4Aβ1-15衍生的單克隆抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種4Aβ1-15衍生的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號為CCTCC C2014173的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。本發(fā)明的單克隆抗體能清除Aβ沉積，而不引起微出血負擔，同時實現(xiàn)較少的小膠質細胞激活以避免炎癥因子和T細胞被進一步過度激活，因而可用于預防和治療阿爾茨海默病的治療。
CCTCC C2014173
2014.09.28
【專利說明】4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學領域，尤其涉及一種4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體、產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤、包含該單克隆抗體的藥物組合物、包含該單克隆抗體的試劑盒，以及該單克隆抗體的應用。

【背景技術】
[0002]阿爾茨海默病(AD)是一種最常見的癡呆和神經(jīng)退行性疾病的形式，導致老年人逐漸喪失記憶和認知功能。眾所周知，AD的神經(jīng)病理學特征是腦內細胞外蛋白的斑塊沉積。家族性和散在的案例都認為A β斑塊是其常見的病理特征，提示我們治療的方法應該從抑制其生成，促進其降解以及增強其從腦內清除三方面入手。
[0003]現(xiàn)在，刺激AD患者腦內的Αβ清除成為治療AD最具革新性的藥理學手段，免疫療法通過注射Αβ抗原(主動免疫)或抗Αβ抗體(被動免疫)，已經(jīng)被證實是治療AD最先進和最可能成功的手段(可參見:H.J.Fu, B.Liu, J.L.Frost, C.A.Lemere (2010)Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer’s disease.CNS&neurological disordersdrug targets 9, 197.；N.A.Castello et al.(2014) 7, 8-Dihydroxyf lavone, a smallmolecule TrkB agonist, improves spatial memory and increases thin spine densityin a mouse model of Alzheimer disease-like neuronal loss.PloS one 9，e91453.)。首例人類臨床試驗研究了一種聚合的Αβ 1-42肽段，名為AN1792，發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中可以安全有效地誘導出有利抗體，但在二期臨床被終止，因為人免疫試驗導致了副反應——6%試驗患者產(chǎn)生了腦膜腦炎。已經(jīng)證實主動免疫產(chǎn)生的嚴重副反應顯然是由于豐富的T細胞反應，而可以被大多數(shù)抗Αβ抗體識別的位點位于Αβ蛋白的氨基末端(Αβ1-15區(qū)域)(可參見:X.Guanj J.Zouj H.Guj Z.Yao (2012) Short amyloid-beta immunogens withspacer-enhanced immunogenicity without junct1nal epitopes for Alzheimer’sdisease immunotherapy.Neuroreport 23，879.)。
[0004]由于嚴重的副反應，主動免疫療法逐漸減少使用，而直接注射抗Αβ單克隆抗體(被動免疫)作為一種新的方式進行試驗(可參見:R.Robert，K.LWark (2012)Engineered antibody approaches for Alzheimer’s disease immunotherapy.Archivesof b1chemistry and b1physics 526，132.)。與主動免疫的免疫反應性誘導T細胞產(chǎn)生并伴隨嚴重的副反應相比，被動免疫療法在APP/PS1轉基因小鼠中引起免疫反應不需要生成T細胞，被認為具備適用于人類臨床的一些特別的優(yōu)勢(可參見:K.Gas1rowskij J.Leszek(1997)A proposed new strategy of immunotherapy for Alzheimer’s disease.Medical hypotheses 49，319.)。理論上，抗Αβ的被動免疫療法被認為擁有更快更安全的免疫應答，并且與主動免疫相比潛伏期更短，成為一種更加直接可控的針對A β免疫反應的選擇(可參見:F.Panza et al.(2011)Ant1-beta-amyloid immunotherapy forAlzheimer’s disease: focus on bapineuzumab.Current Alzheimer research 8，808.；B.Solomon,R.KoppeljE.HananjT.Katzav(1996)Monoclonal antibodies inhibit invitro fibrillar aggregat1n of the Alzheimer beta-amyloid peptide.Proceedingsof the Nat1nal Academy of Sciences of the United States of America 93，452.；G.A.Jicha(2009)Is passive immunizat1n for Alzheimer’s disease’ alive andwell’or’dead and buried’ ? Expert opin1n on b1logical therapy 9，481.)。
[0005]之前的研究表明大多數(shù)在人類和動物體內產(chǎn)生的抗Αβ抗體識別的位點位于Αβ蛋白的氮端(Αβ 1-15)，而T細胞位點已經(jīng)被證實在Αβ 15-42(可參見:X.Guan，J.Yang,H.Gu,J.Zou, Z.Yao(2013)Immunotherapeutic efficiency of a tetravalentAbeta1-15vaccine in APP/PSItransgenic mice as mouse model for Alzheimer’sdisease.Human vaccines&immunotherapeutics 9, 1643.；M.Lee et al.(2005)Abeta42immunizat1n in Alzheimer’s disease generates Abeta N-terminalantibodies.Annals of neurology 58, 430.)。在發(fā)明人的實驗室，已經(jīng)制備了4Αβ 1-15(由肽段GPGPG連接的四段Αβ1-15重復序列)，用4Αβ1_15蛋白主動免疫后，在AD轉基因模型鼠APP/PS1中可以顯著減少Αβ病理變化并且改善認知功能(可參見:X.Guan, J.Zou, H.Gu, Z.Yao(2012)Short amyloid-beta immunogens withspacer-enhanced immunogenicity without junct1nal epitopes for Alzheimer’sdisease immunotherapy.Neuroreport 23, 879.；X.Guan, J.Yang, H.Gu, J.Zou, Z.Yao (2013)Immunotherapeutic efficiency of a tetravalent Abetal_15vaccinein APP/PSItransgenic mice as mouse model for Alzheimer’s disease.Humanvaccines&immunotherapeutics 9, 1643.)。但主動免疫仍可能存在著副反應,如T細胞增殖引起的炎癥反應，可能會對其進一步應用產(chǎn)生影響。
[0006]雖然過去已經(jīng)產(chǎn)生出抗A β 1-42的多克隆和單克隆抗體，但無一被證實能在動物和/或人中產(chǎn)生所需的療效而又不產(chǎn)生嚴重的副作用。例如，對高齡ΑΡΡ23小鼠接受的持續(xù)5個月每周一次的N末端定向性抗A β 1-42抗體的臨床前研究所得的被動免疫結果顯示治療相關性副作用。特別是這些小鼠比用鹽水處理的小鼠顯示出微出血量和嚴重程度加劇(Pfeifer et al.，Science2002298:1379)。也有文章描述高齡(>24 個月)Tg2576 和 PDAPP小鼠有類似的出血增加情況(Wilcock et al., J Neuroscience2005, 25:629-636)。在這兩種小鼠品系中，注射抗體Αβ 1-42都導致微出血的顯著增加。
[0007]單克隆抗體技術是抗體制備的經(jīng)典方法，該技術比較成熟，應用廣泛。本發(fā)明人旨在利用單克隆抗體與Αβ特異性結合，達到清除Αβ沉積，而不引起微出血負擔，同時實現(xiàn)較少的小膠質細胞激活以避免炎癥因子和T細胞被進一步過度激活，從而實現(xiàn)對老年性癡呆的預防和治療。


