基酸。
還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多表位蛋白可以額外地包含一種或多種其它EBV CTL肽，例如一種或多種列于表2或表5的現(xiàn)有技術(shù)的LMP表位，和/或EBV CTL表位YLLEMLWRL(SEQ ID NO2)和YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多表位蛋白包含大量MHC I型限制性LMP1和/或LMP2CTL表位。
優(yōu)選，至少有一種上述CTL表位具有選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)和IALYQQNW(SEQ IDNO21)。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多表位包含13種EBVCTL表位，該表位分別具有以下的氨基酸YLLEMLWRL(SEQ IDNO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ IDNO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNTLLSAW(SEQ ID NO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQ ID NO59)。
更優(yōu)選，該分離的多表位蛋白具有如SEQ ID NO81(圖.8)所示的氨基酸序列。
表5及圖8中的多表位中的CTL表位是被篩選的包括了廣泛的MHC I型特異性的表位。例如，估計(jì)這些最優(yōu)選的HLA特異性包含了約90％的亞洲、非洲以及高加索人群。
還注意到，圖8中的分離的多表位蛋白(SEQ ID NO81)已被本申請(qǐng)的發(fā)明者證實(shí)可以誘導(dǎo)被多表位免疫的小鼠中的CD8+CTL應(yīng)答，該應(yīng)答可保護(hù)小鼠不受到腫瘤的攻擊。
同時(shí)還考慮了EBV CTL表位的變異體。
一般來(lái)說(shuō)，此處所用術(shù)語(yǔ)”變異體”是本發(fā)明的EBV CTL表位，其中被刪除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸或被不同的氨基酸所取代，但本質(zhì)上不改變其免疫原性。本領(lǐng)域熟知某些氨基酸可以被改變成具有廣泛相似的特性的其它氨基酸，但并不改變其免疫原性(保守取代)。
選擇性取代(selecting substitution)會(huì)造成功能的本質(zhì)改變，選擇性改變的保守度較小，其能被忍受的程度也相對(duì)較低。一般來(lái)說(shuō)，可能會(huì)造成蛋白質(zhì)特性最大改變的取代是那些其中(a)親水性殘基(如Ser或Thr)被疏水性殘基(如Ala，Leu，Ile，Phe或Val)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被其它任何殘基所取代；(c)具有帶正電側(cè)鏈的殘基(如Arg，His或Lys)被帶負(fù)電的殘基(如Glu或Asp)所取代；或(d)具有大側(cè)鏈的殘基(如Phe或Trp)被具有小側(cè)鏈的殘基(如Ala或Ser)或無(wú)側(cè)鏈的殘基(如Gly)所取代。
自然發(fā)生的變異體EBV CTL表位的特殊例子由表4與SEQ IDNO40-50提供，這些變異體衍生自特定的種族區(qū)域的EBV分離物，并將在以下詳細(xì)討論。
本發(fā)明還討論了本發(fā)明的EBV CTL表位的”衍生物”，例如通過(guò)氨基酸殘基的化學(xué)修飾，生物素?；?，與熒光染料結(jié)合，加入表位標(biāo)記(如c-myc，血細(xì)胞凝集素和FLAG標(biāo)記)，以及便于重組蛋白表達(dá)、檢測(cè)和純化(如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白，六組氨酸和麥芽糖結(jié)合蛋白，但不限于此)的融合配偶體(fusion partners)來(lái)生成。
氨基酸的化學(xué)修飾包括但不限于，酰化作用修飾，脒化，賴氨酸的pyridoxylation，還原性烷基化，用2，4，6-三硝基苯硫酸(TNBS)將氨基進(jìn)行三硝基苯化作用，通過(guò)將半胱氨酸過(guò)甲酸氧化成磺基丙氨氨來(lái)進(jìn)行羧基的酰胺修飾與氫硫基修飾，水銀劑衍生物的形成，二硫化物與其它硫醇化合物的混合物的形成，與馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)，碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化，以及在堿性pH下氰酸鹽的氨甲酰化，雖然不限于此。
在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等(John Wiley和Sons NY，1995-2000)第15章，其中有廣泛的與蛋白質(zhì)化學(xué)修飾相關(guān)的方法。
本發(fā)明的EBV CTL表位，EBV多表位以及包含此表位的蛋白質(zhì)可以通過(guò)任何現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法來(lái)生產(chǎn)，包括但不限于，化學(xué)合成，DNA重組技術(shù)和LMP蛋白的蛋白酶剪切以產(chǎn)生肽片段。
在一個(gè)實(shí)施例中，EBV CTL表位可以通過(guò)化學(xué)合成制備，包含固相和液相合成。這些方法是本領(lǐng)域中所熟知的，雖然參考文獻(xiàn)中有化學(xué)合成技術(shù)的實(shí)施例，如SYNTHETIC VACCINES Ed.Nicholson(Black 孔 Scientific Publications)的第9章以及CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等(John Wiley和Sons，Inc.NY USA 1995-2001)的第15章所提供的。在該方面，參考文獻(xiàn)也見(jiàn)于WO 99/02550和WO 97/45444。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的重組EBV CTL表位，或優(yōu)選，包含EBV CTL表位的蛋白質(zhì)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟方便地制備，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(冷泉港出版社，1989)，特別是第16和17章；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Eds.Ausubel等，(John Wiley和Sons，Inc.NY，USA，1995-2001)，特別是第10和16章；以及CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，(John Wiley和Sons，Inc.NY，USA，1995-2001)，特別是第1，5和6章。
核酸與表達(dá)結(jié)構(gòu)本發(fā)明提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的EBV CTL表位或多表位。
編碼本發(fā)明經(jīng)選擇的EBV CTL表位及其變異體的核苷酸序列如表4中所示。編碼本發(fā)明其它EBV CTL表位的核苷酸序列，可容易地由已公開(kāi)的完整LMP1編碼核酸序列推導(dǎo)出來(lái)，例如Genbank獲取號(hào)X58140。
本發(fā)明還提供了編碼EBV肽變異體的核苷序列，例如表4中所示(SEQ ID NO63-65，67-69，71-76和78-80)。
編碼多表位蛋白的分離的核苷序列如SEQ ID NO82和圖8所示。
此處所用術(shù)語(yǔ)”核酸”指單鏈或雙鏈mRNA，RNA，cRNA，RNAi和DNA，其中DNA包括cDNA和基因組DNA。
“多核苷酸”是具有80個(gè)或80個(gè)以上的連續(xù)核苷酸的核酸，而”寡核苷酸”具有少于80個(gè)的連續(xù)核苷酸。
“探針”可以是單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，適當(dāng)標(biāo)記后用于在Northern或Southern雜交中檢測(cè)其互補(bǔ)序列。
“引物”通常為單鏈寡核苷酸，優(yōu)選具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸，它可與其互補(bǔ)核酸模板退火，并由例如Taq聚合酶，依賴于RNA的聚合酶或測(cè)序酶(SequenaseTM)這樣的DNA聚合酶作用以依賴模板的方式延伸。
本發(fā)明還包括利用密碼子序列豐余序列修飾的核苷酸。在一個(gè)更特別的例子中，密碼子的使用可以被修飾以將特定生物或細(xì)胞型中的核酸的表達(dá)最大化。
本發(fā)明還包括經(jīng)修飾的嘌呤(例如次黃苷，甲基次黃苷和甲基腺苷)和經(jīng)修飾的嘧啶(如硫尿核苷及甲基胞嘧啶)的用途。
本發(fā)明還提供了表達(dá)結(jié)構(gòu)，其包括編碼至少一個(gè)，或優(yōu)選大量的本發(fā)明的EBV CTL表位的核苷酸序列。
恰當(dāng)?shù)兀鲜霰磉_(dá)結(jié)構(gòu)包含被可操作地連接到表達(dá)載體中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列的所述核苷酸序列。
存在于表達(dá)載體中的“調(diào)控核苷酸序列”可包括增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，剪接供體/受體信號(hào)，Kozac序列，終止子及聚腺苷酸化序列，如本領(lǐng)域所熟知的那樣并促進(jìn)被可操作地連接于其上的核苷酸序列的表達(dá)，或促進(jìn)被編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
這里所用的“可操作地連接”是指所述調(diào)控核苷酸序列與本發(fā)明的核苷酸序列有位置上的關(guān)聯(lián)，用以引起，調(diào)節(jié)或控制其轉(zhuǎn)錄。
調(diào)控核苷酸序列通常對(duì)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞或生物是適當(dāng)?shù)?。在本領(lǐng)域中已知有適用于各種宿主細(xì)胞的大量的各種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和合適的調(diào)控序列。
對(duì)于啟動(dòng)子，結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子(如CMV，SV40，牛痘，HTLV1以及人類延長(zhǎng)因子啟動(dòng)子)與誘導(dǎo)性/抑制性啟動(dòng)子(如tet-抑制性啟動(dòng)子及IPTG-金屬硫蛋白-或蛻皮激素-誘導(dǎo)性啟動(dòng)子)都是本領(lǐng)域中所熟知的，并包含于本發(fā)明中。也將意識(shí)到，啟動(dòng)子可以是結(jié)合超過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子元件的雜交型啟動(dòng)子。
優(yōu)選，所述表達(dá)結(jié)構(gòu)還包括一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，這些標(biāo)記適用于被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如bla，kanR及tetR)的篩選或被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如潮霉素，G418以及嘌呤霉素)的篩選。
