專利名稱:一族新的靈長類造血生長因子的制作方法
本發(fā)明涉及一族新的靈長類IL-3樣造血生長因子，以及用遺傳工程重組技術(shù)生產(chǎn)這種造血因子的方法。
紅細(xì)胞生成素，即造血生長因子，是促進(jìn)造血細(xì)胞生存，生長和分化的蛋白。集落刺激因子(CSFS)是這些造血生長因子的子集，其特征在于能夠維持造血細(xì)胞集落在體外生長，這些造血細(xì)胞起源于骨髓，胎兒肝臟，和其它造血器官的祖先細(xì)胞。
某些紅細(xì)胞生成素的生物化學(xué)和生物學(xué)鑒定和特性描述受到少量天然存在因素的阻礙，這些因素的來源如血液和尿。最近已經(jīng)分子克隆了某些這種紅細(xì)胞生成素，進(jìn)行異種表達(dá)并純化為均一性。[D.Metcalf，“The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors”，Blood，67(2)257-267(1986).]其中紅細(xì)胞生成素是人和鼠的GM-CSF，人的G-CSF，人的CSF-1和鼠的IL-3。已經(jīng)證明人的GM-CSF[R，Donahue et.al.，Nature，321872-875(1986)]，鼠的IL-3[J.Kindler et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，831001-1005(1986);Metcalfetal.，Blood，6846-57(1986)]和人的G-CSF[K.Welteet al.，J.Exp.Med.，165941-948(1987)]在體內(nèi)對(duì)紅細(xì)胞生成有效。在此之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鼠蛋白IL-3在人的系統(tǒng)中沒有復(fù)制。[D.R.Cohen et al.，Nucl.Acids Res.，143641(1986).]。
本發(fā)明提供一族基本上沒有其它靈長類蛋白的靈長類IL-3樣生長因子，其特征是肽序列相同于或基本相似于下面表Ⅰ和Ⅱ中所示的氨基酸序列。這些序列可用表中所示的DNA序列或能夠與多肽雜交和編碼具有IL-3樣生物學(xué)特性的多肽的序列或其它各種各樣可證實(shí)這種特性的修飾序列所編碼。這些多肽也以IL-3樣生物學(xué)特性為特征。
作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明提供一種基本上不與其它人的多肽結(jié)合的人的多肽，其特征為肽序列與表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并至少具有一種IL-3樣生物學(xué)特性。作為本發(fā)明多肽的另一實(shí)例的是基本上不與其它靈長類多肽結(jié)合的長臂猿多肽，其特征為肽序列與表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并至少具有一種IL-3樣生物學(xué)特性。
本發(fā)明多肽的特征在于至少具有一種IL-3樣特性，這些特性如下a.用還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測得表觀分子量約為14～35千道爾頓;
b.在標(biāo)準(zhǔn)人骨髓測定中能夠以10-100微微克分子的濃度刺激各種譜系的多種類型造血細(xì)胞集落的形成;
c.在CML測定中能夠以10-100微微克分子的濃度刺激CML細(xì)胞增殖;
d.等電點(diǎn)為pH6.0～pH7.6;
e.在Superose 6凝膠過濾柱上43kd處有一個(gè)單一的尖峰;
f.在N-聚糖酶處理之后的凝膠上有一個(gè)單一的20.5kd的條帶;和g.對(duì)用Edman降解法分析N-末端的污染水平不大于2%。
另外，本發(fā)明提供含有有效治療劑量的一種或多種本發(fā)明的多肽的藥用組合物。這些組合物可用于治療許多疾病的方法，這些疾病的特點(diǎn)是缺乏造血細(xì)胞。按照本發(fā)明的這些方法需要給病人服用有效量的至少一種在此所述的多肽。
這樣的治療方法可用于治療下列疾病，如白細(xì)胞減少，血小板減少，貧血，B細(xì)胞缺乏，T細(xì)胞缺乏，細(xì)菌感染和病毒感染，包括在骨髓移殖之后免疫細(xì)胞或造血細(xì)胞缺乏。本發(fā)明的這些方法還可包括與IL-3樣多肽同時(shí)或相繼服用有效量的至少一種其它的紅細(xì)胞生成素，白細(xì)胞介素，或生長因子。作為這種應(yīng)用的典型的紅細(xì)胞生成素包括GM-CSF，G-CSF，CSF-1或促紅細(xì)胞生成素。典型的白細(xì)胞介素是IL-1，IL-2，IL-4或IL-6。這些方法也可使用生長因子(如B細(xì)胞生長因子)，B細(xì)胞分化因子，或嗜曙紅細(xì)胞分化因子。
本發(fā)明的再一方面是可在表達(dá)基礎(chǔ)上編碼具有至少一種IL-3樣生物學(xué)特性的靈長類多肽的DNA序列。這樣的序列包括表Ⅰ或Ⅱ中所示的在5′-3′方向上的核苷酸序列。此外本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下可與表Ⅰ或Ⅱ的DNA序列雜交的DNA序列或者在非嚴(yán)格條件下可與所述DNA序列雜交的DNA序列，該序列可在表達(dá)基礎(chǔ)上編碼具有至少一種IL-3樣生物學(xué)特性的蛋白。表Ⅰ和Ⅱ序列的等位基因變異，無論這樣的核苷酸變化是否引起肽序列的變化，連同它的其它類似物和衍生物也都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的另一方面是含有如上所述DNA序列的載體與表達(dá)控制序列有效的結(jié)合。這樣的載體可用于生產(chǎn)靈長類IL-3樣多肽的新方法，其中用編碼IL-3樣多肽表達(dá)的DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系與表達(dá)控制序列有效的結(jié)合進(jìn)行培養(yǎng)。所述的這種方法可使用許多已知細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來表達(dá)多肽。目前較好的細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和細(xì)菌細(xì)胞。
通過對(duì)下面的較好實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)敘述，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將更加清楚。
本發(fā)明所提供的這族靈長類IL-3樣生長因子基本上不與其它靈長類的蛋白質(zhì)結(jié)合，其特征在于氨基酸序列與下面表Ⅰ和Ⅱ所示的序列相同或基本相似。這族新的生長因子各成員的特征也是具有至少一種IL-3樣生長因子的生物學(xué)特性，如下所述。最好證明這族本發(fā)明的生長因子中的任一成員具有一種以上的IL-3樣生物學(xué)特性。
在此定義“IL-3樣生物學(xué)特性”一詞包括一種或多種下列生物學(xué)特點(diǎn)和在活體內(nèi)及體外的活性。一種這樣的特性是維持供給紅細(xì)胞樣，淋巴樣，和髓樣譜系的祖先細(xì)胞的生長和分化。例如，在標(biāo)準(zhǔn)人骨髓測定中，IL-3樣生物學(xué)特性是粒細(xì)胞型集落和紅細(xì)胞樣裂解的刺激作用。另一這樣的特性是與早期多潛在干細(xì)胞相互作用。
IL-3樣生物學(xué)特性是維持多能前體細(xì)胞的生長。另一特性是能夠刺激慢性骨髓白血病(CML)細(xì)胞增殖。IL-3樣生物學(xué)特性也可刺激肥大細(xì)胞的增殖。IL-3樣生長因子還可維持依賴各種因子的細(xì)胞系的生長和(或)誘導(dǎo)20-α-甾類脫氫酶(20-α-SPH)和Thy-1抗原的表達(dá)。IL-3樣的另一生物學(xué)特性是刺激KG-1細(xì)胞集落形成和(或)刺激在脾骨髓培養(yǎng)物中組胺合成的增加。IL-3還有一種生物學(xué)特性就是用還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測得表觀分子量約為14～35kd。IL-3的其它生物學(xué)特性已在本領(lǐng)域揭示了。