【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供能清除Αβ沉積，而不引起微出血負擔，同時實現(xiàn)較少的小膠質細胞激活以避免炎癥因子和T細胞被進一步過度激活的單克隆抗體。
[0009]本發(fā)明的技術方案如下:一種4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體，所述單克隆抗體由于2014年9月28日保藏于中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為CCTCCC2014173的雜交瘤細胞株5C8H5產(chǎn)生。
[0010]在上述技術方案中，4Αβ 1-15是由GPGPG連接的四段Αβ 1-15重復序列，其中，Αβ 1-15氨基酸序列為:DAEFRHDSGYEVHHQ。4Αβ 1-15去除了 Αβ的T細胞抗原表位保留了Αβ的B細胞抗原表位，并用多個重復B細胞抗原表位增強抗原的免疫原性，避免了細胞免疫反應保證了強的體液免疫反應。在發(fā)明人的實驗室中，已經(jīng)證明用4Αβ 1-15蛋白主動免疫后，在阿爾茨海默病(AD)轉基因模型鼠APP/PS1中可以顯著減少A β病理變化并且改善認知功能，但考慮到主動免疫可能存在的副反應，發(fā)明人采用雜交瘤細胞株技術，通過大量實驗以及豐富技術經(jīng)驗，用4Αβ 1-15抗原制備了一種全新的單克隆抗體，命名為5C8H5，接種了 AD轉基因模型鼠APP/PS1。發(fā)明人檢測了 5C8H5接種和4Αβ 1-15接種的小鼠血清和腦內的抗Αβ抗體，可溶性/不可溶性的Αβ 40/42，Αβ斑塊，神經(jīng)發(fā)生，膠質細胞激活和行為學。這些結果揭示在AD轉基因模型鼠APP/PS1中，4Αβ 1_15衍生的單克隆抗體與其相應的抗原免疫組相比，擁有更好的免疫治療效果，能夠誘導更多的Αβ消除和行為學的改善同時伴隨較少的小膠質細胞激活。5C8H5雜交瘤細胞株已被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C2014173，本發(fā)明的單克隆抗體被鑒定為IgGl型，效價較高。
[0011]作為對上述技術方案的進一步改進，所述單克隆抗體由以下方法制備獲得:
[0012]在小鼠體內接種雜交瘤細胞株CCTCC C2014173，生產(chǎn)腹水抗體，取出腹水進行純化，得到4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體；或者
[0013]體外培養(yǎng)雜交瘤細胞株CCTCC C2014173，分離純化培養(yǎng)液，獲得4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體。
[0014]在上述技術方案中，前一種方法適于大量獲取抗體，后一種方法適于獲得高純度的抗體，通過上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，如鹽析、凝膠過濾、親合色譜層析等方法。
[0015]本發(fā)明還提供了一種雜交瘤細胞株，以保藏號CCTCC C2014173保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0016]在上述技術方案中，本發(fā)明的雜交瘤細胞系具有較強的分泌單克隆抗體的能力(例如，C8H5單抗的細胞培養(yǎng)上清液可進行1:1000倍稀釋后進行ELISA試驗其滴度未明顯下降)，能穩(wěn)定、大量分泌本發(fā)明的單克隆抗體。
[0017]作為對上述技術方案的進一步改進，所述的雜交瘤由以下方法制備獲得:
[0018]4Αβ 1-15蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0細胞按細胞數(shù)量5:1至10:1混合，然后在聚乙二醇作用下進行融合，融合后進行HAT培養(yǎng)，第7天用HT完全培養(yǎng)基換出HAT完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待上清顏色變黃時，吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞，用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定高效分泌4Αβ 1-15單克隆抗體，即獲得所述雜交瘤。
[0019]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述4Αβ 1-15蛋白免疫BALB/C小鼠的步驟為:
[0020]用弗氏完全佐劑乳化抗原進行第一次免疫，免疫劑量為50 μ g/只；與第一次免疫間隔兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化抗原，進行第二次免疫，免疫劑量為50μ g/只；與第二次免疫間隔兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化抗原，進行第三次免疫，免疫劑量為50 μ g/只；與第三次免疫間隔兩周后，進行加強免疫，免疫劑量為10yg/只；加強免疫前，第三次免疫后，用ELISA法測抗體效價，取抗體效價最高的小鼠進行加強免疫。
[0021]本發(fā)明還提供了一種組合物，包括所述的單克隆抗體和藥學上可接受的載體。
[0022]在上述技術方案中，本發(fā)明的組合物可以為多種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液劑(例如可注射和可輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸齊U、散劑、脂質體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預定的給藥方式和治療應用。典型的優(yōu)選組合物為可注射或可輸注溶液劑形式。優(yōu)選的給藥方式是胃腸外(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)給藥。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體通過靜脈內輸注或注射給予。在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗體通過肌肉內或皮下注射給予。還可將輔助性活性化合物摻入到組合物中，在某些實施方案中，可將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種可用于治療阿爾茨海默病或相關疾病或病癥的另外治療藥劑一起共配制和/或共給予。例如，可將一種本發(fā)明抗體或其抗體部分與一種或多種能結合其它靶標的另外抗體一起共配制和/或共給予。
[0023]在上述技術方案中，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的容積、分散介質、包衣料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一個或多個以及它們的組合。在很多情況下，優(yōu)選的是將等滲劑例如糖、多元醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。
[0024]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述的單克隆抗體和能夠產(chǎn)生可檢測信號的標記物。
[0025]本發(fā)明提供的單克隆抗體具有高親和力，能與阿爾茨海默病病人腦組織特異性結合，而不結合正常腦組織。因此，含有單克隆抗體的試劑盒，可用于診斷阿爾茨海默病，特別是阿爾茨海默病的早期診斷。其中，能夠產(chǎn)生可檢測信號的標記物包括但不限于以下:放射性同位素或放射性核素；熒光標記，如FITC、羅丹明；酶標記，如辣根過氧化物酶、熒光素酶或堿性磷酸酶；化學發(fā)光標志；生物素酰基基團；磁性物質。
[0026]本發(fā)明還提供了所述的4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體在制備預防或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。由于4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體5C8H5對阿爾茨海默病擁有較好的免疫治療效果，能夠誘導更多的Αβ消除和行為學的改善同時伴隨較少的小膠質細胞激活，因而可用于預防或治療阿爾茨海默病的藥物的制備中。
[0027]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述藥物的劑型是注射液或凍干制劑。注射液可通過皮下注射、靜脈注射或輸注的方式直接進行給藥。凍干制劑使用時，先用葡萄糖注射液或滅菌注射用水溶解，加液量可根據(jù)臨床需要酌定。對于凍干制劑，還可包括抗凍齊U，如0-10%蔗糖(最好0.5-1.0%)。其它合適的抗凍劑還有海藻糖和乳糖。在注射液和凍干劑型中都可使用穩(wěn)定劑，如l_50mM L-甲硫氨酸(最好5-10mM)。
