專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療的gm-csf和il-17抑制劑的制作方法
用于治療的GM-CSF和IL-17抑制劑本發(fā)明涉及炎性疾病的治療。本發(fā)明的另一方面涉及腫瘤性疾病(如癌癥)的 治療。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于治療炎性和/或腫瘤性疾病的藥物組合物。根據(jù) 本申請(qǐng)?zhí)峤坏氐姆桑景l(fā)明同樣可能涉及兩種特殊物質(zhì)在制備用于治療上述疾病的藥 物中的用途。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，最初被確定為一種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因 子，最近被表明為一種在炎癥和自身免疫中的重要細(xì)胞因子。在包括過(guò)敏和銀屑病患 者、關(guān)節(jié)炎和哮喘患者中的各種炎性部位中檢測(cè)到高水平的GM-CSF mRNA或蛋白質(zhì)。在過(guò)去的幾年來(lái)，許多體內(nèi)研究表明，通過(guò)中和抗體阻斷GM-CSF能夠在一系 列炎癥模型中(包括在關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎、銀屑病和肺部疾病模型中)預(yù)防 甚至治愈促炎性疾病。GM-CSF通過(guò)刺激成熟中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖和活化，在 先天免疫中起著重要的作用。另外，已證明GM-CSF通過(guò)體外調(diào)節(jié)樹(shù)突細(xì)胞的分化和成 熟在抗原呈遞反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。已有報(bào)導(dǎo)GM-CSF在體內(nèi)通過(guò)人類(lèi)外周血單核細(xì)胞 (PBMC)、T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)優(yōu)先誘導(dǎo)I型促炎性細(xì)胞因子。白介素17(IL_17)是一類(lèi)獲得性免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子家族，目前主要由六個(gè)成員組 成，從IL-17A到IL-17F。據(jù)描述，IL-17與IL-17受體結(jié)合，IL-17受體家族目前包含 五個(gè)成員，IL-17RA到IL-17RE，它們相互之間共享相當(dāng)大的序列同源性。IL-17受體家 族成員是I型跨膜蛋白。目前人們一般認(rèn)可IL-17受體在所有免疫系統(tǒng)細(xì)胞中大量表達(dá)， 并且對(duì)含IL-17A、IL-17F和IL-17D的不同細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行刺激可以誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子如 IL-I β、TNF α和IL_6和趨化因子IL_8和MIP-I α的表達(dá)。與其受體相反，IL-17主 要由近來(lái)發(fā)現(xiàn)的Thl7細(xì)胞產(chǎn)生，并且其表達(dá)經(jīng)常與感染和自身免疫相關(guān)。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性的、炎性和系統(tǒng)性自身免疫疾病。盡管RA的 病因和發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚，這種疾病被表征為是侵襲性滑膜增生(血管翳形成)和 炎癥(滑膜炎)，這導(dǎo)致漸進(jìn)性關(guān)節(jié)軟骨和骨骼的破壞。RA是由屬于先天性和獲得性免 疫系統(tǒng)中的許多細(xì)胞類(lèi)型和因子之間的復(fù)雜相互作用導(dǎo)致的。例如，已報(bào)導(dǎo)在RA病人 中觀察到不同細(xì)胞因子表達(dá)的普遍提高，如IL-2、IL-4、IL-5、IL_7、IL_10、IL-13、 IFN Y、G-CSF、GM-CSF > MCP-1禾Π MIP-1 β與對(duì)照組相比有高得多的表達(dá)水平。此 外，已經(jīng)確認(rèn)IL-1、TNFa和IL-18是RA中刺激T細(xì)胞的重要炎性因子。已發(fā)表報(bào)導(dǎo)提 出了一種在RA中GM-CSF的致病作用的假說(shuō)。支持該假說(shuō)的證據(jù)如下(i)GM-CSF是 在RA病人的滑膜中產(chǎn)生，并且可以在病人的滑液中檢測(cè)到該細(xì)胞因子表達(dá)水平的增加； (ii)在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA)中，使用中和抗GM-CSF單克隆抗體(mAb)可 以降低疾病的嚴(yán)重程度；(iii)GM-CSF缺陷小鼠對(duì)于膠原和mBSA誘導(dǎo)疾病的敏感性降 低；Gv)在CIA小鼠中注射重組GM-CSF可以使疾病惡化；(ν)化療后接受GM-CSF的 RA患者表現(xiàn)出顯示關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的潮紅。除了上述已鑒定的不同細(xì)胞因子，IL-17也顯示與RA病理學(xué)相關(guān)，因?yàn)镮L_17 在RA滑膜和滑液中表達(dá)水平提高，并且在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，IL-17的阻斷可以減輕關(guān)節(jié)炎 中的炎癥和破壞。另外，IL-17基因缺陷小鼠表現(xiàn)出膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的抑制，并且當(dāng)將IL-17-/"小鼠與IL-IRa-/-小鼠交配時(shí)，IL-17-/-小鼠完全缺乏在IL-I受體拮抗劑缺陷 Balb/c小鼠中通?？吹降亩嚓P(guān)節(jié)炎自發(fā)啟動(dòng)。還已報(bào)導(dǎo)在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，IL-17加上 TNFa的局部共同刺激可以通過(guò)影響中性粒細(xì)胞的招募和生存，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在呼吸 道中的GM-CSF依賴(lài)性聚集。已在小鼠中使用的用于研究人的類(lèi)RA疾病的模型之一為鏈球菌細(xì)胞壁(SCW) 關(guān)節(jié)炎。在所述模型中，向小鼠的一個(gè)膝關(guān)節(jié)中通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(La.)注射細(xì)菌細(xì)胞壁片段 可以同時(shí)誘導(dǎo)急性疾病和慢性復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎。通過(guò)向幼齡小鼠的膝關(guān)節(jié)中一次注射SCW 片段，可以獲得先天免疫起主要致病作用的急性關(guān)節(jié)炎。通過(guò)重復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)注射SCW片 段，可以建立慢性復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型，其中獲得性免疫系統(tǒng)中的介質(zhì)逐漸取代了先天免 疫反應(yīng)的最初優(yōu)勢(shì)。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是另一種廣泛接受的關(guān)節(jié)炎模型，其基于 對(duì)抗軟骨膠原II型(CII)的T細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的自身免疫活性。該小鼠模型與人RA具 有一些臨床、組織病理和免疫原性上共同的特點(diǎn)，其主要特征為在滑液炎癥之后有嚴(yán)重 的軟骨及骨組織的破壞。本發(fā)明人在TNF α無(wú)關(guān)的慢性SCW炎癥模型和TNF α依賴(lài)的 CIA模型中探索了中和GM-CSF的治療效果。另外，他們也研究了通過(guò)抑制GM-CSF 和IL-17通路阻斷先天性和獲得性免疫系統(tǒng)的影響。這是通過(guò)在IL-17受體基因缺陷小 鼠(IL-17R-KO小鼠)中中和GM-CSF，或是通過(guò)使用中和GM-CSF和IL-17的化合物 進(jìn)行聯(lián)合治療來(lái)執(zhí)行的。發(fā)明人意外觀察到，通過(guò)聯(lián)合阻斷GM-CSF和IL-17通路， 兩種炎性疾病均能以高效方式治療。在CIA模型中，聯(lián)合施予GM-CSF抑制化合物和 IL-17抑制化合物可以極大降低膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床評(píng)分，而單獨(dú)施予給藥GM-CSF 抑制化合物或IL-17抑制化合物不能顯著減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。此外，詳細(xì)的組織學(xué) 分析表明，對(duì)關(guān)節(jié)炎癥和軟骨及骨破壞的聯(lián)合治療有著協(xié)同效應(yīng)。因此，對(duì)兩條通路的 聯(lián)合阻斷可以導(dǎo)致對(duì)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的高效保護(hù)。這些結(jié)果特別讓人意外，這是因?yàn)橹?到最近還假設(shè)GM-CSF處于IL-17的下游(參見(jiàn)文獻(xiàn)Kawaguchi M.et al.，J.Allergy Clin. Immunol. 114 (2004)，444-450 ； Starnes T.et al., The Journal of Immunology 169 (2002)， 642-646 ; Laan M.et al.，Eur.Respir.J.21 (2003)，387-393)。因此，人們尚未預(yù)期到結(jié)合 了中和GM-CSF和IL-17的化合物的治療會(huì)有額外或協(xié)同的效果。本申請(qǐng)首次表明了體 內(nèi)聯(lián)合阻斷IL-17和GM-CSF的有益效果。本申請(qǐng)所示數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持這樣一個(gè)觀點(diǎn)，抗 GM-CSF和抗IL-17的聯(lián)合治療不只在RA中同時(shí)還在其它自身免疫和炎性疾病(如下文 所述定義)情況中有非常重大的治療效果。因此，本發(fā)明所述的藥物方法和手段特別針對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療，但也可能用 于其它炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥、銀屑病和肺部炎癥如哮喘和慢性阻塞性肺病 (COPD)。定義本文所用術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指的是動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括但不限于哺乳動(dòng)物， 如實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物(嚙齒動(dòng)物，如大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或小鼠；非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，如食蟹猴 或獼猴)、家畜或?qū)櫸?如狗或貓)、農(nóng)場(chǎng)或農(nóng)業(yè)動(dòng)物(如牛、綿羊、山羊和豬)、和/或 人。優(yōu)選地，所述動(dòng)物為人或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。本文所用術(shù)語(yǔ)“GM-CSF”代指人(智人(Homo sapiens))或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物 的GM-CSF (如文獻(xiàn)中定義)，并且包括其變體(同系物)。本術(shù)語(yǔ)也包括人和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的GM-CSF受體及其變體(同系物)。特別優(yōu)選的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF或非 人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF受體的變體(同系物)包括長(zhǎng)臂猿(nomascus concolor,也稱(chēng)為西黑 冠長(zhǎng)臂猿)和獼猴屬家族(如恒河猴(Macacamulatta)和食蟹猴(Macacafascicularis))的 GM-CSF受體及其變體(同系物)。本文所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗體”或其功能片段，包括具 有結(jié)合動(dòng)物GM-CSF或GM-CSF受體能力的任何抗體或抗體片段。特別地，它包括在 人類(lèi)和至少一種上述猴子物種中表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性(在結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體方 面)的任何抗體或其功能片段。例如，所述抗體或其功能片段能夠結(jié)合(和中和)人類(lèi) GM-CSF和食蟹猴(Macaca fascicularis) GM-CSF。這對(duì)于要向人類(lèi)個(gè)體治療性施予抗體 分子是尤其有益的，這是因?yàn)檫@種抗體通常在進(jìn)行行政審批前必須經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，其中 某些早期試驗(yàn)涉及非人動(dòng)物物種。進(jìn)行這些試驗(yàn)時(shí)，一般希望用與人遺傳上高度相似的 非人物種(如，非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)如食蟹猴)，這是因?yàn)橛纱双@得的結(jié)果一般將高度預(yù)示出將 相同分子向人給藥時(shí)可預(yù)期的相應(yīng)結(jié)果。可是，這種基于動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力至少部分 取決于分子的相似性，并且如果由于物種交叉反應(yīng)性可將相同的治療分子向人和動(dòng)物給 藥，其預(yù)測(cè)能力就非常高。相應(yīng)地，如果抗體分子對(duì)人和其它物種中的相同抗原能交叉 反應(yīng)，就可以使用在人和其它物種(例如上述猴物種中的一種)中相同的抗體分子進(jìn)行試 驗(yàn)。這增加了試驗(yàn)本身的效率以及這些試驗(yàn)對(duì)這些抗體在人(從治療角度最終興趣所在 的物種)中行為的預(yù)測(cè)能力。本文所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗體”還包括具有這種結(jié)合能 力的GM-CSF或GM-CSF受體的單克隆抗體或其功能片段。本發(fā)明第一個(gè)方面涉及一種在患有炎性疾病的個(gè)體中治療炎性疾病的方法，所 述方法包含施予中和GM-CSF的化合物(簡(jiǎn)述為GM-CSF抑制化合物)和中和IL-17的 化合物(簡(jiǎn)述為IL-17抑制化合物)。根據(jù)技術(shù)人員公知的參數(shù)，所述化合物可為一種組 合物的部分，或者它們可為分開(kāi)的藥物。所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案如下(a) —種方法，其中在施予中和IL-17的化合物之前或之后對(duì)個(gè)體施予中和 GM-CSF的化合物，或者同時(shí)施予兩種化合物；(b)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面或(a)所述的方法，其中所述治療個(gè)體為上述定義 的動(dòng)物；(c)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面或(a)或(b)的方法，其中GM-CSF中和化合物為 多肽、模擬肽、核酸或小分子；(d)根據(jù)(c)所述的方法，其中所述多肽為結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗 體或其功能片段；優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(e)根據(jù)(d)所述的方法，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；(f)根據(jù)(d)或(e)所述的方法，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合于人類(lèi)和非人 類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的表位。所述表位優(yōu)選為人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的 不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選為包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)。第65-77位氨基酸序列段中第67位的變異性反映出在作為一 方面的人和長(zhǎng)臂猿GM-CSF (其中第67位為R)與作為另一方面的獼猴科猴子(例如食蟹猴和恒河猴)GM-CSF (其中第67位為Q)之間GM-CSF的這個(gè)位置的異質(zhì)性；(g)根據(jù)(f)所述的方法，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)，氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(h)根據(jù)(e)、(f)和(g)中任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能 片段在其重鏈可變區(qū)包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13或56所示氨基酸序 列中的任一個(gè)；(i)根據(jù)(h)所述的方法，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列中的任一個(gè)與SEQ ID NO 14所示重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重鏈可變區(qū)CDR2序列一起
存在于重鏈可變區(qū)；(j)根據(jù)(h)或(i)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序 列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基
