多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的多肽由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列構(gòu)成。本發(fā)明的多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒在糖尿病的診斷中是有用的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件及檢測(cè)試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病運(yùn))是由遺傳和環(huán)境因素共同引起的一組以糖代謝 紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。胰島素缺乏和胰島素作用障礙單獨(dú)或同時(shí)引起糖類(lèi)、脂肪、 蛋白質(zhì)、水和電介質(zhì)等的代謝紊亂，臨床以慢性高血糖為主要特征。典型病例可出現(xiàn)多尿、 多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即"三多一少"癥狀。
[0003] 在歐洲糖尿病學(xué)會(huì)（European Association forthe Study of Diabetes, EASD)2011 年會(huì)上，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF)發(fā)布 最新數(shù)據(jù)顯示：2011年全世界糖尿病患病人數(shù)已達(dá)3. 66億，較2010年的2. 85億增加近 30%。每年有460萬(wàn)人死于糖尿病，用于糖尿病的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)4650億美元。IDF主席Jean ClaudeManbaya教授說(shuō)："在2011年，每7秒鐘就有1人因糖尿病死亡，警鐘正在敲響"。據(jù) 中國(guó)之聲2011年11月報(bào)道，我國(guó)已確診的糖尿病患者人數(shù)高達(dá)9240萬(wàn)人，為世界第一。全 國(guó)20歲以上的成人中，糖尿病發(fā)病率高達(dá)9. 7%。
[0004] 糖尿病按其病因?qū)W分類(lèi)可分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及特殊類(lèi)型糖 尿病。
[0005] 目前醫(yī)院主要依據(jù)臨床表現(xiàn)(如1型糖尿病多發(fā)于青少年時(shí)期，且有典型的"三多 一少"癥狀，依賴(lài)于胰島素等）區(qū)分1型和2型糖尿病，對(duì)分型不明確的糖尿病患者如成人 遲發(fā)型自身免疫性糖尿?。╨atent autoimmune diabetes in adults，LADA)、及確診1型糖 尿病則需要檢測(cè)1型糖尿病自身抗體來(lái)輔助診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)糖尿病、特別是1型糖尿病的診斷有用的多肽、編 碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達(dá)載體、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、抗該多肽的抗 體、包含該多肽的檢測(cè)器件、包含該多肽或該檢測(cè)器件的檢測(cè)試劑盒、以及該多肽在檢測(cè)1 型糖尿病中的用途、該多肽在制備用于檢測(cè)1型糖尿病的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
[0007] S卩，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案： 1. 一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示，即： PVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPT 〇
[0008] 2.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
[0009] 3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。
[0010] 4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0011] 5. -種檢測(cè)器件，其包括： 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
[0012] 6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0013] 7. -種檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢 測(cè)器件。
[0014] 8.抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
[0015] 9.權(quán)利要求1所述的多肽在制備用于檢測(cè)1型糖尿病的試劑盒或檢測(cè)器件中的用 途。
[0016] 將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于糖尿病（特別是1型糖尿?。┑脑\斷，能夠取得令人滿意 的效果。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1將多肽通過(guò)化學(xué)共價(jià)固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0018] 圖2對(duì)化學(xué)合成的本發(fā)明的多肽進(jìn)行確認(rèn)的HPLC表征圖譜。
[0019] 圖3對(duì)化學(xué)合成的本發(fā)明的多肽進(jìn)行確認(rèn)的MS表征圖譜。
[0020] 圖4對(duì)SJ改性硅膠（iPDMS薄膜）的制作過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明的示意圖。
[0021] 圖5對(duì)多肽微陣列化學(xué)固定過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明的圖。
[0022] 圖6說(shuō)明多肽微陣列點(diǎn)樣模式的示意圖。
[0023] 圖疒8顯示對(duì)不同血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的照片。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明的多狀 本發(fā)明的多肽是30肽。本發(fā)明的30肽由SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列構(gòu)成，即： PVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPT。如實(shí)施例所示，其對(duì)1型糖尿病病人的血清呈陽(yáng)性反 應(yīng)，而對(duì)健康正常人或非1型糖尿病病人血清呈陰性反應(yīng)。因此，該30肽作為1型糖尿病 的診斷工具是有用的。
[0025] 本發(fā)明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用⑴化 學(xué)合成方法、或（2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來(lái)獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合 成本發(fā)明的多肽情況下，通過(guò)使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)合成 方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色 譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都 是本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的。
[0026] 此外，在通過(guò)酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子 W02004/011653號(hào)所述的方法。S卩，可以這樣來(lái)生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸（例如羧基保護(hù)的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來(lái)源的肽合成酶。
[0027] 而且，除了上述的酶方法、化學(xué)合成方法以外，有些情況下，本發(fā)明的多肽還可能 是天然存在（但未被分離出來(lái)）的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來(lái)。