[0028]本發(fā)明還提供了所述組合物在制備預防或治療阿爾茨海默病的藥物中的應用。優(yōu)選地，所述藥物的劑型是注射液或凍干制劑。
[0029]相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為:
[0030]通過雜交瘤技術，發(fā)明人用4Αβ 1-15免疫小鼠，生產(chǎn)出一種全新的單克隆抗體，篩選出最好的雜交瘤細胞株5C8H5，并鑒定為IgGl型，雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCCC2014173。發(fā)明人通過試驗比較了相同的免疫程序下，分別利用4Αβ 1_15進行主動免疫的小鼠和利用5C8H5進行被動免疫的小鼠后兩組小鼠的AD治療表現(xiàn)效果。結果表明，通過免疫治療的手段，有效誘導了激活的小膠質細胞吞噬清除Αβ沉積，改變了微環(huán)境，進一步促使新增殖細胞向神經(jīng)元分化，有利于行為學的改善。在相同的免疫程序下，5C8H5接種的被動免疫比4Αβ 1-15接種的主動免疫表現(xiàn)出了更好更安全的療效，突出了持續(xù)接種特異性抗體可能成為治療AD的更好的方法，而小膠質細胞的激活被控制在一個機體適合的范圍可能成為治療的關鍵。具體地:
[0031]I)與4Αβ 1-15組相比，5C8H5需要較少次數(shù)的接種，使Αβ抗體達到更高滴度，而且被動免疫不需要潛伏期而直接作用于機體。同時，外周免疫抗Αβ抗體可以穿透血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0032]2) 5C8H5顯著改善APP/PS1轉基因小鼠的活動度，空間學習能力和記憶任務的能力。特別是5C8H5組的小鼠比4Αβ 1-15組表現(xiàn)出更多的提高，被動免疫對APP/PS1的改善作用較優(yōu)于主動免疫。
[0033]3)通過腦片的免疫組織化學和定量圖像分析，顯示出5C8H5的Αβ沉積明顯少于4Αβ 1-15 組。
[0034]4)組織切片結果顯示，5C8H5在引起APP/PS1小鼠Αβ斑塊清除的同時，沒有誘發(fā)微出血的增加或其他一些病理變化。
[0035]5)主動免疫與被動免疫之間A β斑塊相關的小膠質細胞的激活沒有統(tǒng)計學差異，但5C8H5組總的小膠質細胞數(shù)顯著少于4Αβ 1-15組。在與Αβ不相關的區(qū)域中，5C8H5組比4Αβ 1-15組含有顯著較少的小膠質細胞。
[0036]6)神經(jīng)發(fā)生的結果顯示，5C8H5組誘導了比4Αβ 1-15組更多的神經(jīng)發(fā)生，是最接近正常組的。同時，分化成早期神經(jīng)元的新增殖細胞(BrdU+/DCX+)和分化成成熟神經(jīng)元的新增殖細胞(BrdU+/NeuN+)也有類似的結果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為四組小鼠血清和腦內抗Αβ抗體濃度的變化趨勢圖，其中，A為血清中抗Αβ抗體的變化趨勢圖出為腦中抗Αβ抗體的變化圖；
[0038]圖2為四組小鼠的曠場實驗和水迷宮實驗結果圖，其中，A為水平運動結果圖，B為直立運動結果圖，C為理毛行為結果圖，D為定位航行結果圖，E、F為空間探索結果圖；
[0039]圖3為四組小鼠的血清和腦中的Αβ40和Αβ42水平變化圖，其中，A為血清中A β 40的變化趨勢圖，B為血清中A β 42的變化趨勢圖，C為海馬中不可溶性A β 40和A β 42的水平圖，D為海馬中可溶性A β 40和A β 42的水平圖，E為皮質中不可溶性A β 40和A β 42的水平圖，F(xiàn)為皮質中可溶性Aβ 40和Αβ 42的水平圖；
[0040]圖4為三組小鼠海馬和皮質中Αβ沉積的共聚焦激光顯微圖像和定量圖像分析結果圖，其中，A、B、C分別為IgG組、5C8H5組、4Αβ 1_15組小鼠海馬中的Αβ沉積共聚焦激光顯微圖像，D為三組小鼠海馬中的Αβ沉積的定量圖像分析結果圖，Ε、F、G分別為IgG組、5C8H5組、4Αβ 1-15組小鼠皮質中的Aβ沉積共聚焦激光顯微圖像，H為三組小鼠皮質中的Αβ沉積的定量圖像分析結果圖；
[0041]圖5為5C8H5免疫小鼠第三天和第35天的Αβ沉積共聚焦激光顯微圖像和定量圖像分析結果圖，其中，Α、B分別為第3天和第35天小鼠海馬中的Αβ沉積共聚激光焦顯微圖像，C為海馬中Αβ沉積的定量圖像分析結果圖，D、E分別為第3天和第35天小鼠皮質中的Αβ沉積共聚焦激光顯微圖像，F(xiàn)為皮質中Aβ沉積的定量圖像分析結果圖；
[0042]圖6為四組小鼠的海馬和皮質中Αβ斑塊和膠質細胞激活的免疫染色共聚焦激光顯微圖像以及Αβ斑塊和膠質細胞激活的定量圖像分析結果圖，其中，A-D分別為C57組、IgG組、5C8H5組、4Αβ 1-15組小鼠海馬中Αβ斑塊和膠質細胞激活的免疫染色共聚焦激光顯微圖像，E-F別為C57組、IgG組、5C8H5組、4Αβ 1-15組小鼠皮質中A β斑塊和膠質細胞激活的免疫染色共聚焦激光顯微圖像，1-L為C57組、IgG組、5C8H5組、4Α β 1-15組小鼠A β斑塊和膠質細胞激活的免疫染色高倍共聚焦激光顯微圖像(63X油鏡)，Μ、Ν為Αβ斑塊和膠質細胞激活的定量圖像分析結果圖；
[0043]圖7為四組小鼠腦組織免疫組織化學染色共聚焦激光顯微圖像，其中，A-D分別為C57組、IgG組、5C8H5組、4Αβ 1-15組小鼠腦組織經(jīng)BrdU染色后的共聚焦激光顯微圖像，E為四組小鼠齒狀回BrdU+細胞的定量圖像分析結果圖，F(xiàn)-1分別為C57組、IgG組、5C8H5組、4Α β 1-15組小鼠腦組織經(jīng)BrdU+/DCX+染色后的共聚焦激光顯微圖像，箭頭所指部分為BrdU+/DCX+細胞，J為四組小鼠齒狀回BrdU+/DCX+細胞的定量圖像分析結果圖，K-N為C57組、IgG組、5C8H5組、4Αβ 1-15組小鼠腦組織經(jīng)BrdU+/NeuN+染色后的共聚焦激光顯微圖像，箭頭所指部分為BrdU+/NeuN+細胞，O為四組小鼠齒狀回BrdU+/NeuN+細胞的定量圖像分析結果圖。

【具體實施方式】
[0044]本申請中，如無特別說明，本發(fā)明的實施都使用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些技術都是本領域技術人員所掌握的。這些技術在本領域技術人員常用文獻中有詳細第描述，如Sambrook等人編著的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版等。
[0045]在本發(fā)明中，以編號提及的抗體與從相同編號的雜交瘤獲得的單克隆抗體相同。例如，單克隆抗體5C8H5是與從雜交瘤細胞株5C8H5或其亞克隆或后代細胞獲得的抗體相同的抗體。
[0046]在本發(fā)明中，術語“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位?！氨砦弧痹诒绢I域內也稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子的化學活性表面基團如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈組成并且通常具有特定的三維結果特征以及特定的電荷特征。
[0047]在本發(fā)明中，術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”可互換使用，并且當提及術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”時，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細胞。例如，當提及雜交瘤細胞株5C8H5時，其還指雜交瘤細胞株5C8H5的亞克隆和后代細胞。
[0048]在本發(fā)明中，術語“主動免疫”是利用抗原刺激，使機體產(chǎn)生抗體的方法。免疫須經(jīng)幾天，幾個星期或更長時間才出現(xiàn)，但能長久甚至終生保持。
[0049]在本發(fā)明中，術語“被動免疫”是機體被動接受抗體、致敏淋巴細胞或其產(chǎn)物所獲得的特異性免疫能力。它與主動產(chǎn)生的自動免疫不同，其特點是效應快，不需經(jīng)過潛伏期，一經(jīng)輸入，立即可獲得免疫力。
[0050]在本發(fā)明中，術語“單克隆抗體”，簡稱“單抗”，是由B淋巴細胞轉化而來的漿細胞分泌的，每個B淋巴細胞株只能產(chǎn)生一種它專有的、針對一種特異性抗原決定簇的抗體，這種從一株單一細胞株產(chǎn)生的抗體就是單克隆抗體。
[0051]實施例1 4Αβ 1-15肽的合成
[0052]4Αβ 1-15肽的制備方法可參考專利號為“ZL 201010163165.2”，名稱為“重組4Αβ 15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法”的發(fā)明專利，其中，4Αβ 15即本發(fā)明的4Αβ 1-15。本發(fā)明使用的4Αβ 1-15多肽抗原由麗珠制藥公司提供，蛋白純度>95%。
[0053]此外，還可根據(jù)4Αβ 1-15的序列人工合成全長的4Αβ 1_15肽，其中:
[0054]Αβ 1-15 肽氨基酸序列為:DAEFRHDSGYEVHHQ ；
