本發(fā)明涉及肝癌的臨床分子診斷的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)肝癌基因標(biāo)志物的5-羥甲基胞嘧啶含量從而檢測(cè)肝癌是否存在的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

肝癌是最常見(jiàn)的全球惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)病748300例，死亡695900例，其中50％以上發(fā)生在中國(guó)。在原發(fā)性肝癌中，70％-85％為肝細(xì)胞肝癌(hcc)。目前，肝癌的5年生存率僅3％-5％，因?yàn)榇蟛糠只颊呔驮\時(shí)已屬中晚期，失去了最佳治療時(shí)間。因此，早檢查早診斷早治療是提高患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵。

目前肝癌的檢測(cè)主要通過(guò)影像學(xué)、組織活檢、血清學(xué)檢測(cè)等。然而，影像學(xué)易受操作者經(jīng)驗(yàn)影響，并且依賴于設(shè)備，費(fèi)用昂貴，尤其是在醫(yī)療資源有限的情況下，其準(zhǔn)確率難以保證，難以廣泛和常規(guī)應(yīng)用。組織活檢是目前臨床上確診肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但組織活檢存在很大局限性，例如手術(shù)取樣的困難，或者某些癌癥部位不便進(jìn)行穿刺，并且穿刺本身也會(huì)帶來(lái)一定的臨床風(fēng)險(xiǎn)，反復(fù)穿刺篩查更會(huì)給患者帶來(lái)巨大痛苦。血清學(xué)檢測(cè)目前應(yīng)用最廣的是對(duì)甲胎蛋白(afp)的檢測(cè)，但afp對(duì)早期肝癌的靈敏度和特異性都不高，例如在一些非肝癌的慢性肝病患者，如很多慢性肝炎和肝硬化患者中，血清afp也升高。

在對(duì)肝癌的早期篩查中，難度最大的是對(duì)小肝癌的篩查。小肝癌又稱為亞臨床肝癌或早期肝癌，臨床上無(wú)明顯肝癌癥狀和體征，一般指肝細(xì)胞癌中單個(gè)癌結(jié)節(jié)最大直徑不超過(guò)3厘米或兩個(gè)癌結(jié)節(jié)直徑之和不超過(guò)3厘米的肝癌。我國(guó)的小肝癌標(biāo)準(zhǔn)是：?jiǎn)蝹€(gè)癌結(jié)節(jié)最大直徑不超過(guò)3厘米；多個(gè)癌結(jié)節(jié)數(shù)目不超過(guò)兩個(gè)，其最大直徑總和應(yīng)小于3厘米。小肝癌的手術(shù)切除率高達(dá)93.6％，預(yù)后較好，生存率較高。因此早期篩查出小肝癌具有重要的臨床意義。目前對(duì)小肝癌的篩查也主要采取超聲檢查、影像學(xué)診斷與血清甲胎蛋白檢測(cè)等方法。但如上所述，這些傳統(tǒng)方法對(duì)于小肝癌診斷的準(zhǔn)確率和特異性不高。

因此，尋找新的肝癌標(biāo)志物，尤其是預(yù)警監(jiān)測(cè)和早期診斷的標(biāo)志物是對(duì)于提高早期肝癌的診斷率，實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過(guò)對(duì)正常樣品和肝癌樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)其中各基因上的5-羥甲基胞嘧啶(5-hmc)含量進(jìn)行分析，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了多個(gè)極具信息的可用于檢測(cè)肝癌的基因標(biāo)志物。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)肝癌的基因標(biāo)志物，包括一個(gè)或多個(gè)選自以下的基因：fat非典型鈣粘蛋白1(fat1)、雌激素相關(guān)受體γ(esrrg)、γ氨基丁酸a類(lèi)受體β3亞基(gabrb3)、tnf受體超家族成員11b(tnfrsf11b)、受體互作絲氨酸/蘇氨酸激酶4(ripk4)、重排的l-myc融合蛋白(rlf)、溶質(zhì)載體家族13成員5(slc13a5)、細(xì)胞色素p450氧化還原酶(por)和deltexe3泛素連接酶(dtx1)。優(yōu)選的，所述基因標(biāo)志物包括至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)或至少九個(gè)選自以下的基因：fat1、esrrg、gabrb3、tnfrsf11b、ripk4、rlf、slc13a5、por和dtx1。更優(yōu)選的，所述基因標(biāo)志物包括fat1、esrrg、gabrb3、tnfrsf11b、ripk4、rlf、slc13a5、por和dtx1。

