專利名稱：一種雙膜法提取云芝胞外多糖的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領域，具體涉及ー種提取真菌胞外多糖的方法，更確切地說是ー種基于膜技術(shù)提取云芝胞外多糖的方法。
背景技術(shù)：
云芝胞內(nèi)糖肽也稱云芝糖肽，由云芝胞內(nèi)糖和胞外多糖組成，是運用現(xiàn)代生物エ程技術(shù)從云芝菌中提取精制的具有生理活性的蛋白多糖物質(zhì)，其功效成分含量遠高于云芝菌本身，且易于被人體吸收。傳統(tǒng)的云芝胞外多糖生產(chǎn)是將分離后的云芝發(fā)酵濾液濃縮到一定倍數(shù)后進行多 次酒精醇沉，去除其中的單糖，提高多糖含量。但是在醇沉過程中由于單糖往往伴隨著多糖同時被醇沉下來，單糖去除率較低，因此需要多次醇沉,耗費酒精和人工較多，生產(chǎn)成本較高；同時，傳統(tǒng)的熱濃縮方式，耗用大量的蒸汽，對生產(chǎn)成本和產(chǎn)品質(zhì)量有較大影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述云芝胞外多糖分離純化方法的不足，從而提供ー種基于膜技術(shù)來提取云芝胞外多糖的方法，該方法既提高了云芝胞外多糖的提取效果，又減少了廢水的排放，増加了社會效益。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要按照下述步驟進行一種雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，該方法包括下述步驟I)將云芝發(fā)酵液通過微濾膜，得到微濾透析液和菌絲體，收集微濾透析液；其中，微濾膜的孔徑在O. 05 I μ m，操作溫度為10 70°C，工作壓カ進壓為2 8bar，出壓為O 5bar ；2)將步驟I)中的微濾透析液通過超濾膜，得到超濾透析液和濃縮液，收集濃縮液；其中，超濾選擇截留分子量為800 IOOODa的超濾膜，操作溫度為38 50°C，工作壓カ進壓為I 8bar,出壓為O. 5 3bar ；3)將步驟2)中超濾濃縮液在低溫條件下濃縮得到濃縮漿；濃縮漿再進ー步低溫真空烘干至干燥物水分含量為3 8%，即得。所得干燥物即為云芝胞外多糖。優(yōu)選將步驟2)中超濾濃縮液在40 80°C條件下濃縮到固形物含量為30 70%得到濃縮漿，再將所得的濃縮漿在60 75°C，真空度-O. 08 -O. 085Mpa的條件下進行烘干，烘干至干燥物水分含量為3 8%。優(yōu)選微濾采用孔徑為O. 05 O. 5 μ m的微濾膜，進ー步優(yōu)選微濾采用孔徑為
0.05 μ m的微濾膜，微濾采用50 60°C的操作溫度，進壓為2 4bar，出壓為O. 8
1.5bar,最優(yōu)選微濾采用孔徑為O. 05 μ m的微濾膜,微濾采用50 60°C的操作溫度，進壓為3bar，出壓為lbar。優(yōu)選超濾采用截留分子量為800 IOOODa的超濾膜，超濾采用40 450C的操作溫度，進壓為6 8bar，出壓為I 3bar。最優(yōu)選超濾采用截留分子量為IOOODa的超濾膜，超濾采用40°C的操作溫度，進壓為7bar，出壓為2bar。
本發(fā)明微濾所用膜為陶瓷膜或有機膜。超濾所用膜材料可選用PAN、PVDF、PC、PES、PP、PE復合膜中的ー種。云芝胞外多糖是生物活性產(chǎn)品，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)其對溫度較為敏感，若溫度超過60°C，每升高5°C，云芝胞外多糖指標下降10%。在不超過60°C范圍內(nèi)，分別選取20、30、40、50、600C 5個溫度進行膜分離的操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這5個溫度操作所得到的云芝胞外多糖其理化指標相差不大，但是不同溫度下膜通量及維持該溫度所產(chǎn)生的能耗大不相同，低溫下膜通量較小，而且維持低溫所需冷卻水較大，溫度升高，操作過程不需要冷卻水或需要極少的冷卻水，優(yōu)選膜過濾溫度范圍40 60°C，進ー步優(yōu)選微濾膜50 60°C，超濾膜40 45°C。