Fap來(lái)源的抗腫瘤ctl表位肽p639及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽及其在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。所述抗腫瘤CTL表位肽為九肽，為表位肽P639，分子量907.14，具體為：GLFKCGIAV。本發(fā)明中，我們利用90%以上的上皮性腫瘤高表達(dá)而正常組織中幾乎不表達(dá)的特異性抗原FAP，根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)FAP進(jìn)行HLA?A2限制性的CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)與篩選，確定這兩種CTL表位肽能夠與HLA?A2分子產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合能力，且可有效激活特異性CTL反應(yīng)，具有成為治療性腫瘤多肽疫苗的可行性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL 表位肽P639及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞激活蛋白（Fibroblast Activation Protein a，F(xiàn)AP)存在于腫瘤基質(zhì) 成纖維細(xì)胞中，于1986年首次發(fā)現(xiàn)，1990年正式命名為FAPJAP表達(dá)于90%以上的上皮性腫 瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞膜和胞漿中，包括卵巢癌，結(jié)腸癌，膀胱癌，肺癌，乳腺癌等，而在 正常的成纖維細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，是一個(gè)特異性非常強(qiáng)的腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。而且作 用于腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞相對(duì)于直接作用于腫瘤細(xì)胞自身而言也有一些吸引人的優(yōu)點(diǎn)：如 腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與快速增殖的腫瘤細(xì)胞相比其基因組更加穩(wěn)定，其表 面抗原表達(dá)相對(duì)來(lái)說(shuō)也更加穩(wěn)定，而且基質(zhì)細(xì)胞在各種腫瘤中的差異較小，針對(duì)腫瘤基質(zhì) 的治療可用于多種實(shí)體腫瘤。尤其近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫抑制方面發(fā)揮著很大的作 用。因此，綜合來(lái)看，F(xiàn)AP作為一種腫瘤基質(zhì)抗原，在免疫治療等方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 如今，隨著對(duì)免疫學(xué)的研究進(jìn)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗病毒、抗細(xì)菌、抗腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，是機(jī)體免疫的一條 重要防線。尤其是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的其在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮的重要作用更是引起了研究人 員的廣泛興趣。
[0004] 腫瘤抗原為內(nèi)源性抗原，主要通過(guò)MHC-I類(lèi)分子途徑所遞呈。基于MHC-I類(lèi)分子封 閉的結(jié)構(gòu)特性，其只能識(shí)別由8~12個(gè)氨基酸所組成的短肽段，這些肽段被稱(chēng)為抗原表位。月中 瘤抗原經(jīng)APC細(xì)胞攝取加工后形成相應(yīng)的短肽，進(jìn)而與MHC-I類(lèi)分子結(jié)合，并最終遞呈到細(xì) 胞表面以便CD8+ T細(xì)胞表面的TCR所識(shí)別，從而活化CTL細(xì)胞，引發(fā)CTL特異性免疫應(yīng)答。目 前，研究較多的抗原表位為九肽。該領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)也逐漸催生了治療性腫瘤多肽疫苗的研究。 然而，如何快速尋找并利用CTL表位去有效激發(fā)其介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤 作用，卻成為難點(diǎn)。
[0005] 而隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)與免疫學(xué)的迅速發(fā)展與融合，研究人員已經(jīng)可以利用多種 在線抗原表位預(yù)測(cè)工具，準(zhǔn)確、快速的尋找到理想的抗原表位，大大的提升了工作效率。目 前常用的有BMAS(主要是計(jì)算8~10肽與MHC-I類(lèi)分子解離的半衰期）、NetCTL 1.2(主要是 能夠?qū)?2種MHC-I類(lèi)超型限制性的表位進(jìn)行預(yù)測(cè)）和SYFPEITHI(主要預(yù)測(cè)抗原肽與MHC的親 和力）等。不同的軟件有不同的特點(diǎn)，因此，綜合運(yùn)用這些軟件可以提高抗原表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn) 確性，這也是本領(lǐng)域研究的一般策略。
