專利名稱:嵌合型人γ-干擾素受體/免疫球蛋白多肽的制作方法
γ-干擾素(IFNγ)是由NK細(xì)胞和激活的輔助T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì),它具有抗病毒和抗增殖活性,在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)方面起著多效作用。γ-干擾素調(diào)節(jié)抗體的形成和T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞的分化,增強(qiáng)數(shù)種細(xì)胞類型上主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類結(jié)構(gòu)的表達(dá),因而擴(kuò)增了輔助細(xì)胞的抗原提顯能力。γ-干擾素通過作用于吞噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,在激活非特異性防御機(jī)制中起著重要作用。γ干擾素是巨噬細(xì)胞殺微生物和殺腫瘤特性的主要激活劑,它增強(qiáng)吞噬作用,誘導(dǎo)ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性),并調(diào)節(jié)下列物質(zhì)的釋放MHCⅢ類基因編碼的多肽(即補(bǔ)體成分和TNFα)、蛋白酶抑制劑(C1抑制劑)、IL1、GM-CSF、纖維連接素、花生四烯酸代謝物、1,25-羥基維生素D3、溶酶體酶(IP-30、水解酶、中性蛋白酶,即uPA)和趨化性因子(IP-10)。最后,TFNγ還促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用、吞噬細(xì)胞通過結(jié)締組織的遷移以及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白的趨化和粘連(Landolfo和Garotta,J.Immunol.Res.3,81-94)。
多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,IFNγ在誘發(fā)或促進(jìn)下列疾病方面起著關(guān)鍵性作用,所說疾病包括胰島素依賴性糖尿病、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、暴發(fā)型肝炎、異體移植排斥反應(yīng)、血栓形成和繼發(fā)于一般性施瓦茨曼型反應(yīng)的出血。另外,IFNγ在促進(jìn)Kawasaki病(皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征)和見于一些類肉瘤病患者中的高血鈣(1,α-甾醇-羥化酶能將維生素D3轉(zhuǎn)化為其最具活性的形式1,25-二羥基維生素D3,而IFNγ能誘導(dǎo)1,α-甾醇-羥化酶水平的升高)中也有作用(Garotta等人,Pharmacol.Res.21,5-17;Landolfo和Garotta,同上文;Gilles等人,Hepatology16,655-663,)。在艾滋病(AIDS)的發(fā)病機(jī)理中,組織巨噬細(xì)胞在建立慢性感染狀態(tài)中有作用。因?yàn)樗鼈兇砣嗣庖呷毕莶《?HIV)的重要貯存庫(kù)。體外實(shí)驗(yàn)表明,IFNγ增強(qiáng)被感染的巨噬細(xì)胞表達(dá)成熟的HIV,并能夠惡化該疾病的進(jìn)程(Ganser等人,Onkologie 9,163-166,Biswas等人,J.Exp.Med.,176,739-750)。最后,IFNγ在炎性神經(jīng)病性疾病中或在AIDS、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、萊姆病和敗血癥的神經(jīng)病性并發(fā)癥中起重要作用。IFNγ激活的巨噬細(xì)胞將L-色氨酸轉(zhuǎn)化為神經(jīng)毒素喹啉酸(Heyes等人,Biochem.J.283,633-635)。
借助交聯(lián)實(shí)驗(yàn)、與放射性同位素標(biāo)記的IFNγ結(jié)合以及與未標(biāo)記的IFRγ的特異性競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了在多種細(xì)胞上存在的IFNγ的特異性受體(IFNγR)。Rubinstein等人(Immunol.Rev.97,29-50[1987)已描述了人IFNγ(hIFNγ)和人IFNγ受體(hIFNγR)之間的交聯(lián)復(fù)合物,其分子量(Mr)范圍是70,000~165,000,盡管存在著這一明顯的異質(zhì)性,但對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行的結(jié)合和結(jié)構(gòu)性研究表明只有一種表觀分子量為90KDa的IFNγ結(jié)合蛋白(p90)和一類離解常數(shù)約為10-11~10-10M的結(jié)合位點(diǎn)(Sarkar和Gupta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,5160-5164;Aguet和Merlin,J.Exp.Med.165,988-999;Calderon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4837-4841;Fountoulakis等人,J.Immunol.143,3266-3276;Van Loon A.P.G.M等人,J.Leukocyte Biol.,49,462-473)。另外一種能被檢測(cè)到的hIFNγR的50Kd成分(p50)是p90蛋白的蛋白水解降解產(chǎn)物(Aguet和Merlin,同上文;Sheehan等人,J.Immunol.140,4231-4237;Fountoulakis等人,同上文;Van Loon A.P.G.M.等人,同上文)。因?yàn)閔IFNγR的這一p50成分包括細(xì)胞外功能區(qū)、跨膜區(qū)和部分細(xì)胞內(nèi)功能區(qū),所以,它不是天然存在的hIFNγR的可溶形式(Fountoulakis等人,同上文;Van Loon A.P.G.M.等人,同上文)。總之,IFNγR是一種普遍存在的膜錨蛋白(Valente等人,Eur.J.Immunol.22,2403-2412),它似乎在正常細(xì)胞上被表達(dá)的程度(每個(gè)細(xì)胞最多達(dá)103位點(diǎn))低于在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)程度。因此,據(jù)報(bào)道一些人癌細(xì)胞系和B細(xì)胞系以每個(gè)細(xì)胞104結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量級(jí)表達(dá)IFNγR(Uecer等人,Cancer Res.46,5339-5343;Aguet和Merlin,同上文)。
已經(jīng)描述過hIFNγR的分子克隆和表達(dá)(Aguet等人,Cell55,273-280)。然而,因?yàn)樘烊籌FNγR以及重組IFNγR是膜錨蛋白,所以它們存在著不溶于生理性溶液的不利之處。因此,難以實(shí)現(xiàn)IFNγ拮抗劑的研究或設(shè)計(jì)以及給哺乳動(dòng)物施用純化的IFNγR以抑制IFNγ與其特異性受體的結(jié)合,從而難以預(yù)防、抑制和/或調(diào)節(jié)自身免疫紊亂、慢性炎癥、遲發(fā)型過敏反應(yīng)和異體移植排斥反應(yīng)的病程。
