化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用涉及的是基因工程技術(shù)、抗體和試劑盒領(lǐng)域。本發(fā)明是通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，篩選出金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA內(nèi)的強(qiáng)抗原表位，第745個(gè)氨基酸至第877個(gè)氨基酸，共133個(gè)氨基酸，選擇原核生物均偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)該基因片段、制備金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的強(qiáng)抗原表位片段。表達(dá)的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的強(qiáng)抗原表位片段，可用于金黃色葡萄球菌抗體的檢測(cè)及用于免疫制備抗金黃色葡萄球菌的單抗和多抗等。
【專利說(shuō)明】化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)，制備重組金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的FnBPA片段，選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的建立等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]金黃色葡萄球菌是一種能引起人類和動(dòng)物疾病的條件致病菌。它作為正常菌群寄生于人類皮膚和粘膜表面，占醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的大部分。金葡菌能引起皮膚和軟組織感染，以及危及生命的轉(zhuǎn)移性并發(fā)癥，如肺炎、菌血癥，心內(nèi)膜炎，化膿性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎，它廣泛存留于醫(yī)院，引起免疫系統(tǒng)損傷的宿主和手術(shù)病人感染，并存留醫(yī)療器械中。金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，因此，奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品等食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。金黃色葡萄球菌也是各級(jí)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)重點(diǎn)檢測(cè)的病原體之一。因此，建立金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法非常重要。
[0003]傳統(tǒng)鑒定和分離金黃色葡萄球菌的方法步驟較多，并且具有一定的局限性。首先要根據(jù)被檢測(cè)的致病菌類型對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，其鑒定結(jié)果一般只能定性不能定量，并且所需時(shí)間長(zhǎng)，速度慢，一般3~4d才能推測(cè)結(jié)果，準(zhǔn)確鑒定需要5~7天。大多數(shù)免疫學(xué)技術(shù)例如熒光標(biāo)記抗體實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫試驗(yàn)等都得到廣泛應(yīng)用，但它們所需成本較高、耗時(shí)且對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的處理，限制其在生活中的廣泛應(yīng)用。建立一種簡(jiǎn)單、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組金黃色葡萄球菌的FnBPA的部分片段。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的部分片段，第745個(gè)氨基酸一第877個(gè)氨基酸，共133個(gè)氨基酸，選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL21中表達(dá)該基因。表達(dá)的蛋白可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
[0005]金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白(ECMBP)，包括FnBP、ClfA和Ebp等，它們均為細(xì)菌表面的蛋白成分，具有相似的結(jié)構(gòu)。FnbpA是纖連蛋白結(jié)合蛋白(Fnbp)的一種，是細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)成分。通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌臨床分離株Fnbp的雙重PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)95%以上的菌株存在粘附素基因FnbpA而FnbpB基因僅有10%，本研究選用FnBPA作為研究對(duì)象。
[0006]通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，篩選出金黃色葡萄球菌的特異性表面蛋白FnPFA抗原表位富集區(qū)，選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)。表達(dá)的蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。
[0007]化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的133個(gè)氨基酸的基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是采取以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
1.金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成:
利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析金葡菌表面蛋白FnBPA的全氨基酸序
列，發(fā)金葡菌表面蛋白FnBPA的N端(第745氨基酸一第877氨基酸)含有較強(qiáng)的抗原決定簇。選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5’端增加了酶切位點(diǎn)(下畫(huà)線部分)，在3’端增加了終止密碼子(TGA)和ZA0 I酶切位點(diǎn)(下畫(huà)線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒PGEX4T-2飽BamH I和ZAo I酶切位點(diǎn)內(nèi)。
[0008]篩選的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第745個(gè)aa —第 877 個(gè) aa):
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，該基因片段編碼含強(qiáng)抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745個(gè)氨基酸至第877個(gè)氨基酸，共133個(gè)氨基酸，在該基因片段的5’端增加了 I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，在3’端增加了終止密碼子TGA和ZA0 I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，化學(xué)合成的基因序列全長(zhǎng)414bp，序列如下:
2.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，采用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因序列編碼的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，純化表達(dá)的蛋白片段，具體方法如下: 金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 用BernH I和通ο I雙酶切質(zhì)粒pGEX4T_2和化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，電泳回收后，用T4 DNA連接酶連接，使金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段插入到載體PGEX4T-2內(nèi)的BeuM I和Xho I位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個(gè)融合蛋白，全長(zhǎng)359個(gè)氨基酸，該融合蛋白N端融合了載體上的226個(gè)氨基酸，C端包含金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA內(nèi)的第745個(gè)氨基酸至第877個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)氨基酸序列如下:
3.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段序列，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法制備的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA片段，用于金黃色葡萄球菌抗體檢測(cè)及單抗和多抗的制備，并用于膠體金試劑條的組裝。
【文檔編號(hào)】C07K14/31GK103725697SQ201310750813
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】李越希, 李丙軍, 許桂麗, 馬穎, 張素芬, 袁敬宇, 徐悅玥, 潘英, 李素芹, 陳樂(lè)如, 蔡冉, 周潔, 尚彥紅 申請(qǐng)人:李越希