表達(dá)結(jié)構(gòu)還可以包含了一個(gè)融合配偶體(fusion partner)，典型地由表達(dá)載體提供)，所以本發(fā)明的重組蛋白作為融合蛋白與所述融合配偶體一起被表達(dá)。融合配偶體主要的優(yōu)點(diǎn)是可以協(xié)助所述融合蛋白的鑒定和/或純化。
融合配偶體的例子已在前文中描述過(guò)。典型地，在以親和層析分離融合蛋白時(shí)，融合配偶體特別有用。為了使用親和層析純?nèi)诤隙嚯臅r(shí)，用于層析的相關(guān)基質(zhì)分別為抗體，蛋白A-或G-，谷胱甘肽，直鏈淀粉，以及鎳或鈷綴合樹(shù)脂。許多這樣的基質(zhì)皆可買到試劑盒的形式獲得，例如適用于(HIS6)融合配偶體的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。
適合于表達(dá)的宿主細(xì)胞可為原核或真核細(xì)胞，如大腸桿菌(例如DH5α)，酵母細(xì)胞，應(yīng)用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的Sf9細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如原淋巴細(xì)胞系，鼠EL4細(xì)胞和分離自被轉(zhuǎn)化的如人或鼠這樣的被轉(zhuǎn)化的宿主生物的脾細(xì)胞，盡管不限于此。
表達(dá)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)許多已熟知的任一技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物中，這樣的技術(shù)包括但不限于熱激轉(zhuǎn)化，電穿孔，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，顯微注射，脂質(zhì)體接介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)融合，微粒轟擊，病毒轉(zhuǎn)化及類似技術(shù)。
在一個(gè)特別的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種以多表位表達(dá)結(jié)構(gòu)的形式存在的表達(dá)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選，所述此多表位結(jié)構(gòu)適于用做DNA疫苗。
根據(jù)這一實(shí)施例，編碼大量EBV CTL表位的核酸可以，例如由合成的寡核苷酸采用例如Splice Overlap by Extension PCR這樣的技術(shù)來(lái)合成，如Thomson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925845中所描述的那樣。
在一些特別的形式中，本發(fā)明的表達(dá)結(jié)構(gòu)可用于表達(dá)和運(yùn)送病毒源載體，如痘病毒與腺病毒。
當(dāng)被用做疫苗運(yùn)送系統(tǒng)時(shí)，病毒源的表達(dá)結(jié)構(gòu)可以VLPs的形式或作為“裸露的”核酸結(jié)構(gòu)施用于動(dòng)物。
在一個(gè)特別實(shí)施例中，根據(jù)該實(shí)施例的多表位表達(dá)結(jié)構(gòu)包含牛痘病毒啟動(dòng)子，如存在于質(zhì)粒子載體中的p7.5啟動(dòng)子。例如，Khanna等，1992提出以標(biāo)記獲救重組來(lái)生產(chǎn)TK-重組體牛痘病毒。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基于腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)，用于疫苗運(yùn)送系統(tǒng)。基于腺病毒的結(jié)構(gòu)可感染大范圍的哺乳動(dòng)物或人類細(xì)胞，包括休眠或增生細(xì)胞。
這種基于腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)可以包含結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性/抑制性啟動(dòng)子，如四環(huán)素誘導(dǎo)性/抑制性系統(tǒng)。
這種基于腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)的優(yōu)選形式為缺少至少一個(gè)E1基因的衍生自不可復(fù)制型A5腺病毒。這樣的不可復(fù)制型用克隆技術(shù)的Aden-X系統(tǒng)來(lái)提供。
下文詳細(xì)提供了特別優(yōu)選的基于腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)與疫苗運(yùn)送系統(tǒng)。
藥物組合物與疫苗本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種EBV CTL表位的藥物組合物，包括變異體及其衍生物，或是編碼相同表位的核酸表達(dá)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的藥物組合物為“免疫療法組合物”，提供可對(duì)如前所述的與EBV相關(guān)的疾病的治療與預(yù)防。
在一特別實(shí)施例中，所述藥物組合物是疫苗。
疫苗的形式可以是富含蛋白疫苗(proteinacious vaccine)的形式，其包含一種或多種本發(fā)明EBV CTL表位，包括了亞單位疫苗或DNA疫苗形式，它的一個(gè)特別的例子是如前文所述的多表位表達(dá)結(jié)構(gòu)。
與DNA疫苗相關(guān)的潛在的合適的技術(shù)可見(jiàn)于WO 96/03144和Thomson等，1998，J.Immunol.160 1717。
基于腺病毒結(jié)構(gòu)的運(yùn)送可經(jīng)系統(tǒng)性施用于動(dòng)物或是經(jīng)由如樹(shù)突細(xì)胞這樣的初級(jí)轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，接著將被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞施用于動(dòng)物體內(nèi)。
Ranieri，1999和Gahn等，2001年提出了被腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突細(xì)胞用于治療與EBV相關(guān)的疾病時(shí)的運(yùn)送實(shí)例。
恰當(dāng)?shù)?，藥物組合物更進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
“藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑”是指可以安全地進(jìn)行系統(tǒng)性施用的固體或液體填充物，稀釋劑或做成膠囊的物質(zhì)等。依照施用時(shí)的特殊途徑，可以使用本領(lǐng)域中所熟知的各種不同的載體。這些載體以選自包括糖類，淀粉，纖維素及其衍生物，麥牙，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸緩沖液，乳化劑，等張鹽水與鹽類，鹽類是如同包括了氯化氫的礦物酸鹽，溴化物與硫化物，有機(jī)酸如醋酸鹽，丙酸鹽與丙二酸鹽以及無(wú)熱原水(pyrogen-free water)。
一篇描述藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑和賦形劑的有用參考文獻(xiàn)，見(jiàn)于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)。
可用任何安全途徑為患者提供本發(fā)明的組合物?？墒褂美缃?jīng)口，直腸，腸外注射，舌下，口腔，靜脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，肌肉內(nèi)，真皮內(nèi)與皮下的注射，或經(jīng)吸入，眼球內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦室內(nèi)或經(jīng)透皮膚等及其類似途徑。例如，肌肉內(nèi)與皮下注射較適合于免疫原性組合物，富含蛋白疫苗以及DNA疫苗的施用。
藥劑形式包括藥片，散劑(dispersions)，懸浮物，注射劑，溶液，糖漿，片劑，膠囊，栓劑，噴劑，穿透皮膚的貼片等及其類似形式。藥劑形式也可包括注射或移植一種專門設(shè)計(jì)的受控制放射裝置，或是其它經(jīng)過(guò)修飾形式的有其它作用的移植物。受控制的治療試劑的放射可受其包被影響，例如，有疏水性聚合物包括丙烯酸樹(shù)指，蠟，高脂肪酒醇，多乳酸與多甘醇酸(polyglycolic acids)，以及一些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素。另外，受控制的放射也可以用其它聚合物聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體和/或微球體粒子來(lái)影響。
適合口服或腸外注射的本發(fā)明的藥物組合物可以獨(dú)立單位呈現(xiàn)，如膠囊，小袋，或藥片，每單位含有一種以上預(yù)定量的本發(fā)明的一種或多種藥劑，以粉末或顆?；蛞匀芤?，水溶液中的懸浮物，非水溶液，油分散于水中的乳濁液或水分散于油中的乳濁液。這種組合物可用任何配藥方法配制，但每種方法皆包含這樣的步驟將含有一種或多種必須成分的載體與一種或多種上述藥劑結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的藥劑與液相載體或精細(xì)分隔的固相載體或兩者皆有，做完全一致的混合后制成組合物，之后若需要的話，再將產(chǎn)物塑成想要的外型。
可用與藥劑設(shè)計(jì)兼容的方法來(lái)以藥物有效量施用上述組合物。在本發(fā)明內(nèi)容中，對(duì)病患施用的劑量足以在一段適當(dāng)時(shí)間后在患者身上產(chǎn)生有利的應(yīng)答。施用劑量應(yīng)由醫(yī)師判斷，視施用對(duì)象的各種因素而定，如年齡，性別，體重及其一般健康狀況等。
在一個(gè)特別的免疫療法組合物與疫苗的例子中，“藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑”可為一佐劑。在本領(lǐng)域中將會(huì)了解，“佐劑”是指包含一種或多種物質(zhì)的組合物，其可增強(qiáng)疫苗組合物的免疫原性與效力。合適的佐劑沒(méi)有限定性的例子，包括角鯊?fù)楹徒酋徬?或其它動(dòng)物油)；嵌段共聚物；洗滌劑如Tween-80；QuilA，礦物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；棒狀桿菌衍生佐劑如氨芐咪唑；丙酸桿菌衍生佐劑如Propionibacterium acne；牛型結(jié)核菌(Bacille Calmette和Guerin或BCG)；百日咳博德特氏菌抗原；破傷風(fēng)類毒素；diptehria類毒素；白細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素2和白細(xì)胞介素12；單核因子如白細(xì)胞介素1；腫瘤壞死因子；干擾素如gamma-干擾素；組合物如皂苷-氫氧化鋁或Quil-A aluminium氫氧化鋁；脂質(zhì)體；ISCOM和ISCOMATRIX佐劑；結(jié)核桿菌細(xì)胞壁萃取物；合成糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；Avridine；脂質(zhì)A衍生物；葡聚糖硫酸酯；單獨(dú)的DEAE-extran或與磷酸鋁的混合物；羧基聚甲烯如聚羰乙烯′EMA；丙烯酸共聚物乳濁液如Neocryl A640(例如US 5047238)；水分散于油中的乳濁液如Montanide ISA 720小兒麻痹病毒，牛痘或動(dòng)物痘病毒蛋白；或其混合物。