通過培養(yǎng)攜帶含有編碼各個(gè)可溶形式IFNγR的DNA順序之表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株并分離這種可溶性IFNγR得以將可溶形式的人IFNγR[shIFNγR]和可溶形式的小鼠IFNγR[smIFNγR]工程化。所說的shIFNγR包括天然IFNγR中從N末端部分到跨膜區(qū)的整個(gè)細(xì)胞外功能區(qū)(至少是天然IFNγR順序的氨基酸26-246),但缺乏天然IFNγR的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū),并能夠特異地結(jié)合IFNγ(Fountoulakis等人,J.Biol.Chem.265,13268-13275,Gentz等人,Eur.J.Biochem.210-545-554和歐洲專利申請(qǐng)393502)。該可溶形式IFNγR的分子量約為30-32KDa,以約10-10M的親和力結(jié)合IFNγ,在體內(nèi)有活性并且是穩(wěn)定的,它不是免疫原,能作為特異性中和內(nèi)源性IFNγ的藥物加以應(yīng)用。因此,該可溶形式IFNγR能夠用于治療胰島素依賴性糖尿病、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、暴發(fā)型肝炎、甲狀腺炎、異體移植排斥反應(yīng)、膿毒性腹膜炎和施瓦茨曼型反應(yīng)以及由IFNγ激活的巨噬細(xì)胞釋放的神經(jīng)毒性喹啉酸所致的炎性神經(jīng)病性疾病。另外,可將該可溶形式IFNγR應(yīng)用于AIDS患者,以遲緩感染的慢性化,延長(zhǎng)疾病的無癥狀期并預(yù)防神經(jīng)病性并發(fā)癥。該可溶形式的IFNγR還可作為IFNγ拮抗劑加以應(yīng)用,以防止脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、萊姆病和敗血癥的神經(jīng)病性并發(fā)癥。然而,該可溶形式的IFNγR在血中僅持續(xù)存在1-3小時(shí)。在淋巴樣器官中存在6小時(shí)(Ozmen等人,J.Chemotherapy 3,Suppl.3,99-102;Ozmen等人,J.Immunol.Methods 147,261-270;Gentz等人,同上文)。
通過將可溶形式的小鼠IFNγR與小鼠免疫球蛋白恒定區(qū)部分相結(jié)合產(chǎn)生嵌合型小鼠IFNγR-免疫球蛋白多肽(Kürschner等人,J.Biol.Chem.267,9354-9360)能夠增加IFNγR在血液及淋巴樣器官中存在的持久性(Kürschner等人,J.Immunol.149,4096-4100)。
然而,這些嵌合型IFNγR-免疫球蛋白多肽存在著不能施用于人體以抑制IFNγ與其特異性受體結(jié)合的缺點(diǎn)。為了解決這個(gè)問題,構(gòu)建了編碼嵌合型人IFNγR-人免疫球蛋白多肽的DNA順序。
更確切地說,本發(fā)明提供了包括兩部分DNA順序結(jié)合的DNA順序,其中所說的一部分DNA順序編碼能結(jié)合hIFNγ的hIFNγR片段,優(yōu)選的是具有整個(gè)或部分如
圖1所示的順序的hIFNγR片段,所說的另一部分DNA順序編碼人免疫球蛋白重鏈或輕鏈的部分或全部恒定區(qū),優(yōu)選的是人免疫球蛋白(如IgG、IgA、IgM或IgE,尤其是IgG,例如IgG1和IgG3)的重鏈,特別是除恒定區(qū)的第一區(qū)之外的所有區(qū)域。優(yōu)選的人免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)例如是Ck。
本發(fā)明還涉及由所說DNA順序編碼的重組嵌合型多肽,如hIFNγR-HG1、hIFNγR-HG3或hIFNγR-HCK。該嵌合型多肽可以包括不明顯改變蛋白質(zhì)活性的氨基酸替換?,F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)知道并描述過發(fā)生在蛋白質(zhì)和多肽中一般不改變這類分子活性的氨基酸替換,例如H.Neurath和R.L.Hill的“The Proteins”(Academic Press,New York,1979,尤其參見圖6,第14頁(yè))。最常見的交換有Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly反之亦然本發(fā)明的重組嵌合型多肽另外還能夠含有由“接頭”順序編碼的數(shù)個(gè)氨基酸的順序,這些順序產(chǎn)生于用來表達(dá)重組嵌合型多肽的表達(dá)載體。
本發(fā)明的重組嵌合型多肽還含有與親和性載體材料優(yōu)選結(jié)合的特異性順序。這類順序的例子是含有至少兩個(gè)相鄰組氨酸殘基的順序(參見歐洲專利申請(qǐng)282042的有關(guān)方面)。這類順序選擇性地與次氮基三乙酸鎳螯合物樹脂結(jié)合(Hochuli和Doebeli,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 368,748EP253303)。因此,含這類特異性順序的重組嵌合型多肽能被選擇性地從其它多肽中分離出來。該特異性順序能與嵌合型多肽氨基酸順序的C末端或N末端連接。
這類嵌合型多肽在體內(nèi)具有延長(zhǎng)了的半衰期。例如,已經(jīng)證實(shí)了由人CD4分子的頭兩個(gè)區(qū)域或其部分與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的不同區(qū)域構(gòu)成的嵌合型多肽在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)(參見Traunecker等人,Nature 331,84-86;歐洲專利申請(qǐng)394827)。此外,正如前文已述,嵌合型小鼠IFNγR-免疫球蛋白多肽在血中及淋巴樣器官中表現(xiàn)出延長(zhǎng)了的半衰期。
因?yàn)橐呀?jīng)知道編碼天然IFNγR的基因的完整DNA順序(Aguet等人,同上文),所以,借助現(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法,優(yōu)選固態(tài)法,如Merrifield的方法(J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154),即可化學(xué)合成編碼hIFNγR片段的DNA順序。另外,利用DNA重組技術(shù)的方法可以由編碼hIFNγR的DNA生產(chǎn)hIFNγR片段(Sambrook等人,“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”,2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory)。,優(yōu)選的是,如實(shí)施例5、6和7中詳述,借助聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),利用編碼hIFNγR的質(zhì)粒制備包括信號(hào)順序和hIFNγR細(xì)胞外部分在內(nèi)的片段。
例如,歐洲專利申請(qǐng)393502已描述了可適用于經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼IFNγR的DNA順序的質(zhì)粒。特別合適的質(zhì)粒是質(zhì)粒phIFNγR(實(shí)施例2)。
然后,利用已知的方法,可將編碼hIFNγR片段的DNA順序整合到含有編碼人免疫球蛋白(Ig)重鏈或輕鏈恒定區(qū)的部分或全部區(qū)域的DNA順序的適宜表達(dá)載體中(Sambrook等人,同上文)??梢杂勺鳛閹в蠭g恒定區(qū)的雜合分子而被用于表達(dá)CD4的表達(dá)載體提供Ig恒定區(qū)。這類表達(dá)載體包括但不限于pSV2衍生的載體(參見例如German,C.“DNA Cloning”,Vol Ⅱ.,Glover編輯,D.M.,IRL Press,Oxford,1985),如同pCD4-Hμ、pCD4-Hγ1和pCD4-Hγ3(歐洲專利申請(qǐng)394827中有詳細(xì)描述)。
歐洲專利申請(qǐng)394827說明書和上文引用的Traunecker等人的參考文獻(xiàn)還包括關(guān)于這些載體在表達(dá)嵌合型蛋白和在構(gòu)建表達(dá)具有其它免疫球蛋白片段的嵌合型蛋白的載體方面的進(jìn)一步應(yīng)用的資料。為了本發(fā)明的目的,利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的并描述過的方法(例如Sambrook等人,同上文)用編碼hIFNγR片段的DNA順序替代上述載體中CD4編碼部分,產(chǎn)生質(zhì)粒如phuIFNγR-HG1(實(shí)施例5)、phuIFNγR-HG3(實(shí)施例6)和phuIFNγR-HCk(實(shí)施例7)。