酸序列；(k)根據(jù)(j)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；⑴根據(jù)(h)或(i)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重 鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(m)根據(jù)(h)到⑴任一所述的方法，其中人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDRl 區(qū)包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2區(qū)具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(η)根據(jù)(h)到(m)任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的輕鏈氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重鏈氨基酸序列；(ο)根據(jù)(h)到(η)任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包 含與如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源性的氨 基酸序列。同源性可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)程序(如Vector NTI (InforMax , Maryland,美 國(guó)))來(lái)確定。該程序在一個(gè)氨基酸一個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上比較被比對(duì)的序列，并能設(shè)置各 種水平的比較嚴(yán)謹(jǐn)度(如等同氨基酸、保守氨基酸替換等)。作為本文中所用的術(shù)語(yǔ)， 如果所論及的兩個(gè)氨基酸中的每一個(gè)都屬于相同的化學(xué)組別，即酸性、非極性、不帶電 荷的極性和堿性，則它們被認(rèn)為是互相的“保守替換”。例如而不限于，兩個(gè)屬于非 極性氨基酸組的不同氨基酸被認(rèn)為是互相的“保守替換”，即使這兩個(gè)氨基酸不相同， 而一個(gè)是非極性氨基酸另一個(gè)是堿性氨基酸，則不會(huì)被認(rèn)為是“保守替換”。Alberts， Johnson, Lewis, Raff, Roberts 和 Walter 的 “Molecular Biology of the Cell”(第 4版 (2002))的第3.1節(jié)把氨基酸分成四個(gè)主要的組酸性、非極性、不帶電荷的極性和堿 性。該分組方式可用于在本發(fā)明中確定特定氨基酸是否是另一個(gè)所論及的氨基酸的保守 替換；
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(P)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面或(a)到(O)中任一所述的方法，其中所述中和 IL-17的化合物為多肽、模擬肽、核酸或小分子；(q)根據(jù)(ρ)所述的方法，其中所述多肽為可以結(jié)合IL-17或IL_17受體的抗體 或其功能片段，優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段。(r)根據(jù)(q)所述的方法，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；以及(s)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面或ω到ω中任一所述的方法，其中炎性疾病 為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包含對(duì)TNF-α中和劑治療有抗藥性的RA)、哮喘、多發(fā)性 硬化癥(MS)、慢性阻礙性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特發(fā)性肺纖 維化(IPF)、炎性腸道疾病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn，s disease)、葡萄膜炎、黃斑變 性、結(jié)腸炎、銀屑病、沃勒變性、抗磷脂抗體綜合征(APS)、急性冠脈綜合征、再狹窄 (restinosis),動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失敗的整形外 科植入、血管球性腎炎、狼瘡或其它自身免疫性疾病。本發(fā)明第二個(gè)方面涉及一種在患有腫瘤性疾病的個(gè)體中治療腫瘤性疾病的方 法，所述方法包括施予一種中和GM-CSF的化合物和一種中和IL-17的化合物。根據(jù)技 術(shù)人員公知的參數(shù)，所述化合物可為一種組合物的部分，或者它們可為分開(kāi)的藥物。根據(jù)第二個(gè)方面，所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案如下(a) 一種方法，其中在施予中和IL-17的化合物之前或之后對(duì)個(gè)體施予所述中和 GM-CSF的化合物，或一種方法，其中同時(shí)給藥兩種化合物；(b)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面或(a)所述的方法，其中所述治療個(gè)體為上述定義 的動(dòng)物；優(yōu)選地，所述個(gè)體為人類(lèi)或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物；(C)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面或(a)或(b)的方法，其中中和GM-CSF的化合物 為多肽、模擬肽、核酸或小分子；(d)根據(jù)(c)所述的方法，其中所述多肽為結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗 體或其功能片段，優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(e)根據(jù)(d)所述的方法，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；(f)根據(jù)(d)或(e)所述的方法，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合于人類(lèi)和非人 類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的表位。所述表位優(yōu)選為人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的 不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)；(g)根據(jù)(f)所述的方法，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)、氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(h)根據(jù)(e)、(f)和(g)中任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能 片段在其重鏈可變區(qū)包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸序 列中的任一個(gè)；(i)根據(jù)(h)所述的方法，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列中的任一個(gè)與SEQ ID NO 14所示重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重鏈可變區(qū)CDR2序列一起
存在于重鏈可變區(qū)；(j)根據(jù)(h)或(i)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基
酸序列；(k)根據(jù)(j)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；⑴根據(jù)(h)或(i)所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重 鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(m)根據(jù)(h)到⑴任一所述的方法，其中人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDRl 區(qū)包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2區(qū)具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(η)根據(jù)(h)到(m)任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的輕鏈氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重鏈氨基酸序列；(ο)根據(jù)(h)到(η)任一所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包 含分別與如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源性 的氨基酸序列。此處定義的同源性與前述本發(fā)明的第一個(gè)方面的實(shí)施方案(ο)相同；(ρ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面或(a)到(ο)中任一所述的方法，其中所述中和 IL-17的化合物為多肽、模擬肽、核酸或小分子；(q)根據(jù)(ρ)所述的方法，其中所述多肽為可以結(jié)合IL-17或IL_17受體的抗體 或其功能片段，優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段。(r)根據(jù)(q)所述的方法，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；和(s)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面或(a)到(r)任一所述的方法，其中所述腫瘤性疾 病為癌癥；以及(t)根據(jù)(S)所述的方法，其中所述癌癥為白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。本發(fā)明的第三個(gè)方面為一種用于人類(lèi)醫(yī)學(xué)和/或獸醫(yī)學(xué)的藥品組合物，特別是 用于在上述定義的人類(lèi)和/或動(dòng)物中治療炎性疾病或腫瘤性疾病的藥品組合物。所述組 合物包含一種GM-CSF中和化合物(簡(jiǎn)述為GM-CSF抑制化合物)和一種IL-17中和化 合物(簡(jiǎn)述為IL-17抑制化合物)。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，所述組合物的優(yōu)選實(shí)施方 案如下(a) —種組合物，其中所述GM-CSF抑制化合物為多肽、模擬肽、核酸或小分 子；(b)根據(jù)(a)所述的組合物，其中所述多肽為結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的 抗體或其功能片段；優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(c)根據(jù)(b)所述的組合物，其中所述抗體或其功能片段為人類(lèi)單克隆抗體或其 功能片段；(d)根據(jù)(b)或(C)所述的組合物，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合于人類(lèi)和非
12人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的表位。所述表位優(yōu)選為人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的 不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選為包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)。(e)根據(jù)(d)所述的組合物，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)，氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(f)根據(jù)(c)、(d)和(e)中任一所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功 能片段在其重鏈可變區(qū)包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸 序列中的任一個(gè)；(g)根據(jù)(f)所述的組合物，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列中的任一個(gè)與SEQ ID NO 14所示重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ IDNO 15所示重鏈可變區(qū)CDR2序列一
起存在于重鏈可變區(qū)；(h)根據(jù)(f)或(g)所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其 輕鏈可變區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸 序列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨
基酸序列；⑴根據(jù)(h)所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可 變區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；(j)根據(jù)(f)或(g)所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其 重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(k)根據(jù)(f)到(j)任一所述的組合物，其中人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)包含CDRl、CDR2和CDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDRl 區(qū)包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2區(qū)具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；⑴根據(jù)(f)到(k)任一所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段 包含如SEQ ID NO 34所示的輕鏈氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示 的重鏈氨基酸序列；(m)根據(jù)(f)到⑴任一所述的組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段 包含分別與如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源 性的氨基酸序列，此處定義的同源性與前述本發(fā)明的第一個(gè)方面的實(shí)施方案(ο)相同；(η)根據(jù)(a)到(m)中任一所述的組合物，其中所述IL_17抑制化合物為多肽、 模擬肽、核酸或小分子；(ο)根據(jù)(η)所述的組合物，其中所述多肽為結(jié)合IL-17或IL_17受體的抗體或 其功能片段，優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(ρ)根據(jù)(ο)所述的組合物，其中所述抗體或其功能片段分別為人類(lèi)單克隆抗體 或其功能片段；(q)根據(jù)(a)到(ρ)中任一所述的組合物，其中所述組合物用于治療炎性疾病和 /或腫瘤性疾病，特別地，其中所述炎性疾病為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包含對(duì)TNF-α中和劑治療有抗藥性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化癥(MS)、慢性阻礙性肺病(COPD)、急性 呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、炎性腸道疾病(IBD)、克羅恩氏病、 葡萄膜炎、黃斑變性、結(jié)腸炎、銀屑病、沃勒變性、抗磷脂抗體綜合征(APS)、急性冠 脈綜合征、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失敗的 整形外科植入、血管球性腎炎、狼瘡或自身免疫性疾?。徊⑶?或者所述腫瘤性疾病為 癌癥例如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。根據(jù)本申請(qǐng)?zhí)峤坏氐姆?，本發(fā)明的第四個(gè)方面可為GM-CSF抑制化合物和 IL-17抑制化合物在制備治療如上進(jìn)一步說(shuō)明的炎性疾病和腫瘤性疾病的藥物中的聯(lián)合用 途。因此，在本發(fā)明第四個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以配制包含GM-CSF抑制化合物 和IL-17抑制化合物的藥物，該藥物用于如下給藥方式(1)首先施予GM-CSF抑制化合物，然后施予IL-17抑制化合物；(2)首先施予 IL-17抑制化合物，然后施予GM-CSF抑制化合物；以及(3)同時(shí)施予GM-CSF抑制化 合物和IL-17抑制化合物。因此，根據(jù)技術(shù)人員公知的參數(shù)，所述化合物可為一種組合 物的部分，或者它們可為分開(kāi)的藥物?？蛇x地，本發(fā)明的第五個(gè)方面可以為用于治療上述任何疾病的GM-CSF和IL-17 抑制化合物。再一次說(shuō)明，所述化合物的給藥方式可以為以任何順序一個(gè)接一個(gè)地給藥 或者可以為同時(shí)給藥。同樣，根據(jù)技術(shù)人員公知的參數(shù)，所述化合物可為一種組合物的 部分，或者它們可為分開(kāi)的藥物。對(duì)于使用GM-CSF和IL-17抑制化合物制備藥物的情況，和對(duì)于用于治療任意 所述疾病的GM-CSF和IL-17抑制化合物的情況，優(yōu)選的實(shí)施方案如下(a)所述接受治療的個(gè)體如上定義；(b)所述GM-CSF抑制化合物為多肽、模擬肽、核酸或小分子；(c)根據(jù)(b)所述的多肽為結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗體或其功能片段； 優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(d)如(C)定義的所述抗體或其功能片段為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；(e)所述抗體或其功能片段結(jié)合于人和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的表位。所 述表位優(yōu)選為人和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GM-CSF的不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選為包含氨基 酸第 23-27 位(RRLLN)和 / 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。(f)所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第28-31位(LSRD)、氨基酸第32_33位 (TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(g)根據(jù)(d)、(e)和(f)中任一所述的人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重鏈可 變區(qū)包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸序列中的任一個(gè)；(h)實(shí)施方案(g)，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列中的任一個(gè)與SEQ ID NO 14所示重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重鏈可變區(qū)CDR2序列一起存在于
重鏈可變區(qū)；⑴實(shí)施方案(g)或(h)，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序 列；