對(duì)于亞單位疫苗，這種疫苗的一個(gè)制配實(shí)施例是以ISCOM來(lái)配制，如同WO97/45444所描述的。
抗體本發(fā)明還包括針對(duì)本發(fā)明的EBV CTL表位的抗體。
本發(fā)明的抗體可以是單克隆或多克隆抗體?？贵w制造，純化與使用的方法已為大家所熟知，可見(jiàn)于Coligan等，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley和Sons NY，1991-1994)的第二章以及Harlow，E.和0 Lane，D，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988，兩者在此處都通過(guò)引用被合并近來(lái)。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的抗體會(huì)與本發(fā)明的一個(gè)多肽，片段，變異體或衍生物結(jié)合或綴合結(jié)合。例如，抗體可包含多克隆抗體。制備這種抗體，可以將本發(fā)明的多肽，片段，變異體或衍生物注射到生產(chǎn)型物種，這可以包括小鼠與家兔，以獲的多克隆抗血清。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備多克隆抗體的方法?？梢允褂玫牡湫头椒ㄒ?jiàn)于前述的Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Harlow和Lane，1988。
用于代替獲自生產(chǎn)物種的多克隆抗血清，單克隆抗體可以標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備，這樣的方法例如詳述于之前所提的Khler和Milstein，1975，Nature 256，495中所描述的，或多個(gè)其最近修飾體如Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY所描述的，是將一種或多種多肽，片段，變異體或衍生物接種到生產(chǎn)用的物種，取其無(wú)限增殖的脾臟細(xì)胞或其它抗體產(chǎn)生細(xì)胞來(lái)制備單克隆抗體。
本發(fā)明還包括在上述單克隆或多克隆抗體中，包含抗體的Fc或Fab片段?？蛇x地，抗體可包含針對(duì)本發(fā)明的分離的蛋白的單鏈抗體Fv(scFvs)。這種scFv例如可以依照下列各文中的方法來(lái)制備，US No5091513，EP239400或Winter和Milstein，1991，Nature 349293的標(biāo)記與本發(fā)明的抗體或抗體片段有關(guān)。
標(biāo)記選擇包括以下的組色素原，催化劑，酶，螢光劑，化學(xué)冷光分子，鑭系離子如銪(Eu34)，放射性同位素與直接視覺(jué)標(biāo)記。直接視覺(jué)標(biāo)記可以由下列物質(zhì)組成使用，包括膠狀或非金屬粒子，染色粒子，酶或底物，有機(jī)聚合體，乳濁液顆粒，脂質(zhì)體，或其它含有信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的小泡，及類似物。
于US 4366241，US 4843000和US 4849338詳細(xì)陳述許多可用來(lái)做標(biāo)記的酶，它們?cè)谶@通過(guò)引用合并入本發(fā)明。本發(fā)明中有用的酶標(biāo)記包括堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧物酶，螢光素酶，b-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，蘋果酸脫氫酶及類似物質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記可以單獨(dú)使用或者與溶液中的第二種酶結(jié)合來(lái)使用。
雖不限于此，但經(jīng)實(shí)施例，螢光染色劑可為異硫氰酸熒光素(FITC)，奧地綠(oregon green)，異硫氰酸熒光素(TRITL)，別藻藍(lán)素(APC)及R-藻紅蛋白(RPE)。
所以本發(fā)明可容易地被理解并付諸實(shí)際作用，下列非限制性實(shí)施例可引導(dǎo)技術(shù)人員，其中實(shí)施例一提出本發(fā)明EBV CTL表位的說(shuō)明與免疫特性描述，實(shí)施例二則提出腺病毒介導(dǎo)的本發(fā)明的EBV多表位運(yùn)輸方式。
實(shí)施例實(shí)施例1材料與方法細(xì)胞系的建立與維持以B95.8，BL74與QIMR-WIL病毒分離株來(lái)將外周B細(xì)胞做外源性病毒轉(zhuǎn)化，由血清陽(yáng)性的捐贈(zèng)者來(lái)建立EBV轉(zhuǎn)化的LCLs。這些細(xì)胞系例行性地保持在添加了2mM L-谷氨酸鹽，100IU/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素外加10％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基RPMI1640中。此外，肽運(yùn)輸物(TAP)-陰性BxT雜交細(xì)胞系。174×CEM.T2(稱為T2)(Salter 1986)肽穩(wěn)定性分析。
為了產(chǎn)生植物凝集素(PHA)胚細(xì)胞，以PHA刺激外周血單核細(xì)胞(PBMC)(CSL Ltd，Melbourne，Australia)，培養(yǎng)三天后，含有MLA 144上清液的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和高度純化的重組人類IL-2(rIL-2)被添加(Khanna 1992)。每?jī)芍芨鼡QrIL-2與MLA上清液以使PHA胚細(xì)胞增殖(不再添加PHA)，直至六周。
病毒分離株LCLs(類淋巴母細(xì)胞系)由一組不相關(guān)的健康捐贈(zèng)者來(lái)建立，這些捐贈(zèng)者為血清陽(yáng)性的非洲人，高加索人以及新幾內(nèi)亞人。建立的方法為，在0.1μg/ml環(huán)包菌素A存在的條件下(Moss 1988)，讓培養(yǎng)的外周淋巴細(xì)胞自發(fā)性的生長(zhǎng)。總數(shù)為29的自發(fā)性LCLs(11個(gè)高加索人，11個(gè)新幾內(nèi)亞人，2個(gè)非洲人，以及5個(gè)東南亞人)被用來(lái)使每個(gè)獨(dú)立個(gè)體重獲其固有的EBV分離群。此外，由EBV攜帶者的鼻咽癌活體切片直接測(cè)序16種來(lái)自東南亞人的病毒分離株。
EBV基因片段的PCR與DNA測(cè)序側(cè)面連接LMP1基因不同區(qū)域的特定寡核苷酸引物被選擇用于PCR擴(kuò)增(表1)。結(jié)果的PCR的產(chǎn)物以QIAquick旋轉(zhuǎn)柱(QiagenInc.Chatsworth，CA)純化，而且遵照制造者的實(shí)驗(yàn)步驟以PRISMready reaction dyedeoxy terminator cycle測(cè)序試劑盒(AppliedBiosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)從兩端做測(cè)序。
合成肽肽的氨基酸序列是由公布的LMP1序列而來(lái)，這些LMP1序列是原自高加索原樣型1EBV菌株B95.8。用Merrifield固相法(MimotopesPty Ltd，Melbourne，Australia)在自動(dòng)肽合成儀上合成45個(gè)肽，長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸，8個(gè)殘基重疊，且橫跨整個(gè)LMP1序列。肽試樣量被溶于20％DMSO中至2mg/ml。
EBV血清陽(yáng)性捐贈(zèng)者招募一組來(lái)自不同種族的42位健康病毒攜帶者與鼻咽癌患者來(lái)進(jìn)行此研究。每位捐贈(zèng)者經(jīng)血清學(xué)和基于PCR的DNA分型方法進(jìn)行HLA分型(表2)。
INF-γ-ELISPOT分析ELISPOT分析是用來(lái)評(píng)估來(lái)自帶有LMP1肽的大量血清陽(yáng)性捐贈(zèng)者的PBMC經(jīng)刺激后能否誘導(dǎo)T細(xì)胞中INF-γ的表達(dá)(Bharadwaj2000)。簡(jiǎn)言之，將96孔充分混合的纖維素酯膜平板(Millipore，Bedford，USA)預(yù)先涂上100μL/孔的10μg/mL的抗-IFN-γmAb，1-D1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)，于4℃過(guò)夜。每板用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌3次，不具活性的部位以5％的牛胎血清阻斷。來(lái)自已知HLA分型的健康的EBV攜帶者的PBMCs用Ficoll-Hypaque(Sigma)密度梯度離心從全血中分離出來(lái)。將PBMCs加入三個(gè)一組的孔中，每孔體積100μL含2.5×105個(gè)細(xì)胞，然后將肽加入PBMCs中至終濃度達(dá)5μg/Ml。同時(shí)做一組含三種不同細(xì)胞數(shù)的測(cè)試，三個(gè)孔分別含2.5×105，1.5×105及1×105個(gè)PBMC細(xì)胞。分析PBMCs對(duì)不同濃度肽的反應(yīng)，肽濃度分別為10μg/mL，5μg/mL及1μg/ml。在陰性對(duì)照中，將PBMCs單獨(dú)培養(yǎng)在未加肽的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。平板于37℃，5％的CO2濃度下培養(yǎng)過(guò)夜(約16-20小時(shí))，再前后分別以PBST(0.05％的Tween-20于PBS中)與PBS沖洗三次，然后每孔加入100μl的1μg/mL抗-IFN-γmAb，7-B6-1(Mabtech，Stockholm，Sweden)，并于室溫孵育3-4小時(shí)。孵育后再前后分別以PBST與PBS各沖洗三次，再在每孔添加100μl的1μg/mL抗生蛋白鏈霉素-堿性磷酸酯酶綴合物(Sigma)。平板在室溫下孵育2小時(shí)。然后再次分別以PBST與PBS洗滌孔各三次，用堿性磷酸酶綴合基質(zhì)(BCIP/NBT；Sigma)與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和氮藍(lán)四唑進(jìn)行30分鐘到1小時(shí)的顯色反應(yīng)，就可以看到呈黑色斑點(diǎn)狀的個(gè)別IFN-γ生成細(xì)胞。以影像分析軟件自動(dòng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)(ImagePro)(Bharadwaj 2001)，并以斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/106PBMCs來(lái)表示。分泌IFN-γ的T細(xì)胞的其數(shù)目是通過(guò)從實(shí)驗(yàn)組的SFC計(jì)數(shù)中減去陰性對(duì)照值來(lái)計(jì)算。
去除CD4+與CD8+細(xì)胞用抗人CD4+或CD8+免疫磁性微粒去除新鮮PBMCs中的CD4+或CD8+細(xì)胞(Dynabeads M450-CD4和M450-CD8)，分別(Dynal，Oslo，Norway)依照廠商的建議。通過(guò)對(duì)被去除的PBMCs用FITC-綴合抗-CD8和PE-綴合抗-CD4抗體雙重染色，及用Coulter EPICSXL細(xì)胞計(jì)數(shù)器的流式細(xì)胞儀來(lái)確定去除的有效性。FACScan分析可確定此實(shí)驗(yàn)方法能去除＞95％的CD4+或CD8+細(xì)胞。細(xì)胞被重新計(jì)數(shù)，再將細(xì)胞重懸于R10中，并設(shè)置于一式三份的ELISPOT分析中。