例如,合適的表達(dá)載體包括pBC12MI[ATCC 67109]、pSV2dhfr[ATCC 37146]、pSVL[Pharmacia Uppsala,Sweden]、pRSVcat[ATCC 37152]和pMSG[Pharmacia,Uppsala]。優(yōu)選用于表達(dá)嵌合型hIFNγR-免疫球蛋白多肽的載體是pN316和pN346型載體(參見圖2和圖3),由此得到表達(dá)載體pN316-huIFNγR-HG1、pN316-huIFNγR-HG3和pN346-huIFNγR-HCK(參見實(shí)施例5、6和7),所述三種質(zhì)粒已分別轉(zhuǎn)化到E.coli K803中,根據(jù)為了專利目的的布達(dá)佩斯條約于1993年1月26日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM),Brauschweig,F(xiàn)ederal Republic of Germany,保藏號(hào)分別是DSM7421、7419、7420。這些載體最好通過例如轉(zhuǎn)染作用導(dǎo)入到適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中。
能夠應(yīng)用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括例如人赫拉細(xì)胞、H9細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3細(xì)胞和C127細(xì)胞、CV1非洲綠猴腎細(xì)胞、鵪鶉QC1-3細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞和COS細(xì)胞系。優(yōu)選的是CHO細(xì)胞系(ATCC CCL 61)。
為了進(jìn)行表達(dá),也可將編碼嵌合型hIFNγR-免疫球蛋白多肽的DNA順序整合到 酵母或昆蟲細(xì)胞中的適宜載體上。例如,為了在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn),可以應(yīng)用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞載體系統(tǒng)(參見綜述Luclow和Summers,Bio/Technology 6,47-55)。在用重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的嵌合型多肽能進(jìn)行包括N-糖基化作用(Smith等人,Proc.Natl..Acad.Sci.USA82,8404-8408)和O-糖基化作用(Thomsen等人,12.International Herpesvirus Workshop,University of Philadephia,Pennsylvania)的翻譯后加工。
依據(jù)所選擇的表達(dá)載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)確定進(jìn)行本發(fā)明嵌合型hIFNγR-免疫球蛋白多肽的表達(dá)的方式。
通常,在最適合于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)含有所需表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。一個(gè)典型的表達(dá)載體含有啟動(dòng)子成分(介導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄)、蛋白質(zhì)編碼順序和轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行有效中止及多腺苷酸化所需的信號(hào)。其它的成分可以包括增強(qiáng)子和由剪接的供位和受位結(jié)合的插入順序。
用于指定編碼順序瞬間表達(dá)的大多數(shù)載體都攜帶SV40復(fù)制原點(diǎn),它使得指定順序在細(xì)胞(如COS細(xì)胞)中復(fù)制以達(dá)到高拷貝數(shù),所說的細(xì)胞在組成上表達(dá)啟始病毒DNA合成所需的T抗原。瞬間表達(dá)并不僅限于COS細(xì)胞。任何能被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系都能用于此目的。控制高效轉(zhuǎn)錄的成分包括來自SV40的早期或晚期啟動(dòng)子和來自逆轉(zhuǎn)錄病毒(如RSV、HIV、HTLVI)的長(zhǎng)末端重復(fù)片段(LTRs),然而,還可以用細(xì)胞的信號(hào)(例如,人-β-肌動(dòng)蛋白-啟動(dòng)子)。
另外,可以在與選擇性標(biāo)志(如gpt、dhfr、新霉素或潮霉素)共轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上篩選攜帶整合入染色體中之目的的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。
目前,已能夠擴(kuò)增被轉(zhuǎn)染的基因以大量地表達(dá)外源基因。二氫葉酸還原酶(DHFR)是開發(fā)攜帶多于1000個(gè)拷貝目的基因的細(xì)胞系的有用標(biāo)志。在提高氨甲喋呤用量的條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,然后,移出氨甲喋呤,細(xì)胞系含有整合到染色體中的擴(kuò)增基因。在用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的表達(dá)載體中,是用勞氏肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子控制表達(dá)。
用適宜表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞以及用于其轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體和表達(dá)重組嵌合型多肽也是本發(fā)明的目的。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的蛋白質(zhì)化學(xué)法可以從細(xì)胞群或培養(yǎng)物上清液中純化本發(fā)明的嵌合型多肽,所說的方法有例如沉淀法(例如硫酸銨沉淀法)、透析法、超濾法、凝膠過濾法、離子交換層析法、十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、等電聚焦法、親和層析法(如免疫親合層析法)、正相或反相高效液相法(HPLC)等。優(yōu)選的是,在親合層析法后獲得在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)的嵌合型hIFNγR-免疫球蛋白多肽。
本發(fā)明的嵌合型多肽以及其生理適合的鹽能被用于治療病程中牽涉IFNγ的疾病,例如,治療自身免疫性疾病(如Ⅰ型糖尿病、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、慢性炎癥(如施瓦茨曼型反應(yīng))、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、異體移植排斥反應(yīng)、多發(fā)性硬化、暴發(fā)型肝炎以及因IFNγ激活的巨噬細(xì)胞釋放的神經(jīng)毒素喹啉酸引起的炎性神經(jīng)病性疾病。另外,該嵌合型多肽還能被用于艾滋病患者以延緩感染的慢性化,延長(zhǎng)疾病的無癥狀期和防止神經(jīng)病性并發(fā)癥。該嵌合型多肽還能作為IFNγ拮抗劑加以應(yīng)用,以預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、萊姆病和敗血癥的神經(jīng)病性并發(fā)癥和/或用于生產(chǎn)相應(yīng)的藥物制劑??梢运帉W(xué)適用的口服、注射或局部用組合物和方式施用該嵌合型多肽。劑量和給藥率可以與已知IFN類藥物在臨床上的現(xiàn)行使用的情況相類似。本發(fā)明的藥物組合物含有嵌合型多肽或其生理適用的鹽及可藥用的載體材料。任何常規(guī)載體材料都可以應(yīng)用。載體材料可以是一種適于腸內(nèi)、透皮或胃腸外給藥的有機(jī)或無機(jī)物。合適的載體包括水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物油、聚二醇類、凡士林等。而且,藥物制劑可以含有其它藥用活性劑。根據(jù)所認(rèn)可的藥物調(diào)劑的實(shí)際,可以添加另外的添加劑,如調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。