[0055]4A β 1-15肽氨基酸序列為:4段重復的DAEFRHDSGYEVHHQ序列，中間以肽段GPGPG連接，共75個氨基酸。
[0056]實施例2雜交瘤的產(chǎn)生和單抗的制備
[0057]動物免瘡
[0058]將經(jīng)過純化的4Αβ 1-15抗原(蛋白純度> 95% )免疫了 6周齡的Balb/c小鼠。免疫方式為皮下或腹腔注射。第一次免疫時，用弗氏完全佐劑(FCA5Sigma)乳化抗原，免疫劑量為50 μ g/只。間隔兩周后，以弗氏不完全佐劑(FIA ；Sigma)乳化抗原，進行第二次免疫，免疫劑量為SOyg/只。第二次免疫兩周后，以弗氏不完全佐劑(FIA5Sigma)乳化抗原，進行第三次免疫，免疫劑量為50 μ g/只。第三次免疫兩周后，進行加強免疫，免疫劑量為10yg/只。其中，多肽抗原以111^/1111溶于？85，與佐劑按體積比1:1進行免疫。加強免疫前，第三次免疫后，用ELISA法測抗體效價，取抗體效價最高的小鼠進行加強免疫，制備單克隆抗體。
[0059]ELISA最佳抗原包被濃度與最佳陽性血■清稀釋濃度的確定
[0060]陰性對照:取4只8周齡SPF級的Balb/C雌性小鼠，在免疫前對所有小鼠進行斷尾采血，置于室溫l_2h，待血清充分析出時離心分離血清，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061]陽性對照:第三次免疫后10d，再次使用相同的方法采血，4°C保存?zhèn)溆?同時檢測血清中抗體效價)
[0062]采用方陣試驗確定最佳抗原包被濃度和最佳對照血清濃度:
[0063](I)包被:以合成多肽為抗原,按倍比稀釋從第一列為15 μ g/ml,每孔100 μ I/孔一直稀釋到96孔板中第11列，最后一列只加包被液作為空白對照。振動平板以使抗原分布均勻，4 °C過夜。
[0064](2)封閉:第二天，倒掉ELISA板中液體，用吸水紙拍干后，使用多道移液器加入洗滌液200 μ g/孔，置于搖床中快速洗滌5min，倒掉洗滌液，然后使用吸水紙排干，重復洗滌3次；用0.1 %名叫封閉液200 μ g/孔，37°C封閉30min，洗滌3次，吸水紙拍干。
[0065](3)加一抗:陰、陽性血清用稀釋液作 1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、I: 16000、1:32000稀釋，加入相應孔中，100 μ g/孔，設空白對照，37°C孵育60min,洗滌3次，吸水紙拍干。
[0066](4)加二抗:加入HRP標記羊抗小鼠IgG(l:5000稀釋)，100yg/孔，37°C孵育60min，孵育后洗滌液洗滌3次，吸水紙拍干。
[0067](5)顯色:加底物溶液0PD，100 μ g/孔，室溫避光孵育15min，用2M H2SO4終止液終止反應，10yg/孔，因為是使用OPD作為顯色液，隨著時間的推移，顏色會發(fā)生變化，所以在加入終止液后應迅速使用酶標儀讀取實驗結果。在酶標儀中選用450nm的波長，測定實驗結果的OD吸光值。
[0068]把陽性血清孔的OD值接近1.0,陽性血清孔與陰性血清孔的比值大于2.1的抗原血清最大稀釋度作為抗原及對照血清的最適工作濃度，在保證OD值靈敏度的情況下，以最小抗原包被濃度為最佳實驗濃度。
_] 細胞融合
[0070]I) SP2/0細胞(骨髓瘤細胞)的制備
[0071]培養(yǎng)基:RPMI1640完全培養(yǎng)基(1%雙抗+10%胎牛血清)+20yg/ml 8-AG ;細胞濃度以14?5X1Vml為宜，最大濃度不得超過106/ml。
[0072]細胞處于對數(shù)生長的中期時，按1:3?1:10的比例傳代，每3?5天傳代一次。
[0073]將細胞吹勻，取出細胞懸液，置于一潔凈的離心管中，水平離心機1000r/min離心5min，棄上清，加入1640培養(yǎng)液，使細胞混勻，將細胞懸液移入一潔凈的細胞培養(yǎng)瓶中，補加1640至10ml，再將細胞混勻，移出5ml，置于另一潔凈的細胞培養(yǎng)瓶中，混勻，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0074]融合當天，將細胞從培養(yǎng)皿中輕輕吹下，使用50ml離心管收集吹下來的細胞，水平離心機1000r/min離心5min,棄上清,加入1ml不完全培養(yǎng)基,離心洗漆,重復洗漆三次，將細胞重懸于1ml不完全培養(yǎng)基內混勻，取SP2/0細胞懸液，加入質量體積比為0.4%臺盼藍染液，做活細胞計數(shù)，等體積SP2/0細胞懸液和0.4%臺盼藍染液混勻后，加入血球計數(shù)板計數(shù)，細胞濃度稀釋至106個/ml，置于37°C水浴中備用。
[0075]2)免疫脾細胞的制備(融合當天)
[0076]加強免疫的Balb/c雌性小鼠摘眼球靜脈放血，分離血清，_80°C保存，篩選陽性克隆時做間接ELISA的陽性對照用。
[0077]眼球靜脈放血后，迅速將小鼠頸椎脫臼致死，75%酒精浸泡消毒5min，小鼠移入超凈工作臺中，固定于平皿上，滅菌剪刀、鑷子小心剪開前左腿下方皮膚和腹膜，無菌取出脾臟，浸入已盛有基礎培養(yǎng)基的平皿和尼龍膜。剝離被膜結締組織，用注射器針芯研磨充分，懸液轉移至離心管，用基礎培養(yǎng)基沖洗平皿和尼龍膜數(shù)次，并將沖洗液轉移至離心管，水平離心機800r/min離心6min,棄上清,低滲法破碎紅細胞:加2ml純水(高壓滅菌)，吹打5秒，迅速加入2ml的1.8%的氯化鈉溶液(高壓滅菌)，水平離心機800r/min離心6min,棄上清，基礎培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，水平離心機800r/min離心6min，重復2次，棄上清，重懸細胞至10ml，混勻，臺盼藍染色，活細胞計數(shù)后備用。
[0078]3)飼養(yǎng)細胞的制備(融合前一天)
[0079]完全培養(yǎng)基:Hybridoma-SFM培養(yǎng)基+2% HAT+1 %雙抗；
[0080]取8周齡的Balb/c雌性小鼠2只，頸椎脫臼致死，75%酒精浸泡消毒5min，小鼠固定于平皿上，移入超凈工作臺中，鑷子提起小鼠腹部表皮，無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，一次性無菌注射器吸取HAT選擇培養(yǎng)基1ml注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不動，左右用鑷子夾取酒精棉球輕輕揉動小鼠腹部，反復沖洗，注射器吸出腹腔內的培養(yǎng)基(內含巨噬細胞)，沖洗液放入1ml離心管，100rpm/分離lOmin，取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調整細胞數(shù)至每毫升含4萬個活細胞，加入96孔板，0.05ml/孔，放入37°C CO2孵箱培養(yǎng)。
[0081]如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數(shù)量少，則可以在細胞換液時再加入一些。
[0082]每只小鼠可得3-5 X 16個細胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細胞。
[0083]4)細胞融合
[0084]取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按細胞數(shù)量5:1至10:1混合(骨髓瘤細胞SP2/0約3000個/孔)，加入無菌離心管內，1000r/min離心1min,棄上清,無菌紙(高壓滅菌)充分吸干殘余液體(以免影響PEG濃度)，手握離心管垂直輕敲桌面，使兩種細胞充分混勻，直至成糊狀，離心管置于37°C水浴的燒杯中，吸取預熱的50% PEG溶液Iml (過濾器)，60s內緩慢滴入，邊滴邊轉動離心管，靜止作用Imin(輕輕振蕩)，加入37°C預熱的不完全培養(yǎng)基以終止PEG作用:每2min內分別緩慢加入Iml，2ml，3ml，4ml，5ml，1ml培養(yǎng)基，邊滴邊轉動離心管，輕輕攪動離心管使PEG徹底稀釋而失去融合作用，水平離心機100r/min離心1min,棄上清,2%的HAT選擇培養(yǎng)液輕懸細胞沉淀,均勻混合，用移液器輕輕分裝到已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ I ( —般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板)，培養(yǎng)板移至37°C，5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察雜交瘤生長狀況。
[0085]篩詵和克降
[0086]融合后的細胞隔兩天采用半換液的方式更換HAT完全培養(yǎng)基，第7天用HT完全培養(yǎng)基換出HAT完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待上清顏色變黃時，收集上清(一般成功融合的細胞培養(yǎng)基會變黃)，用建立好的間接ELISA方法檢測特異性抗體(以免疫PBS的小鼠或SP2/0細胞培養(yǎng)上清液作陰性對照，陽性血清做陽性對照)。對ELISA檢測呈陽性的細胞進行有限稀釋，并在每次有限稀釋后5-6天進行ELISA測試，測定0D450讀數(shù)。挑去0D450讀數(shù)最高的陽性細胞克隆進行進一步的有限稀釋，直至用ELISA測定96孔板時，整個96孔板的結果均為陽性。從中挑取0D450讀數(shù)較高的陽性細胞克隆，從而獲得產(chǎn)生抗4Αβ 1-15單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將其命名為5C8H5。