表Ⅰ和Ⅱ所示的特定的肽序列是本發(fā)明生長因子族中的兩個(gè)典型的成員。表Ⅰ的865bp DNA序列是從無尾長臂猿白血病病毒感染的長臂猿T-細(xì)胞系UCD-144-MLA的c DNA表達(dá)庫分離出來的[T.G.Kuwakami et al.，Nature，235170(1972)]。該序列含有一個(gè)單一的456個(gè)核苷酸的長開放閱讀骨架，它編碼大約152個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為CSF-80，并且通過高度疏水序列(leu leu leu leu gln leu leu)表明該序列包含一個(gè)常規(guī)前導(dǎo)分泌序列。成熟蛋白質(zhì)開始于表Ⅰ中的第20號(hào)氨基酸，即丙氨酸。編碼區(qū)含有3個(gè)半胱氨酸，兩個(gè)在成熟蛋白質(zhì)中，由此表明有一個(gè)二硫鍵。通過特征序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr說明有兩個(gè)潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)。通過編碼序列所顯示的大小和糖基化圖形是淋巴激活素樣蛋白質(zhì)的特點(diǎn)。865bp區(qū)剩余的非編碼部分在天然宿主的轉(zhuǎn)錄中可能具有調(diào)節(jié)作用。該序列的3′端也含有包括幾個(gè)重復(fù)序列ATTTA的AT富集片段，被認(rèn)為與RNA信息穩(wěn)定性有關(guān)[見G.Shaw and R.Kamen，Cell，46(5)659-677(1986)]。
表Ⅰ
用表Ⅰ的序列作為探針從人的基因組庫中得到了表Ⅱ的674bp DNA序列[J.J.Toole et al.，Nature，312342-346(1984)]。表Ⅱ的DNA序列最初通過將人的基因組序列的外顯子拼接在一起進(jìn)行構(gòu)建，通過與表Ⅰ的長臂猿IL-3樣多肽的DNA序列比較鑒定了該序列。這種通過人的cDNA克隆的mRNA分析證實(shí)的人的序列也可編碼大約152個(gè)氨基酸的多肽，該多肽是該族靈長類蛋白質(zhì)中的一員。這種人的多肽包括由高度疏水序列(leu leu leu leu gln leu leu)所示的常規(guī)前導(dǎo)分泌序列。成熟多肽開始于表Ⅱ的第20號(hào)氨基酸，即丙氨酸。在成熟蛋白質(zhì)中編碼區(qū)含有2個(gè)半胺氨酸，表明有一個(gè)二硫鍵。通過特征序列Asn-X-Ser說明有兩個(gè)潛在的無冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)。674bp序列的剩余非編碼部分在天然宿主的轉(zhuǎn)錄中可能具有調(diào)節(jié)作用。
人基因[表Ⅱ]外顯子的核苷酸序列96%以上與長臂猿基因[表Ⅰ]的DNA序列同源。11個(gè)密碼子核苷酸序列的變化可導(dǎo)致長臂猿和人蛋白質(zhì)的氨基酸不同。表Ⅱ序列上面的核苷酸，表明長臂猿序列不同于相關(guān)的人序列的位點(diǎn)。與之相似，下面的氨基酸，即人的氨基酸序列表明長臂猿序列不同之處。箭頭表明在人基因組序列中外顯子和內(nèi)含子連接的位點(diǎn)。
華盛頓特區(qū)的國立生物醫(yī)學(xué)服務(wù)結(jié)構(gòu)(National Biomedical Services of Washington，D.C.)的計(jì)算機(jī)檢索揭示了長臂猿和人的IL-3樣序列在氨基酸水平上約有29%同源于鼠的IL-3DNA序列，在核苷酸水平上約有45%與鼠的IL-3DNA序列同源，這是M.C.Fung等人在Nature 307233-237(1984)中公開的。人的IL-3樣基因的外顯子結(jié)構(gòu)與鼠的IL-3編碼區(qū)相比是類似的。
表Ⅰ所述的新的865bp c DNA序列包括在大腸桿菌HB101質(zhì)粒中，已于1986年7月11日貯存在A.T.C.C.12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD并給定注冊(cè)號(hào)為ATCC 67154。其c DNA序列列于下面的表Ⅱ中的新型基因組序列包括在入噬菌體中，它也已于1986年8月7日貯存在A.T.C.C.并給定注冊(cè)號(hào)為ATCC 40246。包括在大腸桿菌HB101的P SH IL-3-1質(zhì)粒中的人的IL-3 DNA已于1987年2月24日貯存在ATCC.并給定注冊(cè)號(hào)為ATCC67326。
通過35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析進(jìn)一步描述了典型的人和長臂猿IL-3樣多肽的特征，35S-標(biāo)記的蛋白質(zhì)來自于轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞，見如下所述的實(shí)施例。這兩種多肽的大小與表觀分子量約為14kd-35kd，更確切地說為18kd-30kd的分子種類是異源的。這些典型IL-3樣因子的這個(gè)分子量范圍被認(rèn)為起因于純化COS細(xì)胞產(chǎn)生分子的糖基化變化。10-100微微克分子濃度的純化蛋白質(zhì)在體外人骨髓測定中導(dǎo)致小粒性白細(xì)胞型集落的形成。此外，在這些人骨髓測定中促紅細(xì)胞生成素存在下，這兩種多肽可維持紅細(xì)胞和髓樣祖先細(xì)胞的生長在類似的活性水平上。因此這些IL-3樣因子都是多CSFs。這些IL-3樣因子也導(dǎo)致來自患有CML患者的成白細(xì)胞的增殖。這些多肽還能夠刺激副衛(wèi)細(xì)胞和成熟細(xì)胞，如單核細(xì)胞，產(chǎn)生其它造血樣因子，這些因子又刺激其它造血細(xì)胞集落的形成，以及其它造血型細(xì)胞的活性。
全部或部分復(fù)制表Ⅰ和Ⅱ的氨基酸殘基的連續(xù)序列的合成多肽也包括在本發(fā)明中。這些序列，由于與表Ⅰ和Ⅱ的IL-3樣多肽具有共同的一級(jí)，二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特點(diǎn)，所以可能與此共同具有IL-3樣生物學(xué)特性。因此，它們可被用作為在治療和免疫學(xué)方法中天然存在的靈長類IL-3樣多肽的生物學(xué)活性或免疫學(xué)替代物。
本發(fā)明所提供的這族IL-3樣生長因子也包括由與表Ⅰ和Ⅱ相似的序列所編碼的因子，但可對(duì)這些因子進(jìn)行自然修飾或有意加以修飾。例如，一種這樣修飾的人序列是在表Ⅱ中所說明的人cDNA序列，修飾之處是由三聯(lián)體CCC編碼的27號(hào)氨基酸-脯氨酸，而不是在表中該位置上出現(xiàn)的由三聯(lián)體TCC所編碼的絲氨酸。這個(gè)典型的修飾的IL-3樣序列可產(chǎn)生一種活性人IL-3樣因子，它作為p Huc IL3-2包括在大腸桿菌HB101中，于1987年2月13日貯存在ATCC，注冊(cè)號(hào)為ATCC67319。
肽或序列的其它修飾是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可用已知技術(shù)進(jìn)行的。這些IL-3樣相關(guān)序列的重要的特異修飾可包括用其它氨基酸代替每一編碼序列中的兩個(gè)半胱氨酸殘基之一或二者。最好兩個(gè)半胱氨酸都用其它氨基酸，如絲氨酸，代替，去掉二硫橋。這種取代的誘變技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是人所皆知的。[見，美國專利4，518，584號(hào)。]本發(fā)明在此所述的其它IL-3樣因子的序列的特異性突變包括對(duì)一個(gè)或兩個(gè)糖基化位點(diǎn)的修飾。表Ⅰ和表Ⅱ中給出了由于在IL-3樣因子序列中天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代或缺失所得到的糖基化缺乏或部分糖基化的結(jié)果。天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)包括一個(gè)三肽序列，該肽能被適宜的細(xì)胞糖基化酶特異性地識(shí)別。該三肽序列是天冬酰胺-X-蘇氨酸或是天冬酰胺-X-絲氨酸，而X一般可是任何氨基酸。在糖基化識(shí)別位點(diǎn)的第一或第三位氨基酸中之一或兩者上的各種氨基酸取代或缺失(和/或在第二位上的氨基酸缺失)導(dǎo)致修飾過的三肽序列的非糖基化作用。