本發(fā)明還涉及上述基因標(biāo)志物在檢測(cè)肝癌中的用途。

本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于檢測(cè)肝癌的方法，包括以下步驟：

(a)測(cè)定正常樣品和受試者樣品中本發(fā)明所述的基因標(biāo)志物的5-hmc的含量；

(b)用正常樣品中所述基因標(biāo)志物的5-hmc含量作為參照，將受試者樣品中對(duì)應(yīng)的基因標(biāo)志物的5-hmc含量標(biāo)準(zhǔn)化；

(c)對(duì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的所述基因標(biāo)志物的5-hmc含量進(jìn)行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)，并獲得評(píng)分；和

(d)根據(jù)所述評(píng)分獲得檢測(cè)結(jié)果，評(píng)分p大于0.5表明該受試者樣品患有肝癌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是受試者或正常人體液中游離的dna片段，或來(lái)源于細(xì)胞器、細(xì)胞以及組織中的完整基因組dna。其中，體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的基因標(biāo)志物的5-hmc含量可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行測(cè)定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性內(nèi)切酶法、化學(xué)標(biāo)記法、與高通量測(cè)序方法聯(lián)用的沉淀法、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序法(smrt)、氧化重亞硫酸鹽測(cè)序法(oxbs-seq)等。葡糖基化法的原理是采用t4噬菌體β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β-gt)，在葡萄糖供體底物尿核苷二磷酸葡萄糖(udp-glu)存在下，將葡萄糖轉(zhuǎn)移至羥基位置，從而生成β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(5-ghmc)。同時(shí)可采用同位素標(biāo)記底物進(jìn)行定量。在葡糖基化法基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展出限制性內(nèi)切酶法和化學(xué)標(biāo)記法。限制性內(nèi)切酶法的原理是：葡糖基化反應(yīng)改變了一些限制性內(nèi)切酶的酶切特性。甲基化依賴的限制性內(nèi)切酶mspi和hpaii可識(shí)別同樣的序列(ccgg)，但它們對(duì)甲基化狀態(tài)的敏感性是不同：mspi識(shí)別并切割5-甲基胞嘧啶(5-mc)和5-hmc，但不能切割5-ghmc；hpaii只切割完全未修飾的位點(diǎn)，胞嘧啶上的任何修飾(5-mc、5-hmc、5-ghmc)均阻礙切割。若cpg位點(diǎn)含有5-hmc，那么糖基化、酶解之后能檢測(cè)到條帶，未糖基化對(duì)照反應(yīng)中沒(méi)有條帶；同時(shí)可采用qpcr進(jìn)行定量分析。另外，其他限制性內(nèi)切酶也同樣存在阻礙5-ghmc酶切的情況，可應(yīng)用于5-hmc檢測(cè)(如：gmrsd，mspji，pvurtsli，taqi等)?；瘜W(xué)標(biāo)記法的原理是：將酶反應(yīng)底物上的葡萄糖進(jìn)行化學(xué)修飾轉(zhuǎn)變成udp-6-n3-glucose，將6-n3-glucose轉(zhuǎn)移到羥甲基位置，生成n3-5ghmc。隨后，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)方法在每個(gè)5-hmc上添加一分子生物素，結(jié)合下一代高通量dna測(cè)序技術(shù)或單分子測(cè)序技術(shù)，可分析5-hmc在基因組dna中的分布情況。沉淀法是將5-hmc用特殊方式修飾后再將其特異性地從基因組dna中捕獲下來(lái)，并進(jìn)行測(cè)序分析。氧化重亞硫酸鹽測(cè)序法是首個(gè)以單堿基分辨率對(duì)5-hmc進(jìn)行定量測(cè)序的方法.首先將5-hmc進(jìn)行kruo4氧化處理，生成5-甲酰胞嘧啶(5fc)，然后采用重亞硫酸鹽測(cè)序。在此過(guò)程中，5-hmc先氧化為5fc，而后脫氨形成u。通常，同時(shí)采用多種檢測(cè)方法對(duì)5-hmc進(jìn)行定量檢測(cè)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用化學(xué)標(biāo)記法結(jié)合高通量測(cè)序來(lái)測(cè)定本發(fā)明的基因標(biāo)志物的5-hmc含量。在該具體的實(shí)施方案中，測(cè)定本發(fā)明的基因標(biāo)志物的5-hmc含量的方法包括以下步驟：將來(lái)自肝癌患者和正常人的樣品的dna片段化；將所述片段化的dna末端修復(fù)并末端補(bǔ)齊；將末端補(bǔ)齊的dna與測(cè)序接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)對(duì)連接產(chǎn)物中的5-羥甲基胞嘧啶進(jìn)行標(biāo)記；富集含有5-羥甲基胞嘧啶標(biāo)記的dna片段，獲得富集產(chǎn)物；對(duì)富集產(chǎn)物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得測(cè)序文庫(kù)；對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果；根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，標(biāo)記反應(yīng)包括：i)利用糖基轉(zhuǎn)移酶將帶有修飾基團(tuán)的糖共價(jià)連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和ii)將直接或間接連有生物素的點(diǎn)擊化學(xué)底物與帶有修飾基團(tuán)的5-羥甲基胞嘧啶反應(yīng)。