[0006] 各種動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物都有MHC，為避免混淆，人類(lèi)中的MHC基因稱(chēng)為人白細(xì)胞 抗原(HLAs)，其編碼產(chǎn)物稱(chēng)為HLA分子或HLA抗原，分別為對(duì)應(yīng)的HLA-I類(lèi)和HLA-II類(lèi)分子。 而HLA-I類(lèi)分子具有高度的多態(tài)性，具有幾十種亞型，而在中國(guó)人群中，HLA-A2人群所占多 數(shù)，比例高達(dá)53%，因此篩選由HLA-A2分子遞呈的限制性CTL表位在腫瘤免疫治療中具有廣 泛的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明主要是利用FAP的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)WMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多種 表位預(yù)測(cè)軟件，篩選、合成并提供了一種FAP來(lái)源的HLA-A2限制性的CTL表位肽P639。
[0008] 下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案介紹如下： FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639，該類(lèi)表位肽與HLA-A2特異性結(jié)合，為九肽，具體為： 表位肽P639，分子量907.14，其序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為:GLFKCGIAV，SP:Gly-Leu- Phe- Lys- Cys- Gly- lie- Ala- Val〇
[0009]所述FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，采用Fmoc固相合成法制備而成，具體過(guò)程如下： (1) 從C端到N端開(kāi)始合成，合成肽C端的第一個(gè)Fmoc-氨基酸的羧基與Wang樹(shù)脂以共價(jià) 鍵結(jié)合，這樣C端第一個(gè)氨基酸就連接到固相載體上，隨后將氨基端的Fmoc保護(hù)基脫去； (2) 然后以第一個(gè)氨基酸的氨基末端作為結(jié)合位點(diǎn)，與下一個(gè)氨基酸的羧基末端在縮 合劑的活化作用發(fā)生縮合反應(yīng)形成肽鍵，生成一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽;然后不斷重復(fù)這一 過(guò)程，直至合成目的肽； (3) 最后將目的肽段從樹(shù)脂上切割下來(lái)，經(jīng)過(guò)洗滌、沉淀等步驟獲得粗肽； (4) 再經(jīng)HPLC純化后，得到精肽，其純度大于95%，最后經(jīng)質(zhì)譜分析并驗(yàn)證其分子量是否 符合理論值。
[0010]所述FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽作為腫瘤治療藥劑的應(yīng)用，具體而言，可作為治 療性多肽疫苗應(yīng)用。
[0011] 在腫瘤多肽疫苗研究當(dāng)中，目前大多數(shù)選用的都是腫瘤細(xì)胞自身所表達(dá)的抗原， 較少有人關(guān)注腫瘤基質(zhì)抗原。而隨著研究的進(jìn)展，腫瘤基質(zhì)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所發(fā) 揮的巨大作用逐漸得到揭示，其參與了多種病理進(jìn)程，如：腫瘤血管的生成、腫瘤細(xì)胞的增 殖侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、慢性炎癥、腫瘤免疫抑制等。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)中所占比例最 大的類(lèi)群，而FAP是其所表達(dá)的特異性抗原，因此，靶向于FAP可有效破壞腫瘤基質(zhì)，進(jìn)而抑 制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
[0012] 在本發(fā)明中，我們利用90%以上的上皮性腫瘤高表達(dá)而正常組織中幾乎不表達(dá)的 特異性抗原FAP，利用其一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)BMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多種表位預(yù)測(cè) 軟件分別對(duì)FAP進(jìn)行HLA-A2限制性的CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)與篩選，在綜合各預(yù)測(cè)篩選結(jié)果的 基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選確定了 P639這種具有抗腫瘤活性的表位肽結(jié)構(gòu)，確定這 種CTL表位肽能夠與HLA-A2分子產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合能力，且可有效激活特異性CTL反應(yīng)，具有 成為治療性腫瘤多肽疫苗的可行性。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明所述表位肽P639的質(zhì)譜分析圖譜； 圖2是本發(fā)明所述表位肽在體外活性實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的特異性CTL的ELISP0T檢測(cè)結(jié)果； 圖3是本發(fā)明所述表位肽在體外活性實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)T2A2細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn) 的檢測(cè)結(jié)果。