(j)根據(jù)⑴所述的人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段，在其輕鏈可變區(qū)進(jìn)一步包含 如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；(k)根據(jù)實(shí)施方案(h)或(g)所述的人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段，在其重鏈可 變區(qū)包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；⑴實(shí)施方案(g)到(k)中的任一個(gè)，其中人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDRl 區(qū)包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2區(qū)具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(m)實(shí)施方案(g)到⑴中的任一個(gè)，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的輕鏈氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重鏈氨基酸序列；(η)實(shí)施方案(g)到(m)中的任一個(gè)，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段 包含分別與如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70% 同源性的氨基酸序列。同源性可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)程序(如Vector NTI (InforMaxTM, Maryland,美國(guó)))來(lái)確定。該程序在一個(gè)氨基酸一個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上比較被比對(duì)的序 列，并能設(shè)置各種水平的比較嚴(yán)謹(jǐn)度(如等同氨基酸、保守氨基酸替換等)。作為本文 中所用的術(shù)語(yǔ)，如果所論及的兩個(gè)氨基酸中的每一個(gè)都屬于相同的化學(xué)組別，即酸性、 非極性、不帶電荷的極性和堿性，則它們被認(rèn)為是互相的“保守替換”。例如而不限 于，兩個(gè)屬于非極性氨基酸組的不同氨基酸被認(rèn)為是互相的“保守替換”，即使這兩個(gè) 氨基酸不相同，而一個(gè)是非極性氨基酸另一個(gè)是堿性氨基酸，則不會(huì)被認(rèn)為是“保守替 換”。Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts 禾口 Walter 的 “Molecular Biology of the Cell"(第4版(2002))的第3.1節(jié)把氨基酸分成四個(gè)主要的組酸性、非極性、不帶電 荷的極性和堿性。該分組方式可用于在本發(fā)明中確定特定氨基酸是否是另一個(gè)所論及的 氨基酸的保守替換；(O)實(shí)施方案(a)到(η)中的任一個(gè)，其中所述IL-17抑制化合物為多肽、模擬 肽、核酸或小分子；(ρ)根據(jù)(ο)所述的多肽為結(jié)合IL-17或IL-17受體的抗體或其功能片段，優(yōu)選 地，所述抗體為單克隆抗體或其功能片段；(q)根據(jù)(ρ)所述的抗體或其功能片段為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段；以及(r)所述炎性疾病為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包含對(duì)TNF-α中和劑治療有抗藥 性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化癥(MS)、慢性阻礙性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、炎性腸道疾病(IBD)、克羅恩氏病、葡萄膜炎、黃斑 變性、結(jié)腸炎、銀屑病、沃勒變性、抗磷脂抗體綜合征(APS)、急性冠脈綜合征、再狹 窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失敗的整形外科植入、 血管球性腎炎、狼瘡或自身免疫性疾病；和/或所述腫瘤性疾病為癌癥，例如白血病、 多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。如前所述，本文所用術(shù)語(yǔ)“IL-17”，是指一類(lèi)獲得性免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子家族，由IL-17A到IL-17F六個(gè)成員組成。該術(shù)語(yǔ)的定義還包含異二聚體，如已被報(bào)導(dǎo)例如通 過(guò)CD4+T細(xì)胞生理表達(dá)的IL-17A/IL-17F。特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明被中和的IL-17家族 成員包含IL-17A、IL-17F和IL-17D。更優(yōu)選地，IL-17A和IL-17F的效應(yīng)根據(jù)本發(fā)明 被中和。由于優(yōu)選由IL-17A、IL-17F和IL-17D組成的組，所以也優(yōu)選中和/抑制IL-17 受體亞組(IL-17R)的信號(hào)，如IL-17RA、IL-17RB和IL-17RC信號(hào)，更優(yōu)選IL-17RA 和IL-17RC的信號(hào)。本文所用術(shù)語(yǔ)“特異結(jié)合”或相關(guān)表述，如“特異性結(jié)合”、“特異地結(jié) 合”、“特異結(jié)合物”等，指GM-CSF/IL-17抑制化合物以及優(yōu)選人類(lèi)單克隆抗體或其 功能片段(如上定義)區(qū)分出GM-CSF/IL-17和任何數(shù)量的其它不同于GM-CSF/IL-17 的潛在抗原的能力如此之高，從多種作為潛在結(jié)合配偶體的不同抗原的集合中，僅結(jié)合 或僅顯著結(jié)合GM-CSF/IL-17。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“顯著”結(jié)合GM-CSF/IL-17，是 指在從作為潛在結(jié)合配偶體的同樣可接觸的多種不同抗原的匯聚物中，比任何其它不同 于GM-CSF/IL-17的抗原高至少10倍、優(yōu)選50倍、最優(yōu)選100倍或更高頻率(在動(dòng)力 學(xué)意義上)地結(jié)合GM-CSF/IL-17。這些動(dòng)力學(xué)測(cè)量可在Biacore設(shè)備上進(jìn)行。本文中所用的“中和作用”、“中和劑”、“中和”和其語(yǔ)法上相關(guān)的變體指 部分或完全減弱GM-CSF/IL-17的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)。該GM-CSF/IL-17的一種 或多種生物學(xué)效應(yīng)的部分或完全減弱可由修飾、阻斷和/或消除GM-CSF/IL-17介導(dǎo)的 過(guò)程例如信號(hào)傳導(dǎo)(例如在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖或釋放可溶性物質(zhì)、上調(diào)或下調(diào) 細(xì)胞內(nèi)基因活化所顯示的)而造成，例如導(dǎo)致除了 GM-CSF之外的配體的表面受體的表 達(dá)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員能理解的是，存在多種模式來(lái)確定試劑(例如所論及的抗體或其 功能片段)是否能被劃分為中和劑。例如，這一般可通過(guò)如下標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)試來(lái)實(shí)現(xiàn)在 第一個(gè)增殖試驗(yàn)中，將其增殖程度已知取決于GM-CSF活性的細(xì)胞系和一系列含各種濃 度的GM-CSF—起孵育，孵育后測(cè)定細(xì)胞系的增殖程度。通過(guò)這種測(cè)量，確定出能使 細(xì)胞達(dá)到半最大增殖程度的GM-CSF濃度。然后進(jìn)行第二個(gè)增殖實(shí)驗(yàn)，其在每一系列 樣品中利用第一個(gè)增殖實(shí)驗(yàn)中所用的相同數(shù)量的細(xì)胞、以上確定的GM-CSF濃度、以及 此次使用各種濃度的懷疑是GM-CSF中和劑的抗體或其功能片段。再測(cè)量細(xì)胞增殖以 確定足以導(dǎo)致半最大生長(zhǎng)抑制的抗體或其功能片段的濃度。如果得到的生長(zhǎng)抑制對(duì)抗體 (或其功能片段)濃度的圖是乙狀的(sigmoidal)，使得隨著抗體(或其功能片段)濃度 增加而降低細(xì)胞增殖，則在一定程度上導(dǎo)致抗體依賴(lài)性生長(zhǎng)抑制，即以某種程度中和了 GM-CSF活性。在這種情況下，抗體或其功能片段可被認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的“中和 劑”。其增殖程度已知取決于GM-CSF活性的細(xì)胞系的一個(gè)例子是TF-1細(xì)胞系，其如 文獻(xiàn) Kitamura，T 等(1989) .J Cell Physiol 140，323-34 所述。如所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，細(xì)胞增殖的程度不是確立GM-CSF中和能 力的唯一參數(shù)。例如，測(cè)定其分泌水平依賴(lài)于GM-CSF的信號(hào)傳遞分子(如細(xì)胞因子) 的水平，可用于鑒定可疑的GM-CSF中和劑(GM-CSF抑制化合物)。用于確定IL-17 抑制化合物的中和效應(yīng)的相應(yīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)定是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？捎糜诖_定所論及的抗體或其功能片段是否是GM-CSF活性的中和劑的細(xì)胞系 的其它實(shí)例包括 AML_193(參見(jiàn)文獻(xiàn) Lange，B.等(1987) .Blood 70，192-9)、GF-D8 (參 見(jiàn)文獻(xiàn) Rambaldi，A.等(1993) .Blood 81，1376-83)、GM/SO (參見(jiàn)文獻(xiàn) Oez，S.等(1990) .Experimental Hematology 18, 1108-11)、M07E (參見(jiàn)文獻(xiàn) Avanzi，G.C.等(1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64)、TALL-103 (參見(jiàn)文獻(xiàn) Valtieri，M.等(1987). Journal of Immunology 138，4042-50)、UT-7 (參見(jiàn)文獻(xiàn) Komatsu，N.等(1991) .Cancer Research 51, 341-8)。可用于確定所論及的化合物(例如抗體或其功能片段)是否是 IL-17活性的中和劑的基于細(xì)胞系/細(xì)胞的分析的實(shí)例包括IL-17蛋白質(zhì)的BEAS-2B體 外分析(BEAS-2B，人類(lèi)支氣管上皮細(xì)胞(ATCC，CRL-9609))或成纖維細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)IL_6 釋放分析(參見(jiàn)文獻(xiàn) Yao 等，1995，Journal of Immunology, 155，5483-5486)。應(yīng)當(dāng)理解，在含有GM-CSF和IL-17的受體的細(xì)胞之外或細(xì)胞之內(nèi)，根據(jù)本發(fā) 明的GM-CSF和IL-17的抑制作用/中和作用都能夠分別發(fā)生。因此，通過(guò)化合物產(chǎn)生 的GM-CSF和IL-17的抑制作用/中和作用既可以為抑制或阻止GM-CSF或IL-17與其 特異性受體結(jié)合的作用，也可以為抑制這些細(xì)胞因子與其受體結(jié)合所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào) 的作用。細(xì)胞內(nèi)作用的IL-17信號(hào)的抑制劑/中和劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的 化合物，包括 JAK/STAT、MAPKp38、NF-kappaB 或 JNK 抑制劑。如上定義，GM-CSF或IL-17的抑制劑可以選自由多肽、模擬肽、核酸和小分子 組成的組。本文所用術(shù)語(yǔ)“多肽”描述一組由多于30個(gè)氨基酸組成的分子。根據(jù)本發(fā)明， 所述多肽的組包含由一個(gè)或多個(gè)多肽組成的“蛋白質(zhì)”。術(shù)語(yǔ)“多肽”還描述蛋白質(zhì)片 段，只要這些片段由多于30個(gè)氨基酸組成。在本領(lǐng)域眾所周知，多肽可能形成多聚體， 如二聚體、三聚體和更高寡聚體，即由多于一個(gè)多肽分子組成。這樣的多聚體也包括在 術(shù)語(yǔ)“多肽”的定義中。形成這種二聚物、三聚物等的多肽分子可為相同的或不同的。 于是，這種多聚物的相應(yīng)的更高級(jí)結(jié)構(gòu)，被命名為同或異二聚物，同或異三聚物等。異 多聚物的一個(gè)實(shí)例為一種由兩個(gè)相同輕鏈和兩個(gè)相同重鏈組成的天然形式的抗體分子。 術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”還指自然或非自然修飾的多肽/蛋白質(zhì)，其中所述修飾可例如 通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾(如糖基化、乙?；⒘姿峄?產(chǎn)生。這種修飾是本領(lǐng)域公知的。術(shù)語(yǔ)“小分子”指的是一組分子量少于1000D、并且優(yōu)選為300-700D的藥物化 合物。相應(yīng)的小分子可以源于至少部分隨機(jī)的肽文庫(kù)。本發(fā)明適用的小分子文庫(kù)是本領(lǐng) 域所公知的，并且/或是可以從經(jīng)銷(xiāo)商購(gòu)買(mǎi)的。術(shù)語(yǔ)“核酸”在本發(fā)明范圍中定義為由磷酸、糖、嘌呤和嘧啶堿基的多個(gè)重復(fù) 單元構(gòu)成的大分子。這些分子的實(shí)施方案包括DNA、RNA和PNA。在本發(fā)明范圍中， 核酸的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案為適體(aptamer)。適體為這樣的DNA或RNA分子，其 選自基于與其它分子結(jié)合能力的隨機(jī)庫(kù)。所選擇的適體可以結(jié)合核酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)小 分子、甚至整個(gè)有機(jī)體。術(shù)語(yǔ)“模擬肽”指的是一種設(shè)計(jì)用來(lái)模擬肽的小蛋白樣鏈。這種分子是為了改 變分子的特性，通過(guò)修飾現(xiàn)有肽而人工獲得的。例如，修飾親本現(xiàn)存肽以改變?cè)摲肿拥?穩(wěn)定性或生物學(xué)活性。這些修飾包含改變骨架和加入非天然氨基酸。術(shù)語(yǔ)“GM-CSF受體”是指GM-CSF的生理細(xì)胞表面受體，在本領(lǐng)域中是指 CD116和常見(jiàn)bata⑶c)亞基形成的異二聚體。術(shù)語(yǔ)“IL-17受體”指的是IL-17不同亞 型的生理細(xì)胞表面受體的家族。目前所述家族尤其包含以下亞型IL-17RA、IL-17RB、 IL-17RC、IL-17RD 和 IL-17RE。
中和用肽鏈的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案為抗體(或其功能片段)，更優(yōu)選為人類(lèi) 抗體(或其功能片段)。生產(chǎn)抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)楣那乙言诶缥墨I(xiàn)Harlow和 Lane “ Antibodies, A Laboratory Manual “， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 以及文獻(xiàn) Harlow and Lane " Using Antibodies A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999中描述。術(shù)語(yǔ)“抗體”包含不同種類(lèi)(如IgA、IgG、IgM、IgD 和IgE)和亞類(lèi)(如IgGl、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。本發(fā)明所述抗體定義也包含抗 體的衍生物，所述抗體衍生物包括對(duì)所述分子的修飾，如糖基化、乙?；?、磷酸化、法 尼基化(famesylation)、羥基化、甲基化或酯化。非人類(lèi)或人類(lèi)抗體或其功能片段(具有GM-CSF和IL-17特異性)優(yōu)選是單克隆 的。制備單克隆的人抗體尤其困難。與用永生化的細(xì)胞系融合鼠B細(xì)胞相反，融合人B 細(xì)胞和永生化的細(xì)胞系是不可行的。因此，人單克隆抗體是克服抗體技術(shù)領(lǐng)域中現(xiàn)存的 公認(rèn)的技術(shù)障礙的結(jié)果?？贵w的單克隆性質(zhì)使其尤其適于用作治療劑，這是因?yàn)樵摽贵w 將作為單一、均一的分子種類(lèi)而存在，其可以被很好地表征并重復(fù)制備并純化。這些因 素產(chǎn)生的產(chǎn)物，其生物活性可被高精度地預(yù)測(cè)出，如果要使該分子被管理部門(mén)批準(zhǔn)可以 向人給藥治療，則這是非常重要的。特別優(yōu)選地，單克隆抗體(或其相應(yīng)功能片段)是人抗體(或其相應(yīng)功能片 段)。為了使抗體試劑能對(duì)人給藥治療，抗體為人源的是非常有利的。在對(duì)人患者給藥 后，人抗體或其功能片段將最可能不引發(fā)患者免疫系統(tǒng)的強(qiáng)免疫原性應(yīng)答，即不會(huì)被識(shí) 別為“外來(lái)的”非人蛋白。這指不產(chǎn)生宿主(即患者)抗體來(lái)抗該治療性抗體，否則宿 主抗體就會(huì)阻斷治療性抗體的活性和/或加速患者身體清除治療性抗體，由此阻止其發(fā) 揮所希望的治療效應(yīng)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“人”抗體應(yīng)被理解為指具有特異性的抗體或其功能片段， 其包括包含于人的種系抗體群內(nèi)的一種或多種氨基酸序列。因此為了在本文中定義， 抗體或其片段可被認(rèn)為是人的，條件是由這樣的一種或多種人的種系氨基酸序列組成， 即，條件是所論及的抗體或其功能片段的一種或多種氨基酸序列與表達(dá)的一種或多種人 的種系氨基酸序列一致?？贵w或其功能片段也可以看成是人的，條件是它由如下序列組 成所述序列與其最接近的人的種系序列的差別不超過(guò)由于體細(xì)胞超突變印記所帶來(lái)的 差別。另外，許多非人哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，如小鼠和大鼠)抗體包含VHCDR3氨 基酸序列，其預(yù)計(jì)也存在于表達(dá)的人抗體群中?？杀活A(yù)計(jì)存在于表達(dá)的人的所有組成成 分(repertoire)中的人或非人源的一個(gè)或多個(gè)任何這種序列也可被認(rèn)為是符合本發(fā)明目的 的“人”的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，被用于藥學(xué)目的的人類(lèi)單克隆抗體或其功 能片段在人和至少一種猴物種之間顯示出交叉反應(yīng)性。優(yōu)選所有其它(非抗體或非抗體 來(lái)源的)GM_CSF和/或IL-17的中和/抑制化合物具有同樣的物種間交叉反應(yīng)性。由于 該抗體通常將在行政審批前必須經(jīng)歷大量試驗(yàn)，其中某些早期試驗(yàn)涉及非人動(dòng)物物種， 因此這種交叉反應(yīng)抗體非常有用。為了進(jìn)行這些測(cè)試，一般希望用與人遺傳上高度相似 的非人物種，這是因?yàn)橛纱双@得的結(jié)果一般將高度預(yù)示出將相同分子向人給藥時(shí)所預(yù)期 的相應(yīng)結(jié)果?？墒牵@種基于動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力至少部分取決于分子的相似性，當(dāng)由 于物種交叉反應(yīng)性而可將相同的治療分子向人和動(dòng)物模型給藥時(shí)，其預(yù)測(cè)能力是非常高的。如在本發(fā)明的實(shí)施方案中，當(dāng)抗體分子與人和另一種很相關(guān)的物種中的相同抗原交 叉反應(yīng)時(shí)，可以使用該相同抗體分子在人以及該很相關(guān)的物種(如上述猴物種)中進(jìn)行試 驗(yàn)。這增加了測(cè)試本身的效率以及這些試驗(yàn)對(duì)這些抗體在人(從治療角度最終興趣所在 的物種)中行為的所能達(dá)到的預(yù)測(cè)能力。在使用不是抗體(或不是抗體衍生)的中和/ 抑制化合物的可供選用的其它實(shí)施方案中也是這樣的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，人單克隆抗體可以是IgG抗體。