[0028] 本發(fā)明的核酸、表汰載體宿豐細(xì)朐，以及抗本發(fā)明的多fit的抗體 本發(fā)明還涉及編碼該多肽的核酸（本發(fā)明的核酸）、包含該核酸的表達(dá)載體（本發(fā)明的 表達(dá)載體）、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞（本發(fā)明的宿主細(xì)胞），它們優(yōu)選可用于生產(chǎn)本 發(fā)明的多肽。本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制 備。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明的多肽的抗體，其可用于檢測(cè)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可 以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備。
[0029] 本發(fā)明的檢測(cè)器件 本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)器件（本發(fā)明的檢測(cè)器件），其包括固體載體、以及連接于該固 體載體上的本發(fā)明的多肽。
[0030] 在本發(fā)明中，對(duì)固體載體沒(méi)有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料（例如是 可以通過(guò)過(guò)濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料）的載體即可。
[0031] 構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于：硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟 隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、 聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵 氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹(shù)脂、多糖類(lèi)、蛋白（白蛋白等）、碳或它們的組 合等。
[0032] 固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳 納米管、傳感器芯片等。正如本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè) 置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0033] 在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25ηπΓ約1mm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，磁珠具有約50ηπΓ約10 μ m范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
[0034] 在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24μ πΓ約 165 μ m范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24 μ πΓ約44 μ m范圍的直徑。高 交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
[0035] 具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或 Spherotech，Liberville，IL購(gòu)買(mǎi)的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0036] 二氧化硅（Si02)_處理或二氧化硅（Si02)基的固體載體的例子包括可從 Polysciences，Warrington，PA購(gòu)買(mǎi)的超常磁性二氧化娃珠等，其可以用于捕捉核酸（例如 DNA)?；蛘?，還可以使用可從Dynal Biotech購(gòu)買(mǎi)的M-280等。
[0037] 具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為 該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington, PA銷(xiāo)售的珠子（名稱(chēng)：Biomag(注 冊(cè)商標(biāo)）羧基）、或者 Bangs Laboratory, Inc·, Fishers, IN 的名稱(chēng)為 MC02N/2928 的珠 子?；蛘?，可以使用Dynal Biotech銷(xiāo)售的M-270等。
[0038] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠。蘇州傯聚生物 材料有限公司開(kāi)發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料（iPDMS薄膜，參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利 CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑 成份(使該材料可通過(guò)表面引發(fā)聚合反應(yīng)（SIP)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過(guò)聚乙二醇甲 基丙烯酸酯（P〇ly(〇lig〇(ethylene glycol) methacrylate)，p0EGMA)表面修飾獲得的。 SJ改性娃膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附（Nonspecific protein adsorption, NPA) 能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測(cè)中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近"絕對(duì)0"水平(接近或 低于儀器的檢測(cè)極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過(guò)使用更強(qiáng)的信號(hào) 擴(kuò)增手段來(lái)提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性 能和良好的可操作性。蘇州傯聚公司已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個(gè)腫瘤標(biāo)志物組 成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測(cè)，證明了這種材料是 一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時(shí)，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以 通過(guò)控制修飾反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。
[0039] 本發(fā)明的多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載 體的連接方法來(lái)進(jìn)行。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過(guò) 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺[l-ethyl-3-(3_dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide，EDC]和N-輕基玻拍醜亞胺（N_hydroxysuccinimide，NHS)的反應(yīng)將改性娃 膠表面高分子鏈上的羧基（-C00H)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶 的氨基（-NH2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面（參見(jiàn)圖1)。
[0040] 對(duì)于點(diǎn)樣時(shí)使用的點(diǎn)樣液中本發(fā)明的多肽的濃度沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1 μ g~l〇〇〇 μ g/mL，更優(yōu)選10 μ g~500 μ g/mL。此外，對(duì)于本發(fā)明 的多肽在固體載體上分布的密度沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為 1?100點(diǎn)/10mm 2,更優(yōu)選5?50點(diǎn)/10mm2。
[0041] 本發(fā)明的檢測(cè)器件可以用于檢測(cè)糖尿病(特別是1型糖尿病)、或者制備用于檢測(cè) 糖尿病(特別是1型糖尿?。┑脑噭┖?。