[0014] 圖4是本發(fā)明所述表位肽在進(jìn)行HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)體重變化； 圖5是本發(fā)明所述表位肽在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的特異性CTL的ELI SPOT檢 測(cè)結(jié)果； 圖6是本發(fā)明所述表位肽在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)T2A2細(xì)胞 的殺傷實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)介紹，介紹具體實(shí)施例 前，首先對(duì)本發(fā)明中所用到部分實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、細(xì)胞來(lái)源等簡(jiǎn)單介紹如下，其他未說(shuō) 明試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等以本領(lǐng)域常用為準(zhǔn)，不再重復(fù)介紹。
[0016] 主要實(shí)驗(yàn)試劑： 人β2微球蛋白，Merck公司； rhIL-2、rhIL-7、rmlL-2，PEPR0TECH公司； IFN-γ ELISP0T試劑盒、單克隆抗體Anti-Human HLA-A2，eBioscience公司； LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Promega公司； 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備： RP-HPLC分析儀，日本島津公司； 流式細(xì)胞儀(Calibur)，美國(guó)K)公司； 酶標(biāo)儀，MD公司； 血液來(lái)源： HLA-A2+健康供者的外周血來(lái)自鄭州大學(xué)學(xué)生中招募的志愿者，樣品的采集經(jīng)鄭州大 學(xué)倫理委員會(huì)備案批準(zhǔn)； 陽(yáng)性對(duì)照肽 P321:參考《Identification of a new broad-spectrum CD8+ T cell epitope from over-expressed antigen COX-2 in esophageal carcinoma》（Cancer Letters，2009，24( 1) : 55~61)，由發(fā)明人自行合成獲得； 細(xì)胞來(lái)源： T2A2細(xì)胞(TAP缺陷），由第三軍醫(yī)大學(xué)吳玉章教授惠贈(zèng);所用T2A2細(xì)胞系是轉(zhuǎn)入了人 HLA-A*0201的T、B淋巴母細(xì)胞的雜交系，其不表達(dá)HLA-DR和MHC -II類(lèi)分子，可以很好的用 于MHC-I類(lèi)分子的抗原遞呈和T細(xì)胞識(shí)別的研究;且所使用的T2A2細(xì)胞呈TAP缺陷狀，抗原肽 不能進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與HLA-I分子進(jìn)行組裝，空載的HLA-I分子被遞呈到靶細(xì)胞表面，但是 其在低溫條件下極其不穩(wěn)定，構(gòu)象極易發(fā)生改變，此時(shí)HLA-A2 mAb不能檢測(cè)出HLA-A2陽(yáng)性 的細(xì)胞，而當(dāng)HLA-A2分子處于抗原肽荷載狀態(tài)時(shí)，構(gòu)象便被穩(wěn)定下來(lái)，通過(guò)孵育HLA-A2抗 體便能檢測(cè)出HLA-A2陽(yáng)性的細(xì)胞;如此，抗原肽結(jié)合力便可通過(guò)靶細(xì)胞表面HLA-A2的表達(dá) 情況加以反映； 小鼠來(lái)源： HLA-A2.1/KbR基因小鼠為第二軍醫(yī)大學(xué)曹雪濤院士惠贈(zèng)，于IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中 飼養(yǎng);實(shí)驗(yàn)室選擇6~8周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0017] 實(shí)施例！ 本發(fā)明所提供的FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639，與HLA-A2特異性結(jié)合，為九肽，具體 為： 表位肽P639，分子量907.14，其序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為:GLFKCGIAV，即：Gly- Leu- Phe- Lys- Cys- Gly- lie- Ala- Val〇
[0018] 所述CTL表位肽P639采用Fmoc固相合成法制備而成。合成時(shí)，合成肽從C端到N端逐 個(gè)延長(zhǎng)。合成時(shí)所用氨基酸均為α-氨基被Fmoc(芴甲氧羰?；?所保護(hù)的氨基酸，其中個(gè)別 氨基酸的側(cè)鏈也有保護(hù)基團(tuán)，分別為Cys(Trt，三苯甲基），Lys(Boc，叔丁氧羰基）。詳細(xì)制備 步驟如下所述。
[0019] ⑴稱(chēng)量0.3g Wang樹(shù)脂用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)充分溶脹，置于合成儀當(dāng)中；然 后在DIC (N，N-二異丙基碳二亞胺，促進(jìn)氨基酸縮合）、H〇Bt(l-羥基苯并三唑，活化羧基、抑 制外消旋）、DMAP(4-二甲氨基吡啶，催化縮合反應(yīng)，只在添加第一個(gè)氨基酸時(shí)使用）的作用 下，加入C端第一個(gè)氨基酸，即將Fmoc-Val-OH連接到Wang樹(shù)脂上，連接時(shí)，將合成儀置于搖 床中，室溫、200r、反應(yīng)2.5小時(shí)； 反應(yīng)結(jié)束后依次使用DMF洗滌2次，無(wú)水甲醇洗滌2次，DCM(二氯甲烷）洗滌3次，最后 再用DMF洗滌2次，每次均為2min，洗滌時(shí)溶液量控制在高出樹(shù)脂表面lcm左右，不宜過(guò)多或 過(guò)少； 洗滌結(jié)束后，挑出少量樹(shù)脂（lmg左右），烘干，用紫外分光光度計(jì)于290 nm下測(cè)量其0D 值，以備取代值計(jì)算，取代值SD=0D/( 1.65 X樹(shù)脂質(zhì)量）； 