例如，表Ⅰ中序列的Asn34可由谷氨酸酰胺在一個(gè)這樣修飾的IL-3樣因子中取代。所得到的因子(Gln34)應(yīng)該僅含一個(gè)天冬酰胺連接的糖基部分(位于Asn89)，而不是兩個(gè)。本專業(yè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都將會(huì)知道，在34位上取代另一個(gè)氨基酸，和/或在糖基化識(shí)別位點(diǎn)之內(nèi)于其它位點(diǎn)取代另一個(gè)氨基酸，例如于Ser36插入纈氨酸，可以制備出具有同樣Asn89單糖基化的糖蛋白類似物。同樣，89位的Asn和/或91位的Ser可由誘變技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被嵋允挂蜃釉谠撐稽c(diǎn)上去糖基化。此外，按上述也可使兩個(gè)位點(diǎn)均改變。對(duì)糖基化位點(diǎn)的這種修飾也可用于修飾表Ⅱ中各序列[見A.Miyajima et al.，EMBO J.5(6)1993-1197(1986)和下述的實(shí)施例Ⅳ]。本專業(yè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在得到此處的揭示后，可以很容易地得到表Ⅰ和表Ⅱ中各序列的其它類似物和衍生物。這類顯而易見的修飾包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還包括新的DNA序列，它不與編碼其它靈長類蛋白的DNA序列結(jié)合，并且編碼表達(dá)靈長類IL-3樣多肽或生長因子。這些DNA序列包括在表Ⅰ和表Ⅱ中所述的從5′到3′方向的序列和在嚴(yán)緊控制雜交條件下[見Maniatis et al.，Molecular Cloning(A.Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory
，pagrs 387 to 389]與表Ⅰ和表Ⅱ中各DNA序列雜交的序列。這種嚴(yán)緊控制雜交條件舉例如在65℃，4×SSC雜交，然后在65℃，0.1XSSC洗一小時(shí)。另外的嚴(yán)緊控制雜交條件如在50%甲酰胺中以42℃4×SSC雜交。
在松馳調(diào)控雜交條件下與表Ⅰ或Ⅱ各序列雜交，并且編碼表達(dá)具靈長類IL-3樣生物學(xué)性質(zhì)的生長因子的DNA序列也編碼這一族新的生長因子的各成員。這種非嚴(yán)緊控制雜交條件舉例如50℃，4×SSC，或用30-40%甲酰胺于42℃雜交。例如，與表Ⅰ和(或)表Ⅱ的序列共有重要同源區(qū)，如共有糖基化位點(diǎn)或二硫鍵的并且編碼具一種或更多種IL-3樣生物學(xué)性質(zhì)的靈長類蛋白的DNA序列，很明顯是編碼這一新族生長因子的各成員的，甚至當(dāng)這種DNA序列不是嚴(yán)緊控制地與表Ⅰ或表Ⅱ的序列相雜交時(shí)也是如此。
相似地，能編碼由表Ⅰ或Ⅱ的序列編碼的靈長類IL-3樣多肽，但由于遺傳密碼的簡并性或等位變異(在一種群中自然發(fā)生的堿基改變，它可能造成也可能不造成氨基酸的改變)而造成的在密碼子序列上有所不同的那些DNA序列，也能編碼此處所述的這一族新的生長因子的各成員。本發(fā)明還包括由于點(diǎn)突變或?yàn)樘岣呋钚裕娱L半衰期或提高由此所編碼的多肽生產(chǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)修飾而造成的表Ⅰ和表Ⅱ各DNA序列的改變序列。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)這一新族靈長類IL-3樣生長因子的新方法。本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)適宜的細(xì)胞或細(xì)胞系，它們是已經(jīng)被在已知的調(diào)節(jié)序列控制下編碼表達(dá)新的靈長類IL-3樣多肽的DNA序列所轉(zhuǎn)化。適宜的細(xì)胞或細(xì)胞系可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。對(duì)適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇，以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、放大、篩選、生產(chǎn)產(chǎn)物和純化等方法均為已知。例如見Gething and Sambrook，Nature，293620-625(1981)，或Kaufman et al.，Mol.Cell.Biol.Biol.，5(7)1750-1759(1985)或Howley et al.，U.S.Patent 4，419，446。另一種適宜的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在實(shí)施例中給出，是猴COS-1細(xì)胞系。另一種相似的有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是CV-1細(xì)胞系。
另外適宜作為本發(fā)明宿主細(xì)胞的是細(xì)菌細(xì)胞。例如，在生物技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的作為宿主細(xì)胞的各種E.coli變異菌株(例如，HB101，MC1061和以下各實(shí)施例中所用的各菌株)。本方法中還可以使用枯草桿菌(B.subtilis)，假單胞菌(Pseudomonas)和其它桿菌(Bacilli)的各種菌株。
本專業(yè)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所熟知的許多酵母菌也可用作表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。此外，當(dāng)需要時(shí)，昆蟲細(xì)胞也可用于本發(fā)明的方法作為宿主細(xì)胞。例如，見Miller et al.，Genetic Engineering，8277-298(Plenum Press 1986)和其中所引述的各參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的另一方面提供了在本發(fā)明方法中由于表達(dá)這些新靈長類多肽的載體。這些載體包含有上述編碼本發(fā)明新的靈長類多肽的新的DNA序列。另外，參入有上述修飾過的序列的載體也是本發(fā)明的具體實(shí)施，而且在生產(chǎn)這些IL-3樣多肽中是有用的。在本方法中使用的載體還含有與本發(fā)明DNA編碼序列聯(lián)合作用的并能指導(dǎo)在所選宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的被選擇過的調(diào)節(jié)序列。
本文所述的新族靈長類IL-3樣生長因子中各成員可以用于治療許多疾病，特別是治療那些特征為造血系統(tǒng)中髓樣細(xì)胞、紅細(xì)胞樣細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞，巨核細(xì)胞或它們的相結(jié)合的水平降低的疾病。此外，它們還可用于激活成熟的髓樣細(xì)胞的(或)淋巴樣細(xì)胞。本發(fā)明多肽可治療的還有白細(xì)胞減少癥，一種外周血中循環(huán)白細(xì)胞減少癥狀。白細(xì)胞減少癥可由接觸某些病毒和暴露于輻射而引發(fā)。但經(jīng)常是多種抗癌藥劑的副作用，如化療藥物。用這些IL-3樣多肽組合物治療白細(xì)胞減少癥可以避免用現(xiàn)有藥品所帶來的不良副作用。
使用本發(fā)明的多肽治療多種免疫缺陷癥，如缺乏T和(或)B淋巴細(xì)胞，以及免疫紊亂如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等均是有益的。這些因子本身或與其它治療物結(jié)合起來可以用于治療或糾正由病毒如HTLⅥ，HTLⅦ，HⅣ侵染，強(qiáng)劑量輻射，抗癌藥物以及其它醫(yī)療造成的免疫缺陷癥。本發(fā)明的多肽單獨(dú)地或與其它促紅細(xì)胞生成素相結(jié)合可用于治療其它血細(xì)胞缺乏癥，包括血小板減少癥，貧血癥。這些新肽的其它用途在于治療接受骨髓移植的患者，以及用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)用于診斷或治療的單克隆或多隆抗體。
因而，本發(fā)明的另一方面是治療上述各種癥狀的方法和藥用組合物。這種組合物包括有效治療劑量的本發(fā)明靈長類IL-3樣多肽族的一種或多種，并配合以藥理上可接受的載體。這種組合物可以經(jīng)腸胃外地系統(tǒng)給藥。另外，還可以靜脈內(nèi)給藥。如果需要，還可以皮下給藥。當(dāng)系統(tǒng)性地給藥時(shí)，則本發(fā)明的組合物是以不含熱原的非腸胃道給藥可接受的水溶液形式使用的。這種非腸胃道給藥可接受的蛋白溶液，在考慮到pH值，等滲性和穩(wěn)定性等而進(jìn)行制備時(shí)，均是屬于本專業(yè)領(lǐng)域的范圍。