多克隆CTL系與LMP1特異性CTL克隆的建立依先前公布的方法(Mossl988；Khannal998)來(lái)建立多克隆CTL系與LMP1特異性CTL克隆。簡(jiǎn)言之，在24孔板中2ml孔體積，用被10μM肽所觸發(fā)的1×106個(gè)自體淋巴細(xì)胞刺激2×106個(gè)PBMCs(應(yīng)答物對(duì)刺激物比值為2∶1)1小時(shí)。3天后加入含有IL-2(10U/ml)的培養(yǎng)基讓細(xì)胞繼續(xù)增殖。到第7天時(shí)以γ放射性(8000rad)自體LCLs再次刺激淋巴細(xì)胞。在培養(yǎng)基中十天后，這些細(xì)胞在針對(duì)肽敏感的自體PHA胚細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)51Cr放射分析中用作多克隆效應(yīng)子。
為了生產(chǎn)對(duì)LMP1衍生肽有特異性的外周血CTL克隆，在孔體積在培養(yǎng)基中的24孔板的2ml孔中用對(duì)肽敏感的(10ug肽/ml)自體免疫細(xì)胞(1×106)重新活化健康捐贈(zèng)者的PBMCs(2×106)。3天后，細(xì)胞被接種到0.35％的瓊脂糖上，并在含有гIL-2(50IU/ml)的T細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基維持。3天后，長(zhǎng)出的克隆被轉(zhuǎn)移到圓底的96-孔培養(yǎng)皿中(Life Technologies)，并培養(yǎng)于含有гIL-2(50-100IU/ml)的T細(xì)胞培養(yǎng)基中。
T細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的殺傷此項(xiàng)技術(shù)(Burrows，1992)是基于在CTL培養(yǎng)基中的細(xì)胞對(duì)彼此呈遞肽抗原的活性，如果是合適的肽，將導(dǎo)致CTL-CTL殺傷。CTL克隆(約300個(gè)細(xì)胞/孔)孵育在含10μM肽的25μl T細(xì)胞培養(yǎng)基中。于37℃培養(yǎng)3小時(shí)后用倒置顯微鏡評(píng)估細(xì)胞溶解的情形。
細(xì)胞毒性分析以合成的肽表位對(duì)靶細(xì)胞預(yù)敏，然后用51Cr孵育90分鐘。孵育后在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中洗滌這些細(xì)胞，并將這些細(xì)胞用做5小時(shí)51Cr放射分析中的靶(Moss，1988)。
MHC穩(wěn)定性分析為評(píng)估MHC與EBV分離群得到的HLA A2-限制性LMPI表位變異體的結(jié)合，將T2細(xì)胞(2×105)與200μl的每種肽(100μg/ml)在26℃下孵育14-16小時(shí)，接著在于37℃下孵育2-3小時(shí)。孵育后采用以特異性單克隆抗體(HB82，ATCC)，通過(guò)FACS測(cè)量HLA A2的表達(dá)。
結(jié)果不同種族健康病毒攜帶者體內(nèi)的LMP1-特異性T細(xì)胞應(yīng)答為了充分描述記憶T細(xì)胞對(duì)血清陽(yáng)性病毒攜帶者體內(nèi)LMP1的應(yīng)答，我們使用ELISPOT分析法，這種分析法可以在體內(nèi)快速地勾勒出LMP1-特異性免疫應(yīng)答而不會(huì)延長(zhǎng)體內(nèi)培養(yǎng)。用整組重疊LMP1肽刺激分離自血清陽(yáng)性病毒攜帶者的PBMC(表2)，并檢測(cè)生產(chǎn)INF-γ的細(xì)胞。圖1A和B代表用整組重疊肽做ELISPOT分析的數(shù)據(jù)(17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，8個(gè)殘基重疊)。在檢測(cè)的21個(gè)健康捐贈(zèng)者中，有7位對(duì)45種肽中的7種有強(qiáng)烈的體內(nèi)應(yīng)答(SFC范圍從39-824/106個(gè)PBMC)(圖IA)。這些應(yīng)答的一個(gè)有趣現(xiàn)象是大部分的T細(xì)胞反應(yīng)都直接針對(duì)這些存在于LMP1跨膜部分與CTAR1結(jié)構(gòu)域中的表位，然而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何針對(duì)CTAR2和N末端的反應(yīng)(圖1B)。特別地，CTAR1結(jié)構(gòu)域中幾乎有80％的區(qū)域皆會(huì)被T細(xì)胞識(shí)別。圖1列出所有會(huì)被不同捐贈(zèng)者識(shí)別的17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽。為了鑒定出能對(duì)這些肽有應(yīng)答的T細(xì)胞亞型，我們從7位能識(shí)別17mer肽的捐贈(zèng)者中分離出PBMCs，將其分成CD4消去型與CD8消去型兩群，然后再用ELISPOT分析法檢測(cè)。這些肽中有5種對(duì)CD4+與CD8+T細(xì)胞都有活性，這表明這些序列包括了MHC I型與MHC II型限制性表位。另一方面，肽DWTGGA LLVLYSFALML清楚地顯示出其只對(duì)依賴于CD8+T細(xì)胞的有活性，然而對(duì)肽TDDSGHES DSNSNEGRH的應(yīng)答則主要是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)(圖2A和B)。肽TDDSGHESDSNSNEGRH的依賴于CD4的活性與先前Leen及其同事所觀察到的結(jié)果一致，他們圖繪出了該序列中的HLA DQ2-限制性表位。
LMP1特異性T細(xì)胞應(yīng)答的詳細(xì)做圖在ELISPOT分析中，使用經(jīng)過(guò)截短的17mer肽來(lái)得到LMP1特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的詳細(xì)做圖。實(shí)驗(yàn)起初以12mer重疊性肽來(lái)繪制17mer肽中的免疫原性區(qū)域。取自4位個(gè)體捐贈(zèng)者的重疊肽的代表性如圖3A-D所示?？偟?2種12mer肽被認(rèn)為可能是決定因子(參見(jiàn)表3)。基于這些12mer肽，跨越12mer肽的重疊的9mer肽被用于界定出最小表位序列。來(lái)自4個(gè)不同捐贈(zèng)者的代表性數(shù)據(jù)如圖4A-D所示。共有18種9mer肽被認(rèn)為可能是最小的表位序列(表3)。其中兩種最小序列(YLLEMLWRL和YLQQNWWTL)在之前已被鑒定為CTL表位(Khanna，1998)，而其它的序列則是在本研究中第一次被發(fā)現(xiàn)。
新LMP1 CTL表位的特性為了進(jìn)一步描述由ELISPOT分析所確定的最小T細(xì)胞表位的特性，我們制備出對(duì)這些表位有特異性的多克隆CTL細(xì)胞系與克隆CTL細(xì)胞系。用合成的肽表位刺激來(lái)自健康血清陽(yáng)性捐贈(zèng)者的PBMCs，并在標(biāo)準(zhǔn)51Cr放射實(shí)驗(yàn)來(lái)建立CTL克隆或多克隆細(xì)胞系。圖5與圖6為兩種新表位(IALYLQQNW和ALLVLYSFA)的一系列數(shù)據(jù)。先以肽敏感的自體PBMC來(lái)刺激，接著再以放射性自體LCL連續(xù)重復(fù)刺激以產(chǎn)生IALYLQQNW肽特異性CTL克隆。用51Cr放射分析針對(duì)于對(duì)肽敏感的自體與異體PHA胚細(xì)胞以及LCLs來(lái)篩選具有IALYLQQNW特異性CTL活性的CTL克隆。圖5A中的數(shù)據(jù)清楚地顯示，與CTL僅共享HLA B57的靶細(xì)胞被IALYLQQNW特異性CTL克隆所識(shí)別，這表明該表位只受HLA B57等位基因限制。自體PHA胚細(xì)胞最小表位的滴定進(jìn)一步確定了該CTL克隆的精細(xì)特異性(圖5B)。
先前對(duì)HIV CTL表位的研究顯示，相似的HLAI型分子可呈現(xiàn)出完全相同的肽如CTL表位(Goulder等，2000)。因?yàn)镠LA B57與HLA B58的一般亞型只有幾個(gè)氨基酸的差異，并享有相似的肽結(jié)合基元，所以我們便探究IALTLQQNW也會(huì)受到HLA B58等位基因的限制的可能性。我們對(duì)兩位HLA B58健康血清陽(yáng)性捐贈(zèng)者的研究也確實(shí)顯示出對(duì)最小IALTLQQNW表位有同等強(qiáng)烈的應(yīng)答(表3)。這些觀察顯示，該表位展現(xiàn)出對(duì)HLAB57與HLAB58兩者的雙重HLA限制。用與上述相類似的方式鑒定了HLA-A2限制性CTL表位。用肽特異性T細(xì)胞系來(lái)確認(rèn)ALLVLYSFA表位的HLA A2限制性(圖6A)。ALLVLYSFA表位特異性CTL克隆的精細(xì)特異性隨后通過(guò)最小肽的劑量應(yīng)答分析來(lái)證實(shí)(圖6B)。
其它17-mer肽，TDDSGHESDSNSNEGRH，在ELISPOT分析中表現(xiàn)出CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，分析中有3/21的健康捐贈(zèng)者其反應(yīng)大小介于131-190SFC/106PBMC之間(圖1A)。建立自兩位不同捐贈(zèng)者的多克隆CTL細(xì)胞系會(huì)識(shí)別以肽包被的自體PHA胚細(xì)胞(數(shù)據(jù)未列出來(lái))。兩位捐贈(zèng)者(MM和RE)分別識(shí)別最小肽ESDSNSNEG和DSNSNEGRH，但這些最小表位并不會(huì)導(dǎo)致CTL細(xì)胞系的產(chǎn)生。值得注意的是，Leen及其同事之前已繪制出一個(gè)位于17mer序列之間的HLA DQ2-限制性T細(xì)胞表位(表3)。
不同人種對(duì)最小HLAI型-限制性LMP1 CTL表位的識(shí)別為了確定對(duì)HLAI型-限制性LMP1CTL表位識(shí)別的頻率，我們用ELISPOT分析法從一組不同種族的健康病毒攜帶者中篩選出PBMC。分析的詳細(xì)摘要列于表3。此分析中包含4種不同的HLA I型限制性及一種HLA II型限制性T細(xì)胞表位。我們觀察到對(duì)有35-45％測(cè)試的捐贈(zèng)者中對(duì)HLA-A2限制性YLLEMLWRL，YLQQNWWTL和ALLVLYSFA表位有強(qiáng)烈應(yīng)答。這些應(yīng)答在高加索人中有較高的一致性，而這些表位被東南亞捐贈(zèng)者識(shí)別的頻率則較低。HLA-B57限制性IALYLQQNW表位被5/7的HLA B57陽(yáng)性個(gè)體所識(shí)別。令人感興趣的是，一些HLA B58陽(yáng)性捐贈(zèng)者(3/5)也識(shí)別該表位，且與HLA B57陽(yáng)性捐贈(zèng)者同樣有效，由此進(jìn)一步證實(shí)了該表位有雙重的HLA I型限制性。HLA II型限制性LMP1表位TDDSGHESDSNSNEGRH會(huì)被所有三種健康的病毒攜帶者所識(shí)別。
源自不同地理區(qū)域的EBV分離群中其HLAI型限制性LMP1 CTL表位的序列分析本發(fā)明與我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究(Khanna，1998)中，LMP1內(nèi)的表位都通過(guò)參考I型EBV菌株，B95.8再活化的CTL來(lái)確認(rèn)。然而在治療EBV相關(guān)惡性腫瘤時(shí)，這種表位若是有效CTL治療的基礎(chǔ)，我們就必須首先確定這些表位序列在世界各地不同人群的其它EBV菌株中的保守程度。因此，我們從健康病毒攜帶者與NPC活體切片中分離出許多EBV，并將其編碼LMP1表位的DNA區(qū)域做序列分析。四種LMP1表位(IALYLQQNW，ALLVLYSFA，YLLEMLWRL和YLQQNWWTL)的序列分析結(jié)果的詳細(xì)摘要列于表4。來(lái)自高加索，非洲以及東南亞捐贈(zèng)者病毒分離株，其HLAA2限制性(ALLVLYSFA和YLQQNWW TL)以及HLA B57和B58限制性(IALYLQQNW)表位皆高度保留(表4)。只有少數(shù)病毒分離株顯示出有輕微的表位序列變異。在新幾內(nèi)亞人分離株中，雖然YLQQNWW TL和IALYLQQNW表位通常是保守的，然而取代的情形在ALLV LYSFA中更加普遍。每單一分離株都顯示有一個(gè)相同的改變，即在第7位由絲氨酸變?yōu)楸彼?表4)。