隨后用封頭液(體積比，醋酸酐:吡啶=1:1)封閉未反應(yīng)的樹(shù)脂，恒溫震蕩15 min，將液 體負(fù)壓條件下抽干;此步驟的主要目的是對(duì)未發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)進(jìn)行封閉，以減少副產(chǎn)物； 洗滌后（洗滌步驟同上），加入脫保護(hù)液（體積比，DMF:哌啶=4:1)，恒溫震蕩反應(yīng)20 min，除去Fmoc保護(hù)基，按前述方法再次洗滌； 隨后進(jìn)行茚檢(Kaiser法）：取少量樹(shù)脂于玻璃試管中，加入茚檢試劑，沸水浴lmin，觀 察溶液顏色改變情況;若溶液以及樹(shù)脂顆粒顏色變成藍(lán)色，說(shuō)明氨基酸保護(hù)基團(tuán)已經(jīng)被成 功脫除，可以進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的縮合;反之則說(shuō)明氨基酸的保護(hù)基團(tuán)沒(méi)有或者只是極少 部分被脫除； 然后，根據(jù)取代值SD計(jì)算C端下一個(gè)氨基酸，即Fmoc- Ala -OH的所需質(zhì)量，計(jì)算公式 為:ne=M_X2.5Xm?旨XSD;在DIC、HoBt的作用下，將其連接到Val的氨基上，再次按 前述方法洗滌； 茚檢結(jié)束后(此次茚檢后溶液和樹(shù)脂顆粒顏色應(yīng)為無(wú)色，才能說(shuō)明氨基酸成功加上，因 為此時(shí)第二個(gè)氨基酸加入后還未進(jìn)行脫保護(hù)），得到Ala - Val -Wang樹(shù)脂； (2) 重復(fù)步驟（1)，依次按順序?qū)le、Gly、Cys、Lys、Phe、Leu、Gly連接到肽鏈上； (3) 最后用脫保護(hù)液脫去Fmoc保護(hù)基，按前述方法洗滌后，用切割試劑(體積比，三蒸 水:苯酚:苯甲硫醚：1，2-乙二硫醇:三氟乙酸=2:2:2:1:33)將P639從Wang樹(shù)脂上切下，經(jīng) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、離心、洗滌、沉淀、烘干等步驟，得到抗腫瘤CTL表位肽P639粗肽； (4) RP-HPLC分離純化：用HPLC制備柱(0DS-39.4 X 250mm，安捷倫公司）分離純化，具體 為： 取步驟(3 )中表位肽P639粗肽15~20mg溶于4mL三氟乙酸和乙腈的混合溶液(二者體積 比4:1)中，過(guò)濾并超聲波震蕩除氣； 制備時(shí)，選擇流動(dòng)相A為含有0.1%的TFA的超純水溶液，流動(dòng)相B為100%的色譜級(jí)乙 腈溶液，二者比例為4:1，進(jìn)行梯度洗脫，流速設(shè)置為5mL/min，收集主峰，用凍干機(jī) (Genentech，US)冷凍干燥獲得精肽(高純度肽）。
[0020] 對(duì)所制得的精肽采用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI/MS)進(jìn)行質(zhì)譜分析(此部分由上?？齐?生物科技有限公司完成），以進(jìn)行分子量鑒定。
[0021] 表位肽P639鑒定結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，所制得精肽分子量為908.0,與 理論值相吻合。
[0022] 實(shí)施例2 對(duì)于實(shí)施例1所制備的表位肽P639,為驗(yàn)證其是否具有免疫活性，本實(shí)施進(jìn)行了一系列 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。首先，運(yùn)用結(jié)合力實(shí)驗(yàn)對(duì)其表位肽與HLA-A2分子的親和性進(jìn)行了檢驗(yàn)；隨后， 通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)^1^13?01')檢測(cè)了表位肽誘導(dǎo)獲得的正1丫+的(：11頻率，同時(shí)〇)!1革巴 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和CTL胞內(nèi)因子染色實(shí)驗(yàn);最后，根據(jù)所建立的HLA-A2.1/K b轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型， 對(duì)表位肽的體內(nèi)免疫效果進(jìn)行了測(cè)定。相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要介紹如下。
[0023] 一、細(xì)胞結(jié)合力、及表位肽/MHC復(fù)合物的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（即CTL表位肽與HLA-A2分子 間的結(jié)合力和結(jié)合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)） 具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下： (1) 取培養(yǎng)中的T2A2細(xì)胞，選擇分裂增殖明顯狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用電 動(dòng)移液器輕輕貼壁吹吸培養(yǎng)體系均勻的細(xì)胞懸液，收集于15 mL離心管中，SOOrpm離心10分 鐘收集T2A2細(xì)胞，無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基洗滌3次，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為IX 106/mL，鋪于無(wú) 菌24孔板中，每孔lmL; (2) 分別設(shè)置空白對(duì)照組(不加任何肽）、P321陽(yáng)性對(duì)照組、PBS陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各 兩個(gè)復(fù)孔； 