專利名稱：幼齡動物胸腺生長因子及其提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從健康的幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)新鮮胸腺中提取具有生物活性的中小分子胸腺蛋白混合物，即胸腺生長因子，其分子量＜60KD；本發(fā)明還涉及從健康的幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)胸腺中提取其胸腺生長因子的提取分離方法。
胸腺是機體的中樞免疫器官，是T細胞發(fā)育分化的場所，胸腺中有免疫增強作用的多種激素和免疫抑制作用的因子，這兩類功能相對立地因子，共同擔負著機體細胞免疫功能的調節(jié)作用。因此，分離純化胸腺中各種因子具有十分重要的臨床意義。
動物胸腺特別是幼齡動物胸腺生長因子能明顯促進成纖維細胞，內皮細胸的增殖，對胃潰瘍有明顯的促愈合作用，在治療消化性潰湯方面，可以取得療程短，愈合率高，復發(fā)率低的良好效果，在消化性潰瘍治療及創(chuàng)傷愈合方面具有良好的臨床應用、開發(fā)前景。
本發(fā)明目的在于應上述臨床應用、開發(fā)前景的需要，提供一種從幼齡動物胸腺中提取分離出動物胸腺生長因子的提取分離方法及動物胸腺生長因子。
本發(fā)明提供的從幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)胸腺中提取分離動物胸腺生長因子的提取分離方法如下
1、提取
取健康幼齡動物(乳豬、乳牛或其它幼齡動物)的新鮮胸腺(離體6小時之內)磨碎成勻漿，經(jīng)FP2000型分離桂分離(西德產，分子量6萬以下)，收集分離外液，濃縮凍干成幼齡動物胸腺生長因子干粉。
在選材過程中，發(fā)現(xiàn)胸腺有包囊或結節(jié)、質地粗糙、色澤不正?；蛴挟惓馕都半x體超過6小時者均不符合選材的質量要求。
2、分離純化
將上述幼齡動物胸腺生長因子凍干粉(蛋白濃度為15-20mg/ml)的水溶液，使用Pharmacia快速蛋白液相色譜儀(FPLC，LCC-500，P-500泵，MV-7進樣器，UV280nm檢測系統(tǒng)，0.5AuFs，陰離子交換柱MonoQHR5/5)對其幼齡動物胸腺生長因子凍干粉(蛋白濃度為15-20mg/ml的水溶液)進行純化，加樣量0.5ml/次，NaCl非線性梯度洗脫。洗脫A液20mmol/L，Tris-Hle，pH8.0。洗脫B液20mmol/l Teis-Hle，1.0mol/L，NaCl，pH8.0，洗脫速度為1ml/min，使B液在0-60％之間為線性梯度，運行22min，B液在100％時洗脫5min，整個洗脫在32min完成，在280mm紫外檢測進行峰收集，每個峰作為一組份收集，分別收集各洗脫峰，收集的樣品用雙蒸水透析(18-24h)去鹽，低溫干燥，最好是真空冷凍干燥。
在紫外監(jiān)測系統(tǒng)的監(jiān)測下，整個洗脫過程共洗脫出和收集到9個組份吸收峰(分別稱為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9)。
然后將各組份峰進行PAGE凝膠電泳，促細胞增殖活性等項測定。
GradiFracTM柱層析系統(tǒng)分離純化圖譜見圖1。
經(jīng)GradiFracTM純化后各組份峰與促細胞增殖效應的關系測定
(一)SWiss3T3細胞[H3]-TdR摻入法測定各組份活性