[0087]單克隆抗體在小鼠體內誘導腹水產(chǎn)生，抗體用親和色譜分析進行純化。
[0088]細胞培養(yǎng)上清和腹水通過ELISA檢測。我們建立了擁有最高滴度的細胞系5C8H5。根據(jù)單克隆抗體表型分析試劑盒及說明書，雜交瘤細胞系的表型為IgG。雜交瘤細胞系凍存和復蘇后，雜交瘤分泌抗體的穩(wěn)定性沒有減弱。
[0089]實施例3單克隆抗體接種AD轉基因小鼠后免疫學、病理學及行為學觀察試驗
[0090]1、材料與方法
[0091]L I分纟目和免瘡稈序
[0092]小鼠被分為4組(每組8只)，其中三組是AD轉基因模型鼠APP/PS1，由南京大學模式動物研究中心提供，另一組是野生型C57B1/6J小鼠不作處理。三組轉基因小鼠中，其中一組接種單克隆抗體5C8H5(以下簡稱“5C8H5”)作為實驗組。由于5C8H5被鑒定為IgG表型，我們選擇小鼠IgG，一種無關同型對照抗體作為陰性對照，也即第二組接種了小鼠IgG。同時，我們建立了一組小鼠接種4Αβ 1-15抗原，用于比較在相同的免疫程序下，4Αβ 1-15和5C8H5，也就是主動免疫和被動免疫，哪一組能表現(xiàn)出更好的治療AD的效果。
[0093]由于轉基因小鼠腦內的Αβ斑塊可以從6月齡開始被檢測到，而且外周注射抗Αβ抗體可以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)明人計劃通過腹腔注射，從6月齡開始到8.5月齡，每2周一次，一共注射6次。5C8H5和IgG組小鼠每只接種0.1ml (lmg/ml)抗體蛋白，用無菌PBS稀釋(pH 7.4)。4Αβ 1-15抗原處理組用MF59佐劑1:1乳化并通過皮下注射0.1ml (lmg/ml)給小鼠。所有的動物飼養(yǎng)在溫度可控、光循環(huán)可控的設備中，試驗嚴格根據(jù)機構指導方針實施。
[0094]1.2酶聯(lián)免疫反應ELISA檢測血清和腦內的抗A g抗體
[0095]每次免疫后第二天，我們分別通過小鼠尾靜脈采血，4°C保存過夜，8000r/min離心10分鐘分離血清并儲存在-80°c。飼養(yǎng)在標準環(huán)境中的34周齡小鼠深度麻醉后處死。小鼠用生理鹽水灌注。取腦并沿著正中矢狀一切為二。右半腦臨時凍存用于生物學分析，左半腦放在4%多聚甲醛中固定用于免疫組織化學分析。血清和腦勻漿Αβ抗體水平采用ELISA方法檢測?？寡逑♂尯蠹尤?6孔板，37°C孵育I小時，洗板3次。HRP共軛的二抗稀釋后加入96孔板，37°C孵育30分鐘，洗板5次。TMB顯色液加入每孔，然后加入終止液，15-30分鐘顯色，然后讀取吸光度值。
[0096]1.3曠場行為學實駘和水誅宮行為學實齡
[0097]APP/PS1轉基因小鼠第6次接種后一周，我們檢測了曠場和水迷宮的行為學。
[0098]曠場行為學實驗通常用于檢測嚙齒動物的自發(fā)活動和情緒(可參見:A.M.Bronikowski et al.(2001) Open-field behav1r of house mice selectively bredfor high voluntary wheel-running.Behav1r genetics 31,309.)。我們用 60 X 60 厘米長寬和45厘米高的五塊黑色塑料板拼成空曠場地，通過管帶與外界相連。Polytrack錄像系統(tǒng)和相應的 Chromotrack 軟件(PAS2011.exe, PASuse2011.exe, Path View2011.exe, bySan Diego Instruments, Inc., San Diego, CA)用于收集，數(shù)字化和數(shù)據(jù)分析[可參見:A.M.Bronikowski et al.(2001) Open-field behav1r of house mice selectively bredfor high voluntary wheel-running.Behav1r genetics 31, 309 ；E.Mikics, B.Barsy, B.Barsvari, J.Haller(2005)Behav1ral specificity of non-genomic glucocorticoideffects in rats:effects on risk assessment in the elevated plus—maze and theopen-field.Hormones and behav1r 48，152.)。所有實驗都在昏暗的紅色光照下在暗房中進行。在曠場試驗在，小鼠貼壁放下。常規(guī)測試間隔60分鐘。每組試驗后要用水進行試驗裝置清潔，并且用干毛巾擦拭避免殘留影響下一組試驗。行為的視頻被試驗設備上訪2米的高架光敏相機記錄下。
[0099]水迷宮(MWM)是一個檢測嚙齒動物海馬依賴性的空間學習記憶的實驗。它主要是在一個圓周的空曠游泳池中，通過遠端信號導航記錄動物從起始位置到找到水下潛在的平臺(可參見:Y.Ziv et al.(2006) Immune cells contribute to the maintenance ofneurogenesis and spatial learning abilities in adulthood.Nature neuroscience9,268.；C.V.Vorhees, M.T.Williams(2006)Morris water maze: procedures forassessing spatial and related forms of learning and memory.Nature protocolsI, 848.；0.Butovsky et al.(2006)Glatiramer acetate fights against Alzheimer’sdisease by inducing dendritic-like microglia expressing insulin-like growthfactorl.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United Statesof America 103，11784.)。小鼠在一個直徑0.8米的白色無毒的恒溫的(23°C )水池中訓練找到平臺，連續(xù)7天訓練。定位航行包括了 1-4天的采集階段和6-7天的反轉階段，小鼠每天接受4次訓練；第5天是空間探索。第一天，它們要求找到水池中位于水面上訪I厘米的可視平臺，用于檢測APP/PS1轉基因小鼠和野生型小鼠是否具有相似的活動能力和視覺。接下來三天，它們要求在每次訓練中找到位于水面下I厘米的隱藏平臺。逃避潛伏期是每只老鼠在四個象限找到平臺并爬上去的平均時間，最多60秒。每只小鼠可以在平臺停留30秒，然后從設備移入鼠籠。如果小鼠在60秒內沒有找到平臺，它將被手動地放到平臺上，30秒后移回鼠籠。每次試驗的間隔至少300秒。第5天，平臺從水中移出，每只小鼠進行60秒的空間探索。最后兩天，平臺放在前四天的對側象限，小鼠每天仍進行四組再訓練。數(shù)據(jù)用Etho Vis1n自動跟蹤系統(tǒng)記錄。
[0100]1.4免疫組織化學染色
[0101]飼養(yǎng)在標準環(huán)境中的33周齡小鼠腹腔注射Bromodeoxyuridine (BrdU, Sigma-Aldrich ;按體重50mg/kg進行注射)，每天一次連續(xù)5天。接種完之后它們繼續(xù)在這種環(huán)境下飼養(yǎng)。處理組和對照組的小鼠第一次接種后7天深度麻醉處死檢測DCX/BrdU，NeuN/BrdU是在首次免疫BrdU后28天檢測。為了確保腦組織適當?shù)墓潭ê兔庖呷旧?，小鼠用生理鹽水灌注。取腦后按照材料方法沿著正中矢狀切面一切為二。
[0102]免疫組織化學法分析，左半腦后固定過夜，然后放入30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中平衡。我們用冰凍切片機(Leica SM2000R)收集一系列固定后的半腦的40微米厚度冠狀腦切片，每片間間隔240微米，隨機開始取片橫跨整個齒狀回，并在免疫組化之前儲存在4°C。
[0103]用漂片法進行染色。切片封閉并用一抗孵育4°C過夜，然后加入二抗37°C孵育2小時。切片用PBS洗3遍并裱在載玻片上。所有試驗一式三份。
[0104]免疫組化的抗體和試劑。一抗:抗Αβ42_Αβ沉積物(1:2000;英杰公司)，大鼠抗BrdU(l:400 ;牛津生物技術)，羊抗_DCX(1:400 ;圣克魯斯生物技術)，小鼠抗-NeuN(l: 800 ;Sigma),兔抗-1bal (1:1000 ;Wako Chemicals USA).二抗:Alexa Fluor555 羊抗小鼠，Alexa Fluor 594 驢抗大鼠，Alexa Fluor 488 驢抗羊，Alexa Fluor 488 羊抗小鼠，Alexa Fluor 488羊抗兔，(1: 400 ;全部來自英杰公司).
