一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的基因載體是由硬脂酰修飾的多肽經(jīng)二硫鍵橋連而成的；本發(fā)明還涉及上述基因載體的制備方法，以及上述基因載體在基因治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體具有轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率高且細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，為基因治療中的基因遞送提供了一種有效的手段。
【專利說明】一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體及其制備方法與 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體及 其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 基因治療是將基因（主要為DNA或RNA)傳遞到病人特定細(xì)胞中，從而促進(jìn)或抑制 目標(biāo)蛋白的表達(dá)，達(dá)到治療人類疾病的目的。在基因治療實(shí)際應(yīng)用過程中，由于基因片段容 易被核酸酶降解，且?guī)ж?fù)電荷，分子量較大，本身很難通過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，這就需要利 用基因載體來保護(hù)并傳遞基因片段進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)?；蜉d體既要保證高的轉(zhuǎn)染效率，又要 有較低的細(xì)胞毒性。因此，發(fā)展低毒高效的基因傳遞載體是基因治療成功應(yīng)用的重要前提。
[0003] 基因載體分病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒類基因載體是將病毒中的致病基 因以治療基因替代，由于控制病毒進(jìn)入細(xì)胞、胞內(nèi)運(yùn)輸以及編碼進(jìn)入細(xì)胞核部分的基因還 在病毒載體上，所以病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是靶基因表達(dá)效率高，但同時(shí)也有免疫原性、可能激活 原癌基因引發(fā)腫瘤及難以大量制備等缺點(diǎn)，從而限制了病毒載體的臨床應(yīng)用。非病毒基因 載體的優(yōu)勢(shì)在于免疫原性弱，制備方便，對(duì)基因材料的要求限制少。非病毒基因載體分為聚 合物和脂質(zhì)體兩大類，前者有聚乙烯亞胺（PEI)、殼聚糖（CS)、聚氨基酸（PAA)、樹枝狀大分 子（PAMM)、多肽等，后者有陽離子脂質(zhì)體、DNA脂質(zhì)涂層復(fù)合物、類脂質(zhì)體等。
[0004] 多肽類載體主要是指細(xì)胞穿透肽（CPP)，由于容易制備，毒性低，同時(shí)還具有穿透 細(xì)胞膜的特性，近年來受到了很大的關(guān)注。細(xì)胞穿透肽能夠與基因片段形成載體/基因 復(fù)合物，從而有效地引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽中的帶正電的氨基酸如 精氨酸在引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮了主要作用（van Asbeck AH, Beyerle A, McNeill H, Bovee-Geurts PH, Lindberg S,Verdurmen WPj et al.Molecular parameters of siRNA-cell penetrating peptide nanocomplexes for efficient cellular delivery. ACS nano. 2013 ;7:3797-807.)。
[0005] 載體/基因復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后首先富集在內(nèi)吞體中，之后內(nèi)吞體與 溶酶體融合，基因片段進(jìn)入溶酶體，在溶酶體中降解。因此基因片段必須從內(nèi)吞體和溶酶體 中釋放，進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中才能夠發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)組氨酸具有"質(zhì)子海綿"作用，可以在內(nèi) 吞體和溶酶體中溶液的PH降低時(shí)與氫離子結(jié)合，從而阻止內(nèi)吞體中溶液的PH值下降，引起 Cl-內(nèi)流，導(dǎo)致內(nèi)吞體和溶酶體滲透性腫脹，最后內(nèi)吞體和溶酶體破裂從而將基因片段釋放 到細(xì)胞質(zhì)中。
[0006] 硬脂?；且环N親脂性基團(tuán)，與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層有很高的親和力，利用硬脂 酰修飾基因載體可以增加載體與細(xì)胞膜的親和力，從而提高載體引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞的 能力。
[0007] 基于上述理論，本發(fā)明提供了一種富含精氨酸和組氨酸并修飾有硬脂?；鶊F(tuán)的可 降解多肽基因載體，克服了當(dāng)前多肽類載體還存在引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞的能力不強(qiáng)、基 因轉(zhuǎn)染效率不高、不可降解的缺陷。
[0008] 目前尚無有關(guān)硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種可生物降解的，且引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞的能力強(qiáng)、 基因轉(zhuǎn)染效率高的多肽類基因載體；本發(fā)明的另一目的是提供該多肽類基因載體的制備方 法；本發(fā)明的第三目的是提供該多肽類基因載體在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題是：如何提高多肽類基因載體引導(dǎo)基因片段進(jìn)入 細(xì)胞的能力，以及如何提高多肽類基因載體所載基因的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)保證材料具有可生 物降解特性。