IgG不僅 包含負(fù)責(zé)高度區(qū)別性地識(shí)別和結(jié)合抗原的可變抗體區(qū)，而且還包含通常在內(nèi)源產(chǎn)生的抗 體中出現(xiàn)的重和輕抗體多肽鏈的恒定區(qū)，在某些情況下，甚至在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上帶有 碳水化合物修飾。這樣的糖基化一般是IgG型的標(biāo)志，而且這些恒定區(qū)的部分組成了完 整抗體的所謂Fc區(qū)，已知其能在體內(nèi)引發(fā)出各種效應(yīng)器功能。另外，F(xiàn)c區(qū)介導(dǎo)IgG與 Fc受體的結(jié)合，由此延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期并輔助IgG向Fc受體增加的地方——例如發(fā)炎組織 歸巢。有益的是，IgG抗體是IgGl抗體或IgG4抗體，這些是優(yōu)選的形式，這是因?yàn)樗?們的體內(nèi)作用機(jī)制被特別好地理解并表征了。尤其對(duì)于IgGl抗體是這樣。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，人單克隆抗體的功能性片段可以是scFv、 單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv、VHH抗體、雙抗體、串聯(lián)的雙抗體、Fab、Fab，或F(ab)2。這 些形式通?？杀环殖蓛蓚€(gè)亞型，即由單多肽鏈組成的那些，和包含至少2條多肽鏈的那 些。前一亞型的成員包括scFv(包含一個(gè)VH區(qū)和一個(gè)VL區(qū)，它們通過(guò)多肽接頭連接成 單多肽鏈)；單結(jié)構(gòu)域抗體(包含單個(gè)抗體可變區(qū))，如VHH抗體(包含單VH區(qū))。后 一亞型的成員包括Fv(包含一個(gè)VH區(qū)和一個(gè)VL區(qū)，形成分開(kāi)的多肽鏈，非共價(jià)地相互 連接)；雙抗體(包含2條非共價(jià)連接的多肽鏈，其中每一條包含2個(gè)抗體可變區(qū)一通 常每條多肽鏈有一個(gè)VH和一個(gè)VL-這兩條多肽鏈以頭對(duì)尾構(gòu)型排列而形成二價(jià)抗體分 子)；串聯(lián)的雙抗體(雙特異性單鏈Fv抗體，其包含具有兩種不同特異性的4個(gè)共價(jià)相 連的免疫球蛋白可變VH和VL區(qū)，形成上述雙抗體兩倍大的同二聚體)；Fab (包含作為 一條多肽鏈的完整的抗體輕鏈(其自身包含了 VL區(qū)和完整的輕鏈恒定區(qū))，以及作為另 一條多肽鏈的一部分抗體重鏈(其包含完整的VH區(qū)和部分重鏈恒定區(qū))，所述2條多肽 鏈通過(guò)鏈內(nèi)二硫鍵而在分子間相連)；Fab’(如同以上Fab，除了具有包含在抗體重鏈上 的另外的還原二硫鍵)和F(ab) 2 (包含2個(gè)Fab，分子，每個(gè)Fab，分子與另一個(gè)Fab， 分子通過(guò)鏈間二硫鍵相連)。一般而言，上文所述類(lèi)型的功能性抗體片段給設(shè)計(jì)，例如 需要在特定緊急情況下臨時(shí)治療給藥的抗體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)帶來(lái)了很大的靈活性。例 如，可期望減小給藥抗體的大小，從而在治療已知很少有血管分布的組織(例如，關(guān)節(jié)) 時(shí)增加組織穿透程度。在某些情況下，也可期望增加治療性抗體被清除出身體的速率， 所述速率一般通過(guò)減少給藥抗體大小來(lái)加速。只要抗體片段能維持特異性結(jié)合親本抗體 表位/靶標(biāo)的特性，即，只要能分別特異性結(jié)合GM-CSF或IL-17，這個(gè)抗體片段就定義 為本發(fā)明范圍內(nèi)的功能性抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述人單克隆抗體或其功能片段可以呈現(xiàn) 為單價(jià)單特異性的；多價(jià)單特異性的，尤其是二價(jià)單特異性的；或是多價(jià)多特異性的， 尤其是二價(jià)雙特異性的形式。一般而言，多價(jià)單特異性的、尤其是二價(jià)單特異性的抗體 (如上述完整的人IgG)可帶來(lái)治療優(yōu)勢(shì)，即通過(guò)這種抗體起到的中和作用能夠被抗體親 抗原性(avidity)作用(即相同的抗體結(jié)合至多個(gè)相同抗原(此處指GM-CSF/IL-17)分子)增強(qiáng)。本發(fā)明的抗體片段的幾種單價(jià)單特異性形式如上所述(例如，scFv、Fv、VHH 或單結(jié)構(gòu)域抗體)。多價(jià)多特異性的、尤其是二價(jià)雙特異性形式的人單克隆抗GM-CSF/ IL-17抗體，可包括完整的IgG，其中一個(gè)結(jié)合臂結(jié)合非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的GM-CSF/ IL-17,而另一個(gè)結(jié)合臂結(jié)合于不同于GM-CSF/IL-17的另一抗原。其它多價(jià)多特異性 的、尤其是雙價(jià)雙特異性形式，優(yōu)選為人單鏈雙特異性抗體，即包含2個(gè)上述scFv實(shí)體 的重組人抗體構(gòu)建體，通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的小的插入性多肽間隔區(qū)連成一個(gè)連續(xù)的多 肽鏈(例如參見(jiàn)WO 99/54440,其涉及抗CD19x抗CD3雙特異性單鏈抗體)。在本文 中，雙特異性單鏈抗體的范圍內(nèi)所涵蓋的雙特異性單鏈抗體的一個(gè)scFv部分將特異結(jié)合 如上所提及的GM-CSF/IL-17，而該雙特異性單鏈抗體的另一個(gè)scFv部分將結(jié)合另一個(gè) 確定具有治療利益的抗原。優(yōu)選的另一方式是，如上所述雙特異性單鏈抗體將特異性結(jié) 合GM-CSF，而該雙特異性單鏈抗體的另一個(gè)scFv部分將結(jié)合IL-17。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，抑制性人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段可以 是衍生化的，例如用有機(jī)聚合物，例如用一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯 吡咯烷酮(“PVP” )分子進(jìn)行衍生化。本領(lǐng)域已知，這種衍生化有益于調(diào)節(jié)抗體或其 功能片段的藥效學(xué)性質(zhì)。尤其優(yōu)選的是衍生化為PEG-馬來(lái)酰亞胺的PEG分子，其能以 位點(diǎn)特異性方式通過(guò)半胱氨酸的巰基來(lái)與抗體或其功能片段綴合。在這些中，尤其優(yōu)選 的是20kD和/或40kD的PEG-馬來(lái)酰亞胺，其可以是支鏈或直鏈的形式。尤其有益的 是增加較小的人抗GM-CSF/IL-17抗體片段(如scFv片段)的有效分子量，其通過(guò)將后 者與一個(gè)或多個(gè)PEG分子(尤其是PEG-馬來(lái)亞酰胺)偶聯(lián)而獲得。本文中所用人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF的編號(hào)指成熟的GM-CSF的，即不帶有其 17個(gè)氨基酸信號(hào)序列的GM-CSF(上述人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)物種的成熟的GM-CSF的總長(zhǎng)度 都是 127 個(gè)氨基酸)。人 GM-CSF (SEQ ID NO 57)和長(zhǎng)臂猿 GM_CSF(SEQ ID NO 58)的序列如下APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETVEVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM
ASHYKQHCPP TPETSCATQIITFESFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE某些獼猴科成員(例如恒河猴(SEQ ID NO 59)和食蟹猴(SEQ IDNO 60))的 GM-CSF序列如下APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNKTVEVVSEMFDLQ EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMMASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFQSFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE上述本發(fā)明的人單克隆抗體(或其功能片段)所結(jié)合的最小表位(更好是不連續(xù) 表位)在以上GM-CSF序列中用粗體字表示。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“不連續(xù)表位”應(yīng)被 理解為是給定多肽鏈(本文中的成熟的人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF)中至少2個(gè)不相鄰的氨 基酸序列段，其同時(shí)并特異地與抗體結(jié)合。根據(jù)該定義，這種同時(shí)的特異的結(jié)合可以是 針對(duì)線型GM-CSF多肽的。在本文中，可以設(shè)想成熟的GM-CSF多肽形成了延伸的環(huán)， 在環(huán)的一個(gè)區(qū)域中上面粗體字所指示的2個(gè)序列排成排，例如或多或少互相平行和彼此接近。在該狀態(tài)下，它們特異并同時(shí)與本發(fā)明的抗體片段結(jié)合。根據(jù)該定義，以上所示 的成熟GM-CSF的2個(gè)序列段的同時(shí)特異結(jié)合也可以采取抗體與構(gòu)象表位結(jié)合的形式。 在本文中，成熟的GM-CSF已經(jīng)形成了其通常在體內(nèi)所形成的三級(jí)構(gòu)象。在該三級(jí)構(gòu)象 中，成熟的GM-CSF多肽鏈以如下方式折疊使以上所示的2條序列段處于空間相鄰的 位置，例如在成熟、折疊的GM-CSF的特定區(qū)域的外表面，然后他們?cè)诖送ㄟ^(guò)其在周?chē)?多肽序列環(huán)境內(nèi)的三維構(gòu)象被識(shí)別。優(yōu)選的人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段包含如SEQ IDNO 14所示的 重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 1所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變 區(qū)CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 2所 示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序 列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO 3所示的重鏈可 變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQIDNO: 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 4所示的重鏈可變區(qū)CDR3序 列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQID NO 15所 示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 5所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包 含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重鏈可 變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 6所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ IDNO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序 列和如SEQ ID NO 7所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所 示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 8所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可 變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 9 所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ IDNO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1 序列，如SEQIDNO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO: 10所示的重 鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列， 如SEQID NO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 11所示的重鏈可變區(qū) CDR3序列；或是包含如SEQID NO: 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO: 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO: 12所示的重鏈可變區(qū)CDR3序 列；或是包含如SEQID NO: 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO 15所 示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 13所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或是包 含如SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重鏈可 變區(qū)CDR2序列和如SEQ ID NO 56所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列。更優(yōu)選的是，以上14種CDR1、CDR2和CDR3序列的組合的任一種存在于這樣 的人單克隆抗體或其功能片段中，其中該人單克隆抗體或其功能片段進(jìn)一步在其輕鏈可 變區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序 列。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，抑制性人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段在其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQIDNO: 20中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 22中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 23中所示的氨基酸序列；或 這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基 酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQIDNO: 25中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 27中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 28中所示的氨基酸序列；或這 樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸 序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQIDNO: 30中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 31中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO 32中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 33中所示的氨基酸序列；或這 樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸 序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體 或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū) 包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。 根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，抑制性人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段在其 輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 54中所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQ IDNO 20中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQIDNO: 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 22中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 23中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基 酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQ ID NO 25中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQ ID NO 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 27中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 28中所示的氨基酸序列；或這 樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸 序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗 體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)包含如SEQIDNO: 30中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段， 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 31中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包 含如SEQIDNO: 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO 32中所示的 氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 33中所示的氨基酸序列；或這 樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸 序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體 或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū) 包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。 