對(duì)HLA A2限制性表位的序列分析，來(lái)自不同人種的EBV分離株中的YLLEMLWRL揭示了一個(gè)有趣的遺傳變異形式。高加索人分離株有5/11對(duì)YLLEM LWRL表位表現(xiàn)出原樣型B95.8序列，其它7/11的分離株則有一些改變，影響一個(gè)或多個(gè)殘基(表4)。在四個(gè)分離株中，位置2的亮氨酸，位置5的甲硫氨酸以及位置8的精氨酸分別被取代為苯丙氨酸，異亮氨酸以及甘氨酸。其它兩個(gè)分離株在位置2與位置5或只有位置5顯示有取代。對(duì)來(lái)自東南亞人群的病毒分離株的序列分析顯示幾乎所有分離株皆有相同的取代情形，其中包括位置2(L→F)和位置5(M→I)的取代。一個(gè)分離株顯示在位置4有突變(E→D)。在這必須重要地強(qiáng)調(diào)，來(lái)于自發(fā)性LCLs和NPC活體切片兩者的病毒分離株一般都表現(xiàn)出相同的突變形式(表4)。在東南亞人群的分離株中，并沒(méi)有檢測(cè)到任何的野生型序列。令人感興趣的是，在東南亞人群中發(fā)現(xiàn)的表位YLLEMLWRL表位的顯性遺傳變異形式(YFLEILWRL)，這也常出現(xiàn)在高加索人群的病毒分離株中。
為了更進(jìn)一步表針YLLEMLWRL表位的遺傳變異體，我們合成每種變異體序列的合成肽，并用EBV特異性CTL來(lái)做HLA結(jié)合和免疫識(shí)別的評(píng)估。如圖7所示的數(shù)據(jù)表明，在致敏性自體PHA胚細(xì)胞被特異性CTL克隆水解時(shí)，大多數(shù)變異體序列的合成肽作用效率比原養(yǎng)野生型YLLEMLWRL肽顯著要低。只有一種變異體序列YLLEILWRL被認(rèn)為與野生型表位同樣有效(圖7A)。此外，在用常見(jiàn)于東南亞人群分離株的變異體肽序列(YFLEILWRL)孵育T2細(xì)胞時(shí)，并無(wú)法挽救HLA A2的表達(dá)(圖7B)。其它變異體肽(YFLEILWGL，YLMEILWRL和YLLEILWRL)卻明顯地增加了T2細(xì)胞上MHC表達(dá)，這表示造成這些變異體喪失其抗原性歸因于T細(xì)胞受體與MHC-肽復(fù)合體間的相互作用不恰當(dāng)，而不是不與MHC結(jié)合。
實(shí)施例2材料與方法重組LMP1多表位插入片段的構(gòu)建編碼多表位氨基酸序列的DNA序列是由通用密碼子設(shè)計(jì)的。我們將有20個(gè)堿基對(duì)重疊的5條長(zhǎng)寡核苷酸(引物1-5，長(zhǎng)度范圍在74-100個(gè)堿基之間)代表了多表位DNA序列，通過(guò)重疊延伸和逐步不對(duì)稱PCR(stepwise asymmetric PCR)(參見(jiàn)圖8)的剪接方式將它們?cè)谝黄鹜嘶?。?jiǎn)言之，多表位序列特異性引物L(fēng)MPA與LMPB用開(kāi)始為高溫的PCR反應(yīng)(94℃，1分鐘)擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體積為20μl內(nèi)含延長(zhǎng)酶混合物與PCR緩沖液。5個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，PCR程序會(huì)暫停在72℃，將上述反應(yīng)液體2μl轉(zhuǎn)移到新的72℃預(yù)熱的20μl反應(yīng)液中，用引物L(fēng)MPC及多表位序列特異性正向引物再進(jìn)行另五個(gè)循環(huán)。在第10個(gè)循環(huán)時(shí)，程序會(huì)再次暫停，再將2μl后一次的反應(yīng)液添加到新的20μl反應(yīng)液中，用引物L(fēng)MPD及多表位序列特異性正向引物再進(jìn)行五個(gè)循環(huán)。所有寡核苷酸都被加入之前，該逐步PCR被一直重復(fù)。在最后一個(gè)步驟中，用多表位序列特異性正向和反向引物將最后一次的2μl反應(yīng)液做擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。
該片段的核酸序列(從5’末端起)依次編碼Bam HI限制性酶切位點(diǎn)，Kozak共有序列，甲硫氨酸起始密碼子，13個(gè)連續(xù)的最小LMPl和LMP2CTL表位(表5)，終止密碼子，EcoRI限制性酶切位點(diǎn)(圖8)。全長(zhǎng)凝膠純化的PCR片段被克隆到接入pcDNA3表達(dá)載體的BamHI/EcoRI位點(diǎn)，通過(guò)測(cè)序檢查突變。
制備Ad5-LMP多表位疫苗載體使用使用Adeno-X系統(tǒng)(CLONTECH，Palo Alto，CA)的高效的連接方法{Mizuguchi 1998 & 1999}來(lái)裝配和生產(chǎn)基于Ad5的腺病毒(參見(jiàn)圖8)。LMP1多表位插入片段被接到pAd-TrackCMV的EcoRI與BamH1位點(diǎn)。然后通過(guò)轉(zhuǎn)染人類胚胎腎臟(HEK)293細(xì)胞，將重組Ad5載體包裝入感染性腺病毒中，并通過(guò)凍-融從被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞收獲重組腺病毒(指Ad5-LMPpoly)。
細(xì)胞系的建立和維持用B95.8病毒分離株對(duì)外周B細(xì)胞進(jìn)行外源性病毒轉(zhuǎn)化，以從血清陽(yáng)性捐贈(zèng)者建立起EBV轉(zhuǎn)化的LCLs。這些細(xì)胞系一直被常規(guī)地維持在添加有2mM L-谷氨酸鹽，100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素和10％FCS(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的RPMI 1640中(Gibco Invi-trogen Corp。，Carlsbad，CA)。此外，胚胎腎臟細(xì)胞系293{Graham，1977}被維持在含10％的牛胎兒血清的DMEM中。
用Ad5-LMPPolv載體對(duì)HLA A2/Kb轉(zhuǎn)基因鼠的免疫用于本研究的HLA A2/Kb轉(zhuǎn)基因鼠已再別處描述過(guò)(Theobald，1997)。這些小鼠表達(dá)一種嵌合I型分子，該分子由人類A*0201等位基因的α1與α2結(jié)構(gòu)域，以及鼠H-2KbI型分子的α3結(jié)構(gòu)域所組成。用108噬斑形成單位(plaque forming units，PFU)的重組Ad5-LMPpoly或?qū)φ战M腺病毒對(duì)這些鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)接種疫苗。3周后收成脾臟細(xì)胞，并測(cè)試表位-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。用ELISPOT和體內(nèi)CTL實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)這些T細(xì)胞應(yīng)答。
腫瘤攻擊和多表位免疫應(yīng)用兩種不同的接種策略來(lái)評(píng)價(jià)LMP多表位疫苗的功效。在第一組實(shí)驗(yàn)中，用或Ad5-LMPpoly或?qū)φ战M腺病毒(109PFU/每只鼠)對(duì)HLA A2/Kb鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫。免疫3周后，用107個(gè)活EL4-A2/Kb-LMP1細(xì)胞這些鼠被皮下攻擊。攻擊后，定期地監(jiān)測(cè)這些鼠21天，并以標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小。在第二組實(shí)驗(yàn)中，先用EL4-A2/Kb-LMP1(每只鼠107個(gè)細(xì)胞)腫瘤細(xì)胞攻擊HLA A2/Kb鼠。攻擊10天后，當(dāng)腫瘤直徑大小約位0.2cm時(shí)，再用或者Ad5-LMPpoly或者對(duì)照組腺病毒免疫這些鼠。定期地監(jiān)測(cè)腫瘤的退化來(lái)評(píng)價(jià)LMP多表位疫苗的治療效果。根據(jù)動(dòng)物倫理委員會(huì)的準(zhǔn)則，腫瘤直徑＞1.0cm的任何小鼠都必須使其死亡。
結(jié)果重組腺病毒LMP多表位編碼的CTL表位的內(nèi)源性加工與CTL識(shí)別為了監(jiān)測(cè)是否多表位(Ad5-LMPpoly)所編碼的LMP表位(表5)被內(nèi)源性加工了，我們把被Ad5-LMPpoly感染的靶的細(xì)胞暴露給對(duì)各種表位具有特異性的LMP1或LMP2特異性CTL多克隆細(xì)胞系。這些CTL細(xì)胞系是來(lái)自于健康的病毒攜帶者。與HLA配對(duì)的成纖維細(xì)胞和Ad5-LMPpoly感染的LCLs，被個(gè)別的LMP特異性CTL細(xì)胞系所識(shí)別(圖9)。這些結(jié)果清楚地顯示，被包括在腺病毒LMP多表位內(nèi)的HLA I型限制性CTL多表位能被有效的加工并呈遞給靶的細(xì)胞。
在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，腺病毒LMP多表位被用于在體外反復(fù)刺激PBMC以產(chǎn)生二級(jí)CTL應(yīng)答，PBMC源自健康的EBV血清陽(yáng)性個(gè)體。所產(chǎn)生的多克隆培養(yǎng)物被用做抗自體PHA胚細(xì)胞的效應(yīng)物，這些胚細(xì)胞已先被LMP1或LMP2肽表位致敏。圖10的數(shù)據(jù)清楚地顯示LMP多表位能高效地喚起多重CTL應(yīng)答，其應(yīng)答對(duì)每一位捐贈(zèng)者所表達(dá)的HLA等位基因所限制的表位有特異性。例如，LMP多表位會(huì)刺激針對(duì)表位YLQ(HLA A2-限制性，LMP1)和CLG(HLA A2-限制性，LMP2)的強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答，也觀察到針對(duì)表位ALL(HLA A2-限制性，LMP1)和YLL(HLA A2-，A68-和A69-限制性，LMP1)的應(yīng)答。
相反地，用EBV轉(zhuǎn)化的LCL刺激誘導(dǎo)非常有限的LMP特異性T細(xì)胞的擴(kuò)展，而且LMP肽致敏的靶的細(xì)胞的溶解水平低于可被檢測(cè)的程度(數(shù)據(jù)未顯示)。
Ad5-LMPpoly疫苗的免疫作用反轉(zhuǎn)了LMP1表達(dá)腫瘤的生長(zhǎng)為了檢測(cè)腺病毒LMP1多表位疫苗所誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是否能提供針對(duì)表達(dá)LMP1的腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，用Ad5-LMPpoly或?qū)φ战M腺病毒對(duì)兩組HLA A2/Kb小鼠(每組10只)進(jìn)行首次免疫兩次，每次間隔14天，然后用EL4-A2/Kb-LMP1細(xì)胞攻擊，并定期地監(jiān)測(cè)這些小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況。雖然兩組都有腫瘤長(zhǎng)出，但在對(duì)照組的腺病毒免疫的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)情況較劇烈，而且對(duì)腫瘤的攻擊并不顯示任何保護(hù)作用(圖11)。于此必須強(qiáng)調(diào)，用對(duì)照組腺病毒或Ad5-LMPpoly免疫的動(dòng)物不顯示針對(duì)EL4/A2Kb細(xì)胞攻擊的保護(hù)作用，這表示表位特異性免疫應(yīng)答是此保護(hù)作用的關(guān)鍵(數(shù)據(jù)未顯示)。