1、方法傳代SWiss 3T3細胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，接種到48孔培養(yǎng)板(Costa公司產品)中，每孔接種5×104細胞，20小時后更換無血清培養(yǎng)液(DDED培養(yǎng)液內含15mM HEPES，33.3mM葡萄糖，5mg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，0.02％牛血清白蛋白)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，加稀釋好的不同樣品，使每個樣品終濃度皆為12.5μg/ml，同時加[3H]-TdR(終濃度為1μCi/ml)，37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，36小時后去掉培養(yǎng)介質，PBS洗二次，加甲醇固定二次，每次10min，水洗3次后，加5％三氯醋酸固定二次，再水洗三次，然后加入0.5N NaoH溶解細胞，點膜后，紅外燈下烤下，加入閃爍液，液閃測定。
2、結果經(jīng)GradiFracTM純化后的9個組份峰和提取物原液的活性測定結果見表1、圖2。
表1 SWiss 3T3[H3]-TdR摻入法測定各組份活性結果N＝3**/Δ表示與對照相比P＜0.01由表1得出
1)組份峰1、2、3、4、5均有促進3T3細胞增殖活性，而且W3活性最高。
2)組份峰6、7、8、9沒發(fā)現(xiàn)刺激3T3細胞增殖活性。
從圖2得出1)W3和原樣對3T3細胞有明顯的促增殖作用，而且與劑量有明顯的依賴關系；
2)W3在5μg/ml就能明顯出現(xiàn)促細胞增殖活性，10μg到最高峰；
3)W3的活力明顯高于提取原液，W3的活力比原提取液約高8倍。
(二)內皮細胞(EC)增殖計數(shù)法測定各組份活性。
1、方法
(1)內皮細胞(EC)的制備；取健康產婦分娩后3小時內的臍帶，用D-Hanks液反復沖洗臍靜脈至無血跡，灌入0.25％胰蛋白酶5ml置37℃水浴內10分鐘收集消化液，用5ml含20％小牛血清的1640培養(yǎng)液沖洗臍靜脈，收集沖洗液，將消化液及沖洗液合并收入離心管內，1000rpm，離心10分鐘，去上清，加入內皮細胞培養(yǎng)液(內含20％小牛血清，200u/ml青霉素，0.2ug/ml鏈霉素，200ug/mlECGS)稀釋沉淀細胞，將細胞接種于玻璃培養(yǎng)瓶內，置5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2-3天換液一次，直至細胞單層形成，即進行傳代培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)時，用D-Hanks液輕洗細胞2-3遍。用0.06％胰蛋白酶在室溫消化1-2分鐘，棄消化液，加入內皮細胞培養(yǎng)液，并用吸管吹打20-30次，制成細胞懸液。以1∶2∶3比率傳代。用于實驗的為第2-3代細胞，經(jīng)VIII因子相關抗原(VIIIR.Ag)的抗體檢測，確認為血管內皮細胞后方作為生物效應測定用細胞。
(2)生物效應測定每次取24孔塑料細胞培養(yǎng)板，于每個培養(yǎng)孔內(面積2cm2)加2×104個細胞，將各檢測樣品，按不同濃度10、20、40、80、160、320ug/ml分別加入3孔細胞中平行檢測。每份樣品設立3孔空白對照(與鹽水做對照)將上述細胞置5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)72小時，收集細胞，臺盼藍染色，計數(shù)每孔內活細胞數(shù)，計數(shù)方法為置顯微鏡下每孔隨機計數(shù)5個高倍視野下的細胞數(shù)，取其均值，按下列等式換算成每平厘米培養(yǎng)出的細胞數(shù)。
EC3/cm2＝細胞計數(shù)均值/0.19625×100[EC3內皮細胞數(shù)，0.19625為每高倍鏡視野(×400)面積，單位mm2]，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學處理。
2、結果