可以將藥物制劑制成任何常規(guī)劑型,包括a)適于口服給藥的固體形式,如片劑、膠囊劑、丸劑、粉劑、顆粒劑等;b)適于口服給藥的液體形式,如溶液劑、糖漿劑、懸浮液劑、酏劑等;c)適于胃腸外給藥的制劑,如滅菌溶液劑、懸浮液劑或乳劑;d)局部用的制劑,如溶液劑、懸浮液劑、軟膏劑、霜?jiǎng)?、膠囊劑、微?;蹌?、氣霧劑等。該藥物制劑可以是經(jīng)滅菌的,和/或可以含有佐劑,如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、改變滲透壓的鹽和/或緩沖劑。
胃腸外的劑型可以是能經(jīng)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射的輸注液劑或注射液劑。這些制劑還可含有其它的醫(yī)藥用活性物質(zhì)。其它的添加劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等可根據(jù)所認(rèn)可的藥物調(diào)劑的實(shí)際情況而添加。
本發(fā)明的這類藥物制劑和本發(fā)明的化合物為治療目的的用途也是本發(fā)明的目的。
到目前為止已從總體上描述了本發(fā)明,通過參照具體的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。除非另有指明,本文所包括的實(shí)施例及附圖僅僅是為了進(jìn)行說明,而非意在限制。
圖1表示shIFNγR cDNA的核酸順序(SEQ.ID No.2)和由之導(dǎo)出的氨基酸順序(SEQ.ID No.1)。使用核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫符號(hào)表示所說順序。
圖2是表達(dá)載體pN316的示意圖。所用的縮寫和符號(hào)的含義為RSV=勞氏肉瘤病毒LTR順序(啟動(dòng)子);rppi 3′intron+poly A=大鼠前胰島素原3′內(nèi)含子和多腺苷酸化作用位點(diǎn);PSV40=猿猴病毒40(SV40)病毒啟動(dòng)子;mDHFR=小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR);SV40 poly A=SV40病毒多腺苷酸化作用位點(diǎn)順序;ampicillin=賦予對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因;在實(shí)施例中描述的經(jīng)亞克隆方法滅活的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)示于括號(hào)中。
圖3是表達(dá)載體pN346的示意圖。所用縮寫和符號(hào)的含義是RSV=勞氏肉瘤病毒LTR順序(啟動(dòng)子)rppi 3′intron+poly A=大鼠前胰島素原3′內(nèi)含子和多腺苷酸化作用位點(diǎn);PSV40=SV40病毒啟動(dòng)子;mDHFR=小鼠DHFR;SV40 poly A=SV40病毒多腺苷酸化作用位點(diǎn)順序;ampicillin=賦予抗生素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因;CMV=巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus)增強(qiáng)子部分的順序。在實(shí)施例中描述的經(jīng)亞克隆過程滅活的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)示于括號(hào)中。
圖4是表達(dá)載體pN316-huIFNγR-HG 1的示意圖??s寫和符號(hào)參見圖2的說明。
圖5是表達(dá)載體pN316-huIFNγR-HG3的示意圖。縮寫和符號(hào)參見圖2的說明。
圖6是表達(dá)載體pN346-huIFNγR-HCk的示意圖??s寫和符號(hào)參見圖3的說明。
圖7表示shIFNγR和hIFNγR-HG3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例1測(cè)序所有的cDNA或其經(jīng)適宜的限制性內(nèi)切酶消化所得的片段都被亞克隆到pUC18/19型載體中(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。利用以Sanger方法為基礎(chǔ)的方案測(cè)序并涉及Taq聚合酶及雙鏈DNA。
實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)載體pN346和pN3161.制備含有CMV增強(qiáng)子部分的片段利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等人,Science 230,1350-1354)獲得含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)速發(fā)早期基因的增強(qiáng)子的232bp的片段(Boshart等人,Cell 41,521-530)。
PCR是基于DNA片段的酶擴(kuò)增反應(yīng)兩個(gè)其3′末端相對(duì)定向的寡核苷酸引物與靶順序的相對(duì)鏈雜交。模板熱變性、引物與其互補(bǔ)順序一起退火和退火的引物在DNA聚合酶的作用下延伸,重復(fù)上述循環(huán),產(chǎn)生由PCR引物5′端確定的片段的擴(kuò)增。在每個(gè)引物的5′端增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有利于PCR最終產(chǎn)物的克隆(Scharf等人,Science 233,1076-1078)。
下列寡核苷酸已被用于擴(kuò)增含CMV增強(qiáng)子部分的DNA片段1)5′-GGGCTCGAGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGG3′(SEQ.ID No.8)(正向引物),和2)5′-CCCGTCGACCCTACCGCCCATTTGCGTCAATG3′(SEQ.ID No.9)(反向引物)
利用商售可得的試劑盒(“Geneclean”,BIO 101 Inc.La Jolla,Ca.)從瓊脂糖凝膠中分離被擴(kuò)增的片段。然后用核酸內(nèi)切酶Xhol和Sall(限制性位點(diǎn)在上述引物的劃線處)消化所得片段并按上文所述再次純化(片段1)。
2.制備載體片段利用了含有勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)片段(LTR)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen等人,Molecular and Cellular Biology,March 1985,438-447)和多接頭區(qū)的表達(dá)載體pK21。所說的多接頭區(qū)含有能使目的基因發(fā)生整合(劃線的PvuⅡ位點(diǎn))的下列順序5′-AAGCTTGGCCAGGATCCAGCTG ACTGACTGATCGCGAGATC3′(SEQ.ID No.10)3′-TTCGAACCGGTCCTAGGTCGAC TGACTGACTAGCGCTCTAG5′(SEQ.ID No.11)在基因克隆位點(diǎn)的下游,該載體包含3′內(nèi)含子、多腺苷酸化作用位點(diǎn)和大鼠前胰島素原基因的終止信號(hào)。
用XhoⅠ消化質(zhì)粒pK21,然后再用牛小腸堿性磷酸酶處理以從DNA片段的5′端除去磷酸,如上所述,從瓊脂糖凝膠分離脫磷酸化的載體(片段V1)。
3.制備質(zhì)粒pN340用T4連接酶連接片段1和片段V1。
然后轉(zhuǎn)化E.coli HB 101細(xì)胞,并利用限制性內(nèi)切酶切圖譜和測(cè)序鑒定含有正確方向增強(qiáng)子片段(與在CMV增強(qiáng)子中方向相同)的轉(zhuǎn)化株。所得質(zhì)粒命名為pN340。
4.構(gòu)建表達(dá)載體pN346制備片段F2用XhoⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pN340。所得的XhoⅠ和XbaⅠ片段含有啟動(dòng)子(CMV增強(qiáng)子片段+RSV-LTR)、如上所示的多接頭區(qū)和3′內(nèi)含子+大鼠胰島素原基因的多腺苷酸化信號(hào)。如上所述,用Genclean從瓊脂糖凝膠中分離所得片段。然后用Klenow酶填充該片段的粘末端(片段2)。
制備載體片段V2質(zhì)粒pN308是表達(dá)載體pSV2DHFR(同上文)的衍生物,用PvuⅡ消化然后再用牛小腸堿性磷酸酶處理,失去單個(gè)EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)之間的區(qū)域。如上所述,分離脫磷酸化的載體(片段V2)。