討論何杰金氏病與鼻咽癌有一個(gè)重要的共同特征，即EBV抗原的表達(dá)通常都受限于EBNA1，LMP1和LMP2。其中EBNA1被HLAI型路徑保護(hù)，以避免進(jìn)行加工(Levitskaya，1995)，所以只有LMP1與LMP2才是靶的抗原，可用于發(fā)展新的免疫策略以擴(kuò)展抗原-特異性T細(xì)胞免疫以治療何杰金氏病與鼻咽癌。其治療方法主要在增加T細(xì)胞對(duì)LMP抗原的應(yīng)答，這在治療與EBV相關(guān)的復(fù)發(fā)鼻咽癌和何杰金氏病中很有用。我們采用ELISPOT分析以充分描繪一組病毒攜帶者中LMP1特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在所有這些受測(cè)試的捐贈(zèng)者中，55-60％的健康高加索人檢測(cè)到有LMP1特異性T細(xì)胞應(yīng)答。另一方面，這種應(yīng)答在東南亞的健康病毒攜帶者與鼻咽癌患者中則較少見(jiàn)。
目前研究有一個(gè)令人感興趣的現(xiàn)象，即80％以上的針對(duì)LMP1的T細(xì)胞反應(yīng)都是直接作用于跨膜區(qū)和CTAR1結(jié)構(gòu)域。特別有趣的是，不同的受測(cè)者皆會(huì)優(yōu)先作用于CTAR1結(jié)構(gòu)域。由ELISPOT分析法鑒定的15mer決定子中，有3/7被定位于CTAR1結(jié)構(gòu)域中。另一方面，我們無(wú)法檢測(cè)到T細(xì)胞對(duì)任何位于遠(yuǎn)端C末端CTAR2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的肽有應(yīng)答，然而，CTAR2結(jié)構(gòu)域?qū)σ恍㎜MP1介導(dǎo)的功能來(lái)說(shuō)都是必須的。先前的研究已表明單獨(dú)的該區(qū)域的突變或缺失就會(huì)完全破壞LMP1介導(dǎo)的訊號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)節(jié)過(guò)程。雖然T細(xì)胞對(duì)CTAR2區(qū)域沒(méi)有應(yīng)答的確切原因還未知，但有可能是EBV會(huì)保護(hù)此重要的功能區(qū)域以避免受到潛在的免應(yīng)控制。如果知道這種避免的機(jī)制就有可能找到對(duì)CTAR2結(jié)構(gòu)域起免疫性作用的原因，如此不僅能阻斷LMP1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用，還能破壞正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的潛在感染。
先前的研究提出，全世界不同地理區(qū)域的LMP1序列有高度的變異性。在使用LMP1作為治療復(fù)發(fā)的HD與NPC疾病時(shí)的潛在免疫療法的靶的時(shí)，該遺傳變異被認(rèn)為是一個(gè)最主要的阻礙。因此，確定B95.8衍生的LMP1表位序列在來(lái)自全世界不同地理區(qū)的EBV分離株中的保受狀況是很重要的。研究一大組來(lái)自不同地區(qū)的人的外周血液衍生的EBV分離株和NPC活體切片，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自LMP1的T細(xì)胞表位序列通常是高度保守的。這里所測(cè)序的4種表位中有3種顯示出輕微的變異。有重大變異的唯一序列為HLA A2父型(supertype)-限制性YLLEMLWRL，其在來(lái)自不同地區(qū)的EBV分離株中有不同的序列形式。這在來(lái)自東南亞的分離株中表現(xiàn)的尤其明顯，因?yàn)槠鋂LLEMLWRL表位區(qū)域內(nèi)有相同形式的遺傳變異。而且在分離自NPC與自發(fā)性LCLs的分離株間，其遺傳變異情形相同。雖然在高加索人和PNG中的YLLE MLWRL表位中也發(fā)現(xiàn)共同序列變異體，但這些分離出的表位在每一特定地理區(qū)會(huì)額外表現(xiàn)出不同的遺傳變異。對(duì)YLLEMLWRL表位的遺傳變異做抗原性分析發(fā)現(xiàn)，變異體序列(YFLEILWRL)與野生型序列相較，其普遍見(jiàn)于東南亞人群的變異序列不僅難被表位特異性CTL識(shí)別，也明顯的不被HLA A2結(jié)合。相反地，雖然一些其他的變異序列(YFLEILWGL和YLMEILWRL)不易被T細(xì)胞識(shí)別，但它們對(duì)HLA A2的結(jié)合卻沒(méi)有明顯影響。雖然該表位內(nèi)有如此高的程度的遺傳變異的確切原因/機(jī)制還未明，但有可能是來(lái)自NPC流行的東南亞的分離株中的該表位內(nèi)的突變可以有助于保護(hù)這些分離株免受EBV特異性CTL應(yīng)答的影響。
鑒于LMP1有高度致癌可能性，所以基于全長(zhǎng)LMP1的疫苗或免疫療法策略很不可能是治療NPC與HD的優(yōu)先選擇。而且，本研究表明了在大多數(shù)健康的病毒攜帶者中，LMP1通常只引發(fā)低水平的丁細(xì)胞應(yīng)答。推測(cè)這是因?yàn)長(zhǎng)MP1位于貫穿膜的區(qū)域，使其不易進(jìn)入典型的MHC I型代謝路徑。使用高度保守的LMP1與LMP2表位作為多表位疫苗明顯地能夠克服這些潛在的限制。
相應(yīng)地，本申請(qǐng)發(fā)明人已經(jīng)證明了用表達(dá)含有一系列鄰近的最小LMP1與LMP2CTL表位的LMP多表位蛋白的腺病毒載體免疫接種能夠引起多重獨(dú)立的MHC-限制性CTL應(yīng)答。這些表位不僅被人類細(xì)胞進(jìn)行有效的內(nèi)源性加工，也能在健康的病毒攜帶者中喚起對(duì)LMP抗原具有特異性的記憶型CTL應(yīng)答。而且，腺病毒多表位疫苗也能引發(fā)初級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答，這顯示其在腫瘤攻擊系統(tǒng)中有治療效果。
于此需特別強(qiáng)調(diào)，用于HD和NPC的基于多表位的疫苗有許多優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的地方，它是基于全長(zhǎng)的LMP抗原。多表位蛋白尤其不穩(wěn)定，而且由于它們的限制性2級(jí)與3級(jí)結(jié)構(gòu)，它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中會(huì)快速地被分解。另一方面，全長(zhǎng)的LMP抗原不可能被快速分解，而且可以引起細(xì)胞內(nèi)多種訊號(hào)傳導(dǎo)作用導(dǎo)致注射部位的二級(jí)癌癥的發(fā)生。其它重要優(yōu)點(diǎn)包括，多表位疫苗以相對(duì)微小的構(gòu)造，不需其它相關(guān)物質(zhì)，就可引發(fā)長(zhǎng)期保護(hù)性CTL應(yīng)答以對(duì)抗大量的CTL表位。最后，基于多表位的疫苗也可能能夠克服全世界不同地理人群中廣泛存在的LMP1遺傳變異的潛在問(wèn)題。
如果基于CTL的NPC與HD的治療可以應(yīng)用于顯著性數(shù)量的患者，靶的群體必須通過(guò)以高頻率存在的HLA等位基因的頻率必須要高。在本文中，除了通過(guò)A11，A24和B40被限制的LMP1，LMP2特異性應(yīng)答的等位基因特別令人感到興趣，因?yàn)檫@些等位基因在中國(guó)南方人群中很常見(jiàn)(A11，56％；A24，27％；B40，28％)，特別其中NPC是地方性疾病。因此，我們發(fā)展出一種新的LMP多表位治療疫苗，使用含有LMP1與LMP2兩表位的不具復(fù)制能力的腺病毒，這些表位被普遍存于不同種族人群中的HLA等位基因，A2，A11，A23，A24，B27，B40和B57所限制。估計(jì)這些優(yōu)先篩選的MHC I型限制性表位可有效作用在90％以上的亞洲，非洲以及高加索人群。
整個(gè)專利說(shuō)明書的主要目的是要描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但而不將本發(fā)明限制于任一實(shí)施方案或特定的特性集合。此文中所解釋描述的實(shí)施例可做不同的改變或修飾而不會(huì)背棄本發(fā)明的精神和范圍。
本說(shuō)明書中提及的所有計(jì)算機(jī)程序，計(jì)算方法，專利以及科學(xué)文獻(xiàn)在此處通過(guò)引用都完整地整合到本說(shuō)明書中。
參考文獻(xiàn)1.Anagnostopoulos，I.and M.Hummel.1996.Epstein-Ban-virus intumours.Histopathology 29297-315.
2.Bharadwaj，M.，P.G.Parsons，and D.J.Moss.2001.Cost-efficientquantification of enzyme-linked immunospot.Biotechniques 2001.Jan.；30.(1.)36.-8.3036-38.
3.Burrows，S.R.，S.J.Rodda，A.Suhrbier，H.M.Geysen，and D.J.Moss.1992.The specificity of recognition of a cytotoxic T lymphocyteepitope.Eur.J.Immunol.22191-195.
4.Gahn B，Siller-Lopez F，Pirooz AD，Yvon E，Gottschalk S，Longnecker R，Brenner MK，Heslop HE，Aguilar-Cordova E，RooneyCM.2001.Adenoviral gene transfer into dendritic cells efficientlyamplifies the immune response to LMP2A antigena potential treatmentstrategy for Epstein-Barr virus-positive Hodgkin′s lymphoma.Int.J.Cancer 93706-713.
5.Gires，O.，F(xiàn).Kohlhuber，E.Kilger，M.Baumann，A.Kieser，C.Kaiser，R.Zeidler，B.Scheffer，M.Ueffing，and W.Hammerschmidt.1999.Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus interacts with JAK3 andactivates STAT proteins.EMBO J.183064-3073.
6.Goulder，P.J.，y.Tang，S.I.Pelton and B.D.Walker.2000.HLA-B57-restricted cytotoxic T-lymphocyte activity in a single infectedsubject toward two optimal epitopes，one of which is entirely containedwithin the other.J.Virol.74529l-5299.
7.Hammarskjld，M.L.and M.C.Simurda.1992.Epstein-Barr viruslatent membrane protein transactivates the human inmmnodeficiencyvirus type 1long terminal repeat through induction of NF-kappa Bactivity.J.Virol.666496-6501.