[0105]1.5定量圖像分析
[0106]顯微分析米用Zeiss LSM 710共聚焦激光顯微鏡用于掃描圖像。
[0107]Αβ斑塊和膠質細胞激活的定量圖像分析，是每只小鼠6片40微米的冠狀腦切片間隔240微米免疫染色評估斑塊沉積和Iba-Ι。選擇背側海馬和大腦皮層用于定量分析。切片的解剖學目的區(qū)域(海馬和皮質)用Image-P1 Plus 6.0圖像分析軟件定量，能夠獲取色彩分割并自動通過可編程指令操作。Αβ免疫反應染色區(qū)域用總的腦組織區(qū)域的百分數(shù)表示，膠質細胞免疫反應性的定量圖像分析也用百分數(shù)表示。
[0108]神經(jīng)發(fā)生(BrdU+，BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+)的定量圖像分析，細胞的增殖通過使用體視學細胞計數(shù)設備(MicroBrightField, Williston, USA)計算齒狀回單邊的細胞數(shù)來評估。我們檢測了真實的厚度，定義切片從頂部到底部的適當?shù)膮^(qū)域，避免了采樣過密。測量了間隔240微米的一系列40微米厚度的冠狀腦切片。
[0109]因此，6張冠狀腦切片的分析代表一只小鼠，實驗結果是每組有8只小鼠統(tǒng)計得到的。
[0110]1.6統(tǒng)計分析
[0111]顯微圖像分析，我們使用了 Zeiss LSM 710激光共聚焦掃描顯微鏡。斑塊的定量通過定量圖像分析。切片的平均數(shù)表示每只小鼠的斑塊數(shù)量。細胞的增殖通過使用體視學細胞計數(shù)設備(MicroBrightField, Williston, USA)計算齒狀回單邊的細胞數(shù)來評估。
[0112]數(shù)據(jù)采集采用雙盲。所有的圖片表示平均值土S.D，星號代表統(tǒng)計學差異。數(shù)據(jù)經(jīng)雙因素方差分析檢驗。P < 0.05被認為有意義。
[0113]2 結果
[0114]2.1 5C8H5或4Αβ 1-15的接種誘導血清和腦內抗Aβ抗體濃度的增加
[0115]為了驗證免疫原的接種對AD小鼠模型是否有效，用ELISA檢測了血清和腦內的抗Αβ抗體。
[0116]APP/PS1轉基因小鼠血清中Αβ抗體在6次接種后都可以檢測到。如圖1所示，ELISA檢測5C8H5和4Αβ 1-15的處理顯著增加了小鼠血清和腦內的抗A β抗體濃度。圖1中的A折線圖表示每次接種后一天采血樣檢測的抗A β抗體。第一次接種后，5C8H5處理組的Αβ抗體隨后顯著上升，顯著高于4Αβ 1-15處理組(*#Ρ〈0.001)。同時，5C8H5處理組與4Αβ 1-15處理組相比，Αβ抗體進入平臺期需要較少的免疫次數(shù)，并且在血清內產(chǎn)生了更高的抗體滴度。盡管最后三次5C8H5組和4Αβ 1-15組沒有顯著差異，被動免疫組血清中的抗Αβ抗體仍然高于主動免疫。另一方面，IgG處理組的抗Aβ抗體在每次免疫后可以檢測到輕微的波動。
[0117]6次免疫結束后，飼養(yǎng)在標準環(huán)境下的34周齡小鼠處死取腦用于生物學分析。ELISA檢測抗A β抗體，圖1中的B散點圖表示，5C8H5組腦內的抗Αβ抗體顯著高于4Αβ 1-15處理組，說明被動免疫使更多的抗體進入了中樞神經(jīng)系統(tǒng)。數(shù)據(jù)用平均值土SD表示 A β 抗體(η = 8, *Ρ〈0.05)。
[0118]2.2 5C8H5改善了 AD模型的轉基因小鼠APP/PS1的行為學
[0119]APP/PS1轉基因小鼠和C57從6月齡開始，接受了每2周一次，總共6次的免疫接種。最后一次免疫后一周，我們檢測了小鼠曠場和水迷宮的行為學。
[0120]曠場行為學實驗在安靜的環(huán)境下進行。四組各檢測60分鐘。通過電腦軟件觀察不同的指標。通過最后一次免疫后一周的曠場實驗(如圖2中A-C所示)表明，接種了 6次5C8H5的小鼠比IgG組的水平運動(如圖2中A所示)、直立(如圖2中B所示)、理毛(如圖2中C所示)顯著增加(*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01)，然而與4Αβ 1-15組沒有統(tǒng)計學差異，但是似乎表現(xiàn)得更好，是最接近野生型C57的一組。
[0121]曠場實驗過后，我們進行了水迷宮實驗(MWM)，用于評估海馬依賴性的空間學習記憶能力。小鼠連續(xù)7天被訓練找到平臺。定位航行包括了第1-4天的采集階段和第6-7天的反轉階段，小鼠每天訓練4次；而第5天是空間探索。用小鼠在四個象限60秒內找到平臺并爬上去的平均時間作為每天的逃避潛伏期，我們比較了這四組的水迷宮表現(xiàn)。第一天，可視平臺檢測，四組找到可視平臺的時間沒有差異，表明接種不影響小鼠的運動和視覺。第二天的采集階段，隱藏平臺檢測，四組間仍然沒有差異。第三天和第四天的采集階段，野生型C57小鼠表現(xiàn)最好，5C8H5組和4Αβ 1-15組找到平臺的時間比IgG組顯著減少。顯然的，5C8H5組的小鼠比4Αβ 1-15組在空間學習上表現(xiàn)出更多的改善，但沒有統(tǒng)計學差異(Ρ>0.05)(如圖2中D所示)。在第五天的空間探索階段，平臺從迷宮中移出，5C8H5組和4Αβ 1-15組在之前放置平臺的目標象限的游泳時間和距離顯著高于IgG組(*P〈0.05, **Ρ〈0.01)(單向方差分析)。同時，4Αβ 1-15組與野生型C57組仍有差異(*Ρ〈0.05)(如圖2中E所示)。此夕卜，穿平臺次數(shù)也做了統(tǒng)計，顯示出5C8H5組比IgG組有顯著改善(如圖2中F所示)。在第六天反轉階段，平臺放置在之前位置的對側象限，四組間沒有顯著差異。但是在第七天，5C8H5組比IgG組的逃避潛伏期顯著縮短(Ρ〈0.05)，與4Α β 1_15組沒有統(tǒng)計學差異(如圖2中D所示)。四組間的游泳速度沒有顯著差異。
[0122]2.3免瘡梓種動物的血清中A β 40和A β 42水平h升而腦內下降
[0123]每2周接種了 5C8H5，4AP 1-15或小鼠IgG共6次的APP/PS1轉基因小鼠的A β 40和A β 42被檢測(η = 8) ο
[0124]如圖3中Α、Β所示，在血清中，第一次接種過后,5C8H5組的A β 40和A β 42水平呈現(xiàn)出一個瞬間的下降過程且顯著低于其他兩組轉基因小鼠。但隨著接種次數(shù)的增加，血清中Αβ 40和Αβ 42顯示出逐漸增加的趨勢，直到在第4次接種前后進入平臺期。而4Αβ 1-15組的A β 40和A β 42顯著高于5C8H5組，但沒有統(tǒng)計學差異。與IgG組的A β 40和A β 42不明顯的變化相比，另外兩組表現(xiàn)出了極顯著的差異性(*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001)。
[0125]同時，海馬和皮質中，去垢劑處理的可溶性(如圖3中D、F所示)以及5M鹽酸胍提取的非可溶性的(如圖3中C、E所示)Αβ 40和Αβ 42肽用ELISA進行檢測.結果顯示，與IgG組相比，5C8H5組和4Α β 1-15組的可溶性/非可溶性A β 40和A β 42水平有不同程度的顯著性下降(如圖3中C、F所示)。大部分情況下，5C8H5組的下降比例高于4Αβ 1-15組，有統(tǒng)計學差異(*Ρ〈0.05)。數(shù)據(jù)用平均值土SD表示Αβ 40或Αβ 42。
[0126]2.4在APP/PSI轉某閔小鼠中，5C8H5鉬比4Α β 1-15鉬誘導了審多的腦內斑塊的清除，而不引起微出血.的負擔
[0127]在APP/PS1小鼠右半腦的水平分析后，4%多聚甲醛后固定的左半腦切成40微米厚度的切片進行免疫組織化學分析。免疫組化和圖像定量分析用于檢測Αβ斑塊。
[0128]通過免疫組化，對斑塊負荷的作用是用每一組小鼠Αβ斑塊中間值的腦切片的共聚焦顯微圖像來顯示的,如圖4所示，其中，圖4中的A-C代表海馬，E-G代表皮質。圖4顯示，相比較另外兩組APP/PS1轉基因小鼠，5C8H5處理組的許多大斑塊和大多數(shù)散在的沉積都消失了。如圖4中的D、H所示的定量圖像分析的結果顯示，分別與IgG處理組相比，5C8H5和4Αβ 1-15分別減少了海馬中66%和41 %的斑塊，以及皮質中61%和39%的斑塊(***Ρ〈0.001)。另外，5C8H5處理組小鼠海馬和皮質中的Αβ斑塊沉積都顯著少于4Αβ 1-15組(*Ρ〈0.05)。
[0129]此外，6次免疫后的小鼠腦切片做了組織學實驗，研究5C8H5在導致APP/PS1小鼠Αβ斑塊減少的同時，會不會引起微出血的增加。這一結果與預期相符，這三組的顯微結果顯示沒有微出血和其他病理變化。