連接片段F2和片段V2用T4連接酶連接鈍端載體片段V2和鈍端片端F2。
然后轉(zhuǎn)化E.coli HB 101細(xì)胞,并用限制性內(nèi)切酶切分析和測(cè)序鑒定含有所需方向的片段2的轉(zhuǎn)化株。所得質(zhì)粒命名為pN346(圖3)。
5.構(gòu)建質(zhì)粒pN316除了以質(zhì)粒pK21取代pN340外,如第4段所述同樣構(gòu)建質(zhì)粒pN316。結(jié)果,質(zhì)粒pN316缺乏片段1(如上文第一段所述),只含有RSV LTR啟動(dòng)子成分(圖2)。
構(gòu)建質(zhì)?!皃hIFNγR”在 下面幾段中描述了質(zhì)粒的構(gòu)建過程。在未指定具體的參考文獻(xiàn)或制備的詳細(xì)方法時(shí),都是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)(Sambrook 等人,“Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版),Cold,Spring Harbor Laboratory)。
用EcoR1限制性內(nèi)切酶從噬菌體λgt11-hIFNγR-16(Aguet等人,Cell 55,273-280)切除插入順序,在所用條件下獲得部分酶切消化的DNA。約2.2kb的完整插入片段被連接到質(zhì)粒pUC18中,所得的構(gòu)建體之一-質(zhì)粒phIFNγR被選來用作進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)化E.coli K803如Sambrook等人(同上文)所述,利用熱休克法用質(zhì)粒phIFNγR(實(shí)施例2)轉(zhuǎn)化E.coli K803細(xì)胞。
實(shí)施例4分離質(zhì)粒DNA利用標(biāo)準(zhǔn)方法/(Birnboim和Doly,Nucl.Acids Res.7,1513(1979);Sambrook等人,1989,同上文)從轉(zhuǎn)化的E.coli K803細(xì)胞(實(shí)施例3)中制備質(zhì)粒DNA,從質(zhì)粒phIFNγR中切除編碼可溶性hIFNγR的插入順序,并如實(shí)施例1所述進(jìn)行測(cè)序。shIFNγR的完整核酸順序及由此導(dǎo)出的氨基酸順序示于圖1中。
實(shí)施例5構(gòu)建嵌合型人IFNγR-IgG1(HG1)分子首先,利用質(zhì)粒phIFNγR作模板和利用下列的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)1)5′-AATTCGAGCTCGTAGCAGCATGGCTCTCCTCTTTC3′(SEQ.ID No.3),與hIFNγR cDNA順序的24個(gè)核苷酸配對(duì)[5′未翻譯區(qū)(5′-UT)的8個(gè)殘基和hIFNγR編碼區(qū)的16個(gè)核苷酸],含有SacⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);
2)5′-TTAAGCTTACTTACCACCTTTTATACTGCTATTGA-3′(SEQ.ID.No.4),與shIFNγR編碼區(qū)的后20個(gè)核苷酸配對(duì),并含有另外的15個(gè)殘基,其中有3個(gè)核苷酸編碼HGγ1分子中絞鏈區(qū)的第一個(gè)氨基酸殘基,其余的是由HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)相隨的剪接位點(diǎn)。
在生產(chǎn)商說明的條件下(Perkin-Elmer,Cetus,USA)利用Taq聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。
經(jīng)酚抽取和乙醇沉淀后,將PCR產(chǎn)物再懸浮于適當(dāng)緩沖液中,并按照現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法用SacⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化。
然后,將PCR片段連接至經(jīng)SacⅠ-HindⅢ酶切消化并經(jīng)凝膠純化的pCD4-Hγ1載體上,產(chǎn)生質(zhì)粒phuIFNγR-HG1。
用SacⅠ和KpnⅠ酶裂解質(zhì)粒phuIFNγR-HG1。然后,再懸浮于適宜緩沖液中,并借助標(biāo)準(zhǔn)方法利用Klenow聚合酶使其末端鈍化。所得的片段經(jīng)純化后連接至經(jīng)PvuⅡ打開的表達(dá)載體pN316中。用HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化所得質(zhì)粒,并篩選攜帶約2.55和0.95kb片段的構(gòu)建體。該構(gòu)建體被命名為pN316-huIFNγR-HG1。該構(gòu)建體的示意圖見圖4。
實(shí)施例6構(gòu)建嵌合型人IFNγR-IgG3(HG3)分子除了下列例外,使用同實(shí)施例5所述相同的方案所用PCR 3′接頭是5′-AATTCGAGCTCACCTTTTATACTGCTATTGA(SEQ ID NO.5)SacⅠ如順序所示,產(chǎn)生了一個(gè)額外的限制性位點(diǎn)。SacⅠ位點(diǎn)下游的前18個(gè)核苷酸與可溶性hIFNγR的最后6個(gè)氨基酸配對(duì)(hIFNγR順序中的245至240位,以Met開始作為第1號(hào),如Auget等人所述,同上文)。最后兩個(gè)核苷酸與hIFNγR中第239位的氨基酸密碼子的第3和第2個(gè)核苷酸配對(duì)。
此外,用SacⅠ消化代替SacⅠ/HindⅢ對(duì)PCR產(chǎn)物的雙酶切消化,并將pCD4-Hγ3用作免疫球蛋白基因部分的來源。用SacⅠ消化pCD4-Hγ3,然后將PCR片段連接到經(jīng)SacⅠ消化的pCD4-Hγ3載體上。篩選含有約7.2kb KpnⅠ/SacⅡ片段的構(gòu)建體,并命名為phuIFNγR-HG3。
另外,為了與表達(dá)載體pN316進(jìn)行連接,在結(jié)束T4DNA聚合酶補(bǔ)齊之前先用KpnⅠ(裂解DNA上SacⅠ位點(diǎn)上游數(shù)個(gè)核苷酸,該SacⅠ位點(diǎn)起始是由5′-PCR引物所引入的;參見實(shí)施例5)和SphⅠ消化hIFNγR-IgG3嵌合型基因構(gòu)建體。
所得質(zhì)粒用HindⅢ/SacⅡ限制性內(nèi)切酶雙酶切消化,在眾多條帶中篩選出能產(chǎn)生2.3kb片段的構(gòu)建體。該構(gòu)建體被命名為pN316-huIFNγR-HG3。該構(gòu)建體的示意圖是圖5。
實(shí)施例7構(gòu)建嵌合型人IFNγR-HCK分子除了下述例外,使用實(shí)施例5所述的相同方案將按Sambrook等人(同上文)所述制備的人基因組λ-噬菌體文庫(kù)用作基因組免疫球蛋白K輕鏈恒定區(qū)的來源,用HindⅢ和BamHI限制性內(nèi)切酶消化含有人免疫球蛋白K輕鏈基因的λ克隆,純化含一個(gè)基因組的CK基因區(qū)段的5.4kb片段,繼而連接到Bluescript KS-質(zhì)粒(Stratagene,La Jolla,Ca.)中,產(chǎn)生質(zhì)粒pBS-HCK。
質(zhì)粒phuIFNγR-HG1(如實(shí)施例5所述)被用作hIFNγR片段的來源。該質(zhì)粒在SacⅠ位點(diǎn)處被打開,并且用T4 DNA聚合酶構(gòu)建 鈍端。通過連接具有下列順序的兩個(gè)合成的回文寡核苷酸而將XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)加到鈍端上5′-CCGCTCGAGCGG(Seq.ID No.6)3′-GGCGAGCTCGCC(Seq.ID No.7)這些寡核苷酸得自于Promega,Madison,用XhoⅠ和HindⅢ消化經(jīng)連接XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)后所得的并含有hIFNγR片段的質(zhì)粒。
用凝膠純化所得片段,隨后連接到上述經(jīng)XhoⅠ/HindⅢ打開的質(zhì)粒pBS-HCK中,產(chǎn)生質(zhì)粒phuIFNγR-HCK。
用XhoⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒phuIFNγR-HCK,因而切除長(zhǎng)度約6.2kb的雜合基因構(gòu)建體。如上所述鈍化并純化該片段。
然后,將所得的hIFNγR-HCK嵌合型基因構(gòu)建體與經(jīng)PvuⅡ打開的pN346載體DNA連接,產(chǎn)生質(zhì)粒pN346-huIFNγR-HCK。該構(gòu)建體的示意圖見圖6。
如實(shí)施例5所述,篩選具有優(yōu)選方向之插入片段的質(zhì)粒構(gòu)建體,考慮到片段長(zhǎng)度的差異,優(yōu)選的構(gòu)建體的特征在于其為0.85和6.8kb,而不是2.25和5.4kb片段(其余的片段是不變的)。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞和表達(dá)嵌合型hIFNγR-Ig多肽在含有5%胎牛血清(FBS)的α-最低限度必需培養(yǎng)基(α-MEM,GIBCO/BRL,Paisley,Scotland)中培養(yǎng)CHO-dhfr-細(xì)胞。將細(xì)胞鋪板于平皿(直徑為35mm)中以在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天獲得約90%匯合的單層細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前抽吸培養(yǎng)基并用pH7.2、含0.14M NaCl和15mM磷酸鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗單層細(xì)胞。往平板加入1ml無FBS的α-MEM并于37℃保溫三小時(shí)。轉(zhuǎn)染混合物含有10μ1 Lipotectin(GIBCO,Gaithersburg,MD,U.S.A.),1μg pSV2-Neo質(zhì)粒DNA(Southern和Berg,J.Mol.Appl,Genet.1,327-341)和5μg的huIFNγR-HG1、huIFNγR-HG3或huIFNγR-HCKDNA之一。將混合物加至細(xì)胞中,5小時(shí)后在每一平皿中加入1ml含10%FBS的α-MEM。然后培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。為了進(jìn)行篩選,用胰蛋白酶消化細(xì)胞并將細(xì)胞再懸浮于含α缺陷(minus)MEM(缺少核苷的α-MEM)和1mg/mlG418(GIBCOBRL,Paisley,Scotland)的選擇培養(yǎng)基中,并鋪板于培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中。將平皿孵育12天,收集發(fā)育良好的克隆并轉(zhuǎn)移至12-多孔平皿中。用一種特異性ELISA(詳見實(shí)施例10,圖7和表Ⅰ)分析這些克隆的上清液以檢測(cè)hIFNγR-Ⅰg多肽的存在。將產(chǎn)量最高的克隆用漸進(jìn)增加濃度的氨甲喋呤(MTX,Sigma,St.Louis,MO)進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)增,MTX濃度起始為0.01μM,最高至80μM。所分泌的hIFNγR-Ⅰg多肽的產(chǎn)量達(dá)到10-20μg/ml。
實(shí)施例9純化hIFNγR-Ig多肽用蛋白G柱(5ml Protein G Sepharose 4 Fast Flow,Pharmacia LKB,Uppsala)將hIFNγR-HG1和huIFNγR-HG3雜合蛋白從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的上清液中純化出來,用抗-人IFNγR受體柱將雜合蛋白hIFNγR-HCK純化,該受體柱是按照生產(chǎn)廠家的指導(dǎo)說明通過將60mg單克隆抗體γR46聯(lián)結(jié)至3g CNBr活性Sepharose 4B(Pharmacia LKB,Uppsala)上并裝入柱中而制備的。另一種方法是將hIFNγR-HCK于上述方法制備的抗人kIg輕鏈親和柱上進(jìn)行親和純化。將2升上清液以50ml每小時(shí)的流速上樣。以pH2.8的0.1M對(duì)羥苯基甘氨酸-鹽酸洗脫蛋白。收集每1.5ml的組分,以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和還原條件下的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析hIFNγR-Ig雜合分子。
實(shí)施例10用ELISA檢測(cè)hIFNγR-Ig多肽用單克隆抗體γR46和γR89(用于ELISA中hIFNγR的檢測(cè))以檢測(cè)轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞上清液中hIFNγR-Ig多肽的存在。這些單克隆抗體是按照Garotta等人(J.Biol Chem.265,6908-6915)的描述制備的針對(duì)天然人IFNγ受體的抗體。兩種單克隆抗體只結(jié)合非還原形式的人IFNγ受體、識(shí)別人IFNγ受體細(xì)胞外部分的結(jié)構(gòu)抗原決定簇并抑制IFNγ結(jié)合至與細(xì)胞結(jié)合的人IFNγ受體??贵wγR46是一種檢測(cè)氨基酸26-133之間抗原決定簇的IgM。而抗體γR89是一種與位于氨基酸70-210之間的另一抗原決定簇反應(yīng)的IgG1。根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明,將單克隆抗體γR46在抗-小鼠-IgM-瓊脂糖柱(Sigma,St.Louis,MO)上進(jìn)行親和純化。根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明,將單克隆抗體γR89在蛋白G柱(Pharmacia LKB,Uppsala)上進(jìn)行親和純化。
用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)稀釋抗體γR46貯液,從而獲得10μg/ml純抗體溶液。將含1μg純抗體的100μl該溶液分布于Maxisorp微滴定板(Nunc,Naperville,Ⅰ1)中以包被平底塑料孔。包被反應(yīng)在15-25℃的條件下進(jìn)行過夜。然后通過向每孔中各加入250μl含10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的封閉緩沖液(TRIS/HC1 0.2M,pH7.5)并在15-25℃的室溫下保溫微滴定板24小時(shí)(h)封閉塑料殘余的結(jié)合力。用含5%胎牛血清(FSA)的試驗(yàn)緩沖液(TRIS/乙酸鹽0.05M,pH6.2)將含有由轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)的hIFNγR-Ig多肽hIFNγR-HG3、hIFNγR-HG1或hIFNγR-HCK的上清液稀釋1∶5、1∶50、1∶500、1∶5000。標(biāo)準(zhǔn)溶液用試驗(yàn)緩沖液稀釋為含30ng/ml、10ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml和0.1ng/ml的可溶性hIFNγR、hIFNγR-HG3、hIFNγR-HG1或hIFNγR-HCK試驗(yàn)前,傾出已包被平板上的封閉緩沖液,并將每份樣品或標(biāo)準(zhǔn)稀釋液取200μl分布于已包被平板的3個(gè)孔中。最后,向各孔中加入50μl(100ng/ml)結(jié)合有過氧化物酶(Gallati等人,J.Clin.Chem.Biochem.20,907-914,)的γR89抗體。在15~25℃保持16~24小時(shí)后,用去離子水沖洗平板6~8次,再向每孔中加入200μl以底物緩沖液(K-檸檬酸鹽,0.03M,pH4.1)經(jīng)1∶20稀釋的N-四甲聯(lián)苯胺/H2O2溶液(0.01M3,3′,5,5′-N-四甲聯(lián)苯胺,0.08M H2O2,溶于10%丙酮、90%乙醇中)。在15~25℃保持10分鐘后,向每孔中加入100μl 5%硫酸終止酶促反應(yīng),顏色變?yōu)榧t色可在540nm波長(zhǎng)處使用光度計(jì)(Titerlek Multiskan MC,from Flow Laboratories Woodcock Hill,U.K.)進(jìn)行檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞表達(dá)的hIFNγR-Ig多肽的濃度shIFNγR的適宜標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得(結(jié)果參見下面的表Ⅰ和圖7)。