其中，步驟i)和步驟ii)可以按順序進(jìn)行，也可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行。這種標(biāo)記方法減少了測(cè)序所需的樣本量，且5-羥甲基胞嘧啶上的生物素標(biāo)簽使其在測(cè)序中顯示出更高的動(dòng)力學(xué)信號(hào)，提高了核苷酸識(shí)別的準(zhǔn)確性。在該實(shí)施方案中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于：t4噬菌體β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(β-gt)、t4噬菌體α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(α-gt)及其具有相同或相似活性的衍生物、類(lèi)似物、或重組酶；所述帶有修飾基團(tuán)的糖包括但不限于：帶有疊氮修飾的糖類(lèi)(例如6-n3-葡萄糖)或帶有其他化學(xué)修飾(例如羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、酰胺基、雙烯等)的糖類(lèi)，其中優(yōu)選帶有疊氮修飾的糖類(lèi)；所述用于間接連接生物素和點(diǎn)擊化學(xué)底物的化學(xué)基團(tuán)包括但不限于：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、酰胺基、雙烯。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)固相材料來(lái)富集含有5-hmc標(biāo)記的dna片段。具體地，可以通過(guò)固相親和反應(yīng)或其他特異性結(jié)合反應(yīng)將含有5-羥甲基胞嘧啶標(biāo)記的dna片段結(jié)合在固相材料上，然后通過(guò)多次洗滌去除未結(jié)合的dna片段。固相材料包括但不限于帶有表面修飾的硅片或其他芯片，例如人工高分子小球(優(yōu)選直徑為1nm-100um)、磁性小球(優(yōu)選直徑為1nm-100um)、瓊脂糖小球等(優(yōu)選直徑為1nm-100um)。固相富集中所用的洗滌液是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的緩沖液，包括但不限于：含有tris-hcl、mops、hepes(ph＝6.0-10.0，濃度在1mm到1m之間)、nacl(o-2m)或表面活性劑如tween20(0.01％-5％)的緩沖液。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選直接在固相上進(jìn)行pcr擴(kuò)增從而制備測(cè)序文庫(kù)。如有需要，在固相上進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，可以回收擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增來(lái)制備測(cè)序文庫(kù)。所述第二輪pcr擴(kuò)增可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行。任選地，在制備測(cè)序文庫(kù)的過(guò)程中可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)純化步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的或可商購(gòu)的任何純化試劑盒均可用于本發(fā)明。純化方法包括但不限于：凝膠電泳切膠回收、硅膠膜離心柱法、磁珠法、乙醇或異丙醇沉淀法或其組合。任選地，在高通量測(cè)序之前，對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢查。例如，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行片段大小分析并使用qpcr方法對(duì)文庫(kù)的濃度進(jìn)行絕對(duì)定量。通過(guò)質(zhì)量檢查的測(cè)序文庫(kù)可用于高通量測(cè)序。然后將一定數(shù)量(1-96個(gè))含有不同barcode的文庫(kù)按相同濃度混勻并根據(jù)二代測(cè)序儀的標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)方法上機(jī)測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果。本領(lǐng)域已知的各種二代測(cè)序平臺(tái)及其相關(guān)的試劑可用于本發(fā)明。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)人類(lèi)基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)，挑選出其中比對(duì)到本發(fā)明基因標(biāo)志物上的序列，即選擇比對(duì)位點(diǎn)與基因特征(如組蛋白修飾位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、基因外顯子內(nèi)含子區(qū)域以及基因啟動(dòng)子等)重合區(qū)域的讀段數(shù)量，以代表5-hmc在該基因上的修飾水平，從而測(cè)定5-hmc在該基因標(biāo)志物上的含量。優(yōu)選在進(jìn)行比對(duì)前，首先將測(cè)序結(jié)果清除低質(zhì)量測(cè)序位點(diǎn)，其中衡量測(cè)序位點(diǎn)質(zhì)量的因素包括但不限于：堿基質(zhì)量、reads質(zhì)量、gc含量、重復(fù)序列和overrepresented序列數(shù)量等。該步驟中涉及的各種比對(duì)軟件和分析方法是本領(lǐng)域已知的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定基因標(biāo)志物的5-hmc含量是指測(cè)定該基因標(biāo)志物全長(zhǎng)上的5-hmc含量或測(cè)定該基因標(biāo)志物上某一片段的5-hmc含量或其組合。