[0042] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑倉(cāng) 本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)試劑盒（本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒），其包括本發(fā)明的多肽或檢測(cè) 器件。該檢測(cè)試劑盒優(yōu)選用于檢測(cè)糖尿病(特別是1型糖尿病)，更優(yōu)選用于檢測(cè)結(jié)核病并 發(fā)1型糖尿病。
[0043] 本發(fā)明的檢測(cè)器件或本發(fā)明的多肽是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的要件。本發(fā)明的檢測(cè) 試劑盒還可以包括： 1. 配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液：血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技 有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色 樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)bwj010103)等。該血清稀釋液用來(lái)稀釋血清，試劑盒檢測(cè)的血清要 稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2~200倍，優(yōu)選ΚΓ?ΟΟ倍。
[0044] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 2. 濃縮洗液：固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未 結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是1%的吐溫20水溶液，使用時(shí)需稀釋2~40倍、優(yōu) 選5?20倍。
[0045] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 3. 酶標(biāo)二抗溶液：1型糖尿病病人血清中的1型糖尿病自身抗體可與固體載體(例如 SJ改性硅膠)上的本發(fā)明的多肽結(jié)合，二抗可與抗體結(jié)合，而二抗上的標(biāo)記物可與發(fā)光底物 反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測(cè)的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG。作為 酶標(biāo)二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 山羊抗人IgG(H+L)，產(chǎn)品編號(hào)ZB-2304。對(duì)酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒(méi)有特殊限 制，可以是例如lng?1000ng/mL。
[0046] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 4. 發(fā)光液組分溶液：發(fā)光液可與二抗上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀 器可檢測(cè)到的化學(xué)光。發(fā)光液由兩種溶液混合而成，分別是A液一過(guò)氧化氫溶液，及B液一 發(fā)光氨溶液。發(fā)光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過(guò)才會(huì)發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧 化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過(guò)氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水： 2 H2〇2 - 02 + 2 H20 魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了 一個(gè)雙負(fù)離子，它可被過(guò)氧化氫分解出的氧氣氧化， 產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過(guò)氧化物。該過(guò)氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)?，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基 鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(zhǎng)位于可見(jiàn)光的藍(lán)光 部分。發(fā)光液組分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal? ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate,貨號(hào) 37074。
[0047] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 5. -個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)腔體（例如中國(guó)專(zhuān)利授權(quán)公告CN202054829U)。
[0048] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 6. 其他用于檢測(cè)糖尿病(特別是1型糖尿?。┑臋z測(cè)分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。
[0049] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括： 7. 使用說(shuō)明書(shū)。
[0050] 實(shí)施例
[0051] 以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限 定。通過(guò)本說(shuō)明書(shū)的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含 在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0052] _ 1. 30狀的制各與確認(rèn) 實(shí)施例中使用的30肽具有SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列，由上海吉爾生化有限公司 合成，該多肽的表征圖譜見(jiàn)圖2~3,可以確認(rèn)合成了所述多肽。
[0053] 2.檢測(cè)器件的制各 檢測(cè)芯片是以SJ改性硅膠（iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過(guò)點(diǎn)樣固定多肽溶 液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚 合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過(guò)熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合）固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到 一種新的材料即SJ改性硅膠。其制作過(guò)程如圖4所示。
[0054] 其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個(gè)組分，聚二甲基硅氧烷 (Poly(dimethylsiloxane), Sylgard 184)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)道康寧（DowCorning)公司，包含 液態(tài)組分A (成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物）和交聯(lián) 劑B (成分為帶有乙烯基和Si-H基團(tuán)的二甲基硅氧烷前體）兩種成分。C為末端帶乙 烯基的引發(fā)劑，購(gòu)于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯 單體（01igo(ethylene glycol) methacrylate，以下簡(jiǎn)稱(chēng) 0EGMA，分子量 Mw = 526)購(gòu) 買(mǎi)于Aldrich。將聚二甲基硅氧烷前體A和交聯(lián)劑B與帶乙烯基末端的引發(fā)劑C以 A:B:C=10:1:0. 5比例充分混合。通過(guò)固化反應(yīng)制成透明的彈性硅橡膠，然后通過(guò)SIP技 術(shù)進(jìn)行表面修飾即可得到SJ改性硅膠。實(shí)驗(yàn)表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、 通過(guò)共價(jià)鍵固定的引發(fā)劑，其可以通過(guò)表面引發(fā)聚合反應(yīng)（SIP)實(shí)現(xiàn)表面高分子修飾。使 用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進(jìn)行反應(yīng)獲得聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG)修飾的表面，實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0055] 制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0056] 采用晶芯?PersonalArrayerTM 16個(gè)人點(diǎn)樣儀在改性娃膠上制備多肽微陣列，過(guò) 程為： 1)預(yù)處理 將SJ改性硅膠薄片（15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次， 用氮?dú)獯蹈?，馬上用于點(diǎn)樣。