表Ⅰ用特異性ELISA確定hIFNγR-Ⅰg多肽的濃度受體蛋白 樣品 稀釋倍數(shù) mOD μg/ml450nmhIFNγR-HG3(*) 21 200 981 0.4022 1,000 1091 2.2423 5,000 578 5.60hIFNγR-HG1(*) 11 200 862 3.4812 1,000 288 4.8413 5,000 822 8.27hIFNγR-HCK(*) 31 200 1271 5.2832 1,000 662 1.30433 5,000 1035 10.61shIFNγR(△) 1 200 437 0.112 1,000 598 0.783 25,000 871 2.85*)按hIFNγR-HG3標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的數(shù)據(jù)△)按shIFNγR標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的數(shù)據(jù)。
實(shí)施例11用SDS-PAGE和免疫印跡法分析hIFNγR-Ig多肽在7.5%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。將樣品分別加載于含或不含用于還原或非還原SDS-PAGE的還原劑的樣品緩沖液中。用考馬斯亮藍(lán)R-250(Sigma,St.Louis,MO)對(duì)條帶染色,或?qū)l帶印跡至硝化纖維素膜上,并用單克隆抗體γR46或γR89(Garotta等人,同上文)和碘化或用Ⅰg抗小鼠Ⅰg(Amersham,LittleChalfont,U.K.)顯現(xiàn)或用親和純化的抗人IFNγ受體兔抗體(Valente等人,Eur.J.Immunol.22,2403~2412)和碘化驢Ig抗兔Ig(Amersham,Little Chalfont.U.K.)顯現(xiàn)。每種hIFNγR-Ig多肽的分子量總結(jié)于下面的表Ⅱ和Ⅲ中。
實(shí)施例12用hIFNγR-Ig多肽抑制IFNγ結(jié)合至Raji細(xì)胞上借助抑制IFNγ結(jié)合至Raji細(xì)胞表面受體上測(cè)定CHO細(xì)胞中表達(dá)的hIFNγR-Ig多肽的結(jié)合力。用HBSS(Hank′s基礎(chǔ)鹽溶液;GIBCO/BRL.Paisley,U.K.并補(bǔ)充有1%BSA和15mM HEPES)系列稀釋含hIFNγR-Ig多肽(hIFNγR-HG3、hIFNγR-HG1和hIFNγR-HCK)的溶液,并將每50ml的溶液分成三份分布于聚苯乙烯U型底微滴定板(Costar,Cambridge,MA)的孔中。在用HBSS稀釋后,將50μl碘化IFNγ 2ng(200U)(2×104dpm/ng)加入至每孔中。然后加入含106Raji細(xì)胞(ATCC CCL 86)的100μl HBSS培養(yǎng)基。在0℃孵育90分鐘后,以100xg離心滴定板5分鐘,棄去含未結(jié)合放射性IFNγ的上清液,以沖洗緩沖液(加有0.1%BSA、15mM HEPES和0.01%Triton X100的Hank′s基礎(chǔ)鹽溶液)沖洗細(xì)胞兩次。然后將細(xì)胞再懸浮于200μl沖洗緩沖液中并轉(zhuǎn)移至可彎曲的U型底PVC微滴定板(Dynatech,Chantilly,VA)中,再一次離心。截?cái)嗫蓮澢宀y(cè)定每孔中的放射性。用氯胺T法(Greenwood等人,Biochem.J.89,114-123)碘化IFNγ。
以漸進(jìn)增加劑量(0.4-9ng)的碘化IFNγ與106Raji細(xì)胞孵育來進(jìn)行Scatchard′s分析(Scatchard Ann.N.Y.Acad.Sci.51,660-672)。在過量的冷IFNγ存在下(10μg/ml)測(cè)定非特異性結(jié)合的量。不同受體蛋白抑制IFNγ與Raji細(xì)胞結(jié)合的能力總結(jié)于下表Ⅱ中。
表Ⅱ抑制IFNγ結(jié)合至Raji細(xì)胞被表達(dá)的受體蛋白 MW 結(jié)合位點(diǎn) IC50 IC50kDa ng/ml nMhIFNγR-HG3 184 2 24 0.13hIFNγR-HG1 170 2 29 0.17hIFNγR-HCK82 1 42 0.51shIFNγR 31 1 100 3.23MW是用非還原性SDS-PAGE估測(cè)的分子量。
IC50是對(duì)3ng碘化IFNγ結(jié)合106Raji細(xì)胞產(chǎn)生50%的抑制作用時(shí)的濃度。
實(shí)施例13用hIFNγR-Ig多肽抑制IFNγ的抗病毒活性通過抑制由IFNγ產(chǎn)生的抗病毒活性,測(cè)定CHO細(xì)胞表達(dá)的hIFNγR-Ig多肽的結(jié)合能力。用源自GIBCO/BRL并添加了5%FBS的最低限度必需培養(yǎng)基(MEM)系列稀釋含hIFNγR-Ig多肽(hIFNγR-HG3,hIFNγR-HG1或hIFNγR-HCK)的溶液。將每一稀釋液50μl分成三份加至組織培養(yǎng)級(jí)的平底微滴定板(Costar)的孔中。然后向每孔加入25μl含0.25pg IFNγ(1U/ml IFNγ制品,比活性為108U/mg)的IFNγ溶液。室溫一小時(shí)后,依照Armstrong(Methods in Enzymology),S.Pestka編輯,第78卷,第38頁(yè),Academic Press New York)的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)讀出法測(cè)定其中的IF-Nγ活性。因此,將溶于含5%FBS的MEM中的WISH細(xì)胞(ATCC CCL25)懸浮液(4×105細(xì)胞/ml)50μl加至96孔微滴定板的各孔中,在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱(5%CO2)中于37℃孵育。24小時(shí)后棄去培養(yǎng)上清液,然后向各孔中加入100μl含2% FBS的MEM培養(yǎng)基和1000個(gè)空斑形成單位的腦心肌炎(EMC)病毒(ATCC VR-129B)。在37℃使平板保溫90分鐘,棄去培養(yǎng)基,以100μl含2%FBS的M-EM替代,約24小時(shí)后,當(dāng)孔中不含IFNγ的細(xì)胞顯示100%致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí),棄去培養(yǎng)基,并用PBS沖洗剩余粘附的細(xì)胞。然后向每孔中加100μl結(jié)晶紫溶液(1%結(jié)晶紫、10%乙醇溶于水中制成)。5分鐘后,在染色的單層細(xì)胞干燥前,用水沖洗去除未結(jié)合的染料。最后,將細(xì)胞結(jié)合的染料抽提入100μl甲基溶纖劑中,并在Titertek Multiskan MC(Flow Laboratories,Woodcock Hill,U.K.)上在550nm處讀取吸收值以定量。由于染料的量與每孔中細(xì)胞的數(shù)目成比例,所以所得到的吸收值讀數(shù)為IFNγ對(duì)病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)防護(hù)的量度。hIFNγR-Ig多肽hIFNγR-HG3、hIFNγR-HG1或hIFNγR-HCK抑制IFNγ的抗病毒活性的能力總結(jié)于下表Ⅲ中。
表Ⅲ抑制IFNγ抗病毒活性被表達(dá)的受體蛋白 MW 結(jié)合位點(diǎn) IC50 IC50kDa μg/ml nMhIFNγR-HG3 184 2 2.0 11hIFNγR-HG1 170 2 4.4 26hIFNγR-HCK82 1 nd ndshIFNγR 31 1 6.7 216MW是用非還原性SDS-PGAE估測(cè)的分子量。
IC50是對(duì)10U/ml(5ng/ml)IFNγ發(fā)揮的抗病毒活性的抑制達(dá)到50%時(shí)的濃度。
nd=未測(cè)。