經(jīng)GradiFracTM系統(tǒng)純化后各組份樣品對EC增殖效應的影響見表2
表2為10個不同樣品對EC增殖效應的影響
*/☆P＜0.05Δ/☆＜0.01
表2提示W(wǎng)1-5均有明顯刺激EC增殖活性，而且有劑量依賴關系，W3的活性最高，當?shù)鞍缀吭?0ug/ml 時就能明顯刺激EC生長，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。各組峰之間的活性關系與3T3細胞[H8]-TdB摻入法的測定結果相符，但兩者之間的靈敏度不同。
三、不同動物和不同年齡的動物胸腺提取物活性測定比較
(一)樣品原材料1、乳豬胸腺 2、乳牛胸腺 3、成年豬胸腺 4、成年牛胸腺 5、乳豬肝細胞提取液
(二)提取方法按上述本發(fā)明提供的動物胸腺生長因子的提取分離方法分別對(一)中提供的樣品原材料進行提取制備其提取物。
(三)測定方法按3T3細胞[3H]-TdR摻入法，中入量按20ug/ml計算
(四)測定結果比較見表3
表3為不同來源的樣品促3T3細胞增殖活性測定結果比較樣品 對照樣品1樣品2樣品3樣品4 樣品5cpm值1244☆ 4213** 3823** 2108 2210 2336(x±SD) ±124 ±203±215±216±218 ±213
**/☆表示樣品與對照組比較P＜0.01
注樣品1——乳豬胸腺提取物；
樣品2——乳牛胸腺提取物；
樣品3——成年胸胸腺提取物；
樣品4——乳豬肝細胞提取液；
樣品5——肝細胞提取液
由表3得出，在提取工藝、活性測定方法及蛋白含量相同的情況下，觀察不同樣品的促細胞增殖活性發(fā)現(xiàn)，乳牛和乳豬胸腺提取物均有明顯的促進3T3細胞增殖作用，而成年豬、成年牛胸腺和乳豬肝細胞提取物均未發(fā)現(xiàn)有明顯促3T3細胞增殖的活性。說明應用乳豬和乳?；蚱渌g動物的胸腺作為原料提取促細胞增殖物質，可提得同樣的促細胞增殖效果，因為豬與人之間更具同源性故用乳豬胸腺較為合適些。
四、用PAGEG-SDS凝膠電泳法測定各組份的分子量
(一)電泳方法取30％丙烯酰胺貯存液6.95ml，加分離膠緩沖液4.25ml，水5.61ml，TEMED 0.017ml，10％過硫酸胺，0.17ml制成12％分離膠，再取30％丙烯酰胺0.65ml，濃縮膠緩沖液1.25ml水3.04ml TEMED 0.005ml，10％過硫酸胺0.05ml制成4％濃縮膠，樣品加等體積緩沖液煮沸5分鐘，冷卻后上樣30μl，其中一孔加標準分子量Mark(14.4、21.5、31、40、42.7、55、66.2、97.4KD)50MV電泳3小時，考馬斯亮蘭染色，觀察結果。標準品(上海東風生化制藥廠低分子量Mark)
(二)電泳結果，9個組份峰樣品經(jīng)PAGE-SDS凝膠電泳結果見表4和圖3
表4為經(jīng)GradiFracTM系統(tǒng)純化后的各組份分子量測定結果
表3 圖3結果表明(1)胸腺原提取液分子量范圍約＜60KD，可以明顯辯認的電泳帶共約7條，分子量分別為12.0，16.0，23.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD；(2)W1有6條電泳帶，分子量分別為12.0KD，16.0KD，31.0KD，33KD，40.0KD，55KD；W2和W3僅有1條電泳帶，分子量均為33.0KD；W4，W5各有2條電泳帶，分子量分別為31.0KD和55.0KD；W6和W7各均有3條電泳帶，分子量均為23.0KD，31.0KD，55.0KD。(3)該胸腺生長因子是一組分子量在12KD-55KD之間的多組份的混合物。
五、各活性組份峰的穩(wěn)定性測定
(一)樣品組份峰1，組份峰3，組份峰5和分子量60KD以下的原提取液，共4個樣品，均置于-20℃低溫冰箱和30℃溫箱內儲存30天，觀察活性效應的穩(wěn)定性.
