專利名稱：溶菌酶親和層析凝膠介質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于化工產(chǎn)品制造領(lǐng)域，特別涉及溶菌酶親和層析介質(zhì)的制備技術(shù)。
溶菌酶具有廣泛的用途目前溶菌酶的分離純化大多采用交換層析法，該方法存在操作繁瑣設(shè)備復(fù)雜等問題，如樹脂使用后必須再生，層析時需梯度洗脫等過程；另外尚存在純化倍數(shù)及回收率低，濃縮效果不佳等缺點(diǎn)。采用親和層析法制備溶菌酶，具有高效簡便等優(yōu)點(diǎn)，但往往造價昂貴?，F(xiàn)有的親和層析介質(zhì)種類很多，但均存在某方面的不足。如細(xì)菌細(xì)胞壁酶解產(chǎn)物等與瓊脂糖的偶聯(lián)體其制備復(fù)雜，造價昂貴，在高于70℃的溫度下，凝膠顆粒便會融化而受到破壞；幾丁質(zhì)粉和脫氨幾丁質(zhì)粉均具有很強(qiáng)的非專一性物理吸附，特別是酚類等植物色素，且吸附表面積小。羧甲基—幾丁質(zhì)在偏堿性條件下溶解，嚴(yán)重影響層析操作，另外由于存在羧甲基造成了嚴(yán)重的非專一性的陽離子交換吸附；幾丁質(zhì)包埋纖維素(CC—纖維素)制備繁瑣，且顆粒細(xì)小流速差，不適合層析操作，再者包埋在顆粒表面的幾丁質(zhì)很易脫落；金屬離子絡(luò)合親和層析介質(zhì)介質(zhì)制備復(fù)雜、造價昂貴、具很強(qiáng)的非專一性吸附；免疫親和層析介質(zhì)制備復(fù)雜、造價昂貴，對層析操作的要求嚴(yán)格；N—酰化殼聚糖由于存在一定量未被乙?；陌被?，從而造成非專一性的陰離子交換吸附。
本發(fā)明的目的尋求一種適合于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，效率高、機(jī)械強(qiáng)度好，流速理想，且非專一性吸附小的提取溶菌酶的親和層析介質(zhì)，并且這種介質(zhì)制備簡便，成本較低。本發(fā)明所述的制備方法將完成本發(fā)明所尋求的目的。
本溶菌酶親和層析凝膠介質(zhì)是這樣制備的將一定量的殼聚糖(Chitosan又稱乙酰幾丁質(zhì))粉末充分溶解于pH值小于2的醋酸或鹽酸溶液中，殼聚糖質(zhì)量溶劑體積=1∶15～30，而后加入3—6倍體積的甲醇作為反應(yīng)介質(zhì)，攪勻后過濾，除去未溶解的雜質(zhì)，于濾液中加入低級脂肪酸酐進(jìn)行凝膠化，脂肪酸酐加入比例為殼聚糖質(zhì)量／脂肪酸酐體積=1／15～25，其中合適的脂肪酸酐有乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐和戊酸酐等。接著將所得的凝膠破碎為凝膠顆粒，將破碎后凝膠顆粒懸浮于5—10％的NaOH或KOH溶液中，40℃以上保溫，攪拌除去凝膠顆粒中非N一位的酰化，用水將凝膠顆粒洗至中性并抽干，而后用醋酸或鹽酸水溶液懸浮凝膠顆粒，徐徐加入NaNO2或KNO2溶液并不斷攪拌，氧化脫去凝膠顆粒內(nèi)的未?；挠坞x氨基，接著用堿調(diào)懸浮液pH至中性，用水洗滌凝膠顆粒除去其中殘留的酸和鹽類等物質(zhì)，抽干即得溶菌酶親和層析介質(zhì)。
為了完全脫去凝膠顆粒的非N—位?；?，凝膠顆粒應(yīng)在堿性溶液中60℃保溫1～3小時。本介質(zhì)的理化特性化學(xué)組成脫氨的N—脂肪?；瘹ぞ厶恰?br> 形狀半透明的凝膠顆粒狀。
顏色淺褐色。
膨脹性1g干膠的床體積可達(dá)30～35ml，其吸水值為12～18g水/g干膠，因而具較大的表面積。對雞蛋清溶菌酶的吸附特性吸附容量可達(dá)16．1mg雞蛋清溶菌酶／g介質(zhì)；開放吸附3分鐘其吸附量即可達(dá)總吸附量的80％左右。穩(wěn)定性耐熱(100℃水浴中穩(wěn)定存在)、耐稀酸稀堿；且在不同的pH值、壓力和離子強(qiáng)度下床體積幾乎不發(fā)生變化。流速較為理想，如在3．0×30cm床體積的層析條件下，最大流速可達(dá)20ml／min，非常利于快速洗滌殘留于凝膠顆粒表面的雜蛋白，使得層析操作更為方便。