根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，該抑制性人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段在 其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是這樣的人單克 隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重鏈 可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 20中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片 段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū) 包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 22中所 示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序 列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示 的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或這樣的人單 克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重 鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 25中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功 能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如 SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可 變區(qū)包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 27 中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQID NO 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO 28中所示的氨基酸序 列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所 示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或這樣的人 單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列， 重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO: 30中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其 功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含 如SEQIDNO: 31中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈 可變區(qū)包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ IDNO 32 中所示的氨基酸序列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 33中所示的氨基酸序 列；或這樣的人單克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示 的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或這樣的人單 克隆抗體或其功能片段，其輕鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重 鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。一種優(yōu)選的抑制性人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段，在其輕鏈可變區(qū)包 含CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDR1區(qū)包含SEQID NO 16所示氨基酸序列， CDR2區(qū)具有SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO 18所示氨基 酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中CDR1區(qū)包含如 SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列，CDR2區(qū)具有如SEQIDNO 15所示的氨基酸序列， CDR3 具有如 SEQ ID NOs 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 56 中任一 所示的氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述抗體在其輕鏈中包含如SEQ IDNO : 34中所示 的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO : 35中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中 包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO 36中所示 的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中 包含如SEQIDNO: 37中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO 34中所 示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO : 38中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈 中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO 39中所 示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈 中包含如SEQIDNO: 40中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO 34中 所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ IDNO 41中所示的氨基酸序列；或在其輕 鏈中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO 42中 所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重 鏈中包含如SEQ ID NO 43中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO 34 中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO : 44中所示的氨基酸序列；或在其 輕鏈中包含如SEQ IDNO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO 45 中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其 重鏈中包含如SEQ ID NO 46中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQIDNO: 47中所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重鏈中包含如SEQ ID NO 48中所示的氨基酸序列。以上優(yōu)選的具體實(shí)施方式
提供了人單克隆抗體分子和/或其功能片段，其作為 非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)GM-CSF活性的中和劑特別有利。根據(jù)這些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方 式的人單克隆抗體或其功能片段非常有利是由于以下幾個(gè)原因。首先，它們高度特異地識(shí)別非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)GM-CSF，也就是說(shuō)從非 人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF與其它非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)集落刺激因子(例如非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)G-CSF 和M-CSF)的混合物中，根據(jù)這些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的結(jié)合分子能高度區(qū)分出 靈長(zhǎng)類(lèi)GM-CSF，而在相同環(huán)境中不識(shí)別其它集落刺激因子。這也同樣適用于人類(lèi) GM-CSF。這是指，這些具體實(shí)施方式
所述的人單克隆抗體或其功能片段，在向人給藥 時(shí)，將被預(yù)見(jiàn)到只能特異結(jié)合并中和所期望的靶，而并不結(jié)合與中和其它不期望的靶。 最終，這導(dǎo)致了關(guān)于體內(nèi)作用的治療模式的高度可預(yù)測(cè)性。第二，這些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的結(jié)合物以非常高的親和力結(jié)合非人 類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)GM-CSF。對(duì)于該類(lèi)分子所觀察到的KD值從約4X10_9M低至約 0.04X10_9M，后者相當(dāng)于約40pM。由于在含水介質(zhì)中該分子的動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率極大地 受擴(kuò)散控制，因此不能提高到超出在生理?xiàng)l件下局部擴(kuò)散條件所能達(dá)到的速率，因此低 的KD值主要由動(dòng)力學(xué)解離速率(kj造成，k。ff對(duì)于親和力最高的抗體結(jié)合物來(lái)說(shuō)約為 10_5。。這是指，一旦作為一方的本發(fā)明這些具體實(shí)施方式
所述的人單克隆抗體或其功 能片段與作為另一方的GM-CSF之間形成復(fù)合物，就不能容易地、或至少不能迅速地分 離。對(duì)于要作為生物活性中和劑的結(jié)合分子來(lái)說(shuō)，這些特點(diǎn)是高度有益的，這是因?yàn)樗?希望的中和效果通常將只能在其生物活性要被中和的分子(此處指非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi) GM-CSF)仍舊被中和結(jié)合分子結(jié)合時(shí)才能持續(xù)。因此，仍保持長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合其所要結(jié)合的 靶的中和分子將繼續(xù)中和相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間。人單克隆抗體或其功能片段與非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)GM-CSF的高度結(jié)合親和力 具有額外的優(yōu)勢(shì)。通常，抗體或其功能片段將以大小依賴(lài)性的形式從患者血流中被清除 出，方式是排出并清除較小的分子，然后是較大的。由于兩種多肽(抗體或抗體片段與 所結(jié)合的GM-CSF)的復(fù)合物明顯大于抗體本身，因此上述低^使得治療性中和劑比它 不結(jié)合GM-CSF的情況更慢地從患者身體中被排出并清除。因此，中和活性的幅度與其 體內(nèi)持續(xù)時(shí)間都增加了。根據(jù)上述具體實(shí)施方式
的結(jié)合物所確定的中和活性出人意料地高。如將在下 文中更具體地描述的那樣，可利用TF-1生長(zhǎng)抑制分析進(jìn)行體外測(cè)量GM-CSF中和活性 (Kitamura，T.等(1989) .J Cell Physiol 140，323-34)。測(cè)定 IC5(1 值作為中和潛力的指標(biāo)， IC50表示本發(fā)明這些具體實(shí)施方式
所述的人單克隆抗體或其功能片段引發(fā)半最大TF-1細(xì) 胞增殖抑制作用所需的濃度。對(duì)于上述的人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段，所確 定的IC5(I值約為SXIO^M，或約為0.3nM。因此，本發(fā)明這些具體實(shí)施方式
所述的結(jié)合 分子是很強(qiáng)有力的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)GM-CSF活性的中和劑。然后，總之，人單克隆抗GM-CSF抗體或其功能片段顯示出對(duì)所希望的抗原的 高度區(qū)分能力，非常牢固地結(jié)合該抗原并持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間，并在它所結(jié)合的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)顯示出 高度有效的中和活性。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間保持結(jié)合物_抗原復(fù)合物能減緩該結(jié)合物從身體中被清除，由此延長(zhǎng)所希望的體內(nèi)治療效果的持續(xù)時(shí)間。對(duì)中和/抑制性的單克隆抗IL-17抗體，上述討論也適用。根據(jù)本發(fā)明，所述術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”涉及向患者(優(yōu)選人患者)給藥的組合 物。優(yōu)選地，所述藥物組合物包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的適合制劑。在優(yōu)選的具 體實(shí)施方式中，藥物組合物包含用于非腸道、透皮、內(nèi)腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、膜內(nèi)和/或鼻內(nèi) 給藥或直接注射入組織的組合物。尤其關(guān)注的是，所述藥物組合物通過(guò)輸注或注射向患 者給藥。合適的組合物的給藥方法可通過(guò)不同方式實(shí)施，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、局部或皮內(nèi)給藥。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。合 適的藥物載體的例子是本領(lǐng)域公知的，包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳劑(如油/水乳 劑)、各類(lèi)保濕劑、無(wú)菌溶液、脂質(zhì)體等。包含這些載體的組合物可通過(guò)傳統(tǒng)公知方法 配制。這些藥物組合物可以合適的劑量向患者給藥。劑量方案可由參與的醫(yī)生和臨床因 素來(lái)確定。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知的那樣，對(duì)于任一患者的劑量取決于許多因素，包括患 者的身材、體表面積、年齡、將要施予的特定化合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、綜合健 康情況、以及同時(shí)給藥的其它藥物。非腸道給藥的制劑包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、混 懸液、和乳劑。非水性溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、和可注射 的有機(jī)酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/含水溶液、乳劑或混懸液，包括鹽水和 緩沖介質(zhì)。非腸道載體包括氯化鈉溶液、葡萄糖林格氏液(Ringer’ s dextrose) >葡萄糖 和氯化鈉、乳酸林格氏液(lactated Ringer’ s)、或非揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營(yíng) 養(yǎng)物補(bǔ)充劑、電解液補(bǔ)充劑(如基于葡萄糖林格氏液的那些)等。也可含有防腐劑和其 它添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。另外，本發(fā)明的藥物 組合物可包含蛋白質(zhì)載體，像諸如，血清白蛋白或免疫球蛋白，優(yōu)選是人源的?？稍O(shè)想 的是，除了如本發(fā)明所述，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其它生物活性劑，這取決于藥 物組合物所需的用途。該試劑可以是作用于胃腸系統(tǒng)的藥物、起細(xì)胞抑制劑(cytostatica) 作用的藥物、防止高尿酸血癥(hyperurikemia)的藥物、抑制免疫反應(yīng)的藥物(如皮質(zhì)類(lèi) 固醇)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的藥物、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或諸如細(xì)胞因子的本領(lǐng)域已知 的試劑。本文中所定義的藥物組合物的生物學(xué)活性可以通過(guò)如W099/54440中的細(xì)胞 毒性分析來(lái)測(cè)定(如下述實(shí)施例中所述)，或通過(guò)如文獻(xiàn)Schlereth等(Cancer Immunol. Immunother.20 (2005), 1-12)的方法測(cè)定。此處所用“效能” (efficacy)或“體內(nèi)效能”