(二)活性測定方法按[H8]TdR摻入法，W1，W3，W5按20ug/ml，而原提取液按40ug/ml加入作為測試濃度。
(三)各活性組份峰和混合物提取物在兩種不同條件下其活性穩(wěn)定性測定結果見表5.
表5為兩種不同貯存條件下各組份峰穩(wěn)定性測定結果**/☆ 表示與對照組比較P＜0.01
由表5得出(1)各活性組份峰水溶液在-20℃低溫條件儲存30天內穩(wěn)定。(2)在30℃條件下除原提取液和W1為混合物活性基本穩(wěn)定不變之外，其它各組份峰均失去活性，說明混合物水溶液在室溫條件下儲存比較純樣品相對更為穩(wěn)定，這為該提取物的貯存，運輸推廣應用提供了基礎。
上述各項測定表明
(一)用超濾法從健康幼齡動物新鮮胸腺中提取的混合物，經(jīng)GradiFracTM柱層析系統(tǒng)純化，采用紫外監(jiān)測方法收集到9個組份峰。
(二)經(jīng)3T3細胞[H3]-TdR摻入法和EC培養(yǎng)細胞增殖計數(shù)法檢測活力發(fā)現(xiàn)，組份1.組份2，組份3，組份4，組份5均有不同程度促細胞增殖活性，其中組份3促細胞增殖活性最明顯，而且有明顯的劑量依賴關系，但組份6，組份7，組份8，組份9，均未檢出有明顯促細胞增殖效應。
(三)經(jīng)GradiFracTM柱層析系統(tǒng)純化收集到的9個組份峰，經(jīng)用PAGE-SDS凝膠電泳測分子量表明(1)提取原液有7條電泳帶，分子量分別為12.0，16.0，23.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD，均＜60.0KD；(2)組份1有6條電泳帶，分子量分別為12.0，16.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD；(3)組份2和組份3各有1條電泳帶，分子量均為33.0KD；(4)組份4和組份5各有2條電泳帶，分子量均為31.0和55.0KD；(5)組份6，組份7各有3條電泳帶，其分子量均為23.0，31.0，55.0ZD。
(四)從各活性組份峰的穩(wěn)定性測定表明，各活性組份峰水溶液在-20℃低溫條件下貯存30天其活性均較穩(wěn)定，但在30℃條件下貯存30天，除混合物和W1相對穩(wěn)定之外，其它活性組份活性喪失，表明單組份或較純組份的水溶液不利于常溫保存，而混合物或多組份水溶性物質適合于常溫長期貯存。
綜上所述，本發(fā)明提供的方法從幼齡動物胸腺中提取的胸腺生長因子。分子量在33.0KD和55.0KD的組份有明顯的促3T3和EC增殖效應，尤其是分子量在33.0KD的組份活性最強，在pH2-8范圍相對穩(wěn)定，混合物和多組份物在常溫條件下貯存相對穩(wěn)定。故生產工藝應以提取分子量33.0和55.0KD為重點，考慮到組份的穩(wěn)定性和工藝的簡便程度，應收集60KD以下的混合物為好。
本發(fā)明是從健康乳豬、乳牛或其它幼齡動物新鮮胸腺中提取具有生物學活性的中小分子胸腺蛋白混合物，(分子量＜60KD)。該混合物即幼齡動物胸腺生長因子能明顯促進成纖維細胞，內皮細胞的增殖。對胃潰瘍動物模型有明顯的促愈合作用。在臨床治療消化性潰瘍方面，取得了療程短，愈合率高，復發(fā)率低的良好效果。在消化性潰瘍治療及創(chuàng)傷愈合方面具有良好的臨床應用、開發(fā)前景。


附圖1為GradiFraeTM柱層析系統(tǒng)分離純化圖譜附圖2為不同濃度提取物對3T3細胞增殖活性比較圖附圖3為GradiFraiTM純化后各組份電泳帶分布圖
權利要求