將抽干的凝膠顆粒完全浸泡在600ml 5％的NaOH溶液中，60℃水浴中保溫2hr，用清水洗至中性并抽干，而后用800ml的6％醋酸溶液懸浮凝膠顆粒，徐徐加入15ml 2％的NaNO2溶液并不斷攪拌，30min后，用NaOH調(diào)懸浮液pH至中性；蒸餾水洗滌凝膠顆粒并抽干；于含有NaN3的水溶液或凍干保存?zhèn)溆谩?br> 若想大量制備層析介質(zhì)只要將上述各組分的用量相應(yīng)放大即可。提取雞蛋清溶菌酶的應(yīng)用實(shí)例將20mL新鮮的雞蛋清用5mmol／L NaHCO3溶液稀釋至400mL，攪拌均勻，兩層紗布過濾，濾液中加入適量抽干的凝膠吸附劑(先經(jīng)5mmol／L NaHCO3溶液平衡)，開放攪拌100 min(室溫)，倒在尼龍布上用5mmol／L NaHCO3(內(nèi)含0．2mol／L NaCl)溶液洗滌4～5次，裝柱(2cm×22cm)，用0．1mol／L HAc洗脫，收集活性部分，即為純化的雞蛋清溶菌酶。
本發(fā)明系殼聚糖經(jīng)N—?；兔摪眱刹襟E制成，同幾丁質(zhì)粉和脫氨幾丁質(zhì)相比其消除天然幾丁質(zhì)粉中存在的蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)，從而克服了對雜蛋白和色素的物理吸附作用；另外脫氨處理可除去凝膠顆粒中少許未?；膸щ姷摹狽H+3基團(tuán)，從而消除了非特異性的離子交換吸附；上述兩方面大大地提高了層析介質(zhì)對溶菌酶的吸附專一性。其對溶菌酶的純化效率高，濃縮效果極佳；所得的純化酶活力大于75000U／mg蛋白，活力回收大于70％(以乙?；哪z為親和層析介質(zhì)，從新鮮雞蛋清中純化溶菌酶，其中活力測定按Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn))。
使用本介質(zhì)純化操作簡便使用后的介質(zhì)用蒸餾水沖洗數(shù)次后即可再用，十分方便；直接從雞蛋清開始經(jīng)一次的親和層析步驟，便可獲得高純度的酶。
本介質(zhì)的制備簡單，成本低廉。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶親和層析介質(zhì)的制備方法其特征在于將殼聚糖溶于醋酸或鹽酸溶液中，而后加入3～6倍體積的甲醇，攪勻后，過濾，取濾液，在濾液中加入脂肪酸酐，加入量為殼聚糖質(zhì)量／脂肪酸酐體積=1／15～25，放置讓其凝膠化；將凝膠破碎，用水洗滌凝膠顆粒至中性，而后將其懸浮于5～10％的NaOH或KOH溶液中，在40℃以上保溫，以除去凝膠顆粒中非N—位的脂肪?；?，并用水將凝膠顆粒洗至中性，再用醋酸或鹽酸水溶液懸浮凝膠顆粒，徐徐加入NaNO2或KNO2溶液并不斷攪拌，以氧化脫去凝膠內(nèi)未?；牡挠坞x氨基，用堿調(diào)懸浮液pH至中性，用水洗滌除去凝膠顆粒中殘留的酸和鹽類等物質(zhì)，抽干即得溶菌酶親和層析介質(zhì)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于凝膠顆粒在堿性溶液中60℃保溫1—3小時。
全文摘要
溶菌酶親和層析介質(zhì)的制備方法。將殼聚糖溶于醋酸或鹽酸溶液中,再加入3—6倍體積的甲醇,過濾,于濾液中加入脂肪酸酐讓其酰化成凝膠狀,搗碎凝膠并用水將其洗至中性,用5—10%的NaOH或KOH溶液處理以脫去非N－位的脂肪?；?再用水洗至中性,在酸性條件下用亞硝酸鹽氧化除去凝膠內(nèi)未?；挠坞x氨基,而后用堿調(diào)至中性,用水洗去酸和鹽類等殘留物抽干即得所需的介質(zhì)。
文檔編號C08B37/00GK1279286SQ0011427
公開日2001年1月10日 申請日期2000年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月17日
發(fā)明者王煒軍, 徐鳳彩 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)