根據(jù)本發(fā)明，在測(cè)定各基因標(biāo)志物上5-hmc含量之后，用正常樣品中所述基因標(biāo)志物的5-hmc含量作為參照，將受試者樣品中對(duì)應(yīng)的基因標(biāo)志物的5-hmc含量標(biāo)準(zhǔn)化。舉例而言，正常樣品和受試者樣品中同一基因標(biāo)志物的5-hmc含量分別為x和y，則受試者樣品中該基因標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量為y/x。

根據(jù)本發(fā)明，在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)各基因標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量進(jìn)行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)以獲得評(píng)分，從而根據(jù)所述評(píng)分獲得檢測(cè)結(jié)果。如本文所用，“數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)”是指將來(lái)自生物樣品的基因標(biāo)志物的5-hmc含量與肝癌診斷結(jié)果相關(guān)聯(lián)的任何計(jì)算方法或機(jī)器學(xué)習(xí)方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，可選擇不同的計(jì)算方法或工具用于提供本發(fā)明的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)，例如彈性網(wǎng)絡(luò)正則化、決策樹(shù)、廣義線性模型、邏輯回歸、最高分值對(duì)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、線性和二次判別式分析(lqa和qda)、樸素貝葉斯、隨機(jī)森林和支持向量機(jī)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)各基因標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量進(jìn)行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)并獲得評(píng)分的具體步驟如下：將各基因標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量乘以加權(quán)系數(shù)，獲得該基因標(biāo)志物的預(yù)測(cè)因子t；將各基因標(biāo)志物的預(yù)測(cè)因子t相加，獲得總預(yù)測(cè)因子t；將總預(yù)測(cè)因子t經(jīng)過(guò)logistic轉(zhuǎn)換獲得評(píng)分p；若p＞0.5，則該受試者樣品患有肝癌；若p≤0.5，則該受試者樣品為正常。本文所述的加權(quán)系數(shù)是指在考慮可能影響5-hmc含量的因素(例如受試者地域、年齡、性別、低于、吸煙史、飲酒史、家族史等)的情況下，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種高級(jí)統(tǒng)計(jì)分析方法獲得的系數(shù)。