在治療上述癥狀的方法中，使用的劑量應(yīng)依醫(yī)生考慮到各種影響藥效的因素如患者的狀況，體重，性別，飲食，患病程度，給藥時(shí)間以及其它醫(yī)療因素而予以決定。一般而言，每日劑量為每公斤體重200-1000mg多肽或50-5000單位多肽(一單位指在標(biāo)準(zhǔn)人骨髓檢測中導(dǎo)致半最大刺激的多肽濃度)。
本發(fā)明的治療方法和組合物還包括與其它的因子一起給藥。與本發(fā)明多肽同時(shí)或系列性共同給藥的其它適宜的促紅細(xì)胞生成素、CSFs和白細(xì)胞介素的非限定性名單包括GM-CSF，CSF-1，G-CSF，Meg-CSF，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，IL-1，IL-4，IL-2，B細(xì)胞生長因子，B細(xì)胞分化因子和嗜曙紅細(xì)胞分化因子。其中最重要的是IL-3與IL-6(專業(yè)領(lǐng)域中也稱作B細(xì)胞促進(jìn)因子2)的結(jié)合，它在人胚細(xì)胞檢測中顯示出造成早期干細(xì)胞集落增殖的能力。此外，在治療當(dāng)中，IL-3樣多肽可與單克隆或多克隆抗體化學(xué)結(jié)合或一同給藥。另外，在藥劑中，這些生長因子可結(jié)合有某種毒素，如蓖麻蛋白。應(yīng)調(diào)整上述劑量以補(bǔ)償這種治療組合物中的附加成分。被治療的患者的進(jìn)展可用定期測定血樣如白細(xì)胞計(jì)數(shù)來監(jiān)測。
以下的實(shí)施例詳細(xì)描述遼本發(fā)明的各種方法以及靈長類IL-3樣多肽新族的各成員。
實(shí)施例1長臂猿IL-3樣基因的分離用無尾長臂猿白血病病毒侵染的長臂猿T細(xì)胞株UCD-144-MLA(得自National Institute of Health Laboratories)被用植物凝血素和肉豆蔻乙酸佛波爾酯(PHA/PMA)誘變。用J.M.Chirgwin et al.，Biochem，185294(1979)的程序從這些細(xì)胞中收取全部RNA。選擇Poly A+mRNA并在10%-30%蔗糖梯度上分部。為鑒定編碼這一新造血因子的m RNA，將來自UCD-144-MLA細(xì)胞株的經(jīng)蔗糖梯度分部的m RNA的16個(gè)等分試樣用微注射法注射到爪蟾(Xenopus laveis)卵母細(xì)胞中，對(duì)所得到的條件培養(yǎng)基用實(shí)施例Ⅴ所示的CML檢測法測定在有抗人的GM-CSF抗體存在下刺激成白細(xì)胞增殖的能力。用U.Gubler and B.J.Hoffman，Gene，25263(1983)的程序，將來自蔗糖梯度組分中被鑒定為含編碼IL-3樣生長因子活性信息的m RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈c DNA。
p XM是一種COS細(xì)胞表達(dá)載體，含有SV40強(qiáng)化因子，主腺病毒后期啟動(dòng)子，DHFR編碼序列，SV40后期信息polyA加入位點(diǎn)和Va Ⅰ基因。它被核酸內(nèi)切酶Xho Ⅰ線性化，在有d TTP存在下用DNA聚合酶Ⅰ大片段處理，與等摩爾量的c DNA連接，DNA的終濃度為100μg/ml。由Xho Ⅰ酶解p XM并插入Xho Ⅰ接受的c DNA序列得到的連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化到E.coli HB101菌株中并在L+Amp板上進(jìn)行千板培養(yǎng)以產(chǎn)生大約3×103個(gè)克隆的文庫(可用其它已知的類似的功能性表達(dá)載體替換本方法中的p XM)。
在p XM中的c DNA文庫被復(fù)制平板培養(yǎng)到硝化纖維素濾紙上。從每個(gè)濾紙上獲得的菌落被刮到L肉湯培養(yǎng)基中，分離出質(zhì)粒DNA。每個(gè)DNA樣品是從200-300細(xì)菌菌落中制備出來的。用J.A.Meyers et al.，J.Bacteriol，1271529(1976)的方法純化該DNA。用DEAE介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染法，對(duì)每10個(gè)COS細(xì)胞用約5μg質(zhì)粒DNA的量轉(zhuǎn)染猴COS細(xì)胞(ATCC CRL1650)，并根據(jù)G.G.Wong et al.，Science228810-815(1985)和R.J.Kaufman et al.Mol.Cell Biol.，21304(1982)所述的程序用氯喹處理。
轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收集培養(yǎng)基，并按下述實(shí)施例Ⅴ所述以人的CML檢測法進(jìn)行檢測。一群產(chǎn)生的具菌落刺激活性和CML增殖活性并完全抵抗抗血清對(duì)GMCSF中和的條件培養(yǎng)基被選來作進(jìn)一步的分析。制備從原始活性群中挑出的單個(gè)菌落中得到的質(zhì)粒DNA，并轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。對(duì)該培養(yǎng)基檢測CSF和CML增殖活性。分離到負(fù)責(zé)這種活性的單個(gè)克隆。這一克隆的c DNA插入體被亞克隆到M13中，并用Sanger二脫氧鏈終端法序列化(見表Ⅰ)。
實(shí)施例Ⅱ人的IL-3樣基因的分離以表Ⅰ的序列作為探針，篩選從人基因組文庫(Sau 3A Ⅰ部分酶解克隆到λ載體J1中BamH Ⅰ位點(diǎn)的人DNA)來的1×106克隆。鑒定出三個(gè)噬菌體中含有與c DNA探針強(qiáng)烈雜交的序列。從其中兩個(gè)噬菌體中來的DNA用核酸內(nèi)切酶Sau 3 A Ⅰ酶解完全，并被亞克隆到細(xì)菌噬菌體λM13的BamH Ⅰ位點(diǎn)以克隆載體mp9。含外顯子序列的亞克隆通過與長臂猿c DNA雜交而被鑒定。有一個(gè)亞克隆λCSF-16含有人基因組DNA序列作為大約10kb BglⅡ插入體，如上述已寄存于ATCC。人基因全部外顯子的完整序列以二脫氧鏈終端DNA序列法與一批以實(shí)施例Ⅰ所述長臂猿基因的序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸引導(dǎo)子一起進(jìn)行測定。因?yàn)槿嘶蛲怙@子的核苷酸序列有96%以上與長臂猿c DNA的序列相同，因此，重建了相應(yīng)的人c DNA的核苷酸序列。11個(gè)密碼子中核苷酸序列的改變的結(jié)果是兩個(gè)種的多肽的氨基酸的不同(見表Ⅱ)。
人基因組序列可被從λCSF-16剪切下來并插入到表達(dá)載體中，其中的許多類型是哺乳動(dòng)物，昆蟲，酵母，真菌和細(xì)菌的表達(dá)領(lǐng)域中熟知的。例如，用切口分別在人基因區(qū)629位和3183位核苷酸的核酸內(nèi)切酶Sma Ⅰ和Xho Ⅰ酶解寄存的細(xì)菌噬菌體可以剪切下人基因組序列。所得到的2.5kb的片段含有整個(gè)人IL-3-基因編碼序列，并且包括“TATAA-相關(guān)的”序列于啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，但是缺少“CAT-相關(guān)的”序列和在基因3′末端的多腺苷化信號(hào)。用商品化的連接子序列將該片段的Sam Ⅰ末端轉(zhuǎn)變?yōu)閄ho Ⅰ。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)[見Y-C.Yang et al，Cell，473-10(1986)]將該片段亞克隆到Xho Ⅰ-酶解的質(zhì)粒表達(dá)載體p XM中，得到質(zhì)粒p Y3。
然后將p Y3在細(xì)菌中放大并轉(zhuǎn)染到猴COS-1細(xì)胞中，在該細(xì)胞內(nèi)人的基因被轉(zhuǎn)錄并且RNA被拼接。在如下所述的由于檢測IL-3樣生物活性的CML檢測和人骨髓細(xì)胞檢測中，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基呈陽性。如下所述，使用了長臂猿c DNA探針的Nrothern吸印分析表明存在著一個(gè)1kb m RNA，它來自于這些細(xì)胞中而其大小與來自外周血淋巴細(xì)胞的RNA相同。用標(biāo)準(zhǔn)方法從m RNA合成c DNA，并且鑒定出一個(gè)具CML活性的克隆。從中分離了新的IL-3樣生長因子的c DNA。