本發(fā)明采用云芝發(fā)酵液通過微濾膜，得到發(fā)酵液的微濾透析液和菌絲體，菌絲體可用于提取云芝胞內(nèi)糖；微濾透析液通過超濾膜，得到超濾透析液和濃縮液，超濾透析液可作為發(fā)酵配料水；經(jīng)雙膜處理后可顯著降低生產(chǎn)成本。與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明生產(chǎn)方法為云芝胞外多糖分離提取提供了一種新的方法，該方法具有以下幾個突出的優(yōu)點 I、微濾除菌絲體提高菌絲體得率，操作過程中無機械カ破壞，極大程度保存了菌絲體內(nèi)云芝胞內(nèi)糖成分，配套成本低，無須板框、離心機等裝置；2、超濾I旲的過濾精度聞，單糖去除率聞，提聞z 芝胞外多糖廣品質(zhì)量；同時，超濾透析液中含有單糖，可作為發(fā)酵配料用水，減少了污水處理量；3、用超濾膜進行預濃縮，實現(xiàn)冷濃縮，減少蒸汽用量，降低生產(chǎn)成本；4、本發(fā)明生產(chǎn)過程無酒精消耗，極大的降低了生產(chǎn)成本和エ時消耗，同時，本發(fā)明實現(xiàn)清潔自動化生產(chǎn)，極大改善了工作環(huán)境。5、近年來膜技術(shù)在國內(nèi)外不斷得到廣泛的推廣，膜成本也在不斷下降，將膜分離純化技術(shù)應用到云芝胞外多糖的提取過程中將產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。應用膜技術(shù)不僅能提高產(chǎn)品質(zhì)量，還能減少廢水的排放，保護環(huán)境，實現(xiàn)自動化控制和清潔生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，還能改善工人的工作環(huán)境，提高工作效率。 6、采用本發(fā)明方法得到的多糖得率高達2. 54g/L，總糖含量50. 41%，肽含量29. 75%，單糖2. 14%。云芝胞內(nèi)糖肽標準品購自中國藥品生物制品檢定所，總糖和多糖測定方法苯酚-硫酸法，按照國家藥品標準(WS-XG-021-2002)所提供方法；還原糖測定方法DNS法測定；肽含量測定方法國家藥品標準(WS-XG-021-2002)所提供方法；相對分子質(zhì)量測定方法高效液相色譜，WATERS 6'凝膠色譜柱為Ultrahudrgel Linear 7.8mmX300mm。經(jīng)檢測其有效成分的相對分子質(zhì)量和標準晶出峰時間一致，符合國家藥品標準的要求，因此，該方法在生產(chǎn)上是可行的。與傳統(tǒng)水提法相比，云芝胞外多糖的提取率提高了至少O. 8個百分點，總糖含量和肽含量提高了 20%以上，單糖含量降低了至少3個百分點，且提取時間縮短3倍以上，成本大幅度降低；提取全過程避免了高溫加熱，從而減少了高溫對多糖的破壞；所用儀器設備操作方便，自動化程度較高，便于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖I為雙膜法提取云芝胞外多糖的エ藝流程圖。
具體實施方式
以下通過具體實施例進ー步說明本發(fā)明。但實施例的具體細節(jié)僅用于解釋本發(fā)明，不應理解為對本發(fā)明總的技術(shù)方案的限定。實施例I本發(fā)明云芝胞外多糖提取方法按下述步驟進行I、云芝發(fā)酵液來源由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供變色栓菌(云芝)，Trametes，保藏號CGMCC 5. 161，將菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基26 28°C常規(guī)培養(yǎng)7天，得活化的云芝菌株；將活化好的云芝菌株接種于種子培養(yǎng)基，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖6%，酵母粉4%，蛋白胨5%，磷酸ニ氫鉀O. 2%，硫酸鎂O. 02%，消泡劑O. 1%，用水配制，pH值自然，26 28°C振蕩培養(yǎng)3天得云芝一級種子液；將一級種子液接入ニ級種子培養(yǎng)基，其中二級·種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖4%，酵母粉4%，蛋白胨4%，磷酸ニ氫鉀O. 2%，硫酸鎂O. 02%,消泡劑