除空白對(duì)照組外，各孔分別加入PBS(陰性對(duì)照組)和50 yg/mL的表位肽(實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性 對(duì)照組）以及3 yg/rnL的β2微球蛋白，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育18 h; (3) 18h后，用預(yù)冷的PFA buffer(100 mL PBS7.4+ 5 mL FBS+ 90mg疊氮化鈉）洗滌三 次，棄掉上清， 細(xì)胞結(jié)合力時(shí)，避光加入50 μL已用PFA緩沖液50:1稀釋后的帶有PE熒光標(biāo)記的單克 隆抗體Anti-Human HLA-A2 PE_Cyanine7,4°C避光孵育35min; 表位肽/MHC復(fù)合物的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)時(shí)，每孔加入10 yg/mL的BFA(BrefeldinA， eBioscience公司）孵育lh，洗滌后，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中分別孵育詘、211、411、611 ;孵育 結(jié)束后，洗滌，再避光加入50yL已用PFA溶液50:1稀釋后的鼠抗人單克隆抗體Anti-Human HLA-A2 PE-Cyanine7，4°C避光孵育35min; (4) 預(yù)冷的PFA buffer洗滌后，置于冰上，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄各組平均熒光值MFI (MEAN Fluorescence Intensity)和DCs。值(DC50表示50%肽/MHC分子復(fù)合物解離所需的時(shí) 間）。
[0024] 熒光指數(shù)FI=(實(shí)驗(yàn)組MFI -背景組MFI)/背景組MFI;結(jié)果分析：當(dāng)FI > 1.5時(shí)，表 明實(shí)驗(yàn)組肽(表位肽)與HLA-A2分子具有高結(jié)合力；當(dāng)1.5>FI >0.5時(shí)，表明其結(jié)合力中等； 當(dāng)FI <0.5時(shí)，表明其結(jié)合力較弱。
[0025]結(jié)合力及穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表所示：
結(jié)果顯示，P639顯示出了中等結(jié)合力且半衰期>6h，表明表位肽與MHC分子形成的復(fù) 合物穩(wěn)定性很好，可較好激活免疫反應(yīng)，具有一定的應(yīng)用潛力。
[0026]二、CTL體外免疫活性檢測(cè) CTL體外免疫活性檢測(cè)主要是先體外誘導(dǎo)激活CTL，然后通過(guò)ELISP0T技術(shù)對(duì)IFN- γ的 分泌情況的檢測(cè)和LDH細(xì)胞殺傷情況的檢測(cè)對(duì)免疫活性情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程介紹 如下。
[0027] 1、體外誘導(dǎo)激活CTL 該實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)外周血的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使其激活轉(zhuǎn)化為特異性表達(dá)CD8+的 CTL(細(xì)胞毒性Τ淋巴細(xì)胞），相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程介紹如下。
[0028] (1)選取若干名健康的HLA-A2+的志愿者，由醫(yī)護(hù)人員抽取每人20 mL外周血，加入 到有肝素鈉(抗凝血試劑)的50 mL無(wú)菌離心管中，按1:1的體積比例與的PBS(pH =7.2)進(jìn)行 等體積混合，緩慢吹打混勻； (2) 在15 mL無(wú)菌離心管中加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)螅?，然后輕輕緩慢地加入 步驟(1)中的混勾的抗凝血8 mL;室溫、2000 rpm，離心30 min; (3) 離心完畢后，緩慢取出，可見(jiàn)液體明顯的分為四層，從上到下依次為血漿層，淋巴細(xì) 胞層，分離液層，紅細(xì)胞層。用彎管小心吸取第二層乳白色的外周血單個(gè)核細(xì)胞層(PBMCs) 于已加有約5倍體積PBS的離心管中，2000 rpm、離心15 min; (4) 離心完畢后，盡棄上清，用含10%胎牛血清的頂DM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞 密度為卜1.5 X 106個(gè)/mL，鋪于24孔板中，每孔1 mL，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中過(guò)夜； (5) 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(C0X-2321-329，即P321)、PBS陰性對(duì)照組、無(wú)關(guān)肽對(duì)照組(HBVc 18-27,即HBV)和實(shí)驗(yàn)組； 于次日分別加入各組的多肽10yg/mL，P2微球蛋白（3yg/mL)，第三日加入50 U/mL的 rhIL-2，其后隔天加入rhIL-2進(jìn)行刺激，到第七天結(jié)束為一輪周期； 共三輪刺激； 刺激過(guò)程中，實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)需要每2~3 d進(jìn)行半量換液； 第三輪需要額外補(bǔ)加 lOyg/mL的rhIL_7(Peprotech公司）和5yg/mL 0)3刺激性單克隆 抗體(eBioscience&3)。
[0029] 三輪刺激后，在第21d時(shí)即得到效應(yīng)CTL細(xì)胞。