實(shí)施例Ⅲ人IL-3樣生長因子表Ⅱ的編碼人IL-3樣多肽的c DNA序列也可用除實(shí)施例Ⅱ所述以外的其它方法獲得。例如，根據(jù)專業(yè)領(lǐng)域熟知方法也可化學(xué)合成表Ⅱ的序列。其中的一種化學(xué)合成法包括重建長臂猿IL-3基因以提供人IL-3編碼序列。成熟型長臂猿的氨基酸序列與人IL-3蛋白之間的第一個(gè)不同氨基酸發(fā)生在第82位。從長臂猿IL-3基因第82位氨基酸到該基因3′末端的編碼序列可通過被化學(xué)合成編碼人IL-3的DNA序列所取代，從而得到能在適宜的表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生人IL-3的功能性基因。
在長臂猿序列中以兩個(gè)獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可用于克隆合成性DNA部分，即位于73位氨基酸的AsuⅡ位點(diǎn)和125位氨基酸的Eco R Ⅰ位點(diǎn)。用于插入長臂猿基因的DNA“小盒”(cassette)是由酶學(xué)法提供從兩條在21個(gè)堿基對(duì)上互補(bǔ)的寡核苷酸來的大約160bp的復(fù)式DNA進(jìn)行從AsuⅡ位點(diǎn)到Eco R Ⅰ位點(diǎn)的合成而得到的。完整的復(fù)式DNA是用三磷酸脫氧核苷和DNA聚合酶IKlenow片段將互補(bǔ)區(qū)延展至寡核苷酸的末端而形成的。用AsuⅡ和(或)Eco R Ⅰ酶解完整的復(fù)式DNA得到粘性末端用于以后的克隆化。
第二個(gè)合成性DNA“小盒”包括兩條從Eco R Ⅰ位點(diǎn)到125位氨基酸全長互補(bǔ)的寡核苷酸，以及在基因末端接著152位氨基酸的終止密碼子。在該終止密碼子上或剛好其后用Eco R Ⅰ粘性末端和適宜的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或粘性末端酶解這些寡核苷酸使其克隆到不同的表達(dá)載體中。
合成了兩套這種小盒，一套用于哺乳動(dòng)物表達(dá)，另一套用于細(xì)菌表達(dá)，這是因?yàn)樗玫恼婧思?xì)胞和原核細(xì)胞密碼子之間的不同，真核基因中Cp G雙鏈出現(xiàn)率低，以及要保留或需要不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以用于克隆化。這種密碼子的優(yōu)先選擇性是專業(yè)人員熟知的，例如見T.Maruyama et al.，Nucl.Acids.Res.，14r 151(1986)。以下表Ⅲ中給出了為合成這些小盒的粘性末端以及密碼子改變的示例。然后將小盒克隆到載體p CSF-MLA中以使其轉(zhuǎn)化到帶有編碼人IL-3樣因子的基因的載體中。所得的載體用于表達(dá)人的因子。
表ⅢⅠ.密碼子改變氨基酸號(hào) 細(xì)菌表達(dá) 哺乳動(dòng)物表達(dá)73 CGT74 CGT75 CCG82 CGT86 AGC87 CTG CTG88 CAA CAA89 AAT91 AGC97 CTG CTG100 CTG CTG102 CCG105 CCG108 ACC ACA109 GCT111 CCG112 ACC ACC113 CGT AGG115 CCG120 GAT127 CGC AGG128 CGC131 ACC ACC137 CTG CTG140 GCT GCT143 CAG CAG145 ACC ACC146 ACC ACC147 CTG CTG152 TTC TTC
表Ⅲ(續(xù))Ⅱ.小盒末端小盒號(hào) 細(xì)菌表達(dá)Ⅰ 73 125arg arg…glu phe argT CGT…GAA TTC CGTA GCA…CTT AAG GCA小盒號(hào) 哺乳動(dòng)物表達(dá)Ⅰ 71 125asn leu arg arg…glu phe argAAC CTT CGA AGG…GAA TCC CGTCTTG GAA GCT TCC…CTT AGG GCAG小盒號(hào) 細(xì)菌表達(dá)Ⅱ 126 152phe arg pheAA TTC CGC……TTC TAG AACTCGAGACTGCAG GCG……AAG ATC TTGAGCTCTG
小盒號(hào) 哺乳動(dòng)物表達(dá)Ⅱ 126 152phe arg … pheAA TTC AGG … TTC TAG AACTCGAGAG TCC … AAG ATC TTGAGCTCTTTAA此外，獲得人IL-3樣生長因子的c DNA序列也可涉及對(duì)從組織來源的c DNA進(jìn)行克隆化的方法。根據(jù)T.Maniatis等人(同上)的方法將表Ⅰ的長臂猿c DNA序列作為探針并以外周血淋巴細(xì)胞作為人的來源，分離編碼該人IL-3樣多肽的m RNA。Poly A RNA從外舟血淋巴細(xì)胞中制出，轉(zhuǎn)變?yōu)閏 DNA，克隆為噬菌體或質(zhì)粒的c DNA文庫。通過與作為DNA探針的表Ⅰ的長臂猿編碼序列雜交，可以鑒定人的c DNA克隆和測定IL-3樣生物學(xué)活性。
此外，可用于篩選人的IL-3樣c DNA的組織源包括脾、肝、胸腺、扁桃體、腎，以及其它可從活體解剖和尸解中得到的新鮮組織。特別重要的是那些由腫瘤引起造血細(xì)胞增多如白血病的組織。此外，其來源還有那些寄存于保藏中心如ATCC的細(xì)胞系，以及來自其他國家機(jī)構(gòu)或私人的細(xì)胞系。細(xì)胞系舉例有轉(zhuǎn)化的T或B細(xì)胞系，以及那些并非來自造血細(xì)胞源但又產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞系。
為了表達(dá)人的IL-3樣多肽，將其編碼c DNA轉(zhuǎn)移到適宜的表達(dá)載體中，如p CD或p XM，并用如上所述的常規(guī)遺傳工程技術(shù)將其引入所選擇的宿主細(xì)胞中。具生物活性的重組人IL-3樣多肽的一種哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞。然而，活性多肽也可由E.coli或其他細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生。如實(shí)施例Ⅳ所述，酵母或昆蟲細(xì)胞也可用作表達(dá)體系。
本發(fā)明的另一種表達(dá)這種人IL-3樣多肽的方法是使用從含完整人基因組基因的λCSF-16來的BglⅡ片段構(gòu)建表達(dá)該多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如PCT WO85/20610關(guān)于人促紅細(xì)胞生成素所述。此外，這種人基因組基因可用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和工作信號(hào)子構(gòu)建以用于在其它一些異源系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，例如用昆蟲啟動(dòng)子構(gòu)建昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系。同樣，該基因組基因也可在酵母或其它真核系統(tǒng)中得到表達(dá)。
實(shí)施例ⅣIL-3樣生長因子的表達(dá)質(zhì)粒p CSF-MLA可以通過象上面所述的那樣將表Ⅰ的長臂猿序列插入到Xho Ⅰ水解過的p XM中而被很容易地構(gòu)建。用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的帶有人序列的質(zhì)粒p SHIL-3-1可以象上面實(shí)例Ⅲ中所述的那樣通過人工合成的方法構(gòu)建。另一種質(zhì)粒p Y3也按上述方法制備。然后按常規(guī)技術(shù)，將所有這些帶有靈長類IL-3樣生長因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到經(jīng)過選擇的宿主細(xì)胞中，以表達(dá)多肽。
A.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)為了獲得用于下面所述檢測的IL-3樣因子的表達(dá)，將p SHIL-3-1和p CSF-MLA轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞上，用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基含有高水平的所述生長因子活性。