是指通過(guò)本發(fā)明藥物組合物治療后的反應(yīng)，使用如標(biāo)準(zhǔn)化NCI反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。使用本發(fā)明藥 物組合物治療達(dá)到成功或體內(nèi)效能是指所述藥物組合物達(dá)到其預(yù)期使用目的的效果，即 組合物起到預(yù)期作用的能力，即，病理細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的清除。體內(nèi)效能可以通過(guò)對(duì)各 種疾病實(shí)體建立標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中標(biāo)準(zhǔn)方法包括但不限于白細(xì)胞計(jì)數(shù)、差異、熒 光激活細(xì)胞分選、骨髓穿刺。另外，也可以使用各種疾病特異性臨床化學(xué)參數(shù)和其它已 建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。此外，也可以使用計(jì)算機(jī)斷層掃描、X射線、核磁共振成像(如用于 基于國(guó)家癌癥研究所標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)評(píng)估)、正電子發(fā)射斷層掃描、白細(xì)胞計(jì)、差異、熒光激 活細(xì)胞分選、骨髓穿刺、淋巴結(jié)活組織檢查/組織學(xué)以及各種淋巴特性臨床化學(xué)參數(shù)(如 乳酸脫氫酶)和其它已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。發(fā)展藥物(如本發(fā)明所述藥物組合物)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的可測(cè)調(diào)控。為此，建立了所述候選藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，即影響特定藥物治療給定病情的 能力的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的特征。影響藥物治療某種疾病實(shí)體的能力的藥物藥代動(dòng)力學(xué)參 數(shù)包括但不限于半衰期、分布容積、肝臟首過(guò)效應(yīng)和血清結(jié)合度。上述提到的任一參 數(shù)可影響給定藥物制劑的效能?！鞍胨テ凇敝傅氖峭ㄟ^(guò)生物學(xué)過(guò)程(如代謝、排泄等)清除50%所給藥物所需 的時(shí)間?！案闻K首過(guò)代謝”，指的是藥物首度接觸肝臟(即第一次經(jīng)過(guò)肝臟)而被代謝的 傾向?！胺植既莘e”是指藥物經(jīng)過(guò)整個(gè)機(jī)體各個(gè)部分(如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外空間、組織和 器官等)的滯留度，以及所述藥物在這些部分中的分布。“血清結(jié)合度”指的是藥物與血清蛋白質(zhì)(如白蛋白)互相作用并結(jié)合的傾向， 其中血清蛋白質(zhì)導(dǎo)致藥物生物活性的降低或損失。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)還包括生物利用度、滯后時(shí)間(T.^g)、Ti±、吸收速率、更多 發(fā)病和/或?qū)τ谒o藥物給定劑量的峰值濃度?！吧锢枚龋?，指藥物在血液腔室中的數(shù)量?！皽髸r(shí)間”指的是從施予藥物到該藥物在血液或血漿中的檢測(cè)和可測(cè)性之間 的時(shí)間耽擱?！癟i±”是指藥物到達(dá)最大血藥濃度所需的時(shí)間，“Ci±”指給定藥物獲得的 最大血藥濃度。所有參數(shù)均影響達(dá)到藥物發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)所要求的血液或組織濃度所 經(jīng)歷的時(shí)間。此處所用術(shù)語(yǔ)“毒性”是指表現(xiàn)為副作用或嚴(yán)重副作用的藥物毒性效應(yīng)。這些 副作用事件可以指給藥后大體上缺乏的對(duì)藥物的耐受性和/或給藥后缺乏的對(duì)藥物的局 部耐受性。毒性也包含藥物導(dǎo)致的致畸或致癌作用。此處所用術(shù)語(yǔ)“安全性”、“體內(nèi)安全性”或“耐受性”指的是在剛給藥之 后(局部耐受性)以及使用藥物較長(zhǎng)時(shí)間后，所述給藥沒(méi)有引發(fā)嚴(yán)重的副作用。“安全 性”、“體內(nèi)安全性”或“耐受性”可以通過(guò)在治療和隨訪階段定期評(píng)估。測(cè)量包含臨 床評(píng)估(如器官表現(xiàn))和實(shí)驗(yàn)室異常的篩查?？梢赃M(jìn)行臨床評(píng)估并比較與根據(jù)NCI-CTC 和/或MeDRA標(biāo)準(zhǔn)記錄或編碼的正常結(jié)果的偏離。器官表現(xiàn)可包括諸如過(guò)敏/免疫學(xué)、 血/骨髓穿刺、心律失常、凝血等等之類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)，如在Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE)中設(shè)定的?？梢詼y(cè)試的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)包括例如血液學(xué)研究、臨 床化學(xué)、凝血概況和尿液分析，以及其它體液(如血清、血漿、淋巴或脊髓液)、酒精之 類(lèi)的檢測(cè)。因此安全性可以通過(guò)如身體檢查、成像技術(shù)(如超聲波、X射線、CT掃描、 磁共振成像(MRI))、其它使用技術(shù)設(shè)備的測(cè)量(如心電圖)、生命體征、通過(guò)測(cè)量實(shí)驗(yàn) 室參數(shù)和記錄副作用來(lái)評(píng)估。此處所用術(shù)語(yǔ)“有效且無(wú)毒劑量”是指此處定義的雙特異 性單鏈抗體的耐受劑量，其高到足以引起清除病理細(xì)胞、消除腫瘤、腫瘤縮小或穩(wěn)定疾 病，而沒(méi)有或基本上沒(méi)有大的毒性作用。這種有效且無(wú)毒劑量可通過(guò)例如本領(lǐng)域所述的 劑量遞增研究來(lái)確定，并且其應(yīng)低于誘發(fā)嚴(yán)重副作用(劑量限制性毒性，DLT)的劑量。本申請(qǐng)包括一些附圖，描述如下


圖1 GM-CSF中和用mAb (單克隆抗體)22E9 (A)、IL-17中和用mAb1400.24.17(B)和TNFa拮抗劑依那西普(etanercept) (C)對(duì)慢性SCW炎癥中膝關(guān)節(jié)腫脹 的治療效果。關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)如方法部分中所述。通過(guò)在14、17、21和24天腹腔注射 300iig劑量治療。用攝入膝蓋的99mTc來(lái)測(cè)量炎癥，并以右(關(guān)節(jié)炎膝蓋)/左(PBS對(duì) 照膝蓋)(R/L)比率表示。比率> 1.10則認(rèn)為關(guān)節(jié)腫脹。組間使用曼_惠特尼U檢驗(yàn) (Mann-Whitney U-test) (*0.05 >p> 0.01 ； **0.01 >p> 0.001)進(jìn)行比較，每組 n = 7。圖 2 GM-CSF 中和用 mAb(22E9mAb)，IL-17 中和用 mAb (1400.24.17)和 TNFa拮抗劑依那西普對(duì)滑膜中炎性細(xì)胞的涌入(A)和軟骨破壞(B)的治療效果。誘導(dǎo) 和治療疾病方法參見(jiàn)方法部分。將小鼠在第28天處以安樂(lè)死，并制備其組織學(xué)切片并進(jìn) 行視覺(jué)評(píng)分。各組與對(duì)照組的對(duì)比使用曼_惠特尼U檢驗(yàn)，n = 7。圖3:來(lái)自患有慢性SCW關(guān)節(jié)炎小鼠的典型膝關(guān)節(jié)顯微照片，其中小鼠使用 GM-CSF 中和用 mAb(22E9) (A)、IL-17 中和用 mAb (1400.24.17) (B)、TNF a 拮抗劑依 那西普(C)和對(duì)照mAb (D)進(jìn)行治療。在初始誘導(dǎo)SCW關(guān)節(jié)炎后第28天，制作切片并 用番紅0/快綠染色。P =髕骨，F(xiàn) =股骨，C =軟骨。注意(A)和(B)中軟骨完整保 存，而(C)和(D)中軟骨蛋白聚糖缺失和侵蝕。原始放大倍數(shù)為200X。圖4 局部IL-1 0 (A)和KC(Gro a等價(jià)物)(B)的水平，其通過(guò)在初次誘導(dǎo) SCW關(guān)節(jié)炎后21天建立的髕骨1小時(shí)培養(yǎng)物的上清液中的Luminex珠測(cè)量。其處理如
圖1說(shuō)明所述。圖5 使用對(duì)照抗體和抗GM-CSF抗體來(lái)治療野生型(WT)和IL-17R缺陷型小 鼠的慢性SCW誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。㈧野生型(WT)和IL-17R-/-小鼠的關(guān)節(jié)腫脹。如前 所示，在WT小鼠中對(duì)照抗體治療和抗GM-CSF抗體治療的小鼠的關(guān)節(jié)腫脹在第22、23 和28天有非常明顯的差別。(B)第28天的關(guān)節(jié)炎癥和軟骨蛋白聚糖(PG)破壞。(C)用 對(duì)照抗體治療的WT小鼠的髕骨和股骨的軟骨層的軟骨破壞(侵蝕和軟骨細(xì)胞死亡)(D) 對(duì)IL-17R-/-小鼠施予抗GM-CSF抗體后軟骨損失減輕。(E)用對(duì)照抗體治療的小鼠的 髕骨和股骨的軟骨層有軟骨PG缺失。(F)對(duì)IL-17R-/-小鼠施予抗GM-CSF抗體后有 軟骨PG缺失。細(xì)節(jié)見(jiàn)圖3。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示，每組至少6只小鼠。重復(fù)實(shí)驗(yàn) 一次并獲得類(lèi)似結(jié)果。與使用對(duì)照抗體治療的WT對(duì)照小鼠對(duì)比，*P<0.01，與使用抗 GM-CSF抗體治療的IL-17R-/-小鼠對(duì)比，< 0.01，使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)。圖6:治療10天后，膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的宏觀評(píng)分。關(guān)節(jié)炎第一個(gè)癥狀出現(xiàn) (對(duì)應(yīng)圖6中的第1天)時(shí)，靜脈注射治療小鼠(也為圖6中的第1天)使用⑴單次給予 抗IL17單克隆抗體只有mAb4211.5mg/kg，(ii)只給予抗GM-CSF單克隆抗體22E9 3mg/kg，或(iii)聯(lián)合給予 mAb421 1.5mg/kg 和 22E9 3mg/kg。將使用 mAb421 阻斷 IL-17 與使用22E9中和GM-CSF相結(jié)合，極大的降低了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床評(píng)分，而單獨(dú) 使用mAb421或22E9均不能明顯減輕疾病嚴(yán)重程度。腹腔注射地塞米松(2mg/kg，陽(yáng)性 對(duì)照)2-3天后，小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀消失。IgG2A抗體(同型對(duì)照)作為陰性對(duì)照。結(jié)果 為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM) (n = 9-10只小鼠/組)。與IgG2A同型陰性對(duì)照治療的小鼠 對(duì)比，*P < 0.05，*叩< 0.01，通過(guò)單因素方差分析(one-wayANOVA)和Dunnett的多 重比較試驗(yàn)確定。圖 7 單次施予 22E9 3mg/kg (A)、mAb421 1.5mg/kg(B)、22E93mg/kg 和 mAb 421 1.5mg/kg的組合(C)、或同型對(duì)照(D) 10天后的典型的關(guān)節(jié)切片。關(guān)節(jié)在4%福爾馬林中固定、脫鈣、切片并用蘇木素/伊紅染色。施予大鼠IgG2a(圖7D)的同型對(duì)照 小鼠表現(xiàn)出被標(biāo)記的關(guān)節(jié)炎癥伴有滑膜中大量細(xì)胞浸潤(rùn)(*)，以及被標(biāo)記的關(guān)節(jié)破壞伴有 軟骨和骨組織侵蝕(丨)。雖然嚴(yán)重程度有輕微減輕，但施予3mg/kg 22E9(圖7A)或 1.5mg/kg mAb 421 (圖7B)的小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥和關(guān)節(jié)破壞；而單次施予3mg/kg 22E9和1.5mg/kgmAb421的聯(lián)合治療，則表現(xiàn)出非常顯著減輕的炎癥(*)(圖7C)，并且 良好地保存了帶有接近正常軟骨表面的關(guān)節(jié)完整性(丨)(圖7C)。下面的詳細(xì)試驗(yàn)將使本領(lǐng)域技術(shù)人員能徹底理解本發(fā)明的要旨。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57B1/6 小鼠購(gòu)自 Charles River 公司(位于 Sulzfeld，Germany)。IL-17R 缺陷小鼠由Amgen公司(位于Seattle，WA, USA)的J.Peschon友好提供。上述小鼠養(yǎng)
在頂部具有過(guò)濾器的籠子里，水和食物無(wú)限制提供。使用的小鼠約為10-12周大小。所 有動(dòng)物處理均經(jīng)過(guò)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。制備SCW和誘導(dǎo)SCW關(guān)節(jié)炎在托-休二氏培養(yǎng)基(Todd-Hewitt broth)中過(guò)夜培養(yǎng)化膿鏈球菌 T12 (Streptococcus pyogenes T12)。使用文獻(xiàn) van den Broek et al., Am J Pathol 133 (1),
139-149(1988)中描述的方法制備細(xì)胞壁。各實(shí)驗(yàn)都使用10000 Xg離心后的上清。該制 備物包含11%胞壁酸。將含有25ygSCW(鼠李糖成分)的6μ1磷酸鹽緩沖液(PBS)， 經(jīng)關(guān)節(jié)(La.)注射到幼鼠的右膝關(guān)節(jié)以誘導(dǎo)單側(cè)關(guān)節(jié)炎(如文獻(xiàn)Joosten etal.，AnnRheum Dis 59(3)，196-205(2000)中所述)。為了產(chǎn)生慢性鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié) 炎，分別在第0、7、14和21天進(jìn)行右側(cè)關(guān)節(jié)注射。重復(fù)的注射會(huì)引發(fā)慢性關(guān)節(jié)炎。對(duì) 照組中，左膝關(guān)節(jié)注射PBS。試劑和治療方法使用大鼠mAb22E9(MM500CS，Perbio Science 公司(位于Bonn，Germany))中 和 GM-CSF。使用依那西普(Enbrel ； Wyeth Pharma 公司(位于 Miinster，Germany)) 阻斷TNFci。一些研究已經(jīng)報(bào)導(dǎo)在不同小鼠模型(包括CIA)中人類(lèi)可溶性TNF受體Fc 融合蛋白的有效性。使用大鼠IgG2a同型對(duì)照品(BLD-400516-bulk，Biozol Diagnostica 公司(位于 Eching, Germany))禾口Humira (Abbott, Wiesbaden—Delkenheim 公司(位于 Germany))作為同型對(duì)照。使用大鼠抗鼠 IL-Ιβ mAbl400.24.17 (MM425, Perbio Science 公司(位于Bonn，Germany))中和IL_1 β。所有治療通過(guò)腹腔(i.p.)注射300 μ g的劑 量給藥，并且給予4次i)在第三次反應(yīng)(第14天)前2小時(shí)，ii)在第17天，iii)在 第四次反應(yīng)(第21天)前2小時(shí)和iv)最初疾病誘導(dǎo)后第24天。關(guān)節(jié)腫脹的測(cè)量SCW 關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)腫脹使用文獻(xiàn) Kraijsen et al.，Agents Actionsl 1 (6-7)， 640-2(1981)中所述99mTc攝取方法定量測(cè)定。該驗(yàn)證方法通過(guò)用外部gamma射線計(jì)算由 于局部血流增加和組織腫脹導(dǎo)致的炎癥位點(diǎn)處的放射性同位素的累積。腫脹嚴(yán)重性由右 膝關(guān)節(jié)(炎性組)和左膝關(guān)節(jié)(對(duì)照組)的99mTc攝取的比值來(lái)表示。所有超過(guò)1.10的 值即被認(rèn)為是關(guān)節(jié)腫脹。細(xì)胞因子和趨化因子測(cè)定一些細(xì)胞因子和趨化因子(包括IL-Ιβ、IL-6、TNF α、RANTES > KC和MIP-I α )的表達(dá)水平是在髕骨沖洗物中測(cè)定的。將髕骨及周?chē)航M織從炎性膝關(guān)節(jié)中 分離，并在室溫條件下在含有0.1% BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，如之前文獻(xiàn) Joostenetal., J Immunoll65 (11)，6553-8 (2000)所述。然后，將獲得的上清以 IOOOXg 的速率離心5分鐘。使用Luminex多分析物技術(shù)來(lái)確定細(xì)胞因子和趨化因子的水平。我 們使用的是BioRad公司(位于Munich，Germany)的BioPlex系統(tǒng)并結(jié)合多重細(xì)胞因子和 趨化因子試劑盒。組織學(xué)分析第28天，使用頸椎脫臼法處死小鼠。取出整個(gè)膝關(guān)節(jié)并固定在4%的福爾馬林 中放置7天，然后在5%的蟻酸中脫鈣，石蠟包埋處理。組織切片(7 μ m)用蘇木素/伊 紅(H/E)或番紅O/快綠(SO)染色。在髕骨/股骨區(qū)域中相隔140 μ m的5個(gè)半連續(xù)區(qū) 域上對(duì)膝關(guān)節(jié)中組織病理學(xué)的改變進(jìn)行評(píng)分。通過(guò)兩個(gè)不同的觀察者使用以下參數(shù)對(duì)連 續(xù)編碼的玻片進(jìn)行評(píng)分。在H/E染色玻片中，浸潤(rùn)滑液襯里的細(xì)胞數(shù)量評(píng)分為0-3。在 SO染色玻片中，軟骨破壞評(píng)分范圍為0-3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組間差異使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)和GraphPad Prism 4軟件進(jìn)行檢測(cè)。顯著 性讀數(shù)分組如下* = 0.05 > ρ > 0.01 ； ** = 0.01 > ρ > 0.001 ；并且 *** = ρ < 0.001.下述實(shí)施例將同樣使技術(shù)人員能徹底的理解本發(fā)明的要旨。實(shí)施例1 系統(tǒng)性對(duì)GM-CSF的中和作用減輕慢性SCW模型中的關(guān)節(jié)腫脹在C57B1/6小鼠SCW關(guān)節(jié)炎的慢性期，對(duì)給予生物中和劑GM_CSF (mAb 22E9)、TNFa (依那西普)或IL_1 β (mAb 1400.24.17)治療關(guān)節(jié)腫脹的效果，通過(guò)在第 15、16、22、23和28天攝入膝關(guān)節(jié)的99mTc的差異攝取進(jìn)行研究。結(jié)果用注射關(guān)節(jié)炎 SCW的膝關(guān)節(jié)和注射PBS對(duì)照組的膝關(guān)節(jié)的99mTc攝取比值表達(dá)。系統(tǒng)施予GM-SCF中和抗體在第16、22、23和28天高效并顯著地減輕了關(guān)節(jié) 腫脹，其相應(yīng)ρ值分別為0.018、0.004、0.004和0.002 (
圖1A)。IL-β中和劑也可以減 輕關(guān)節(jié)腫脹，盡管只在第22天(ρ = 0.011)和第23天(ρ = 0.001)觀測(cè)到與對(duì)照組相比 膝關(guān)節(jié)的99mTc攝取比值的顯著減少(
圖1Β)。與預(yù)期相同，依那西普阻斷TNFa，可以 中和人和鼠TNFa，在慢性SCW模型中對(duì)關(guān)節(jié)腫脹沒(méi)有效果(
圖1C)。相反，依那西普 之前顯示對(duì)該疾病模型的急性期是有活性的。因此，慢性SCW關(guān)節(jié)炎中，對(duì)GM-CSF 的中和作用看來(lái)比對(duì)IL-I β的中和作用更有效，其效果一直持續(xù)到第28天，即最后一次 施予抗體后第4天。第二個(gè)獨(dú)立研究證實(shí)了對(duì)GM-CSF的中和作用對(duì)慢性SCW模型中 減輕關(guān)節(jié)腫脹的效能。實(shí)施例2 對(duì)GM-CSF的中和作用減輕炎性細(xì)胞涌入滑膜和軟骨破壞在第28天終止實(shí)驗(yàn)后，制備不同組小鼠關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)切片。炎性細(xì)胞涌入 滑膜的程度和軟骨組織損傷評(píng)價(jià)分別通過(guò)兩個(gè)觀察者對(duì)匿名的Η/Ε和SO染色的組織切片 來(lái)獨(dú)立評(píng)分。所有三種治療，用mAb 22E9中和GM-CSF，用mAbl400.24.17中和IL-1 β和