[0030] 2、ELISP0T技術(shù)檢測(cè)體外誘導(dǎo)的CTL分泌產(chǎn)生IFN- γ的能力 取體外誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞，利用ELISP0T實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其分泌產(chǎn)生的IFN- γ的量進(jìn)行檢測(cè)， 具體過(guò)程介紹如下： (1) 包被板條:板條使用的是密理博公司(Mi 11 ipore )的非預(yù)包被板，先用15yL、35%乙 醇活化PVDF膜lmin，然后用200yL的roS(pH=7.2)洗3遍，每次停留一分鐘；完成后，4°C過(guò)夜 孵育IFN-γ 抗體（Capture Antibody IFN_y，eBioscience); (2) 封閉：于次日每孔加入200 yL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫放置10 min后盡 棄培養(yǎng)基； (3) 細(xì)胞荷肽:調(diào)整T2A2細(xì)胞的濃度為2X106個(gè)/mL，加入相應(yīng)的表位肽(加入量50 yg/ mL)、和人β2Μ(β2微球蛋白，3yg/mL)、或PBS后，置于37 °C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育4 h，作為刺激 細(xì)胞； (4) 收集體外誘導(dǎo)的CTL，即上述三輪刺激后所得效應(yīng)CTL細(xì)胞，用無(wú)血清的頂DM洗2次， 調(diào)整細(xì)胞密度為2 X 106個(gè)/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞； (5) 以總體積lOOyL，接種到已活化的Millipore板條上(步驟(2)中所制備），設(shè)置各組 如下： 實(shí)驗(yàn)孔：（荷載表位肽的T2A2細(xì)胞懸液50 yL+效應(yīng)細(xì)胞懸液50 yL)(效應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì) 胞按1:1的數(shù)量比計(jì)數(shù)）； 陰性對(duì)照孔:荷載PBS的Τ2Α2懸液50 yL+效應(yīng)細(xì)胞懸液50 yL; 自發(fā)對(duì)照孔:效應(yīng)細(xì)胞懸液50 yL+無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基50 yL; 陽(yáng)性對(duì)照孔:效應(yīng)細(xì)胞懸液50 yL+荷載表位肽P321的T2A2細(xì)胞懸液50 yL; 空白對(duì)照孔：100 yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，鋪板完成后，放入無(wú)菌錫紙袋內(nèi)，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育 18 h;期間避免培養(yǎng)箱的頻繁開(kāi)閉和不必要的震動(dòng)，以免影響斑點(diǎn)的形成； (6) 18h后，將板條內(nèi)液體扣干，加入200yL預(yù)冷的無(wú)菌三蒸水，4°C裂解lOmin; 然后將孔內(nèi)液體扣干，1 XWashing Buffer洗6次，每次停留lmin，扣干時(shí)需在無(wú)菌、無(wú) 粉的衛(wèi)生紙上扣干； (7) 每孔加入100yL生物素標(biāo)記的IFN-γ檢測(cè)抗體(eBioscience)，置于37°C、5%C02培 養(yǎng)箱中孵育1 h，時(shí)間到后盡棄孔內(nèi)液體，重復(fù)上述步驟(6)洗滌； (8) 然后每孔加入100yL的酶聯(lián)親和素溶液(eBioscience)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中 孵育1 h，完成后盡棄孔內(nèi)液體，重復(fù)上述步驟(6)洗滌； (9) 按要求配制AEC底物顯色液，100μL7孔，室溫條件下，避光顯色約35 min，逐漸能觀 察到淡紅色斑點(diǎn)； 顯色結(jié)束后，盡棄孔內(nèi)液體，將孔板底座去掉(避免背景加深），用蒸餾水反復(fù)沖洗孔板 以終止反應(yīng)，然后將板條置于避光干燥處，室溫自然晾干；用超微距相機(jī)拍照，記錄各孔中 的斑點(diǎn)數(shù)。
[0031]對(duì)其中3名志愿者的具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示。
[0032]從圖2中可以看出，通過(guò)檢測(cè)IFN-γ的分泌情況，可以發(fā)現(xiàn)表位肽P639均能成功誘 導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL;斑點(diǎn)數(shù)分別為76、52和49個(gè)，其數(shù)目與陽(yáng)性對(duì)照P321組(分別為72、69和 12個(gè))基本相當(dāng)甚至還多于它。雖然在不同志愿者之間表位肽P639表現(xiàn)出一定的差異性，但 這可能是由于個(gè)體間的差異所造成。綜合分析考慮，表位肽P639具有誘導(dǎo)特異性CTLs的能 力。
[0033] 3、LDH細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 參考CytoTox 96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒（Promega公司）說(shuō) 明書(shū)，進(jìn)一步進(jìn)行了 LDH細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程介紹如下。