1.一種幼齡動物胸腺生長因子，其特征在于該幼齡動物胸腺生子因子是一種用超濾法從健康幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)的新鮮胸腺中提取的具有生物活性的中小分子胸腺蛋白混合物，其分子量小于60KD。
2.按權利要求1所述的幼齡動物胸腺生長因子，其特征在于經(jīng)Gradi FracTM柱層析系統(tǒng)純化采用紫外監(jiān)測方法可以收集到W1，W2，W3，W4.W5，W6，W7，W8，W9九個組合峰，
3.按權利要求1所述的幼齡動物胸腺生長因子，其特征在于經(jīng)Gradi FracTM柱層析系統(tǒng)純化收集到的9個組份峰，經(jīng)用PAGE-SDS凝膠電泳測定分子量表明(1)提取原液有7條電泳帶，分子量分別為12.0KD，16.0KD，23.0KD，31.0KD，33.0KD，40.0KD，55.0KD；(2)組份1有6條電泳帶，分子量分別為12.0KD，16.0KD，31.0KD，33.0KD，40.0KD，55.0KD；(3)組份2和組份3各有1條電泳帶，分子量均為33.0KD；(4)組份4和組份5各有2條電泳帶，分子量均為31.0KD和55.0KD(5)組份6和組分7各有3條電泳帶，其分子量均為23.0KD，31.0KD和55.0KD。
Gradi FracTM純化后各組份電泳帶分布圖
4.幼齡動物胸腺生長因子的提取分離方法，其特征在于提取方法如下
提取
取健康幼齡動物(乳豬，乳?；蚱渌g動物)的新鮮胸腺(離體6小時之內)，磨碎成勻漿，經(jīng)FP2000型分離桂分離收集分離外液，濃縮凍干成幼齡動物胸腺生長因子凍干粉。
5.按權利要求4所述的幼齡動物胸腺生長因子的提取分離方法，其特征在于純化分離方法如下
將權4所示方法提取的幼齡動物胸腺生長因子凍干粉(蛋白濃度為15-20mg/ml)的水溶液，使用pharmacia快速蛋白液相色譜儀(FPLC，LCC-500，P-500泵，MV-7進樣器，UV280nm檢測系統(tǒng)，0.5UAFS陰離子交換桂Mono QHR5/5)對其胸腺生長因子凍干粉(蛋白濃度為15-20mg/ml的水溶液)進行純化，加樣量0.5ml/次，NaCl非線性梯度洗脫，洗脫A液20mmol/l Tris-HCI，pH8.0，洗脫B液20mmol/l Tris-HCI，1.0mol/l NaCl，pH8.0，洗脫速度為1ml/min使B液在0-60％之間為線性梯度，運行22min，B液在100％時洗脫5min，整個洗脫在32min完成，在280nm紫外檢測進行峰收集，每個峰作為一組份收集，分別收集各洗脫峰，收集的樣品用雙蒸水透析(18-24h)去鹽，低溫干燥，最好是，真空冷凍干燥。
全文摘要
本動物胸腺生長因子是從健康幼齡動物胸腺中提取的分子量＜60KD的具有生物活性的中小分子胸腺蛋白混合物，其提取分離方法1)取離體不超過6小時的動物胸腺，磨碎成勻漿，經(jīng)FP2000型分離柱分離，收集分離外液，濃縮凍干；(2)將其凍干粉經(jīng)Gradi FracTM桂層析系統(tǒng)純化，采用紫外監(jiān)測收集可分離到的9個組分峰，該胸腺生長因子能明顯促進成纖細胞，內皮細胞增殖，對胃潰瘍有明顯促愈合作用，在治療消化性潰瘍及創(chuàng)傷愈合方面療程短，愈合率高，復合率低，其臨應用、開發(fā)前景可觀。
文檔編號C07K14/475GK1149057SQ9511765
公開日1997年5月7日 申請日期1995年10月20日 優(yōu)先權日1995年10月20日
發(fā)明者陳光明, 楊富強, 王東曉 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院