[0130]Αβ斑塊的減少促使我們展開另一項實驗，來研究抗體處理究竟是引起了已形成的蛋白的清除，還是僅僅阻止了新的斑塊的形成。9月齡的APP/PS1轉基因小鼠分成兩組，雙周注射5C8H5，然后取腦檢測Αβ斑塊沉積，其中一組初次接種后3天檢測，另一組35天檢測。這一部分實驗證實了文獻中已報導的結果。結果如圖5所示，其中Α、Β代表海馬，D、E代表皮質。結果表明，一方面，經(jīng)過短期處理，大斑塊的數(shù)量沒有明顯的改變，但大多數(shù)大斑塊的面積似乎有所減?。涣硪环矫?，第35天的切片顯示斑塊周圍的彌散的蛋白和小的聚集物似乎有所減少。如圖5中的C、F所示的定量圖像分析結果顯示，在間隔32天中，海馬蛋白減少了 44%，皮質蛋白減少了 52% (#Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001)。這一結果證實了抗體處理是激發(fā)了已經(jīng)存在的蛋白的清除作用。
[0131]2.5被動免疫引起Ag斑塊清除，比主動免疫激活較少的小膠質細胞，而斑塊相關的月交質細胞增多
[0132]通過之前的實驗，我們認識到我們制備的單克隆抗體5C8H5確實可以引起Αβ斑塊的清除。同時，根據(jù)之前的實驗，Αβ清除可能與小膠質細胞的吞噬作用相關，而4Αβ 1-15免疫接種后與對照組相比，清除了 Αβ斑塊卻激活了較少的小膠質細胞。這使我們考慮到，被動免疫是否也能引起小膠質細胞的減少，免疫處理后的小鼠激活的小膠質細胞的免疫反應性與Αβ斑塊的面積相比(細胞/面積)是上升還是下降？帶著這些疑問，我們展開另一項實驗。
[0133]用免疫組織化學的方法對四組的Αβ斑塊和激活的小膠質細胞進行雙標。在野生型C57小鼠中，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)散布在腦切片的各個區(qū)域，而APP/PS1轉基因小鼠的小膠質細胞被激活為阿米巴狀態(tài)并且聚集在Aβ斑塊周圍，二者間似乎相互作用。與IgG處理組相比，5C8H5和4Αβ 1-15小鼠腦區(qū)域中，代表小膠質細胞激活的免疫反性的Iba-1陽性細胞(顏色較亮的部位所示)在海馬(如圖6中A-D所示)和皮質(如圖6中E-H所示)中顯著減。定量圖像分析圖(如圖6中M所示)顯示出5C8H5組和4Αβ 1-15的Iba-1免疫反應性減少的百分比分別為，海馬中60 %和27 %，皮質中52 %和23 %。同時，5C8H5處理組腦區(qū)域中的總的小膠質細胞顯著少于4Αβ 1-15組(*Ρ〈0.05)。這一結果促使我們產(chǎn)生疑問，小膠質細胞的免疫反應性或許反應了主動免疫和被動免疫所遵循的不同途徑。
[0134]為了進一步研究免疫影響的Αβ斑塊相關的小膠質細胞，小膠質細胞免疫反應性(%)與Αβ斑塊沉積(％)的比值也做了統(tǒng)計，也就是單位面積的斑塊所含有的激活的小膠質細胞。為了更清晰地觀察Αβ相關的小膠質細胞免疫反應性，我們呈現(xiàn)了 63Χ油鏡的顯微圖像。正如高倍共聚焦顯微圖像(如圖6中1-L所示)所見，5C8H5組和4Αβ 1-15組單位面積Αβ周圍的激活的小膠質細胞似乎多于IgG組。統(tǒng)計結果證實了我們的預期。
[0135]隨著A β斑塊的減少，5C8H5組和4Α β 1-15組中單位面積A β斑塊平均分布的膠質細胞顯著增加(如圖6中N所示)，而5C8H5的活化的小膠質細胞顯著少于4Αβ 1-15組(如圖6中M所示)?？梢愿爬?，在Αβ斑塊不相關的區(qū)域，5C8H5組的小膠質細胞顯著少于 4Αβ 1-15 組。
[0136]2.6 5C8H5有助于APP/PSl轉某閔小鼠神經(jīng)發(fā)牛的維持
[0137]上述實驗結果促使我們研究，免疫療法在正常環(huán)境下是否有利于神經(jīng)發(fā)生。
[0138]為了解決這個問題，我們用免疫組織化學的方法同時檢測了接種了 6次5C8H5、4Αβ 1-15或mouse IgG的APP/PS1轉基因小鼠和同齡的野生型成年C57小鼠齒狀回的神經(jīng)發(fā)生。
[0139]6次免疫的小鼠在第I次注射BrdU后2天被處死，取腦進行免疫組織化學染色。如圖7中A-E所示，我們觀察到5C8H5組和4A β 1-15齒狀回顆粒下區(qū)中BrdU+染色的新增殖的細胞顯著多于IgG組，而5C8H5組中的BrdU+顯著多于4Αβ 1-15組(*#Ρ〈0.001)。
[0140]我們然后檢測了 Αβ抗體是否也能夠影響新生神經(jīng)元的分化，用BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+染色。注射了 5天BrdU的小鼠(24小時一次，腹腔)在注射BrdU后第7天和第28天被處死。第7天，分析了齒狀回中雙標的表達早期分化的神經(jīng)元(DCX+)的新生細胞(BrdU+)。發(fā)現(xiàn)5C8H5組和4Αβ 1-15組齒狀回中BrdU+/DCX+細胞顯著多于IgG組，但少于野生型小鼠(***P〈0.001 ;如圖7中F-J所示)，而被動免疫比主動免疫誘導了更多的BrdU+/DCX+細胞。四組間新生神經(jīng)元(BrdU+/DCX+細胞)和新增殖的細胞(BrdU+)比值似乎沒有明顯差異(P>0.05，t檢驗)。第28天，5C8H5組和4Αβ 1-15組可以檢測到顯著多于IgG組的fcdU+/NeuN+雙標細胞(*#P〈0.0Ol ;如圖7中K-O所示)，結果與fcdU+/DCX+雙標細胞類似。偶然地，免疫處理組BrdU+/NeuN+與BrdU+/DCX+的比值似乎要高于IgG組，提示我們，更少的增殖的新生神經(jīng)元發(fā)生凋亡。為了定量圖像分析神經(jīng)發(fā)生(BrdU+，BrdU+/DCX+and BrdU+/NeuN+),我們使用了體視學的方法(MicroBrightField, Williston, USA)對齒狀回單邊的細胞增殖進行計數(shù)。
[0141]3.檢測結果分析
[0142]在本實驗中，通過雜交瘤技術，發(fā)明人用實驗室之前的4A β 1-15免疫小鼠，生產(chǎn)出一種全新的單克隆抗體，篩選出最好的細胞株5C8H5并鑒定為IgGl型。結果顯示，與IgG處理組相比，用5C8H5單抗接種APP/PS1轉基因小鼠，導致血清和腦內抗Αβ抗體的上升，認知能力行為的改善，可溶性/不可溶性Αβ的下降，海馬和皮質中Αβ沉積的下降，Αβ斑塊相關的小膠質細胞激活的改變已經(jīng)神經(jīng)發(fā)生的增加。同時，在大多數(shù)情況下，被動免疫表現(xiàn)出比主動免疫更好的治療效果。
[0143]每次免疫過后用ELISA檢測血清中A β抗體水平，并且可以在APP/PS1轉基因小鼠中檢測到。與4Αβ 1-15組相比，5C8H5需要較少次數(shù)的接種，使Aβ抗體達到更高滴度，在腦中類似，證實了之前的報到，也就是被動免疫不需要潛伏期而直接作用于機體。同時，它證實了外周免疫抗Αβ抗體可以穿透血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，認為5C8H5可以被用作更好的治療策略。
[0144]Αβ抗體檢測過后，四組動物檢測了包括曠場和水迷宮的行為學。結果顯示，5C8H5顯著改善APP/PS1轉基因小鼠的活動度，空間學習能力和記憶任務。特別是5C8H5組的小鼠比4Αβ 1-15組表現(xiàn)出更多的提高，但沒有統(tǒng)計學差異?？梢钥闯?，被動免疫對APP/PS1的改善作用較優(yōu)于主動免疫相比。
[0145]然后發(fā)明人檢測了血清和腦內的Αβ 40/42研究它們的變化過程。結果顯示，5C8H5組血清的Aβ 40/42第一次接種后出現(xiàn)了一個瞬間的下降，而4Αβ 1-15組和IgG組沒有明顯的改變。隨著接下來的接種，免疫處理組的A β 40/42繼續(xù)上升直到第四次接種，然后出現(xiàn)下降的趨勢。另一方面，海馬和皮質中可溶性/不可溶性的A β 40/42都檢測到比對照組有所下降，而5C8H5比4Αβ 1-15誘導了更多的Αβ減少。這些結果反應了抗Αβ抗體和Αβ蛋白的免疫反應。我們知道，清除腦內細胞外的Αβ蛋白沉積主要有三種主要途徑:直接通過外源性刺激或酶促進Aβ斑塊的分解和清除，誘導Αβ沉積從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中轉運到外周，激活Fe受體介導的吞噬作用清除體內的Αβ。通過抗原或抗體的注射導致腦內Αβ下降而血清中Αβ上升，與之前的理論相一致，也就是抗體進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過將腦內Αβ沉積轉運到外周來降低其病理過程。有趣的是，初次接種5C8H5后，血清中可溶性/不可溶性的Αβ 40/42呈現(xiàn)出瞬間的下降。這提示我們，當抗Αβ抗體通過外周注射，一部分進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而另一部仍留在血液中立即清除血清中的Αβ 40/42，而主動免疫需要一個長時間的潛伏期來完成應答。
[0146]通過腦片的免疫組織化學和定量圖像分析，顯示出5C8H5和4Αβ 1_15表現(xiàn)出比IgG組顯著的斑塊減少作用，而5C8H5的A β沉積明顯少于4Α β 1-15組。這證明了，抗A β抗體的被動免疫可以充分發(fā)揮清除APP/PS1轉基因小鼠Αβ沉積的作用。有報導顯示，夕卜源性抗A β抗體產(chǎn)生免疫應答不需要T的產(chǎn)生，而主動免疫會引起T細胞的增殖，與一些嚴重的副作用相關，并且在Αβ斑塊的清除中并不是必需的。這些結果證實了被動免疫是比主動免疫更加安全的清除Αβ斑塊的方法。