這里所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)進(jìn)行人工合成。該載體的成分，如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等，可從天然來源獲得，或按已知程序進(jìn)行人工合成。見Kaufman等J.Mol.Biol.，159511-521(1982);及Kaufman，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，82689-693(1985)。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子主要有靈長類動(dòng)物細(xì)胞系和嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系，包括轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞系。正常的二倍體細(xì)胞，得自初生細(xì)胞的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株以及初生分離塊都是適合的。只要選擇基因是顯性作用的，那么候選細(xì)胞就不必為在選擇基因中為遺傳缺陷型。為了采用常規(guī)方法使載體DNA穩(wěn)定整合以及隨后的整合載體DNA的放大，可以使用CHO細(xì)胞。或者，該載體DNA也可以包括所有或部分牛乳頭瘤病毒基因組(Lusky等，Cell，36391-401(1984)]，并且將其作為一種穩(wěn)定的游離成分送入象C127鼠細(xì)胞一類細(xì)胞系中。其它的合適哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括(但不僅限于)He La，COS-1猴細(xì)胞，鼠L-929細(xì)胞，得自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3細(xì)胞系，BHK或Hak倉鼠細(xì)胞系。
然后采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)或酶促測定法篩選表達(dá)了產(chǎn)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。采用Southern吸印等標(biāo)準(zhǔn)方法可以測定編碼不同蛋白質(zhì)的DNA的存在。將表達(dá)載體DNA引入合適宿主細(xì)胞(如COS-1猴細(xì)胞)數(shù)天之后，在未通過對(duì)培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)采用活性或免疫學(xué)測定進(jìn)行篩選的情況下，測定編碼變種的DNA的短暫表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也可以使用其它非常熟知的重組遺傳工程技術(shù)和其它已知載體[如p JL3和p JL4(Gough等，EMBO J.4645-653(1985))以及p MT2(Starting with pMT2-VMF，ATCC＃67122;見PCT application PCT/VS87100033)]，例如用Xho Ⅰ來切割得自相應(yīng)質(zhì)粒的表Ⅰ或表Ⅱ的DNA序列，來構(gòu)建與p CSF-MLA和p SHIL-3-1相似的其它哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。將這些載體轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主細(xì)胞就可以導(dǎo)致IL-3樣生長因子的表達(dá)。
B.細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)類似地，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也可以通過用細(xì)菌的序列消除或取代位于編碼序列旁邊的哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)系統(tǒng)來操作表Ⅰ和Ⅱ的序列，從而創(chuàng)造通過細(xì)菌細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)本發(fā)明的IL-3樣因子的細(xì)菌載體。編碼該因子的DNA可按實(shí)例Ⅲ進(jìn)一步進(jìn)行修飾，以使其含有用于細(xì)菌表達(dá)的不同密碼子(象現(xiàn)有技術(shù)所已知的那樣)。該序列最好也象現(xiàn)有技術(shù)所已知的那樣通過操作連接到編碼分泌前導(dǎo)多肽的核苷酸序列骨架上，而這種前導(dǎo)多肽準(zhǔn)許細(xì)菌表達(dá)、分泌、加工成熟的變種蛋白。然后采用已知方法，對(duì)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的化合物進(jìn)行回收，純化和/或就生理化學(xué)、生物化學(xué)和/或臨床參數(shù)進(jìn)行性質(zhì)鑒定。
為了構(gòu)建這樣一個(gè)用于細(xì)菌表達(dá)的細(xì)菌載體，從長臂猿c DNA和合成細(xì)菌盒(如實(shí)例Ⅲ所述)構(gòu)建了一種部分合成的人IL-3樣DNA序列。將該序列放入經(jīng)Ndel/Xba Ⅰ酶解過的載體pal 181中，該載體保存于ATCC，登記號(hào)為40134。將所產(chǎn)生的載體p PLHIL-3-181轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，然后按照PCT申請(qǐng)86/00639所公布的用于GM-CSF的條件進(jìn)行培養(yǎng)。
大腸桿菌的IL-3樣因子是在一種不溶性的內(nèi)含體中產(chǎn)生。為了從其中溶解和得到蛋白質(zhì)，接著進(jìn)行下列步驟。將大約50克的細(xì)胞凍膏重新懸浮在緩沖液A中[含120毫升50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1mM苯基·甲基磺酰氟(PMSF)和2mM的二硫蘇糖醇(DTT)]。使用French壓力機(jī)或Matin Gaulin閥(10，000psi或更大)來破碎細(xì)胞。然后以20，000xg的轉(zhuǎn)速將破碎了的細(xì)胞離心30分鐘，沉淀細(xì)胞碎片，其中含有內(nèi)含體。
沉淀物通過French壓力機(jī)重新懸浮于55%的蔗糖(溶于緩沖液A)中，再次以30，000xg的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。含有IL-3樣因子的內(nèi)含體沉淀物重新懸浮于55%溶于緩沖液A的蔗糖中，且分布在60、65和70%蔗糖的階梯式梯度處。以150，000xg的轉(zhuǎn)速將該梯度離心2小時(shí)。收集沉降到65%層的IL-3樣因子內(nèi)含體。
為了重新恢復(fù)和重新折疊現(xiàn)在近似80%純的IL-3樣因子，將這些內(nèi)含體以2-3毫克/毫升的濃度重新懸浮在8M尿素中。用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM PMSF，2mM DTT和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA))將含有蛋白質(zhì)的尿素溶液稀釋至最終濃度為3M尿素(其中IL-3的濃度近似為1微克/毫升)。將含有6mM還原型谷胱甘肽和6mM氧化型谷胱甘肽的一種氧化/還原緩沖液加到尿酸溶液中，于20℃保溫2小時(shí)。然后將3M尿素溶液向緩沖液B過夜透析，除去尿素。最后離心IL-3蛋白質(zhì)溶液，除去任何沉淀物。到此時(shí)，IL-3樣因子被重新折疊且其純度約為85%。
然后將重新折疊的IL-3樣因子對(duì)50mM MES緩沖液(pH6.0，含有0.1mM EDTA)透析，再上到用同樣緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose柱上。流過DEAE的IL-3樣因子的純度近似為99%。這一步也除去了任何熱原。用200mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)將流過DEAE的IL-3的pH調(diào)至5.0。再將IL-3樣因子上到磺?；?Sepharose柱上。IL-3樣因子與SP-Sepharose結(jié)合后，用含有緩沖液的乙酸鈉沖洗。至此，IL-3樣因子為純品且正確轉(zhuǎn)疊。在CML測定中，該人IL-3樣因子具有1-3×107CML單位/毫克的比活。