8.Henderson，S.，M.Rowe，C.Gregory，D.Croom-Carter，F(xiàn).Wang，RLongnecker，E.Kieff，and A.B.Rickinson.1991.Induction of bcl-2expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 protectsinfected B cells froprogrammed cell death.Cell 651107-1115.
9.Khanna，R.，S.R.Burrows，J.Nicholls，L.M.Poulsen.1998.Identification of cytotoxic T cell epitopes within Epstein-Barr virus(EBV)oncogene laten membrane protein 1(LMP1)evidence for HLA A2supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cells byLMPl-specific cytotoxic T lymphocytes Eur.J.Immunol.28451-458.
10.Khanna，R.and S.R.Burrows.2000.Role of cytotoxic tlymphocytes in Epstein-Barr virus-associated diseases.Annu.Rev.Microbiol.5419-48.
11.Khanna，R.，S.R.Burrows，M.G.Kurilla，C.A.Jacob，I.S.Misko，T.B.Sculley，E.Kieff，and D.J.Moss.1992.Localization of Epstein-Barrvirus cytotoxic T-cell epitopes using recombinant vacciniaimplicationsfor vaccine development.J.Exp.Med.176169-176.
12.Kienzle，N.，M.Buck，S.L.Silins，S.R.Burrows，D.J.Moss，A.Winterhalter，A.Brooks，and R.Klaannn2000.Differential splicing ofantigen-encoding RNA reduces endogenous epitope presentation thatregulates the expansion and cytotoxicity ofT cells.J.Immunol.1651840-1846.
13.Kulwichit，W.，R.H.Edwards，E.M.Davenport，J.F.Baskar，V.Godfrey，and N.Raab-Traub.1998.Expression of the Epstein-Barr viruslatent membrane protein 1induces B cell lymphoma in transgemc mice.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.9511963-11968.
14.Laherty，C.D.，H.M.Hu，A.W.Opipari，F(xiàn).Wang，and V.M.Dixit.1992.The Epstein-Barr virus LMP1 gene product induces A20 zincfinger protein expression by activating nuclear factor k B.J.Biol.Chem.26724157-24160.
15.Lee，S.P.，R.J.Tierney，W.A.Thomas，J.M.Brooks，and A.B.Rickinson 1997.Conserved CTL epitopes within EBV latent membraneprotein 2a potential target for CTL-based tumor therapy.J.Immunol.1583325-3334.
16.Leen，A.，P.Meij，I.Redchenko，J.Middeldorp，E.Bloemena，A.Rickinson and N.Blake.2001.Differential immunogenicity ofEpstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+)T-helper 1responses.J Virol 758649-59.
17.Levitskaya，J.，M.Coram，V.Levitsky，S.Imreh，P.M.SteigerwaldMullen G.Klein，M.G.Kurilla，and M.G.Masucci.1995.Inhibition ofantigen processing by the internal repeat region of the Epstein-Barr virusnuclear antigen-1.Nature.375685-688.
18.Meij，P.，A.Leen，A.B.Rickinson，S.Verkoeijen，M.B.Vervoort，E.Bloemena，and J.M.Middeldorp.2002.Identification and prevalence ofCD8(+)T-cell responses directed against Epstein-Barr virus-encodedlatent membrane protein l and latent membrane protein 2.Int.J.Caneer9993-99.
19.Mosialos，G.，M.Birkenbach，R.Yalamanchili，T.VanArsdale，C.Ware，and E.Kieff.1995.The Epstein-Barr virus transforming protemLMP 1engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptorfamil y.Cell 80389-399.
20.Moss，D.J.，I.S.Misko，S.R.Burrows，K.Burman，R.McCarthy，and T.B.Sculley.1988.Cytotoxic T-cell clones discriminate between A-and B-type Epstein-Barr virus transformants.Nature 331719-721.21.Murray，N.and A.McMichael.1992.Antigen presentation in virusinfection.Curr.Opin.Immunol.4401-407.
22.Ranieri E，Herr W，Gambotto A，Olson W，Rowe D，Robbins PD，Kierstead LS，Watkins SC，Gesualdo L，Storkus WJ.1999.Dendritic cellstransduced with an adenovirus vector encoding Epstein-Barr virus latentmembrane protein 2Ba new modality for vaccination.J Virol.7310416-25.
23.Rickinson，A.B.and E.Kieff.1996.Epstein-Ban-Virus，p.2397-2446.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.HoWley(eds.)，F(xiàn)ieldsVirology.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia.
24.Salter，R.D.and P.Cresswell.1986.Impaired assembly andtransport of HLA-A and-B antigens in a mutant TxB cell hybrid.EMBOJ.5943-949.
25.Theobald，M.Biggs，J.Hermandez，J.Lustgarten，J.Labadie，C.Sherman L.A.1997.Tolerance to p53 by A2.1-restricted cytotoxic Tlymphocytes.J.Exp.Med.185833-841.
26.Wang，F(xiàn).C.Gregory，C.Sample，M.Rowe，D.Liebowitz，R.Murray，A.Rickinson，E.Kieff.1990.Epstein-Barr virus latent membraneprotein(LMP1)and nuclear proteins 2and 3C are effectors of phenotypicchanges in B lymphocytes EBNA-2and LMPl cooperatively induceCD23.J.Virol.642309-2318.
表1

表2

表3

TDDSGHESDSNSNEGRH

表4


表5

序列表<110>The Council of the Queensland Institute of MedicalResearchKhanna，RajivJaikumar，Duraiswamy<120>Epstein Barr Virus Peptide Epitopes，Polyepitopesand Delivery System Therefor<130>11441US2<140>PCT/AU2003/01451<141>2003-11-03<150>2003901792<151>2003-04-15<150>2002952524<151>2002-11-07<160>125<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>1Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>2Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>3Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu1 5<210>4<211>3<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>4Gln Arg His1<210>5<211>5<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>5Ala Gly Asn Asp Gly1 5<210>6<211>3<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>6Gln Asn Trp1<210>7<211>4<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>7Val Leu Tyr Ser1<210>8<211>6
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>8Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>9Gln Arg His Ser Asp Glu His His His1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>10Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>11Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>12Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His1 5
<210>13<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>13Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>14Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp1 5 10<210>15<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>15Leu Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp GluHis His1 5 10 15His<210>16<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>16Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5<210>17
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>17Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly1 5<210>18<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>18Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5 10<210>19<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>19Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln Leu1 5 10<210>20<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>20Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly ProPro Gln1 5 10 15Leu<210>21<211>9
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>21Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>22Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>23Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>24Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5<210>25<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>25Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5 10
<210>26<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>26Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp1 5 10<210>27<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>27Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr LeuLeu Val1 5 10 15Asp<210>28<211>10<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>28Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5 10<210>29<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>29Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5<210>30
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>30Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>31Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu1 5<210>32<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>32Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu1 5 10<210>33<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>33Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met1 5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>34Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5 10
<210>35<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>35Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5 10<210>36<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>36Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe AlaLeu Met1 5 10 15Leu<210>37<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>37Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His1 5<210>38<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>38Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly1 5 10
<210>39<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>39Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn GluGly Arg1 5 10 15His<210>40<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>40Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Ala1 5<210>41<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>41Ile Ala Leu Tyr Leu His Gln Asn Trp1 5<210>42<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>42Ile Ala Leu Tyr Leu Gln His Asn Trp1 5<210>43
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>43Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp1 5<210>44<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>44Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>45Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Gly Leu1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>46Tyr Leu Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>47Tyr Phe Leu Asp Ile Leu Trp Arg Leu1 5
<210>48<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>48Tyr Leu Met Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>49<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>49Tyr Leu His Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>50<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>50Tyr Leu Gln His Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>51<211>11<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>51Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile1 5 10<210>52<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>52Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile
1 5<210>53<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>53Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu1 5<210>54<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>54Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val1 5<210>55<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>55Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala1 5<210>56<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>56Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu1 5<210>57<211>10<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>57
Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp1 5 10<210>58<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>58Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu1 5<210>59<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>59Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val1 5<210>60<211>18<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>60Leu Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu TrpArg Arg1 5 10 15Leu Gly<210>61<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>61
Arg His Ser Asp Glu His His His Asp Asp Ser Leu Pro HisPro Gln1 5 10 15Gln<210>62<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>62gccctccttg tcctctattc ctttgct27<210>63<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>63gcgctccttg tcctctattc ctttgct27<210>64<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>64gcactcttgg tcctctattc ctttgct27<210>65<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>65gcgctccttg tcctctatac ctttgct
27<210>66<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>66attgctctct atctacaaca aaactgg27<210>67<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>67attgctctct atctacacca aaactgg27<210>68<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>68cttgctctct atctacaaca aaactgg27<210>69<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>69attgctctct atctacaaca caactgg27<210>70<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>70
tacttattgg agatgctctg gcgactt27<210>71<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>71tacttcttgg agattctctg gcgactt27<210>72<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>72tacttcttgg agattctctg ggggctt27<210>73<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>73tacttattgg agattctctg gcgactt27<210>74<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>74tacttcttgg agattctctg gcggctt27<210>75<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus
<400>75tacttcttgg acattctctg gcggctt27<210>76<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>76tacctaatgg agattctctg gcgactt27<210>77<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>77tatctacaac aaaactggtg gactcta27<210>78<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>78tatctacacc aaaactggtg gactcta27<210>79<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>79tatctacaac acaactggtg gactcta27<210>80<211>27
<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>80tacttcttgg aaattctctg gcggctt27<210>81<211>122<212>PRT<213>Synthetic protein sequence<400>81Met Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ser Ser Cys SerSer Cys1 5 10 15Pro Leu Ser Lys Ile Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys LeuArg Arg20 25 30Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Leu Leu Ser Ala Trp Ile LeuThr Ala35 40 45Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Cys Leu Gly Gly LeuLeu Thr50 55 60Met Val Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile GluAsp Pro65 70 75