本發(fā)明第三個(gè)方面還涉及利用上述基因標(biāo)志物進(jìn)行肝癌檢測(cè)的試劑盒，其包括用于測(cè)定上述基因標(biāo)志物的5-hmc含量的試劑和說(shuō)明書(shū)。用于測(cè)定基因標(biāo)志物的5-hmc含量的試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如t4噬菌體β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和同位素標(biāo)記(對(duì)于葡糖基化法)、限制性內(nèi)切酶(對(duì)于限制性內(nèi)切酶法)、糖基轉(zhuǎn)移酶和生物素(對(duì)于化學(xué)標(biāo)記法)、pcr和測(cè)序所用試劑等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中用于檢測(cè)肝癌的方法是基于基因標(biāo)志物上的5-hmc含量，因此可以使用更為廣泛的dna樣品來(lái)源。因此，本發(fā)明中用于檢測(cè)肝癌的方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：(1)安全無(wú)創(chuàng)，即使無(wú)癥狀人群也對(duì)該檢測(cè)接受度高；(2)dna來(lái)源廣泛，不存在影像學(xué)中的檢測(cè)盲區(qū)；(3)準(zhǔn)確性高，對(duì)早期肝癌有較高的靈敏度和特異性，適合用于肝癌的早期篩查；(4)操作方便，用戶體驗(yàn)好，容易進(jìn)行肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的基因標(biāo)志物可與其他臨床指標(biāo)相結(jié)合，為肝癌篩查、診斷、治療與預(yù)后提供更準(zhǔn)確的判斷。

附圖說(shuō)明

圖1：用本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物區(qū)分肝癌樣品和健康對(duì)照的結(jié)果。

圖2：用本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物區(qū)分小肝癌樣品和健康對(duì)照的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施。需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明的附圖及其實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明的目的，并不能對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。在不矛盾的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。

實(shí)施例1.肝癌基因標(biāo)志物的篩選

(1)抽提血漿dna：

從來(lái)自20位肝癌患者和20位正常人的樣品中分別抽提10ng血漿dna?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于抽提血漿dna的方法、和試劑進(jìn)行此步驟。

(2)將血漿dna進(jìn)行末端補(bǔ)齊、懸a并與測(cè)序接頭連接：

根據(jù)kapahyperperpkit說(shuō)明書(shū)制備含有50ul血漿dna、7ulendrepair&a-tailingbuffer和3ulendrepair&a-tailingenzymemix的反應(yīng)混合液(總體積為60ul)，在20℃溫浴30分鐘，然后在65℃溫浴30分鐘。在1.5ml低吸附ep管中配置以下連接反應(yīng)混合物：5ulnucleasefreewater，30ulligationbuffer以及10uldnaligase。向45ul連接反應(yīng)混合物中加入5ul的測(cè)序接頭，混合，于20℃加熱20分鐘，然后保持于4℃。使用ampurexpbeads對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，用20ul含tris-hcl(10mm，ph＝8.0)及edta(0.1mm)的緩沖液進(jìn)行洗脫獲得最終的dna連接樣品。

(3)標(biāo)記5-羥甲基胞嘧啶：

制備總體積為26ul的標(biāo)記反應(yīng)混合液：疊氮修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(即udp-n3-glu，終濃度為50um)、β-gt(終濃度為1um)、mg²⁺(終濃度為25mm)、hepes(ph＝8.0，終濃度為50mm)和來(lái)自上述步驟的20uldna。將混合液在37℃溫浴1小時(shí)。取出混合液，用ampurexpbeads純化，獲得純化的20uldna。

然后在上述純化的20uldna中加入1ul連接有生物素的二苯基環(huán)辛炔(dbco-biotin)，于37℃反應(yīng)2小時(shí)，接著用ampurexpbeads純化，獲得純化的標(biāo)記產(chǎn)物。

(4)固相富集含有標(biāo)記的5-羥甲基胞嘧啶的dna片段：

首先，按以下步驟準(zhǔn)備磁珠：取出0.5ulc1streptadvinbeads(lifetechnology)并加入100ul緩沖液(5mmtris，ph＝7.5，1mnacl，0.02％tween20)，渦旋混合30秒，然后用100ul洗滌液(5mmtris，ph＝7.5，1mnacl，0.02％tween20)洗滌磁珠3次，最后加入25ul結(jié)合緩沖液(10mmtris，ph＝7.5，2mnacl，0.04％tween20或其他表面活性劑)，并混合均勻。