[0147]組織切片結果顯示，這種全新的單克隆抗體5C8H5在引起APP/PS1小鼠Αβ斑塊清除的同時，沒有誘發(fā)微出血的增加或其他一些病理變化。第一代AD免疫藥物在臨床被終止，因為6%的受試患者出現(xiàn)了腦膜腦炎。如今，一些文獻報導，癡呆病人腦MRI顯示出小圓點樣的損傷，被認為是微出血。副作用成為治療AD的重要問題。被動免疫的小鼠顯微觀察到腦切片沒有病理學和形態(tài)學的變化，表明5C8H5處理的APP/PS1小鼠在減少A β沉積的同時，沒有引起微出血的增加。
[0148]Αβ斑塊的減少促使我們展開另一項試驗，研究抗體處理究竟是引起已經(jīng)存在的蛋白的清除，還是僅僅阻止新斑塊的形成。我們檢測了 9月齡的APP/PS1轉基因小鼠經(jīng)過5C8H5處理3天和35天的腦中蛋白沉積。結果顯示，大斑塊的數(shù)量沒有明顯變化，而35天的腦片中斑塊周圍的散在的蛋白和小的聚集物似乎有所減少。這驗證了抗體免疫刺激了已經(jīng)存在的蛋白的清除，并且可能通過將大斑塊溶解成小聚集物然后清除的途徑。
[0149]通過免疫組織化學，Αβ斑塊和激活的小膠質細胞雙標的共聚焦顯微圖像顯示，在野生型C57小鼠腦中，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，散布于整個腦區(qū)域，而在APP/PS1轉基因小鼠中，小膠質細胞似乎被激活成阿米巴狀并圍繞在Αβ斑塊周圍，形成內含Αβ的吞噬囊泡。結果顯示，與IgG組相比，5C8H5組和4Αβ 1-15組的激活的小膠質細胞顯著減少，而單位面積Αβ斑塊中所含的激活的小膠質細胞的比例(細胞/斑塊)有所增加。隨著更多的Αβ斑塊的清除和Αβ沉積相關的膠質細胞激活，它揭示了 Aβ的清除可能通過小膠質細胞與Αβ斑塊之間相互作用，而不僅僅是影響小膠質細胞的數(shù)量。
[0150]更進一步，在本實驗中，主動免疫與被動免疫之間Αβ斑塊相關的小膠質細胞的激活沒有統(tǒng)計學差異，但5C8H5組總的小膠質細胞數(shù)顯著少于4Αβ 1-15組。可以概括為，在與Αβ不相關的區(qū)域中，5C8H5組比4Αβ 1_15組含有顯著較少的小膠質細胞。我們猜測，當機體接受到外源性抗原的刺激，T細胞激活，一些促炎因子和激素被釋放，包括小膠質細胞被大量持續(xù)地激活。另一方面，我們知道，小膠質細胞是腦內的宿主巨噬細胞，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主動免疫防御的第一道和最重要的防線。在正常環(huán)境下，小膠質細胞不斷地清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的斑塊、有害神經(jīng)元和傳染劑，它也可以識別非己，吞噬異物，呈遞抗原T細胞。但是當小膠質細胞持續(xù)激活并失去控制，大量的炎癥因子如TNF-a、IL-1和氧化應激產(chǎn)物將會被釋放并伴隨T細胞的產(chǎn)生，對正常機體有害并加重神經(jīng)損傷。與主動免疫激活大量的小膠質細胞相比，被動免疫處理的小鼠Αβ斑塊可以被周圍的小膠質細胞及時清除，并且在非Αβ斑塊區(qū)域被控制住正常生理水平，避免了炎癥因子和T細胞被進一步過度激活，被認為是比主動免疫更安全有效的治療方法。
[0151]神經(jīng)發(fā)生的結果顯示，免疫處理組的齒狀回顆粒下區(qū)BrdU+細胞顯著多于IgG組，認為有更多的新生細胞(BrdU+)被標記。此外，5C8H5組誘導了比4Αβ 1_15組更多的神經(jīng)發(fā)生，是最接近正常組的。同時，分化成早期神經(jīng)元的新增殖細胞(BrdU+/DCX+)和分化成成熟神經(jīng)元的新增殖細胞(BrdU+/NeuN+)也有類似的結果。偶然發(fā)現(xiàn)，免疫處理組的BrdU+/NeuN+與BrdU+/DCX+的比值似乎高于IgG組，認為有較少的新生神經(jīng)元發(fā)生凋亡。這些結果證明，齒狀回的細胞增殖可能是由于免疫治療引起的Αβ清除。進一步來說，抗Αβ抗體誘導海馬神經(jīng)發(fā)生不是短暫的。在所有檢測的時間點，5C8H5誘導了比4Αβ 1-15更多的新生神經(jīng)元數(shù)目。由于行為學的改變是由包括神經(jīng)發(fā)生在內的多因素引起，所以被動免疫相對于主動免疫神經(jīng)發(fā)生顯著增多，改善了行為學卻沒有統(tǒng)計學上的差異。
[0152]綜合看來，發(fā)明人的研究表明，通過免疫治療的手段，有效誘導了激活的小膠質細胞吞噬清除Αβ沉積，改變了微環(huán)境，進一步促使新增殖細胞向神經(jīng)元分化，有利于行為學的改善。在相同的免疫程序下，5C8H5接種的被動免疫比4Αβ 1-15接種的主動免疫表現(xiàn)出了更好更安全的療效，突出了持續(xù)接種特異性抗體可能成為治療AD的更好的方法，而小膠質細胞的激活被控制在一個機體適合的范圍可能成為治療的關鍵。
[0153]實驗揭示了，在阿爾茨海默病的免疫治療中，由本實驗室生產(chǎn)的一種全新的單克隆抗體5C8H5，有望成為比其同源的抗原免疫更有前景的免疫治療方法。
【權利要求】
1.一種4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體，其特征在于:所述單克隆抗體由保藏號為CCTCCC2014173的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。
2.如權利要求1所述的4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體，其特征在于:由以下方法制備獲得: 在小鼠體內接種雜交瘤細胞株CCTCC C2014173，生產(chǎn)腹水抗體，取出腹水進行純化，獲得所述4Αβ 1-15衍生的單克隆抗體；或者 體外培養(yǎng)雜交瘤細胞株CCTCC C2014173,分離純化培養(yǎng)液，獲得所述4Α β 1-15衍生的單克隆抗體。
3.一種雜交瘤細胞株，其特征在于:以保藏號CCTCC C2014173保藏于中國典型培養(yǎng)物保減中心。
4.如權利要求3所述的雜交瘤細胞株，其特征在于，由以下方法制備獲得: 1)4Αβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠； 2)取所述BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0細胞，按細胞數(shù)量5:1?10:1混合，然后在聚乙二醇作用下進行融合； 3)融合后進行HAT培養(yǎng)，第7天時用HT完全培養(yǎng)基換出HAT完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)； 4)待上清顏色變黃時，吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞； 5)用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定高效分泌4Αβ1-15單克隆抗體的細胞株，即獲得所述雜交瘤細胞株。
5.如權利要求4所述的雜交瘤細胞株，其特征在于，所述4Αβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠的步驟為: 1)用弗氏完全佐劑乳化抗原進行第一次免疫，免疫劑量為50yg/只； 2)與第一次免疫間隔兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化抗原，進行第二次免疫，免疫劑量為50 μ g/只； 3)與第二次免疫間隔兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化抗原，進行第三次免疫，免疫劑量為50 μ g/只； 4)與第三次免疫間隔兩周后，用ELISA法測抗體效價，取抗體效價最高的小鼠進行加強免疫，免疫劑量為100 μ g/只。
6.一種組合物，其特征在于:包括權利要求1所述的單克隆抗體和藥學上可接受的載體。
7.一種試劑盒，其特征在于:包括權利要求1所述的單克隆抗體和能夠產(chǎn)生可檢測信號的標記物。
8.如權利要求1所述的4Αβ1-15衍生的單克隆抗體在制備預防或治療阿爾茨海默病的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述應用，其特征在于:所述藥物的劑型是注射液或凍干制劑。
10.如權利要求6所述的組合物在制備預防或治療阿爾茨海默病的藥物中的應用。
【文檔編號】C07K16/18GK104327185SQ201410562674
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權日:2014年10月21日
【發(fā)明者】姚志彬 申請人:中山大學