O.1%，用水配制，pH值自然，26 28°C培養(yǎng)3天，接種量1%，通氣I : O. 4 O. 8vvm ;將ニ級種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵培養(yǎng)基，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖3%，酵母粉4%，蛋白胨4%，磷酸ニ氫鉀O. 2%，硫酸鎂O. 02%,消泡劑O. 1%，用水配制，pH值自然，26 28°C培養(yǎng)4天，接種量3%，通氣I : O. 3 O. 5vvm，發(fā)酵結(jié)束即為云芝發(fā)酵液。2、微濾過濾將上述云芝發(fā)酵液2000Kg (發(fā)酵液固形物含量為3%)通過微濾過濾，得到云芝發(fā)酵液的微濾透析液1750Kg和250Kg的濕菌絲體(含水量為81%)，透析液的透光率為85%，濕菌絲體可用于提取云芝胞內(nèi)糖。微濾過濾所用的膜材料是孔徑為50nm的陶瓷膜，具體エ藝條件是操作溫度為50 60°C，進壓為3. Obar,出壓為I. Obar,壓カ差為
2.Obar03、超濾過濾將步驟I所得的微濾透析液1750Kg通過超濾過濾得超濾透析液1550Kg和200Kg超濾濃縮液，透析液的透光率為95%，1550Kg透析液可作為發(fā)酵配料用水。超濾所用的膜材料是截留分子量為IOOODa的PVDF的超濾膜，エ藝條件是操作溫度為40°C,進壓為7bar,出壓為2bar,壓カ差為5bar。4、低溫濃縮將步驟2超濾所得的超濾濃縮液200Kg在真空度為O. 09MPa，濃縮溫度為60°C下繼續(xù)將云芝胞外多糖濃縮至固形物含量58%的云芝胞外多糖濃縮漿18. 5Kg。5、低溫真空干燥將步驟3得到的18. 5kg云芝胞外多糖濃縮漿進入真空干燥箱進行烘干，得到10. 5kg云芝胞外多糖粗品(水分含量4%)。具體エ藝條件是干燥溫度75 85°C，真空度為-O. 085Mpa，干燥時間40h。該エ藝條件下得到云芝胞外多糖總糖含量50. 41%，肽含量 29. 75%,單糖 2. 14%。實施例2本發(fā)明云芝胞外多糖提取方法，按下述步驟進行I、微濾過濾將實施例I中的云芝發(fā)酵液2000Kg (發(fā)酵液固形物含量為3%)通過微濾過濾，得到云芝發(fā)酵液的微濾透析液1730Kg和270Kg的濕菌絲體(含水量為76%)，透析液的透光率為86%，濕菌絲體可用于提取云芝胞內(nèi)糖。微濾過濾所用的膜材料是孔徑為IOOnm的陶瓷膜，具體エ藝條件是操作溫度為50 60°C，進壓2. Obar,出壓I. Obar，壓カ差為 I. Obar02、超濾過濾將步驟I所得的微濾透析液1730Kg通過超濾過濾得超濾透析液1520Kg和210Kg超濾濃縮液，透析液的透光率為96%，1520Kg透析液可作為發(fā)酵配料用水。超濾所用的膜材料是截留分子量為SOODa的PAN的超濾膜，エ藝條件是操作溫度為42°C，進壓為6. 5bar,出壓為2. Obar,壓カ差為4. 5bar。3、低溫濃縮將步驟2超濾所得的超濾濃縮液210Kg在真空度為O. 09MPa，濃縮溫度為60°C下繼續(xù)將云芝胞外多糖濃縮至固形物含量57%的云芝胞外多糖濃縮漿18Kg。4、低溫真空干燥將步驟3得到的18kg云芝胞外多糖濃縮漿進入真空干燥箱進行烘干，得到10. 2kg云芝胞外多糖粗品(水分含量3%)。具體エ藝條件是干燥溫度75 85°C，真空度為-0.085Mpa，干燥時間40h。該エ藝條件下得到云芝胞外多糖總糖含量
47.50%，肽含量 29. 15%,單糖 3. 05%。實施例3本發(fā)明云芝胞外多糖提取方法，按下述步驟進行 I、微濾過濾將云芝發(fā)酵后的2000Kg發(fā)酵液(發(fā)酵液固形物含量為3%)通過微濾過濾，得到云芝發(fā)酵液的微濾透析液1790Kg和210Kg的濕菌絲體(含水量為80%)，透析液的透光率為80%，濕菌絲體可用于提取云芝胞內(nèi)糖。微濾過濾所用的膜材料是孔徑為500nm的陶瓷膜，具體エ藝條件是操作溫度為50 60°C，進壓2. 3bar，出壓O. 9bar，壓カ差為