[0034] (1)收集效應(yīng)細(xì)胞:將第三輪誘導(dǎo)的CTL收集起來(lái)（即步驟1中體外誘導(dǎo)的CTL)，調(diào) 整細(xì)胞密度為5X106個(gè)/mL; (2) 準(zhǔn)備靶細(xì)胞:收集T2A2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X105 /mL，加入相應(yīng)的表位肽(加入 量50 yg/mL)、和人β2Μ(β2微球蛋白，3yg/mL)，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育4 h; (3) 檢測(cè)板的設(shè)立：100yL體系;具體分組情況為： 實(shí)驗(yàn)組：以T2A2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按12.5 :1、25 :1、50 :1的效靶比加入各相關(guān)細(xì)胞； (12.5:1效靶比組，12.5 yL CTL+50 yL荷載表位肽的T2A2細(xì)胞+37.5yL無(wú)血清MDM培養(yǎng) 基;25:1效靶比組，25以1^(：孔+50以1^荷載表位肽的了242細(xì)胞+25以1^無(wú)血清頂01培養(yǎng)基； 50:1效靶比組，50yL CTL+50 yL荷載表位肽的T2A2細(xì)胞） 背景對(duì)照組：100 yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 靶細(xì)胞最大釋放LDH組:50 yL荷載表位肽的T2A2細(xì)胞+50 yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 靶細(xì)胞自發(fā)釋放LDH組:50 yL荷載表位肽的T2A2細(xì)胞+50 yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放LDH組:12.5:1自發(fā)組，12.5 yL CTL+87.5yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 25:1自發(fā)組，25 yL CTL+75yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基；50:1自發(fā)組，50yL CTL+50 yL無(wú)血清 頂DM培養(yǎng)基； 體積校正對(duì)照組：100 yL無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基； 以上各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔； (4) 按上述加入相應(yīng)細(xì)胞后，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育4 h; (5) 在孵育結(jié)束前45min時(shí)，在靶細(xì)胞最大釋放LDH組和體積校正對(duì)照組中分別加入10μ L裂解液； (6) 1000 rpm、離心10min;然后取50yL上清轉(zhuǎn)入到另一個(gè)96孔酶標(biāo)板對(duì)應(yīng)的孔中，每孔 加入50 yL 37°C預(yù)熱的已稀釋的底物混合液，在室溫條件下避光反應(yīng)30 min; 時(shí)間到后，每孔加入終止液50 yL;去除氣泡（以免影響OD值）； 在1 h內(nèi)，用酶標(biāo)儀(Bio-Red公司），490 nm處檢測(cè)OD值。
[0035]細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式： 細(xì)胞殺傷率(％)=(實(shí)驗(yàn)組釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋 放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放）X1 〇〇%， 所有組均需減去背景對(duì)照組，而靶細(xì)胞最大釋放組應(yīng)減去體積校正組。
[0036]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。可以看出，在志愿者1中，P639組在各個(gè)效靶比下的殺傷率均 明顯高于P321陽(yáng)性對(duì)照組，分別為43%、60%和25%。在志愿者2中，P639組在效靶比為12.5:1 和25:1時(shí)殺傷率均高于陽(yáng)性對(duì)照P321組，分別為37%和62%，而在50:1時(shí)殺傷率與P321組相 當(dāng)，為56%。而在志愿者3中，P639組的殺傷率隨著效靶比的升高而逐漸升高，分別為27%、38% 和54%，均高于P321組。綜合以上分析，我們認(rèn)為P639組能誘導(dǎo)出特異性CTLs，并且能在體外 表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞較明顯的殺傷作用。
[0037]三、HLA_A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)免疫活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 基于上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)表位肽P639在小鼠體內(nèi)的免疫性能進(jìn)行了進(jìn) 一步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，具體過(guò)程介紹如下。