用依那西普阻斷TNF α，在顯著減輕炎性細(xì)胞涌入滑膜方面都是有效的(圖2A)。盡管阻斷TNF α有顯著性效果，但看來(lái)弱于GM-CSF或IL-I β的中和作用，與對(duì)照相比ρ值 分別為0.042、0.004、和0.001。此外，盡管在依那西普治療的小鼠中，炎性細(xì)胞涌入膝 關(guān)節(jié)有所減輕，其軟骨組織并沒(méi)有完整保存(圖2Β)。與之相反，對(duì)GM-CSF的中和作 用顯著地保護(hù)軟骨組織免受損傷(ρ = 0.02 ； mAb22E9對(duì)比同型對(duì)照mAb)(圖2B)。如 前所述，IL-I β中和作用可以有效保護(hù)軟骨組織免受損傷(ρ = 0.004，抗IL-I β對(duì)比對(duì) 照組；圖2Β)。不同治療對(duì)軟骨組織完整性的影響如圖3所示，其中顯示了三種治療中，每組 選擇一個(gè)典型的小鼠的關(guān)節(jié)進(jìn)行番紅O/快綠染色后的顯微照片。在mAb 22E9治療的小 鼠中觀測(cè)到健康的軟骨著色和完好保存的組織(圖3A)，這體現(xiàn)了對(duì)GM-CSF的中和作 用對(duì)保護(hù)軟骨完整性的效果。與之相反，在接受同型對(duì)照抗體的小鼠中(圖3D)，其軟 骨表現(xiàn)出破壞性侵蝕和蛋白聚糖(關(guān)節(jié)軟骨一個(gè)主要的成分)損失所致的染色強(qiáng)度降低。 相似地，在依那西普治療小鼠中看到蛋白聚糖的損失和軟骨損失增加(圖3C)。這與之 前在關(guān)節(jié)炎的慢性SCW模型中顯示TNF α無(wú)關(guān)性的研究是一致的。因此，在本研究中 通過(guò)抗體中和IL-I β對(duì)軟骨有著顯著性的保護(hù)作用(圖3Β)。實(shí)施例3 對(duì)GM-CSF的中和作用降低膝關(guān)節(jié)中IL-I β和KC的產(chǎn)生為了更好的理解GM-CSF的保護(hù)性作用，和它與IL-I β的相互關(guān)系，我們研究 了膝關(guān)節(jié)洗脫液中各種細(xì)胞因子和趨化因子的濃度。因?yàn)樵谥暗膶?shí)驗(yàn)中重復(fù)發(fā)現(xiàn)未受 影響的對(duì)照組膝蓋(左)中的水平低于檢測(cè)限，我們只對(duì)關(guān)節(jié)炎膝蓋(右)進(jìn)行了分析。與在接受同型對(duì)照抗體治療的小鼠膝關(guān)節(jié)中檢測(cè)的水平相比，使用mAb 22E9中 和GM-CSF可顯著的減少局部的IL-I β (ρ = 0.042 ； 22Ε9-治療對(duì)比對(duì)照組)(圖4)。 而使用依那西普阻斷TNF α則對(duì)關(guān)節(jié)中IL-I β的水平?jīng)]有影響(圖4)。并且如我們所 預(yù)料的，在接受mAb中和IL-I β的小鼠中，IL-I β的水平接近基線。所有三種治療都 導(dǎo)致了關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)中趨化因子KC (鼠GRO-α)的表達(dá)顯著性降低(22Ε9對(duì)比對(duì)照組ρ =0.0047 ；依那西普對(duì)比對(duì)照組ρ = 0.0007 ；抗IL-1 β抗體對(duì)比對(duì)照組ρ = 0.007)。所 研究的任何治療都沒(méi)有影響IL-6和RANTES的局部水平(數(shù)據(jù)未顯示)。IL_2、TNF α 和GM-CSF的水平低于分析檢測(cè)限，即小于10pg/ml。實(shí)施例4 IL-17信號(hào)缺乏時(shí)，對(duì)GM-CSF的中和作用可以增強(qiáng)對(duì)軟骨破壞的保護(hù)作用中和GM-CSF能減輕關(guān)節(jié)腫脹并保護(hù)軟骨免受損傷，其效能與中和IL-I β所觀 察到的相似。其后，我們使用抗GM-CSF mAb在IL-17R缺陷小鼠的慢性SCW關(guān)節(jié)炎 中進(jìn)行了相似的研究。IL-17R缺陷在慢性SCW關(guān)節(jié)炎中導(dǎo)致潛伏性關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破 壞(圖5A)。關(guān)節(jié)炎模型中，GM-CSF和IL-17信號(hào)作為聯(lián)合靶標(biāo)可以導(dǎo)致對(duì)關(guān)節(jié)腫脹 的強(qiáng)的增大的抑制(圖5A)。盡管抗GM-CSF治療和IL-17R缺陷都導(dǎo)致細(xì)胞涌入減少， 聯(lián)合靶標(biāo)不能使關(guān)節(jié)炎癥有顯著減輕(圖5B)。然而有趣的是，在使用抗GM-CSF治療 的IL-17R缺陷小鼠中，蛋白聚糖的消耗和軟骨組織損傷(軟骨細(xì)胞死亡和侵蝕)顯著地 減輕了(圖5B-E)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了抗GM-CSF對(duì)軟骨組織的保護(hù)作用可以通過(guò)T 細(xì)胞細(xì)胞因子IL-17的額外靶向而增強(qiáng)。實(shí)施例5
慢性復(fù)發(fā)性SCW的關(guān)節(jié)炎小鼠模型的特征為如人類(lèi)慢性RA晚期時(shí)典型的嚴(yán)重 關(guān)節(jié)破壞。與在CIA小鼠模型和急性SCW關(guān)節(jié)炎模型中觀察到的相反，當(dāng)IL-I β開(kāi)始 作為主要致病因素(72)時(shí)，TNFa中和作用在控制慢性SCW關(guān)節(jié)炎中不再有效。我們 的研究證實(shí)了在慢性SCW關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞中TNF α的無(wú)關(guān)性和IL-I β的關(guān)鍵作用。第一次在該特殊模型中研究了 GM-CSF阻斷，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)在疾病慢性階段腹腔注 射300μ g抗體時(shí)，其在SCW注射的膝蓋中對(duì)關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破壞中的深遠(yuǎn)的抑制作用。 這說(shuō)明，在小鼠中施予一定劑量的抗GM-CSF抗體(該劑量相當(dāng)于在人體中約lmg/kg的 抗體劑量(在異速生長(zhǎng)改正之后))，足以糾正關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)中GM-CSF的水平。慢性 關(guān)節(jié)炎模型中對(duì)GM-CSF的中和作用的治療效能是有著非常重大的意義的?？笹M-CSF 比抗IL-I β能更有效的控制關(guān)節(jié)腫脹，而TNF α阻斷是無(wú)效的。由于TNF α的中和作 用對(duì)炎性細(xì)胞的涌入和KC趨化因子的水平有一定影響，因此異常的TNF α的產(chǎn)生也許 仍然在慢性SCW關(guān)節(jié)炎中有一定效果。然而，對(duì)比于其它關(guān)節(jié)炎小鼠模型，與該疾病 的急性階段相反，TNFci控制該慢性疾病的作用減小。在軟骨保護(hù)中，抗GM-CSF和抗 IL-I β治療都非常有效。GM-CSF和IL-I作用之間的互相依賴(lài)性已在其它關(guān)節(jié)炎模型中 被報(bào)導(dǎo)。在這個(gè)IL-I誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎并在其后注射mBSA的模型中，GM-CSF表現(xiàn)出占優(yōu) 勢(shì)的致病作用。GM-CSF KO小鼠中的GM-CSF缺乏，或在野生型動(dòng)物中的對(duì)GM-CSF 的中和作用，都可以顯著地減輕關(guān)節(jié)炎。然而，在慢性SCW關(guān)節(jié)炎中，GM-CSF看起 來(lái)處于IL-I β的上游，因?yàn)閷?duì)GM-CSF的中和在關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中減少I(mǎi)L-I β水平。通過(guò) 活化的巨噬細(xì)胞和其它GM-CSF刺激的免疫細(xì)胞來(lái)降低IL-I β的產(chǎn)生，也可能解釋為什 么抗GM-CSF的治療在我們的模型中對(duì)軟骨有保護(hù)作用。在急性SCW的模型中，我們 也發(fā)現(xiàn)，抗GM-CSF的抗體能抑制IL-I β水平，而TNF α阻斷劑依那西普則不能。在 RA的CIA小鼠模型中，GM-CSF的阻斷可以顯著減少I(mǎi)L-I β和TNF α的表達(dá)。雖然通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B及其它的活化使得前炎性細(xì)胞因子(如TNFa和 IL-I β)在不同免疫細(xì)胞中急性誘導(dǎo)GM-CSF的表達(dá)，但細(xì)胞因子的層次在炎癥后期似乎 翻轉(zhuǎn)，其中GM-CSF接管控制TNF α和IL-I β的產(chǎn)生，也許還接管控制其它細(xì)胞因子和 趨化因子。在抑制關(guān)節(jié)炎組織中TNF α和IL-I β的同時(shí)，對(duì)GM-CSF的阻斷也有可能 降低依賴(lài)于GM-CSF的免疫細(xì)胞(如粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的活性和存活率。 可以想到GM-CSF不僅直接誘導(dǎo)IL-I β禾PTNFa表達(dá)，而且可以導(dǎo)致協(xié)同的抗凋亡作用 和對(duì)先天免疫系統(tǒng)中多重細(xì)胞的持續(xù)性激活作用，因而間接地增加IL-I β和TNF α的產(chǎn) 生。對(duì)細(xì)胞周期和存活的影響已經(jīng)在mBSA關(guān)節(jié)炎模型中展示，其中體內(nèi)對(duì)GM-CSF的 中和作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中整體細(xì)胞性和周期細(xì)胞數(shù)的顯著減少。實(shí)施例6 除了在野生型動(dòng)物的慢性SCW關(guān)節(jié)炎過(guò)程中阻斷GM-CSF，我們還在IL-17R 缺陷小鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。IL-17由Thl7細(xì)胞產(chǎn)生，其中Thl7細(xì)胞能同時(shí)產(chǎn)生TNF α和 GM-CSF。在TNFa存在時(shí)，IL-17可以誘使滑膜細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF，暗示IL-17在 GM-CSF上游起作用。另外，用LPS刺激經(jīng)GM-CSF治療的骨髓細(xì)胞，可以產(chǎn)生IL-23， 其為可產(chǎn)生IL-17的Thl7細(xì)胞的重要存活因子。在本發(fā)明之前，尚未研究體內(nèi)外中對(duì) IL-17和GM-CSF的聯(lián)合阻斷。本發(fā)明人的本研究首先顯示出，相對(duì)于阻斷單獨(dú)通路， 同時(shí)阻斷IL-17和GM-CSF信號(hào)通路能更好地抑制關(guān)節(jié)腫脹和增加對(duì)軟骨破壞的保護(hù)。這種對(duì)軟骨的強(qiáng)作用也許可以通過(guò)在IL-17和(GM-CSF誘導(dǎo)的HL-Ιβ之間的協(xié)同作用 來(lái)解釋?zhuān)驗(yàn)檫@兩種細(xì)胞因子之前表現(xiàn)出對(duì)通過(guò)RA病人的滑膜產(chǎn)生細(xì)胞因子的過(guò)程和在 骨關(guān)節(jié)炎軟骨中產(chǎn)生PGE2和NO的過(guò)程具有協(xié)同作用。本發(fā)明的研究和之前的研究都強(qiáng) 烈支持這一觀點(diǎn)，即對(duì)GM-CSF的中和作用可能在人類(lèi)RA患者中和在對(duì)TNF α阻斷不 再有反應(yīng)或從一開(kāi)始就沒(méi)有反應(yīng)的患者中具有治療潛力。另外，本發(fā)明展示抗GM-CSF 和抗IL-17的聯(lián)合治療在RA和其它自身免疫和炎性疾病中均有非常深遠(yuǎn)的治療效果。實(shí)施例7 膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是一種被廣泛接受的基于對(duì)抗軟骨膠原II型(CII)的T 細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性的關(guān)節(jié)炎小鼠模型。所述模型與人RA有一些共同的 臨床、組織病理學(xué)和免疫性特征，其主要特征為滑膜炎癥，伴隨有嚴(yán)重的軟骨和骨組織 侵蝕。此處所述本研究的目標(biāo)是在CIA小鼠模型系統(tǒng)中評(píng)估聯(lián)合施予GM-CSF中和化 合物和IL-17中和化合物的治療效能。特別地，在CIA發(fā)作后，研究對(duì)小鼠施予(i)單 獨(dú)的抗IL-17單克隆抗體CmAb 421)、(ii)單獨(dú)的抗GM-CSF單克隆抗體(mAb 22E9)、 和(iii)聯(lián)合的兩種抗體的治療效果，并與陰性對(duì)照(IgG2A)和陽(yáng)性對(duì)照(地塞米松)比 較。抗 IL-17 抗體 mAb421 購(gòu)自 R&D Systems 公司，mAb 22E9 購(gòu)自 Perbio Science 公 司。大鼠IgG2a同型對(duì)照抗體來(lái)自Biolegend公司。所有抗體在_80°C儲(chǔ)存。地塞米松 來(lái)自Centrafarm公司，并于室溫儲(chǔ)存。所有化合物用無(wú)菌PBS稀釋給藥。對(duì)上述化合物對(duì)CIA小鼠的治療效果設(shè)計(jì)了 7周的研究。第O天，在將雄性 DBA/1J小鼠用異氟烷麻醉后，在其尾巴根部注射IOOyg的牛CII使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)。第 21天，將上述小鼠腹腔內(nèi)加壓注射IOOyg溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的CII，之后幾天 內(nèi)，關(guān)節(jié)炎就會(huì)產(chǎn)生。將處于0.05M乙酸中的濃度為2mg/ml的牛II型膠原(CII)用相 同體積的弗氏完全佐劑(2mg/ml的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)株H37Ra) 進(jìn)行乳化。出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的初步癥狀(得分大于等于0.25)時(shí)，將小鼠順序分配到如下所列 出的不同的實(shí)驗(yàn)組，并進(jìn)行另外10天的觀察研究。當(dāng)指頭和爪子其它部分有明顯的紅色和/或腫脹改變時(shí)，小鼠即被認(rèn)為是患有 關(guān)節(jié)炎。每個(gè)爪子的關(guān)節(jié)炎癥通過(guò)視覺(jué)評(píng)分，如文獻(xiàn)R.Smeets等，Arthritis Rheum 2003 所述，每個(gè)爪子評(píng)分范圍為0-2，每個(gè)動(dòng)物最高評(píng)分為8 (4個(gè)有關(guān)節(jié)炎癥狀的爪子，每個(gè) 最高評(píng)分為2): O為沒(méi)有炎癥，1為輕度炎癥，1.5為顯著炎癥，2為嚴(yán)重炎癥。從第21 天到第45天，由對(duì)實(shí)驗(yàn)組別不知情的獨(dú)立的觀察者每周進(jìn)行三次評(píng)分。關(guān)節(jié)炎癥狀產(chǎn)生時(shí)，使用單獨(dú)劑量的抗體進(jìn)行給藥。每周三次(周一、周三和 周五)進(jìn)行劑量為2mg/kg的地塞米松腹腔注射。到第35天仍沒(méi)有表現(xiàn)出任何關(guān)節(jié)炎癥 狀的小鼠被認(rèn)為是無(wú)反應(yīng)者，并從進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析中去除。根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究中藥物劑量設(shè)定為1.5mg/kgmAb421。對(duì)于抗 GM-CSF抗體22E9，劑量設(shè)定為3mg/kg。本研究使用這些劑量來(lái)評(píng)估在膠原誘導(dǎo)的關(guān) 節(jié)炎期間對(duì)IL-17和GM-CSF的聯(lián)合阻斷的效果。地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照，大鼠IgG2a 抗體作為陰性對(duì)照。此外，本研究包括以下實(shí)驗(yàn)組采用抗IL_17(mAb421)治療、采用 抗GM-CSF (22E9)治療、以及采用它們聯(lián)合給藥治療，其中均使用上述劑量給藥。實(shí)驗(yàn)組mAb421 1.5mg/kg+ 大鼠 IgG2a 3mg/kg (共 4.5mg/kg)
22E9 3mg/kg+ 大鼠 IgG2a 1.5mg/kg
mAb421 1.5mg/kg+22E9 3mg/kg大鼠IgG2a l5mg/kg地塞米松2mg/kg如圖6所示，使用mAb421中和IL-17與使用22E9中和GM-CSF的聯(lián)合，極為 顯著地減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床評(píng)分。與之相反，單獨(dú)采用mAb421或22E9的治療 沒(méi)有顯著降低疾病的嚴(yán)重性。腹腔注射地塞米松(2mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照)2到3天后，關(guān)節(jié) 炎癥狀消失。IgG2A抗體治療的小鼠(陰性對(duì)照)表現(xiàn)出明顯的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性的進(jìn)展。組織病理學(xué)分析前爪和后爪(左和右，4例樣品/每只小鼠)。將爪子放在4% 福爾馬林溶液中固定。在用EDTA或標(biāo)準(zhǔn)脫鈣溶液脫鈣3天后，將爪子包被在石蠟中 (paraplast )，用h&E染色，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)估。組織病理學(xué)評(píng)估只限于爪子的指 關(guān)節(jié)(跗骨/腕骨和手指)。組織病理學(xué)評(píng)估顯示，較低的四肢關(guān)節(jié)(腕/跗，手指)有亞急性到慢性的關(guān)節(jié) 炎。關(guān)節(jié)炎的特點(diǎn)是滑膜變厚(滑膜增生)、關(guān)節(jié)內(nèi)滲出物和主要在關(guān)節(jié)囊中的顯著的混 合細(xì)胞浸潤(rùn)。在所述情況中，炎癥細(xì)胞反應(yīng)也出現(xiàn)在結(jié)締組織和肌腱。此外，在更多的 慢性情況中，對(duì)由纖維組織和占大部分的單核細(xì)胞組成的典型肉芽組織進(jìn)行了觀察。對(duì) 指關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕變化也進(jìn)行了觀察。在大多數(shù)情況下，超過(guò)一個(gè)關(guān)節(jié)受到了影響(多 關(guān)節(jié)炎)。圖7所示為單獨(dú)施予22E93mg/kg(A)、單獨(dú)施予mAb421 1.5mg/kg(B)、聯(lián) 合施予22E9 3mg/kg和mAb 421 1.5mg/kg (C)、或施予同型對(duì)照15mg/kg (D) 10天后典型 的關(guān)節(jié)切片圖。將關(guān)節(jié)固定于4%福爾馬林，脫鈣，切片并用蘇木/曙紅染色。接受同 型對(duì)照治療的小鼠(圖7D)顯示出在滑膜中有顯著的關(guān)節(jié)炎癥并伴隨有大量細(xì)胞浸潤(rùn)， 以及軟骨關(guān)節(jié)破壞和骨侵蝕。雖然嚴(yán)重程度稍輕，接受3mg/kg 22E9 (圖7A)或1.5mg/ kg mAb 421 (圖7B)的小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥和關(guān)節(jié)破壞，而接受單次施予22E9 3mg/ kg和mAb421 1.5mg/kg聯(lián)合治療的小鼠顯示出顯著減輕的炎癥，關(guān)節(jié)的完整性也得到了 較好的保存，并伴隨有其表面接近正常的軟骨表面(圖7C)。因此，患有關(guān)節(jié)炎的大部 分病例是出現(xiàn)在陰性對(duì)照組(大鼠IgG2a)的。經(jīng)過(guò)2到3天地塞米松(陽(yáng)性對(duì)照)給藥 后，沒(méi)有檢測(cè)到關(guān)節(jié)炎。比較陰性對(duì)照與在CIA小鼠中單獨(dú)給予mAb421或mAb22E9、 或聯(lián)合給藥，關(guān)于關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和嚴(yán)重程度的最好的結(jié)果出現(xiàn)在mAb421與mAb22E9的 聯(lián)合給藥組。結(jié)論本發(fā)明中發(fā)明人探索了對(duì)GM-CSF的中和作用在兩種不同關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型系統(tǒng) 中的治療效能，即ω不依賴(lài)于TNF α的慢性SCW關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型和(ii)依賴(lài)于TNF α 的CIA模型。另外，他們研究了通過(guò)抑制GM-CSF和IL-17通路途徑來(lái)阻斷先天性免疫 和獲得性免疫的效果。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)在基因缺乏IL-17受體的小鼠(IL-17R-KO小鼠)中 中和GM-CSF實(shí)現(xiàn)，或是使用中和GM-CSF和IL-17的單克隆抗體聯(lián)合治療實(shí)現(xiàn)。發(fā)明 人意外發(fā)現(xiàn)，通過(guò)聯(lián)合阻斷GM-CSF和IL-17通路途徑，兩種類(lèi)型的炎性疾病均可以一 種高效的方式治療。在CIA模型中，抑制GM-CSF的化合物和抑制IL-17的化合物的聯(lián) 合給藥可以顯著地降低膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的臨床評(píng)分，而單獨(dú)給予抑制GM-CSF的化合物 或抑制IL-17的化合物則不能顯著減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。另外，詳細(xì)的組織病理學(xué)分析顯示了聯(lián)合治療對(duì)關(guān)節(jié)炎癥以及對(duì)軟骨和骨的破壞產(chǎn)生的有益效果。因此，聯(lián)合阻斷兩 條通路可以高效保護(hù)機(jī)體免于炎癥和關(guān)節(jié)破壞。直到最近，人們?nèi)匀患俣℅M-CSF處在 IL-17 的下游(參見(jiàn)文獻(xiàn) Kawaguchi M.等，J.Allergy Clin.Immunol.114 (2004)，444-450 ； Starnes T.et al.， The Journal of Immunology 169 (2002)，642-646 ； Laan M.et al.， Eur. Respir.J.21 (2003), 387-393)，因而這些結(jié)果非常令人驚訝。因此，人們并不能預(yù)料到對(duì) 兩條通路的聯(lián)合阻斷會(huì)有額外的或協(xié)同的效應(yīng)。本發(fā)明申請(qǐng)首先證實(shí)了體內(nèi)對(duì)IL-17和 GM-CSF的聯(lián)合阻斷的有益效果。相對(duì)于阻斷單獨(dú)通路，對(duì)IL-17和GM-CSF通路的同 時(shí)阻斷，能更好地抑制關(guān)節(jié)腫脹和增加對(duì)軟骨破壞的保護(hù)。本文所示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提出這樣 一個(gè)強(qiáng)有力的觀點(diǎn)，聯(lián)合抗GM-CSF和抗IL-17的治療，不止對(duì)RA有非常深遠(yuǎn)的治療效 果，并且對(duì)其它如上定義的自身免疫和炎癥疾病也有非常深遠(yuǎn)的治療效果。