I.4bar。2、超濾過濾將步驟I所得的微濾透析液1790Kg通過超濾過濾得超濾透析液1587Kg和203Kg超濾濃縮液，透析液的透光率為94%，1587Kg透析液可作為發(fā)酵配料用水。超濾所用的膜材料是截留分子量為900Da的PP的超濾膜，エ藝條件是操作溫度為45°C，進壓為6. Obar,出壓為I. 8bar,壓カ差為4. 2bar。3、低溫濃縮將步驟2超濾所得的超濾濃縮液203Kg在真空度為O. 09MPa,濃縮溫度為60°C下繼續(xù)將云芝胞外多糖濃縮至固形物含量56%的云芝胞外多糖濃縮漿18. 6Kg。4、低溫真空干燥將步驟3得到的18. 6kg云芝胞外多糖濃縮漿進入真空干燥箱進行烘干，得到10. 6kg云芝胞外多糖粗品(水分含量3%)。具體エ藝條件是干燥溫度75 85°C，真空度為-O. 085Mpa，干燥時間38h。該エ藝條件下得到云芝胞外多糖總糖含量
48.52%，肽含量 28. 73%,單糖 2. 87%。
權(quán)利要求
1.一種雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是該方法包括下述步驟 1)將云芝發(fā)酵液通過微濾膜，得到微濾透析液和菌絲體，收集微濾透析液；其中，微濾膜的孔徑在O. 05 I μ m，操作溫度為10 70°C，工作壓カ進壓為2 8bar，出壓為O 5bar ； 2)將步驟I)中的微濾透析液通過超濾膜，得到超濾透析液和濃縮液，收集濃縮液；其中，超濾選擇截留分子量為800 IOOODa的超濾膜，操作溫度為38 50°C，工作壓カ進壓為I 8bar,出壓為O. 5 3bar ； 3)將步驟2)中超濾濃縮液在低溫條件下濃縮得到濃縮漿；濃縮漿再進ー步低溫真空烘干至干燥物水分含量為3 8%，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟I)中采用的微濾膜的孔徑為O. 05 O. 5 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟I)中微濾采用的操作溫度為50 60°C，工作壓カ進壓為2 4bar，出壓為O. 8 I. 5bar。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟2)中超濾膜選擇截留分子量為800 IOOODa的超濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟2)中超濾膜過濾采用的操作溫度為40 45°C,工作壓カ進壓為6 8bar,出壓為I 3bar。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟I)中微濾所用膜為陶瓷膜或有機膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟2)中超濾所用膜材料選用PAN、PVDF, PC、PES, PP、PE復合膜中的ー種。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟3)中將步驟2)中超濾濃縮液在40 80°C條件下濃縮到固形物含量為30 70%得到濃縮漿。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步驟3)中所得的濃縮漿在60 85°C，真空度-O. 08 -O. 085Mpa的條件下進行烘干，烘干至干燥物水分含量為3 8%,即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙膜法提取云芝胞外多糖的方法，該方法是將云芝發(fā)酵液依次通過微濾和超濾處理分離得到云芝胞外多糖。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)云芝胞外多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了云芝胞外多糖等有效成分的提取效果，降低了生產(chǎn)中乙醇用量，減少濾液廢水的排放，顯著增加了經(jīng)濟和社會效益。
文檔編號C08B37/00GK102827304SQ20121034441
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者王文風, 徐國華, 袁兵兵, 徐玲, 張瑞華, 王英燕 申請人:江蘇神華藥業(yè)有限公司