[0038](一)轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫 (1) 選取6~8周齡的小鼠，稱(chēng)量并記錄體重后進(jìn)行分組，每組3雌2雄，且盡量使得每組小 鼠的平均體重基本一致;共分為3組： P639+Th表位（I-Ab乙肝病毒核心抗原來(lái)源的Th細(xì)胞表位，序列為:TPPAYRPPNAPID+ IFA(弗氏不完全佐劑，Sigma公司）組， PBS +IFA 組， Th表位+IFA組； 分別于第1天、第6天、第11天免疫三次(免疫方式如下述步驟(3)所述）； (2) 表位肽的乳化:免疫時(shí)采用乳化后混合物，具體乳化方式為， 按CTL表位肽100 yg/只、Th表位140 yg/只的量與IFA按1:1的質(zhì)量比例混勻； 將各體系在10 mL離心管中混合均勻后，將滅菌的玻璃注射器插入離心管中反復(fù)吹打 約30 min;起初體系粘稠度低，很難掛壁，隨著不斷吹吸乳化的進(jìn)行，體系最后呈現(xiàn)粘稠度 較高的狀態(tài);此時(shí)，取一盛有冰水混合物的小燒杯，用1 mL注射器吸取少許乳白色的乳化 液，滴入冰水混合物中，若是凝聚為滴狀漂浮于水面說(shuō)明乳化成功，若是入水后彌散，說(shuō)明 乳化操作并不充分，還未形成理想的油包水狀態(tài)，需要繼續(xù)連續(xù)吸打； 乳化成功后用1 mL注射器吸取乳化的表位肽，小心反復(fù)磕實(shí)，以免有氣柱殘存而影響 免疫效果； (3)免疫注射時(shí)，采用背部皮下多點(diǎn)免疫方式進(jìn)行免疫注射;免疫期間每隔一天稱(chēng)量小 鼠體重并進(jìn)行詳細(xì)記錄。
[0039]體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，免疫期間小鼠體重未發(fā)生明顯波動(dòng)， 初步表明表位肽P639未對(duì)小鼠造成明顯的毒副作用。
[0040](二)小鼠脾臟及腿部淋巴結(jié)來(lái)源的⑶8+ CTL體外誘導(dǎo)刺激 (1) 第16天處死小鼠（即步驟(一）中免疫16天后），75%酒精浸泡10 min后在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn) 行解剖，取其脾臟及腿部淋巴結(jié)用一次性200目篩網(wǎng)進(jìn)行研磨； 組織及細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15 mL離心管，每管約10 mL;水平離心機(jī)離心，1300 rpm、10 min，棄上清； 加入紅細(xì)胞裂解液，置于4°C裂解10 min;離心，1300 rpm、10 min，棄上清； 加入含有2%?83的？83(?!17.2)離心洗滌一次，1300印111、1〇1^11，棄上清； 加入10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整密度為5X 106個(gè)/mL，鋪入6孔板中； (2) 第二天加入表位肽，10 yg/mL，02_M，3 yg/mL，rmIL_2，50 U/mL;5天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 [0041 ](三)ELISP0T 和 LDH 實(shí)驗(yàn) 利用ELISP0T技術(shù)對(duì)CTL分泌產(chǎn)生IFN- γ的量進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步進(jìn)行LDH細(xì)胞殺傷實(shí) 驗(yàn)，以對(duì)免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)參考前述即可，不再重復(fù)。（注:小鼠 LDH實(shí)驗(yàn)的效靶比 設(shè)置不同于之前，分別為20:1，40:1和80:1)。
[0042] ELISP0T結(jié)果見(jiàn)圖5。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，經(jīng)體內(nèi)免疫并進(jìn)行體外誘導(dǎo)刺激得到 的轉(zhuǎn)基因小鼠 CTLs同樣具有顯著分泌IFN-γ的能力。Ρ639實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)為98個(gè)極顯著高 于Th表位組和PBS組(P<0.01**)。初步表明我們所構(gòu)建的免疫模型基本可靠，得到的CTLs 能夠用于后續(xù)的細(xì)胞毒性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。
[0043] LDH結(jié)果見(jiàn)圖6。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，P639組在效靶比為40:1和80:1時(shí)殺傷率分 別為35%和34%，極顯著（P<0.01**)高于Th組和PBS組(Ρ<0.0Γ~)。而在效靶比為20:1時(shí)， 殺傷率最低，為26%，顯著(Ρ<0.01*)高于Th組和PBS組(Ρ<0.0Γ)。結(jié)果表明Ρ639組所誘導(dǎo) 的轉(zhuǎn)基因小鼠 CTLs對(duì)靶細(xì)胞也有較明顯的殺傷作用。綜上，表位肽Ρ639在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi) 也具有一定的免疫活性。
[0044]結(jié)合上述所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽能夠在治療性腫瘤多肽 疫苗的研究中加以應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639，其特征在于，所述CTL表位肽P639為九肽，其分子 量907.14,序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：GLFKCGIAV，即：Gly- Leu- Phe- Lys- Cys-Gly- He- Ala- Val〇2. 權(quán)利要求1所述FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639的制備方法，其特征在于，采用Fmoc 固相合成法制備而成。3. 權(quán)利要求1所述FAP來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽P639在制備腫瘤治療藥劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK105949302SQ201610361348
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】陳鯉翔, 王成功, 王婷, 祁元明, 安秀麗, 高艷鋒, 李國(guó)棟
【申請(qǐng)人】鄭州大學(xué)