權(quán)利要求
1.一種在患有炎性疾病的個(gè)體中治療炎性疾病的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體施予(a)一種中和GM-CSF的化合物；以及(b)一種中和IL-17的化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中(1)在施予所述中和IL-17的化合物之前施予所述中和GM-CSF的化合物；(2)在施予所述中和IL-17的化合物之后施予所述中和GM-CSF的化合物；或(3)同時(shí)施予所述中和GM-CSF的化合物和所述特異性結(jié)合并且中和IL-17的化合物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體為人或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述中和GM-CSF的化合物選自由多肽、模擬 肽、核酸或小分子組成的組。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多肽是結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗體 或其功能片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合至GM-CSF的表位， 優(yōu)選至GM-CSF的不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨 基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包括(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或 (C)氨基酸第21-22位(EA)。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重鏈可變區(qū) 包含CDR3，其中該CDR3包含這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列選自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列組成的組。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中任意一個(gè)所述的重鏈可變區(qū)CDR3序列與SEQID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ IDNO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列一 起存在于重鏈可變區(qū)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， 該CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，并且該CDR3包含SEQ ID NO 18所示 氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重鏈可變 區(qū)包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變區(qū)包 含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列，該 CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，該CDR3具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中該CDRl區(qū) 包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，該CDR2區(qū)具有如SEQ ID NO 15所示的氨 基酸序列，該CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含如SEQID NO: 34中所示的輕鏈氨基酸序列，并且包含選自如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重鏈氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含與如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述中和IL-17的化合物選自由多肽、模擬肽、 核酸或小分子組成的組。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述多肽為結(jié)合IL-17或IL-17受體的抗體或其 功能片段。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述抗體和其功能片段分別是人類(lèi)單克隆抗體和 其功能片段。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病選自由類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包 括對(duì)用TNF-Ci中和劑治療有抗藥性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化癥(MS)、慢性阻礙性 肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、炎性腸道疾病 (IBD)、克羅恩氏病、葡萄膜炎、黃斑變性、結(jié)腸炎、銀屑病、沃勒變性、抗磷脂抗體綜 合征(APS)、急性冠脈綜合征、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎(RP)、急性 或慢性肝炎、失敗的整形外科植入、血管球性腎炎、狼瘡和自身免疫性疾病組成的組。
21.一種在患有腫瘤性疾病的個(gè)體中治療腫瘤性疾病的方法，其中所述方法包括對(duì)所 述個(gè)體施予(a)一種中和GM-CSF的化合物；和(b)一種中和IL-17的化合物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中(a)在施予所述中和IL-17的化合物之前施予所述中和GM-CSF的化合物；(b)在施予所述中和IL-17的化合物之后施予所述中和GM-CSF的化合物；或(C)同時(shí)施予所述中和GM-CSF的化合物和所述中和IL-17的化合物。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述個(gè)體為人或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述中和GM-CSF的化合物選自由多肽、模擬 肽、核酸或小分子組成的組。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述多肽是結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受體的抗 體或其功能片段。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體和其功能片段分別為人類(lèi)單克隆抗體和 其功能片段。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合至GM-CSF的表 位，優(yōu)選至GM-CSF的不連續(xù)表位，所述表位優(yōu)選包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/ 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或(C)氨基酸第21-22位(EA)。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重鏈可 變區(qū)包含CDR3，其中該CDR3包含這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列選自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列組成的組。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中任意一個(gè)所述的重鏈可變區(qū)CDR3序列與SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQID NO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序 列一起存在于重鏈可變區(qū)。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， 該CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，并且該CDR3包含SEQ ID NO 18所示 氨基酸序列。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重鏈可變 區(qū)包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕鏈可變 區(qū)包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序 列，該CDR2具有如SEQ IDNO 17所示的氨基酸序列，該CDR3具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其中該 CDRl區(qū)包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列，該CDR2區(qū)具有如SEQ ID NO 15 所示的氨基酸序列，該CDR3具有如SEQIDN0s: 1_13和56中任一所示的氨基酸序列。
35.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含如SEQ ID NO 34中所示的輕鏈氨基酸序列，并且包含選自如SEQ ID NOs: 35-48中任一所示 的重鏈氨基酸序列。
36.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含與如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
37.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述中和IL-17的化合物選自由多肽、模擬肽、 核酸或小分子組成的組。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述多肽為結(jié)合IL-17或IL-17受體的抗體或其 功能片段。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述抗體是人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段。
40.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述腫瘤性疾病為癌癥。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述癌癥為白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。
42.一種藥物組合物，該組合物包含(a)一種中和GM-CSF的化合物；和(b)一種中和IL-17的化合物。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述中和GM-CSF的化合物選自由多 肽、模擬肽、核酸分子或小分子組成的組。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述多肽是結(jié)合GM-CSF或GM-CSF受 體的抗體或其功能片段。
45.如權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述抗體為人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段。
46.如權(quán)利要求44或45所述的藥物組合物，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合至包含 氨基酸第 23-27 位(RRLLN)和 / 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)的 GM-CSF 的表位，該表位優(yōu)選為GM-CSF的不連續(xù)表位。
47.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包括(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或(C)氨基酸第21-22位(EA)。
48.如權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述抗體或其功能片段在其重鏈可變區(qū) 包含CDR3，其中該CDR3包含這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列選自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列組成的組。
49.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中任意一個(gè)所述的重鏈可變區(qū)CDR3序列與 SEQ ID NO 14所示的重鏈可變區(qū)CDRl序列和SEQ ID NO 15所示的重鏈可變區(qū)CDR2 序列一起存在于重鏈可變區(qū)。
50.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸 序列，該CDR2包含SEQID NO 17所示氨基酸序列，并且該CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序列。
51.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)進(jìn)一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
52.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其重 鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NOs 20-33、52、和53中任一所示的氨基酸序列。
53.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段在其輕 鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中該CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨 基酸序列，該CDR2具有如SEQ ID NO : 17所示的氨基酸序列，該CDR3具有如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；并且在其重鏈可變區(qū)包含CDRl區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3，其 中該CDRl區(qū)包含如SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列，該CDR2區(qū)具有如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列，該CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序 列。
54.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含如 SEQ ID NO 34中所示的輕鏈氨基酸序列，并且包含選自如SEQ ID NOs 35-48中任一 所示的重鏈氨基酸序列。
55.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其中所述人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段包含與 如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
56.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述中和IL-17的化合物選自由多肽、模 擬肽、核酸分子或小分子組成的組。
57.如權(quán)利要求56所述的藥物組合物，其中所述多肽為結(jié)合IL-17或IL-17受體的抗 體或其功能片段。
58.如權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述抗體f是人類(lèi)單克隆抗體或其功能片段。
59.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療炎性疾病。
60.如權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述炎性疾病選自由類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)(包括對(duì)用TNF-α中和劑治療有抗藥性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化癥(MS)、慢 性阻礙性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、炎性 腸道疾病(IBD)、克羅恩氏病、葡萄膜炎、黃斑變性、結(jié)腸炎、銀屑病、沃勒變性、抗 磷脂抗體綜合征(APS)、急性冠脈綜合征、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎 (RP)、急性或慢性肝炎、失敗的整形外科植入、血管球性腎炎、狼瘡和自身免疫性疾病 組成的組。
61.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療腫瘤性疾病。
62.如權(quán)利要求61所述的藥物組合物，其中所述腫瘤性疾病為癌癥。
63.如權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中所述癌癥為白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌 或皮膚癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在患有炎性疾病的個(gè)體中治療炎性疾病的方法，所述方法包含對(duì)所述個(gè)體施予一種中和GM-CSF的化合物和一種中和IL-17的化合物。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102014958SQ200980115521
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日
發(fā)明者克里斯蒂娜·普萊特-齊貝克 申請(qǐng)人:米克羅麥特股份公司