80Pro Phe Asn Ser Leu Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg LeuTyr Leu85 90 95Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr SerPhe Ala100 105 110Leu Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp115 120<210>82<211>366<212>DNA<213>Synthetic nucleotide sequence<400>82atgccctacc tgttctggct ggccgccatc agcagctgca gcagctgccccctgagcaag 60atcacctacg gccccgtgtt catgtgcctg aggaggaggt ggaggaggctgaccgtgctg120ctgagcgcct ggattctgac cgccctgacc gccggcttcc tgatcttcctgtgcctgggc180ggcctgctga ccatggtggt gatgagcaac accctgctga gcgcctggatcgaggacccc240cccttcaaca gcctgtacct gctggagatg ctgtggaggc tgtacctgcagcagaactgg300tggaccctgg ccctgctggt gctgtacagc ttcgccctga tcgccctgtacctgcagcag360
aactgg366<210>83<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>83Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val1 5 10<210>84<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>84Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu1 5 10<210>85<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>85Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5 10<210>86<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>86Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5 10<210>87<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>87Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp1 5 10<210>88<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>88His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>89Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg1 5 10<210>90<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>90Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5 10<210>91<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>91Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn1 5 10<210>92<211>12
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>92Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser1 5 10<210>93<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>93Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro1 5 10<210>94<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>94Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro1 5 10<210>95<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>95His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly1 5 10<210>96<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>96Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly1 5 10
<210>97<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>97Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala1 5 10<210>98<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>98Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe1 5 10<210>99<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>99Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5 10<210>100<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>100Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met1 5<210>101<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>101Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe1 5
<210>102<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>102Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5<210>103<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>103Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr1 5<210>104<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>104Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu1 5<210>105<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>105Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val1 5<210>106<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>106
Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val1 5<210>107<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>107Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu1 5<210>108<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>108Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5<210>109<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>109Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn1 5<210>110<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>110Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln1 5<210>111<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>111Gly Asn Asp G1y Gly Pro Pro Gln Leu1 5<210>112<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>112Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5<210>113<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>113Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro1 5<210>114<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>114Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro1 5<210>115<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>115Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly1 5<210>116<211>9<212>PRT
<213>Epstein Barr Virus<400>116Ser pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp1 5<210>117<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>117His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn1 5<210>118<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>118Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly1 5<210>119<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>119Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg1 5<210>120<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>120His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5<210>121
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>121Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn1 5<210>122<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>122Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser1 5<210>123<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>123Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn1 5<210>124<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>124Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser1 5<210>125<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>125
Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp1 權(quán)利要求
1.一種分離的EBV CTL肽表位，其包含LMP1蛋白中的至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，其中所述EBV CTL肽不是YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)或YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)。
2.權(quán)利要求1的分離的EBV CTL肽表位，其包含一段選自下列所構(gòu)成的組的氨基酸序列(i)QRH(SEQ ID NO4)；(ii)AGNDG(SEQ ID NO5)；(i)QNW(SEQ ID NO6)，特別排除序列YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；(iv)VLYS(SEQ ID NO7)；和(v)DSNSNE(SEQ ID NO8)，特別排除氨基酸序列ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)。
3.權(quán)利要求2的分離的EBV CTL肽表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)QRHSDEHHH(SEQ ID NO9)；(ii)GQRHSDEHH(SEQ ID NO10)；(iii)YYHGQRHSD(SEQ ID NO11)；和(iv)WMYYHGQRH(SEQ ID NO12)。
4.權(quán)利要求3的分離的EBV CTL肽表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)YYHGQRHSDEHH(SEQ ID NO13)；(ii)IWMYYHGQRHSD(SEQ ID NO14)；和(iii)LIWMYYHGQRHSDEHHH(SEQ ID NO15)。
5.權(quán)利要求2的分離的EBV CTL表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)AGNDGGPPQ(SEQ ID NO16)；和(ii)PSDSAGNDG(SEQ ID NO17)。
6.權(quán)利要求5的分離的EBV CTL表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)SDSAGNDGGPPQ(SEQ ID NO18)；(ii)DSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO19)；和(iii)PHSPSDSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO20)。
7.權(quán)利要求2的分離的EBV CTL表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)IALYLQQNW(SEQ ID NO21)；(ii)ALYLQQNWW(SEQ ID NO22)；(iii)QNWWTLLVD(SEQ ID NO23)；和(iv)LYLQQNWWT(SEQ ID NO24)。
8.權(quán)利要求7的EBV CTL表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)IALYLQQNWWTL(SEQ ID NO25)；(ii)YLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO26)；和(iii)LIIALYLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO27)。
9.權(quán)利要求2的EBV CTL肽表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)ALLVLYSFAL(SEQ ID NO28)；(ii)LLVLYSFAL(SEQ ID NO29)；(iii)ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；和(iv)VLYSFALML(SEQ ID NO31)。
10.權(quán)利要求9的EBV CTL肽表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)ALLVLYSFALML(SEQ ID NO32)；(ii)GALLVLYSFALM(SEQ ID NO33)；(iii)DWTGGALLVLYS(SEQ ID NO34)；(iv)GGALLVLYSFAL(SEQ ID NO35)；和(v)DWTGGALLVLYSFALML(SEQ ID NO36)。
11.權(quán)利要求2的EBV CTL肽表位，基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成(i)DSNSNEGRH(SEQ ID NO37)；(ii)SGHESDSNSNEG(SEQ ID NO38)；和(iii)TDDSGHESDSNSNEGRH(SEQ ID NO39)。
12.一種分離的EBV CTL肽表位基本上由選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列所組成SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31；以及SEQ IDNO37。
13.一種分離的EBV肽表位的變異體，具有SEQ ID NO40-50中任一的氨基酸序列。
14.一種分離的蛋白質(zhì)，它包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的EBV CTL表位。
15.權(quán)利要求14的分離的蛋白質(zhì)，其為一種多表位蛋白質(zhì)，包含由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)和IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
16.權(quán)利要求14的分離的多表位蛋白質(zhì)，其包含13種EBV CTL表位，這些表位分別具有氨基酸序列YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ ID NO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNTLLSAW(SEQ IDNO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQID NO59)。
17.權(quán)利要求15的分離的多表位蛋白質(zhì)，其包含如SEQ IDNO81所列的氨基酸序列。
18.一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的EBV CTL表位。
19.一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)。
20.一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求13的變異體EBV肽表位。
21.權(quán)利要求20的分離的核酸，包含如SEQ ID NO63-65，67-69，71-76或78-80所示的任一核苷酸序列。
22.權(quán)利要求19的分離的核酸，其包含如SEQ ID NO80所示的核苷酸序列。
23.一種表達(dá)結(jié)構(gòu)，其包含權(quán)利要求18-22項(xiàng)中任一項(xiàng)的分離的核酸，其可操作地連接到表達(dá)載體中的調(diào)控核苷酸序列上。
24.權(quán)利要求23的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其是基于腺病毒。
25.權(quán)利要求24的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其編碼如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列。
26.包含權(quán)利要求23的表達(dá)結(jié)構(gòu)的宿主細(xì)胞或生物。
27.一種藥物組合物，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的EBV CTL肽表位，以及藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其包含有一段選自由下列所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)與IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
29.權(quán)利要求27的藥物組合物，其包含一多表位蛋白質(zhì)，所述多表位蛋白質(zhì)包含如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列。
30.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求23的表達(dá)結(jié)構(gòu)以及藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其包含一表達(dá)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)編碼選自以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)和IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
32.權(quán)利要求29的藥物組合物，其包含一表達(dá)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)編碼具有如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列的多表位蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其包含如SEQ ID NO82所示的核苷酸序列。
34.權(quán)利要求27-33中的任一項(xiàng)的藥物組合物，該組合物是一種免疫療法組合物。
35.權(quán)利要求34中的藥物組合物，該組合物是疫苗。
36.一種對(duì)與EBV相關(guān)的疾病的治療和/或預(yù)防方法，該方法包括對(duì)動(dòng)物施用至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的EBVCTL表位。
37.權(quán)利要求36的方法，其中至少有一種表位包含選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)以及IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
38.權(quán)利要求36的方法，其中至少有一種肽表位是包含如SEQID NO81所示的氨基酸序列的多表位蛋白質(zhì)。
39.治療和/或預(yù)防與EBV相關(guān)的疾病的方法，包括對(duì)動(dòng)物使用權(quán)利要求23的表達(dá)結(jié)構(gòu)的步驟。
40.權(quán)利要求39的方法，其中的表達(dá)結(jié)構(gòu)編碼一多表位蛋白，該蛋白包含選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)與IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中的表達(dá)結(jié)構(gòu)包含如SEQ ID NO82所示的核苷酸序列。
42.權(quán)利要求36-41中任何一項(xiàng)的方法，其中與EBV相關(guān)的疾病選自B細(xì)胞及T細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及淋巴上皮瘤狀癌。
43.權(quán)利要42的方法，其中與EBV相關(guān)的疾病是鼻咽癌(NPC)。
44.權(quán)利要求36-43中任一項(xiàng)的方法，其中的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中的哺乳動(dòng)物是人。
46.權(quán)利要求45的方法，其中至少一種EBV肽表位的一個(gè)或多個(gè)是根據(jù)要接受治療的人的HLA類型而選擇的。
47.一種抗體，它結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的EBV CTL表位或權(quán)利要求13的變異體。
48.一種測(cè)定某一動(dòng)物是否攜帶或曾接觸過(guò)Epstein Barr病毒的檢測(cè)方法，所述方法包括將分離自所述個(gè)體的一種或多種T細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的至少一種EBV肽表位相接觸的步驟，所述一種或多種T細(xì)胞對(duì)至少一種EBV肽表位的應(yīng)答可以指示該動(dòng)物是否攜帶EBV或是曾接觸過(guò)EBV。
49.權(quán)利要求48的方法，其中的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
50.權(quán)利要求49的方法，其中的動(dòng)物是人。
51.一種鑒定EBV CTL表位的方法，該方法包括以下步驟(i)產(chǎn)生大量衍生自EBV LMP1蛋白的不同的肽；(ii)將所述一種或多種上述肽與獲自EBV血清陽(yáng)性的個(gè)體的一種或多種T淋巴細(xì)胞相結(jié)合；(iii)測(cè)量在對(duì)所述一種或多種肽的應(yīng)答中所述一種或多種T淋巴細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)量，其中IFN-γ產(chǎn)量高于參考量即表示所述一個(gè)或多個(gè)肽具有至少一個(gè)EBV CTL表位。
52.權(quán)利要求51的方法，進(jìn)一步包括步驟(iv)測(cè)定是否步驟(ii)所產(chǎn)生的所述一種或多種T淋巴細(xì)胞能水解一種或多種被EBV感染的靶細(xì)胞。
53.通過(guò)權(quán)利要求52的方法獲得的分離的EBV CTL表位。
54.權(quán)利要求53的分離的CTL表位，其具有選自由以下所構(gòu)成的組的氨基酸序列SEQ ID NO9；SEQ ID NO10SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31和SEQ ID NO37。
全文摘要
本發(fā)明提供了Epstein Barr病毒LMP1蛋白的免疫原性細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位肽，它具有9到17個(gè)氨基酸，其最小共有序列選自QRH，AGNDG，QNW，VLYS和DSNSNE。這些肽不論是單獨(dú)存在或存在于多表位結(jié)構(gòu)中，在藥物組合物、疫苗和治療與Epstein Barr病毒相關(guān)的疾病例如包括但不限于有何杰金氏病和/或鼻咽癌的方法中均是有用的。優(yōu)選多表位輸送方式為基于腺病毒的系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1711279SQ200380102880
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者拉吉夫·康納, 賈庫(kù)馬爾·杜賴斯瓦米 申請(qǐng)人:昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所理事會(huì)