順序表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)州名BS(E)國(guó)家瑞士(F)郵政編碼CH-4002(G)電話061-688 42 56(H)電傳061-688 13 95(I)傳真962292/965542 hlr ch(ⅱ)發(fā)明名稱嵌合型人γ-干擾素受體/免疫球蛋白多肽(ⅲ)順序數(shù)11(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)載體類型Floppy dish(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0,#1.25版本(EPO)(ⅳ)現(xiàn)有的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朎P93810170.6(B)申請(qǐng)日1993年3月5日(2)SEQ ID NO1(ⅰ)順序特征
(A)長(zhǎng)度245個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度735bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義否(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度35bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)反義是(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO3AATTCGAGCT CGTAGCAGCA TGGCTCTCCT CTTTC 35(2)SEQ ID NO4(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度35bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義是(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO4
TTAAGCTTAC TTACCACCTT TTATACTGCT ATTGA 35(2)SEQ ID NO5(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度31bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義是(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO5AATTCGAGCT CACCTTTTAT ACTGCTATTG A 31(2)SEQ ID NO6(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度12bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義是(ⅷ)在基因組中的位置
(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO6CCGCTCGAGC GG 12(2)SEQ ID NO7(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度12bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義是(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO7CCGCTCGAGC GG 12(2)SEQ ID NO8(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度33bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否
(ⅲ)反義否(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO8GGGCTCGAGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGG 33(2)SEQ ID NO9(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度32bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義否(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO9CCCGTCGACC CTACCGCCCA TTTGCGTCAA TG 32(2)SEQ ID NO10(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度41bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義否(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO10AAGCTTGGCC AGGATCCAGC TGACTGACTG ATCGCGAGAT C 41(2)SEQ ID NO11(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度41bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的否(ⅲ)反義否(ⅷ)在基因組中的位置(C)單位bp(ⅹⅰ)順序的描述SEQ ID NO11GATCTCGCGA TCAGTCAGTC AGCTGGATCC TGGCCAAGCT T 4權(quán)利要求
1.含有兩部分DNA順序結(jié)合的DNA順序,其中一部分順序編碼入γ-干擾素受體的片段,該片段結(jié)合入γ-干擾素,另一部分順序編碼人免疫球蛋白重鏈或輕鏈(如IgG、IgA、IgM、IgE或Ck)的部分或全部恒定區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA順序,其中一部分順序編碼結(jié)合人γ-干擾素的人γ-干擾素受體片段,而另一部分順序編碼IgG(特別是IgG1和IgG3)的部分或全部恒定區(qū),或者編碼Ck的部分或全部恒定區(qū)。
3.含有如權(quán)利要求1或2所述的DNA順序的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的能在相容性原核生物、昆蟲或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的載體。
5.用如權(quán)利要求3或4所述的載體轉(zhuǎn)化的原核生物的宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
6.由如權(quán)利要求1或2所述的DNA順序編碼的重組蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的重組蛋白,選自hIFNγR-HG1、hIFNγR-HG3或hIFNγR-HCk。
8.生產(chǎn)如權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)的方法,包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化宿主,并分離所說的蛋白質(zhì)。
9.含有一種或多種如權(quán)利要求6或7所述的化合物的藥物組合物,如果需要,還可含有其它的藥用活性劑和藥用載體材料。
10.權(quán)利要求6或7所述的化合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求6或7所述的化合物在制備用于治療疾病的藥品中的應(yīng)用,所說的疾病特別包括 自身免疫性疾病、慢性炎癥、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、異體移植排斥反應(yīng)、多發(fā)性硬化和暴發(fā)型肝炎、炎性神經(jīng)病性疾病以及艾滋病、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、萊姆病和敗血癥的神經(jīng)病性并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及嵌合型γ-干擾素受體/免疫球蛋白多肽和編碼該嵌合型多肽的DNA順序及其制備方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1094092SQ9410269
公開日1994年10月26日 申請(qǐng)日期1994年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月5日
發(fā)明者Z·登姆比克, G·加羅塔, R·詹茨 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司