然后，在磁珠混合液中加入上述步驟獲得的純化的標(biāo)記產(chǎn)物，并在旋轉(zhuǎn)混合器中混合15min使其充分結(jié)合。

最后，用100ul洗滌液(5mmtris，ph＝7.5，1mnacl，0.02％tween20)洗滌磁珠3次，離心去掉上清液，加入23.75ul不含核酸酶的水。

(5)pcr擴(kuò)增：

向上述步驟的最終體系中加入25ul的2xpcrmastermix和1.25ulpcr引物(總體積為50ul)，按照下述pcr反應(yīng)循環(huán)的溫度和條件進(jìn)行擴(kuò)增：

將擴(kuò)增產(chǎn)物用ampurexpbeads純化，得到最終測(cè)序文庫(kù)。

(6)對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢后進(jìn)行高通量測(cè)序：

將獲得的測(cè)序文庫(kù)通過(guò)qpcr進(jìn)行濃度測(cè)定，并用agilent2100對(duì)文庫(kù)中dna片段大小含量進(jìn)行確定。將通過(guò)質(zhì)檢的測(cè)序文庫(kù)以相同濃度混合，用illuminahiseq4000進(jìn)行測(cè)序。

(7)確定各基因標(biāo)志物的5-hmc含量和加權(quán)系數(shù)

將獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步質(zhì)控評(píng)估，清除低質(zhì)量測(cè)序位點(diǎn)后，將達(dá)到測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的讀段利用bowtie2工具與人類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)基因組參考序列進(jìn)行比較。然后利用featurecounts和htseq-count工具來(lái)統(tǒng)計(jì)讀段數(shù)量以確定各基因標(biāo)志物的5-hmc含量。同時(shí)利用高通量測(cè)序結(jié)果，將可能影響5-hmc含量的因素作為共變量，通過(guò)邏輯回歸和彈性網(wǎng)絡(luò)正則化獲得各基因標(biāo)志物的加權(quán)系數(shù)。結(jié)果如表1所示。

表1：本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物的平均標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量和加權(quán)系數(shù)

如上所述，平均標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量是指肝癌樣品中該基因標(biāo)志物的平均5-hmc含量與正常樣品中同一基因標(biāo)志物的平均5-hmc含量之比。從表1可以看出，本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物的5-hmc含量在正常樣品中和肝癌樣品中存在顯著差異，并且除rlf之外，其余基因標(biāo)志物的5-hmc含量相對(duì)于正常人均顯著增加。

實(shí)施例2.肝癌基因標(biāo)志物的有效性

本實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物用于檢測(cè)肝癌的有效性。

根據(jù)實(shí)施例1的方法測(cè)定第一批96個(gè)樣品(50例肝癌和46例健康對(duì)照)中本發(fā)明所述的9個(gè)肝癌基因標(biāo)志物的5-hmc含量，并確定各基因標(biāo)志物的加權(quán)系數(shù)。

將各基因標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化5-hmc含量乘以與其對(duì)應(yīng)的加權(quán)系數(shù)，獲得該基因標(biāo)志物的預(yù)測(cè)因子t后，將各基因標(biāo)志物的預(yù)測(cè)因子t相加，獲得總預(yù)測(cè)因子t，然后將總預(yù)測(cè)因子t根據(jù)以下公式經(jīng)過(guò)logistic轉(zhuǎn)換獲得評(píng)分p：

若p＞0.5，則該受試者樣品患有肝癌；若p≤0.5，則該受試者樣品為正常。

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的方法區(qū)分該批樣品的結(jié)果。如圖1所示，本發(fā)明的方法能夠達(dá)到90％的靈敏度和91％的特異性。

此外，還使用本發(fā)明的9個(gè)肝癌基因標(biāo)志物篩查小肝癌。如圖2所示，在42例小肝癌患者和42例健康對(duì)照的樣品中，使用本發(fā)明的肝癌基因標(biāo)志物篩查小肝癌仍然具有83％左右的靈敏度和83％左右的特異性。