[0057] 2)點(diǎn)樣 將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀 基臺(tái)上，同時(shí)將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺(tái)上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件 為室溫（25°C)，濕度設(shè)定為50%。制成的多肽微陣列上每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0. 6nL，樣點(diǎn)半 徑為200 μ m。
[0058] 3)化學(xué)固定 剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱（26°C，60%濕度)中固定至少6h?；瘜W(xué)固定過(guò) 程如圖5所不。
[0059] 首先通過(guò)點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖 液開(kāi)始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過(guò)化學(xué)結(jié)合，改性 硅膠表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-C00H與多肽分子的一順 2形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，進(jìn)而 將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。
[0060] 5)裝配 固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過(guò)背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專(zhuān) 門(mén)的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個(gè)反應(yīng)器由兩個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成。
[0061] 6)保存 裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0062] 3.用檢測(cè)器件講行檢測(cè) 檢驗(yàn)步驟 1、開(kāi)始檢測(cè)前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屚瓿?后直接使用。使用移液槍將2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完 全浸潤(rùn)。
[0063] 2、將待測(cè)血清樣本用樣本稀釋液按照1:40稀釋混勻。
[0064] 3、棄去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全濕潤(rùn)的狀態(tài)下，每個(gè)血清樣本吸取 200 μ L稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。
[0065] 4、將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開(kāi)啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫 孵育30分鐘。
[0066] 5、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。 [0067] 6、清洗完成后，每個(gè)芯片反應(yīng)器分別加入200 μ L酶標(biāo)抗體溶液，將芯片反應(yīng)器放 入芯片固定座，放到搖床上，開(kāi)啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0068] 7、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)抗體溶液，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3 次。
[0069] 8、清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個(gè)芯片表面分別加入15 μ L發(fā)光底物液，使發(fā)光 液能均勻的鋪于芯片表面。
[0070] 9、將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像，并判讀結(jié)果。
[0071] 1型糖尿病病人血清及其他疾病病人血清樣本由合作醫(yī)院提供。血清由相關(guān)人員 用冰塊/干冰等包裹運(yùn)送或快遞至實(shí)驗(yàn)室。
[0072] 陰性對(duì)照有PBS緩沖液（即在第3步中不用待測(cè)血清孵育，而用PBS溶液孵育，其 余步驟相同）的對(duì)照，血清稀釋液的對(duì)照，及陰性病人(指健康人及非1型糖尿病病人）血清 的對(duì)照。
[0073] 多肽微陣列的點(diǎn)樣模式如圖6所示。其中，三角形的20個(gè)點(diǎn)的樣本為人IgG，作為 實(shí)驗(yàn)的定位點(diǎn)；正方形的4個(gè)點(diǎn)的樣本為PB點(diǎn)樣液，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照；星形點(diǎn)的樣本 多肽即為本發(fā)明的多肽SEQ ID N0 :1，它是1型糖尿病自身抗原蛋白多肽，會(huì)對(duì)1型糖尿病 患者血清產(chǎn)生響應(yīng)；圓形點(diǎn)的的樣本是其他的1型糖尿病自身抗原蛋白多肽，作為實(shí)驗(yàn)的 檢測(cè)指標(biāo)(這些多肽有響應(yīng)說(shuō)明檢測(cè)血清中有1型糖尿病自身抗體)。
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖廣8所示。其中，圖7顯示了陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果，只有三角形所示 的點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖8顯示了 1型糖尿病病人血清的檢測(cè)結(jié)果，三角形、星形點(diǎn)和/或圓 形的樣本有響應(yīng)。需要說(shuō)明的是，儀器測(cè)得信號(hào)值由低到高，相應(yīng)的信號(hào)點(diǎn)顏色由黑一白漸 變。 〈110>蘇州傯聚生物材料有限公司 〈120>多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒 <130> Sz-3 <160> 1 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> PRT 〈213>人工序列 <220> 〈223> 1型糖尿病抗原性多肽 <400> 1 PVNKDQCPRERPEELESGMYHCHSGSKPT 30
【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，即： PVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPT 〇
2. 編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
3. 包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。
4. 導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5. -種檢測(cè)器件，其包括： 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
7. -種檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)器 件。
8. 抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
9. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備用于檢測(cè)1型糖尿病的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104098673SQ201310116438
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】馬雄明 申請(qǐng)人:蘇州偲聚生物材料有限公司