與此類似，表Ⅰ或表Ⅱ的編碼序列可以用Xho Ⅰ從p CSF-MLA或p SHIL-3-1中切出，進(jìn)行進(jìn)一步操作(如，連接到其它已知連接物上，或者通過從其中刪掉非編碼序列對(duì)它進(jìn)行修飾，或者用其它已知技術(shù)改變其中的核苷酸)。經(jīng)修飾的IL-3樣編碼序列就可以插進(jìn)已知細(xì)菌載體中，所用的方法可以象T.Tancguchi等在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.775230-5233上所述的那樣。然后將這一典型細(xì)菌體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主細(xì)胞中，從而使IL-3樣因子表達(dá)。產(chǎn)生IL-3樣因子的細(xì)菌細(xì)胞外表達(dá)的戰(zhàn)略見歐洲專利申請(qǐng)EPA177，343。
C.昆蟲細(xì)胞表達(dá)可按相似方法進(jìn)行操作來構(gòu)建在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的昆蟲載體(如見公布的歐洲專利申請(qǐng)155，476中所述的方法)。通過使用用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞內(nèi)或酵母細(xì)胞外表達(dá)的酵母調(diào)節(jié)序列，也可以構(gòu)建酵母載體(如見公布的PCT申請(qǐng)WO86 00639和歐洲專利申請(qǐng)EP123，289中所述的方法)。
實(shí)施例Ⅴ高水平表達(dá)靈長類IL-3樣生長因子的CHO細(xì)胞系的構(gòu)建從哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生高水平的新型靈長類IL-3樣多肽族的一種方法包括構(gòu)建含有多拷貝的異源IL-3樣基因的細(xì)胞。異源基因可被連接到一可放大的標(biāo)記物(如二氫葉酸還原酶，DHFR)上，按照Kaufman & Sharp，J.Mol.Biol.1982(出處同上)的方法，根據(jù)在增加氨甲喋呤(MTX)濃度條件下的繁殖可篩選含有增加基因拷貝的細(xì)胞。這一方式可被各種不同細(xì)胞型使用。
例如，p Y3含有人IL-3樣基因，該基因在操作中與能夠表達(dá)的其它質(zhì)粒序列相聯(lián)系。通過磷酸鈣共沉和轉(zhuǎn)染，可以將p Y3和DHFR表達(dá)質(zhì)粒p Ad A26 SV(A)3(Kaufman & Sharp，Mol.Cell B.，3(9)1598-1608(1983)一起引入DHFR缺乏的CHO細(xì)胞?；蛘?，象前面提到的那樣將該基因引入p MT2，用得到的載體代替p Y3和p Ad A26 SV(A)3。在含有透析過的牛胎兒血清的α培養(yǎng)基中篩選生長的表達(dá)DHFR轉(zhuǎn)化株，然后按照Kaufman等在Mol.Cell B.，51750(1983)上所述的方法，通過在增大MTX濃度(依次為0.02，0.2，1.0和5μM MTX)的條件下的生長，來篩選放大了的轉(zhuǎn)化株。將轉(zhuǎn)化株克隆，通過CML測定來監(jiān)測生物活性IL-3樣多肽的表達(dá)。IL-3樣多肽的表達(dá)應(yīng)隨著MTX抗性水平的增強(qiáng)而增強(qiáng)。接著可采取類似步驟，以產(chǎn)生這一IL-3樣多肽族的其它成員，包括長臂猿IL-3樣多肽。
實(shí)施例ⅥIL-3樣多肽的生物活性下面的測定都是用長臂猿多肽和人多肽作為本發(fā)明的新型靈長類動(dòng)物IL-3樣多肽族的代表成員來完成的。但是，該族的其它成員在這些同樣測定或其它測定中將顯示IL-3樣生物特性，它取決于各個(gè)多肽所顯示IL-3樣生物特性的數(shù)量。
A.CML測定CML測定基本上是按照Blood，63(4)904-111(1984)上所述的方法完成。原種細(xì)胞得自冰凍袋中的處于穩(wěn)定狀態(tài)的CML患者的外周血。將該袋融化，以每小瓶15×106個(gè)細(xì)胞的濃度分裝成500等分后重新冷凍。用這些“CML8-3”細(xì)胞來測試IL-3樣多肽的IL-3樣活性。在測定的前一天將其中一個(gè)小瓶于37℃迅速融化。將小瓶中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到15毫升試管中，且用RPM Ⅰ中的5%Hi Human AB Serum(GIBCO，RPM I1640)[HAB/RPM I]洗滌兩次。將細(xì)胞在5%CO2、37℃的條件下于5%Hi HAB/R PM I中過夜培養(yǎng)。第二天，從培養(yǎng)物中取出細(xì)胞，菲科爾比(ficolled)、洗滌、重新計(jì)數(shù)后置于一邊。
將含有待測物質(zhì)的100微升10%H IFC S2/RPM I培養(yǎng)基置于一微滴定平板的每一孔中。將上面制備的細(xì)胞通過離心沉淀下去，然后以1.3-2×105個(gè)細(xì)胞/微升的濃度重新懸浮在10%H IFCS/RPMI中。將100微升細(xì)胞加到每一孔中，在抗-人GMCSF抗體存在或缺乏的條件下，將其于37℃在5%CO2中培養(yǎng)48-72小時(shí)。然后向每孔中加入0.5μci的3H-胸苷，于37℃培養(yǎng)6小時(shí)。利用一種過濾多功能裝置將細(xì)胞收集在GFC型C過濾器濾紙上(Schleicher-Schuller)，用磷酸鹽緩沖過的鹽水洗滌后干燥。然后將濾器沉浸在閃爍液中，對(duì)3H的吸收進(jìn)行計(jì)數(shù)。
根據(jù)所測得的胸苷吸收，發(fā)現(xiàn)在這一測定中長臂猿IL-3樣生長因子和人IL-3樣生長因子在刺激白血病胚細(xì)胞的繁殖上都具有活性。
B.骨髓測定使用非粘連骨髓細(xì)胞的人骨髓測定是按G.G.Wong等所述的方法(出處同前)來完成的。在這一測定中，發(fā)現(xiàn)用于長臂猿和人因子的條件培養(yǎng)基能夠有效地產(chǎn)生明顯的粘性白細(xì)胞型譜系的小集落。在染色瓊脂培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)測定時(shí)也產(chǎn)生巨噬細(xì)胞、粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞集落。當(dāng)在促紅細(xì)胞生成素存在的情況下完成這一測定時(shí)，血紅細(xì)胞集落的產(chǎn)生證實(shí)了條件培養(yǎng)基維持紅色祖先細(xì)胞生長的能力。每當(dāng)將GM-CSF與在人骨髓測定中的IL-3樣多肽比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩種肽都處于有促紅細(xì)胞生成素存在的條件下，IL-3樣多肽比GM-CSF能夠維持更多的集落的形成。多數(shù)由GM-CSF維持的集落是單一譜系;而本發(fā)明的多肽維持多譜系集落的形成。類似地，在胚細(xì)胞集落形成測定中，IL-3樣多肽產(chǎn)生更大量的多譜系胚細(xì)胞，而去同一測定中GM-CSF產(chǎn)生非常少的次級(jí)集落。
C.KG-1細(xì)胞測定KG-1測定是按照G.G.Wong等所述的方法(出處同前)來完成。在這一測定中，按本發(fā)明所產(chǎn)生的新型靈長類IL-3樣生長因子族中的長臂猿IL-3樣多肽是有活性的。
D.混合測定在一抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測定中，本發(fā)明IL-3樣多肽刺激嗜曙紅細(xì)胞按劑量依賴方式殺死抗體包被的腫瘤靶細(xì)胞。該多肽另外還刺激嗜曙紅細(xì)胞吞噬血清調(diào)理的面包酵母，并且直接刺激嗜曙紅細(xì)胞產(chǎn)生過氧化陰離子。在初步研究中，是將本發(fā)明的IL-3樣因子注入健康猴子，再觀察白細(xì)胞計(jì)數(shù)，在血小板計(jì)數(shù)和嗜曙紅細(xì)胞數(shù)上都觀察到可重復(fù)的增加。這些初步結(jié)果在人和長臂猿IL-3樣因子中都被觀察到。
實(shí)施例Ⅶ得自COS細(xì)胞條件培養(yǎng)基的IL-3樣多肽的純化現(xiàn)在使用下列方法從COS細(xì)胞獲得同源IL-3樣蛋白質(zhì)(如上面實(shí)例Ⅳ所述)。
