腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有提高的腐蝕穩(wěn)定性的色譜分析用配體，如，基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白的配體，如，葡萄球菌A蛋白，以及制備和使用所述配體的方法。
【專利說明】腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年12月23日的第200911000241.1號(hào)發(fā)明名稱為“腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求申請(qǐng)?zhí)枮镹0.61/203,664，申請(qǐng)日為2008年12月24日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此全部并入本申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及具有提高的腐蝕穩(wěn)定性的色譜分析用配體，例如，基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配體，以及包含此類配體的色譜分析基質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0005]在親和色譜分析中使用的配體通常賦予對(duì)靶分子的高選擇性，因此導(dǎo)致了對(duì)靶分子的高收率以及快速而經(jīng)濟(jì)的純化?；善咸亚蚓鶤蛋白(SpA)的試劑以及色譜分析基質(zhì)達(dá)到了在捕獲和純化抗體的親和色譜分析中的廣泛應(yīng)用，并且由于其結(jié)合IgG而對(duì)免疫球蛋白和抗體的親和性沒有顯著影響的能力，其同樣廣泛應(yīng)用于抗體檢測(cè)方法。
[0006]據(jù)此，已經(jīng)開發(fā)了多種包含A蛋白一配體的試劑以及介質(zhì)，并且在商業(yè)上可獲得，包括，例如，ProSepi) — vA High Capacity, ProSep? VA Ultra 和 ProSqj?UltraPlus (Millipore)及 Protein A Sepharose?, MabSelect?, MabSelect Xtra? 和MabSelect SuRe.丨((GE Healthcare)和 Poros MabCapture A? (Applied Biosystems)。
[0007]為了維持色譜分析`用配體(所述配體包括，如，包含基于SpA的色譜分析用配體的樹脂)的選擇性和結(jié)合能力，需要對(duì)配體結(jié)合樹脂(稱作色譜分析基質(zhì))進(jìn)行清潔，并且通常在堿性條件下清洗，如，使用氫氧化鈉。舉例來說，用于清洗和復(fù)原基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)過程是一種原位清洗(Cleaning-1n-place，CIP)的堿性方案，一般包括使用pH14的IM NaOH對(duì)基質(zhì)進(jìn)行處理。但是，這種不太溫和的處理經(jīng)常是不期望的，當(dāng)配體是ー種蛋白或是基于蛋白的分子時(shí)尤其如此。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了具有堿穩(wěn)定性的基于SpA的色譜分析用配體，例如，其能夠耐受重復(fù)的原位清洗(CIP)循環(huán)。更特別的是，基于本發(fā)明的配體可以在延長(zhǎng)的時(shí)間中耐受傳統(tǒng)的堿性清洗，這使得所述配體成為引人注目的候選物，特別是對(duì)于免疫球蛋白進(jìn)行低成本高效率且高水平的純化而言尤為如此。
[0009]在本發(fā)明的ー個(gè)方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含兩個(gè)或更多個(gè)SpA結(jié)構(gòu)域。例如，在這方面的一些實(shí)施方式中，提供了堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個(gè)或更多個(gè)葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述兩個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于ー個(gè)位點(diǎn)。[0010]在基于該方面的一些實(shí)施方式中，所述配體包含三個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者三個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述三個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或者三個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。在另一些實(shí)施方式中，所述配體包含四個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者四個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域，所述四個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或四個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。在其它實(shí)施方式中，所述配體包含五個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或五個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域；或包含六個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或六個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域；或包含七個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或七個(gè)或更多個(gè)SpAZ結(jié)構(gòu)域，所述五個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或五個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，六個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或六個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，七個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或七個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。
[0011]基于本發(fā)明的另一方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包含位于η + I位的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)槌腚装彼?C)、絲氨酸(S)、丙氨酸(Α)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，η代表分離的SpA結(jié)構(gòu)域的23位天冬酰胺殘基。在分離的SpA結(jié)構(gòu)域的24位具有突變的示例性配體如表1所示，其中η代表天冬酰胺。
[0012]表1
[0013]`
【權(quán)利要求】
1.一種堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個(gè)或更多個(gè)葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域。
2.一種堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個(gè)或更多個(gè)葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域在色譜分析樹脂的多于一個(gè)位點(diǎn)上附著于樹脂。
3.權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述配體包含三個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者三個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述配體包含四個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者四個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述配體包含五個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者五個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述配體包含六個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者六個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述配體包含七個(gè)或更多個(gè)SpA B結(jié)構(gòu)域或者七個(gè)或更多個(gè)SpA Z結(jié)構(gòu)域。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)氨基酸的突變以改變與Fab的結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，其中所述突變包括在第29位丙氨酸取代甘氨酸。
10.一種色譜分析基質(zhì),包含權(quán)利要求1 一 9任一項(xiàng)所述的配體。
11.一種從樣品中親和純化一種或多種免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步驟: (a)提供含有一種或多種免疫球蛋白的樣品； (b)在一種或多種免疫球蛋白同基質(zhì)結(jié)合的條件下，將樣品與權(quán)利要求10的基質(zhì)接觸；和 (C)通過在適宜的條件下洗脫而回收一種或多種結(jié)合的免疫球蛋白。
12.權(quán)利要求1一 9任一項(xiàng)所述的配體,其中所述配體在0.5M NaOH中溫育5小時(shí)后，或10小時(shí)后,或15小時(shí)后,或20小時(shí)后,保留其至少95%的結(jié)合能力。
13.權(quán)利要求1一 9任一項(xiàng)所述的配體,其中所述配體與WtSpA相比能夠結(jié)合至少1.5倍，或2倍，或3倍，或更多的IgG。
14.一種堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包含位于η + I位的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)槌腚装彼?C)、絲氨酸(S)、丙氨酸(Α)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸殘基，其中所述η代表天冬酰胺。
15.一種堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包含位于η + I位的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)檫x自精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(Ε)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(Μ)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、 蘇氨酸(Τ)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)組成的組中的氨基酸的氨基酸殘基，其中η代表天冬酰胺。
16.權(quán)利要求14或15所述的配體，其中η是第23位的天冬酰胺。
17.一種腐蝕穩(wěn)定性親和色譜分析基質(zhì)，包含三個(gè)或更多個(gè)，或者四個(gè)或更多個(gè)，或者五個(gè)或更多個(gè)，或者六個(gè)或更多個(gè)，或者七個(gè)或更多個(gè)通過多位點(diǎn)附著而附著于固體支持物上的SpA B結(jié)構(gòu)域或Z結(jié)構(gòu)域。
18.—種鑒定基于SpA的腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體的方法，所述方法包括如下步驟: (a)以腐蝕劑處理基于SpA的配體； (b)將腐蝕劑處理過的SpA配體加入到多孔板中； (c)將所述基于SpA的配體與飽和量的第一種免疫球蛋白接觸，以使得所述第一種免疫球蛋白結(jié)合所述配體； (d)將所述結(jié)合的第一種免疫球蛋白與能夠結(jié)合所述第一種免疫球蛋白的分子接觸，其中所述分子與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)；和 (e)檢測(cè)來源于所述物質(zhì)的信號(hào)量， 其中所述信號(hào)量與配體的腐蝕穩(wěn)定性是成比例的，因此可以確定所述基于SpA的配體具有腐蝕穩(wěn)定性。
19.權(quán)利要求18所述的方`法，其中所述分子是第二種免疫球蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K14/31GK103601794SQ201310478275
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月24日
【發(fā)明者】N·卞, N·索伊斯, S·斯佩克特, K·萊文 申請(qǐng)人:Emd密理博公司