[0011] 本發(fā)明基于：一是細(xì)胞膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，基因載體經(jīng)親脂性基團(tuán)硬脂酰基 修飾后可以增加與細(xì)胞膜親和力，從而增加基因載體引導(dǎo)基因片段進(jìn)入細(xì)胞的能力。二是 同一類基因載體的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性往往與分子量有關(guān)，一般來說多肽載體分子量較 低，基因轉(zhuǎn)染效率比較低，將多肽載體聚合起來，可以增加分子量載體的基因轉(zhuǎn)染效率，但 同時(shí)也可能會(huì)增加載體的細(xì)胞毒性。由于細(xì)胞內(nèi)富含谷胱甘肽,細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也含有 二硫鍵異構(gòu)酶，這兩種物質(zhì)都能夠迅速的將二硫鍵打開，多肽載體經(jīng)過二硫鍵橋連聚合后， 可以在不增加細(xì)胞毒性的情況下，增加基因轉(zhuǎn)染效率。
[0012] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體，由精氨酸、組氨酸、硬脂 ?；桶腚装彼峤M成的多肽，精氨酸帶正電可以與帶負(fù)電的基因片段結(jié)合并具有穿膜作 用，組氨酸可以促進(jìn)基因片段進(jìn)入細(xì)胞后迅速的釋放到細(xì)胞質(zhì)中，硬脂?；梢栽黾虞d體 與細(xì)胞膜的親和力，半胱氨酸的巰基氧化形成二硫鍵，從而使多肽聚合起來，形成高分子的 聚合物。
[0013] 本發(fā)明的第一個(gè)方面，是提供了一種硬脂酰修飾的多肽，所述的多肽的氨基酸序 列如下所示：
[0014] HHHCRRRRRC(SEQ ID N0:1);氨基酸之間以肽鍵相連，多肽可簡(jiǎn)寫SH3CR5C,縮寫為 HR ；
[0015] 所述的硬脂酰修飾，是指硬脂?；c組氨酸的氨基以酰胺鍵連接。
[0016] 本發(fā)明所述的硬脂?；揎椀亩嚯目梢院?jiǎn)寫為：Stearyl-H3CR5C，可簡(jiǎn)寫為SHR， 其中stearyl-為硬脂酰基，H為組氨酸，C為半胱氨酸，R為精氨酸，Stearyl-H 3CR5C縮寫為 SHR。
[0017] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體，所述的基因 載體為上述的硬脂酰修飾的多肽的聚合物，所述的聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I )所示，其 中的n為彡3的整數(shù)：
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種硬脂酰修飾的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 示，氨基酸之間以肽鍵相連； 所述的硬脂酰修飾，是指硬脂酰基與組氨酸的氨基以酰胺鍵連接。
2. -種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體，其特征在于，所述的基因載體為如權(quán)利 要求1所述的硬脂酰修飾的多肽的聚合物，所述的聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I )所示，其 中的n為彡3的整數(shù)：
所述的硬脂酰修飾的多肽的通過半胱氨酸經(jīng)二硫鍵連接形成聚合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體，其特征在于，所 述的聚合物的分子量為5000-50000Da。
4. 一種如權(quán)利要求2所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的制備方法，其特征 在于，所述的制備方法包括如下步驟： (A) 合成如權(quán)利要求1所述的一種硬脂酰修飾的多肽； (B) 硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的制備：將步驟（A)合成的硬脂酰修飾的多 肽溶于水，加入半胱氨酸鹽酸鹽，使硬脂酰修飾的多肽與半胱氨酸的摩爾比為2. 5-15:1，調(diào) 節(jié)溶液的pH為7-8 ;在攪拌下加入過氧化氫H2O2，至過氧化氫的終濃度為0. 02% -0. 5 %，攪 拌反應(yīng)6-24小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的制備方法，其特征在 于，步驟（B)具體為： 取步驟（A)合成的硬脂?；揎椀亩嚯呐c半胱氨酸鹽酸鹽溶解在水中，使得硬脂?；?修飾的多肽與半胱氨酸鹽酸鹽的摩爾比為2. 5-15:1，加入氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7. 0， 在攪拌下向溶液中加入H2O2，至過氧化氫的終濃度為0. 02% -0. 5%，攪拌反應(yīng)6-24小時(shí)， 反應(yīng)溫度為室溫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的制備方法，其特 征在于，步驟（B)反應(yīng)后的溶液移入截留分子量為1000的透析袋中，透析液為蒸餾水，透析 6小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體的制備方法，其特征在 于，將透析后的溶液低溫凍干，并在-20°C保存。
8. -種如權(quán)利要求2所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體在制備基因治療藥 物中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體在制備基因治療藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是指基因載體中的精氨酸帶正電與帶負(fù)電的基因進(jìn)行 結(jié)合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體在制備基因治療藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的帶負(fù)電的基因是RNA。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的硬脂酰修飾的多肽類可降解基因載體在制備基因治療藥 物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用具體為： 將可基因載體與RNA混合，制得基因轉(zhuǎn)染體系； 所述的基因載體與RNA的氮磷比為5:1?15:1 ; 所述的基因載體與RNA在緩沖液中混合，緩沖液pH為5. 0?7. 0,室溫孵育20?60分 鐘。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK104356199SQ201410597352
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】高申, 臺(tái)宗光, 朱全剛, 王曉宇, 田涇, 姚翀, 劉旭, 胡楚玲, 顧芬芬 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)