A.離子交換法COS細(xì)胞條件培養(yǎng)基[DMEM，0.5%FBS以200毫克/毫升的總蛋白質(zhì)濃度加入一滾柱瓶中]含有大約2-3微克/毫升的IL-3樣多肽。用水稀釋培養(yǎng)基至其傳導(dǎo)率低于8.0ms/cm2。-離子交換藥筒QAE Zeta Prep]用大約500毫升0.1M Tris-HCl(pH8.0)于4℃平衡，然后改用2升40mM Tris-HCl(pH7.4)。培養(yǎng)基按40毫升/分的流量上柱，收集未結(jié)合的部分。用毫升40mM Tris-HCl洗柱，直至未有進(jìn)一步的活性被洗掉為止。將未結(jié)合的部分濃縮在一透濾單位膜[diafilteation unit maembrane，Amicon YM-10]。
B.晶體狀外源凝集素柱法于4℃在20mM Tris(pH7.4)、0.05% Tween-20[緩沖液Ⅰ]中平衡晶體狀外源凝集素柱，然后以每小時(shí)1柱體積的量上料。用緩沖液Ⅰ洗柱以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì);然后用緩沖液Ⅰ加0.2M α-甲基吡喃甘露糖苷洗脫結(jié)合蛋白。收集洗脫部分。
C.逆相高壓液相層析法在室溫下按照下面所述方法將這一IL-3樣多肽制品進(jìn)行逆相高壓液相層析。將IL-3樣制品注射到在100%緩沖液A中平衡過的RPHPLC柱(C4 Vydac)上。緩沖液A為溶于水中的0.1%三氟乙酸(TFA]，緩沖液B為溶于95%乙腈的0.1%TFA。梯度為每分鐘0.2%從45%至70%緩沖液B。從這一梯度收集的部分是46.8%至47.5%緩沖液B。對(duì)這些部分迅速抽真空，以除去乙腈。在第二次逆相HPLC步驟中，緩沖液A是0.15%溶于水的HFBA，緩沖液B是0.15%溶于95%乙腈的七氟丁酸[HFBA]。其梯度為每分鐘0.2%從45%至70%緩沖液B。從這一步驟中所收集的部分是49%至51%緩沖液B。從HPLC洗脫出的這一部分是無熱原的。
實(shí)施例ⅧIL-3樣多肽的分析A.SD S-聚丙烯酰胺凝膠電泳接著R.J.Kaufman和P.A.Sharp.的方法[J.Mol.Biol.159601-621(1982)]，將35S-甲硫氨酸通過代謝整合到由p CSF-MLA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞和由p Y3轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞制備的多肽中。通過對(duì)由COS-1細(xì)胞分泌的標(biāo)記蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(還原條件)[U.K.Laemmli，Nature227680-685(1970)]，發(fā)現(xiàn)了對(duì)于長臂猿和人因子都具有14kd至35kd表現(xiàn)分子量的多肽的分布。這一分布在偽轉(zhuǎn)染對(duì)照樣品中是不存在的。尤其是，發(fā)現(xiàn)CHO產(chǎn)生的人IL-3樣因子分布于21至32kd之間，這表明它比COS細(xì)胞產(chǎn)生的人因子具有更大程度的糖基化，后考主要分布21至28kd。
經(jīng)實(shí)例Ⅵ的純化步驟后用銀染色，平均分子量21，000和25，000的兩條主要帶似乎具有近似等量的兩種因子。這兩帶的不同歸因于N-連接的糖基化的不同。
B.等電聚焦通過對(duì)實(shí)例Ⅶ的純化多肽進(jìn)行天然等電聚焦發(fā)現(xiàn)長臂猿和人多肽都有四個(gè)種類。其pH值的范圍在pH6.0至pH7.6之間。
C.Superose 6快速蛋白質(zhì)液體層析將從HPLC得到的純化部分在20mM Tris(pH7.4)、200mM NaCl和0.05%吐溫-20中的凝膠過濾柱(Superose 6)上走柱。通過這一柱層析，對(duì)于兩種因子都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)表現(xiàn)分子量為43kd的突峰。
D.在CML測定中的比活性在上面所述的CML測定中作為例子的長臂猿IL-3樣因子的比活在2×106-1×107稀釋單位/每毫克多肽的范圍內(nèi)，其平均值為8×106稀釋單位/每毫克多肽。發(fā)現(xiàn)在實(shí)例Ⅳ(B)中所述的由細(xì)菌產(chǎn)生的人多肽具有1-3×10稀釋單位/每毫克多肽的比活。CHO產(chǎn)生的人IL-3樣因子在這一測定中具有2-3×106單位/每毫克蛋白的比活。COS產(chǎn)生的人IL-3樣因子的比活為每毫克約1-2×107單位。一個(gè)稀釋單位(或CML單位)是指在CML測定中達(dá)到最大刺激的一半的因子的稀釋。
E.N-末端分析長臂猿多肽的N-末端序列的分析是通過自動(dòng)Edman降解完成的，它表明該因子的純度為98%。
F.N-聚糖酶處理用N-聚糖酶處理在COS細(xì)胞中產(chǎn)生的人和長臂猿因子，該酶水解N-連接的多糖部分。通過這一方法顯示每一因子都被純化。在凝膠上的每個(gè)因子的14-35kd涂片，對(duì)于長臂猿因子減為15kd的單一帶，對(duì)于人因子減為20.5kd的單一帶。
可以預(yù)期，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在參考了前面所述的較好實(shí)例后，在實(shí)施本發(fā)明的過程中可作出各種改進(jìn)和變動(dòng)，據(jù)信這些改進(jìn)和變動(dòng)都包括在本發(fā)明附帶權(quán)利要求
中。
權(quán)利要求
1.一種基本上不與其它人的多肽結(jié)合的人的多肽，其特征在于肽序列與表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并具有至少一種ⅠL-3樣生物學(xué)特性。
2.一種基本上不與其它靈長類多肽結(jié)合的靈長類多肽，其特征在于肽序列與表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并具有至少一種IL-3樣生物學(xué)特性。
3.按照權(quán)利要求
1或2所述的多肽，其中所述的特性選自下列一組a.用還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測得表觀分子量約為14～35千道爾頓;b.在標(biāo)準(zhǔn)人骨髓測定中能夠以10-100微微克分子的濃度刺激各種譜系的多種類型造血細(xì)胞集落的形成;c.在CML測定中能夠以10-100微微克分子的濃度刺激CML細(xì)胞增殖;d.等電點(diǎn)為pH6.0～pH7.6;e.在Superose 6凝膠過濾柱上43kd處有一個(gè)單一的尖峰;f.在N-聚糖酶處理之后的凝膠上有一個(gè)單一的20.5kd的條帶;和g.對(duì)用Edman降解法分析N-末端的污染水平不大于2%。
4.一個(gè)DNA序列，該序列在表達(dá)基礎(chǔ)上編碼具有至少一種IL-3樣生物學(xué)特性的靈長類多肽并且包括選自下列一組的在5′-3′方向上的核苷酸序列a.表Ⅰ的序列;b.表Ⅱ的序列;c.在嚴(yán)格條件下可與(a)或(b)的DNA序列雜交的DNA序列;d.在非嚴(yán)格條件下可與(a)或(b)的DNA序列雜交并在表達(dá)基礎(chǔ)上編碼具有至少一種IL-3樣生物學(xué)特性的DNA序列;和e.(a)或(b)序列的等位基因變異。
5.一種載體，該載體包含權(quán)利要求
4所述的DNA序列，該序列與表達(dá)控制序列有效的結(jié)合。
6.一種生產(chǎn)靈長類多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)用含有編碼IL-3樣多肽表達(dá)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系與表達(dá)控制序列有效的結(jié)合。
7.按照權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述的細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
8.按照權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述的細(xì)胞系是細(xì)菌細(xì)胞系。
專利摘要
本發(fā)明通過重組技術(shù)提供一族新的靈長類IL-3樣多肽。
文檔編號(hào)C12N15/27GK87104815SQ87104815
公開日1988年7月20日 申請(qǐng)日期1987年7月14日
發(fā)明者斯蒂芬·C·克拉克, 阿格尼斯·B·希亞利塔, 尤·昌格·羊格 申請(qǐng)人:遺傳學(xué)研究所公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan