一種替度魯肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽藥物制備方法領(lǐng)域，尤其涉及一種替度魯肽制備方法。該方法以Asp-Gly二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；合成C端多肽片段-樹(shù)脂及中間多肽片段；按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹(shù)脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹(shù)脂；取替度魯肽樹(shù)脂經(jīng)裂解、純化，即得；Asp-Gly二肽中Gly側(cè)鏈保護(hù)基為Dmb或Hmb；第一多肽片段具有SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：5所示氨基酸序列；中間多肽片段為1～3個(gè)。該方法避免了五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，提高純度。
【專利說(shuō)明】一種替度魯肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽藥物制備方法領(lǐng)域，尤其涉及一種替度魯肽制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]短腸綜合征(SBS)是指由于嚴(yán)重小腸疾病或外科手術(shù)切除大部分小腸導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法正常吸收營(yíng)養(yǎng)而引發(fā)一系列綜合征。SBS降低了患者攝取液體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，導(dǎo)致他們脫水和營(yíng)養(yǎng)不良。而腸外營(yíng)養(yǎng)支持治療又將增加全身感染和其他長(zhǎng)期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，迄今為止尚無(wú)藥物可以治療短腸綜合征。
[0003]替度魯肽(teduglutide)是一種胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)類似物，替度魯肽的氨基酸序列中包含有33個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)如SEQ ID NO: 11所示，是一種天然生成的激素，可減少胃排空和分泌，并調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和修復(fù)。替度魯肽于2001年被定性為孤兒藥。臨床試驗(yàn)表明，該藥能夠降低短腸綜合征患者對(duì)胃腸外營(yíng)養(yǎng)的需求。
[0004]目前，對(duì)替度魯肽的合成方式主要有順序偶聯(lián)和片段偶聯(lián)兩種方法，其中順序偶聯(lián)是以wang樹(shù)脂為載體，采用純固相順序偶聯(lián)的方法進(jìn)行肽的合成，最終切割得到替度魯肽；片段偶聯(lián)則是先合成具有SEQ ID NO:2所示結(jié)構(gòu)的全保護(hù)片段，然后采用純化后的全保護(hù)片段與具有SEQ ID NO: 12所示結(jié)構(gòu)的片段肽樹(shù)脂進(jìn)行固相偶聯(lián)，最終裂解得到替度魯肽。
[0005]由于替度魯肽的肽鏈較長(zhǎng)，采用順序偶聯(lián)的方式合成會(huì)使合成的難度增大，并產(chǎn)生難以純化的雜質(zhì)，降低回收率。而更重要的是，替度魯肽的N端第3~第4個(gè)氨基酸為Asp-Gly,天冬氨酸(Asp)側(cè)鏈中的羧基能與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，這種五元環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成，會(huì)在一定條件下降解開(kāi)環(huán)，而在開(kāi)環(huán)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種雜質(zhì)，例如:Asp的消旋、產(chǎn)生α, β天冬氨酸等，造成替度魯肽純度的下降。研究表明，五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成與Asp或Asn的右側(cè)氨基酸有重大關(guān)系，而Gly由于側(cè)鏈沒(méi)有保護(hù)基團(tuán)且空間位阻小，當(dāng)Gly先于Asp偶聯(lián)時(shí)最易成環(huán)的結(jié)構(gòu)。因此采用順序偶聯(lián)的方式必然會(huì)使替度魯肽的N端第3~第4個(gè)氨基酸在合成的過(guò)程中生成五元環(huán)，從而造成純度的降低。因此，為了解決Asp-Gly片段產(chǎn)生降解的問(wèn)題，采用片段偶聯(lián)的方式先合成具有SEQ ID Ν0:2所示結(jié)構(gòu)的全保護(hù)片段，該全保護(hù)片段即為替度魯肽的N端第I~第4個(gè)氨基酸，其中包括Asp-Gly結(jié)構(gòu)，然后對(duì)該全保護(hù)片段進(jìn)行純化，并采用純化后的全保護(hù)片段與具有SEQ ID NO: 12所示結(jié)構(gòu)的片段肽樹(shù)脂進(jìn)行固相偶聯(lián)，最終裂解得到替度魯肽。但是，雖然在固相偶聯(lián)之前已經(jīng)對(duì)會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)的全保護(hù)片段進(jìn)行了純化，不但增加了制備步驟，且無(wú)法保證其在后續(xù)的固相偶聯(lián)過(guò)程中不發(fā)生再一次的降解。因此，采用這種片段方法不能從根本上解決Asp-Gly片段產(chǎn)生降解的問(wèn)題。檢測(cè)表明，以現(xiàn)有技術(shù)制備替度魯肽現(xiàn)有技術(shù)制備的醋酸替度魯肽的收率為20%，純度為98.5%，其中Asp-Gly片段降解產(chǎn)生雜質(zhì)的含量為0.2%。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種替度魯肽的制備方法，采用Fmoc-Asp (OtBu) - (Hmb) Gly-OH 或 Fmoc-Asp (OtBu) - (Dmb) Gly-OH 為偶聯(lián)原料，從而解決合成過(guò)程中Asp-Gly降解的問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；
[0009]步驟2:合成C端多肽片段-樹(shù)脂及中間多肽片段；
[0010]步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹(shù)脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹(shù)脂；
[0011]步驟4:取替度魯肽樹(shù)脂經(jīng)裂解、純化，即得；
[0012]Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ；
[0013]第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0014]C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0015]中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)~3個(gè)。
[0016]由于先偶聯(lián)Gly再偶聯(lián)Asp的合成方法極易使Asp側(cè)鏈中的羧基與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，因此本發(fā)明將易產(chǎn)生五元環(huán)結(jié)構(gòu)的Asp-Gly作為一個(gè)整體進(jìn)行偶聯(lián)，從而避免了在順序偶聯(lián)過(guò)程中五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，提高了純度及收率。而由于Asp-Gly相連時(shí)側(cè)鏈極不穩(wěn)定，因此采用OtBu對(duì)Asp的側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，而采用Hmb或Dmb對(duì)Gly的側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，從而進(jìn)一步避免五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法采用片段合成的方式，以Asp-Gly 二肽作為合成原料，從而提高了純度及收率。采用Asp-Gly 二肽作為合成原料的目的是避免Asp先于Gly偶聯(lián)而產(chǎn)生Asp降解產(chǎn)物，而采用片段合成是為了避免多次偶聯(lián)過(guò)程中使Asp發(fā)生降解。
[0017]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為I時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0018]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為2時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0019]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為3時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0020]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示
[0021]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~9個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:1所示；中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:6所示；C端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~33個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0022]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0023]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0024]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0025]更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~
5% .
[0026]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0027]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr>Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0028]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0029]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0030]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin0
[0031]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg 和 Ala 即得。
[0032]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0033]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0034]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0035]更優(yōu)選地，裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0036]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個(gè)，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示
[0037]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO: 2所示；序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~12個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第13~20個(gè)氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第21~33個(gè)氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0038]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0039]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0040]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0041 ] 更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~
5% ο
[0042]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0043]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:7所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Thr,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asn、Met、Glu、Asp、Ser> Phe、Ser，經(jīng)裂解即得。
[0044]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Arg,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、Πθ，經(jīng)裂解即得。
[0045]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0046]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0047]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin0
[0048]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr、Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe 和 Asp,即得。
[0049]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0050]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0051]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0052]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0053]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個(gè)，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11所示
[0054]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~9個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~26個(gè)氨基酸的多肽片段；(:端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第27~33個(gè)氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0055]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0056]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0057]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0058]更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~
5% ο
[0059]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0060]優(yōu)選地，序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Glu，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser, Phe、Ser，經(jīng)裂解即得。
[0061]優(yōu)選地，序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0062]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Leu,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg、Ala，經(jīng)裂解即得。
[0063]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0064]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0065]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin0
[0066]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gln 和 lie,即得。
[0067]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.Smmol /I,η
[0068]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0069]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0070]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0071]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；步驟2:合成C端多肽片段-樹(shù)脂及中間多肽片段；步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹(shù)脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹(shù)脂；步驟4:取替度魯肽樹(shù)脂經(jīng)裂解、純化，即得；Asp-Gly 二肽為Fmoc-Asp (OtBu) - (Hmb) Gly-OH 或 Fmoc-Asp (OtBu) - (Dmb) Gly-OH ;第一多妝片段具有 SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)~3個(gè)?，F(xiàn)有的合成方法中，對(duì)于替度魯肽的合成不論是采用順序偶聯(lián)的方式還是采用片段偶聯(lián)的方式，都會(huì)由于先偶聯(lián)Gly再偶聯(lián)Asp而使Asp側(cè)鏈中的羧基與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，而這種五元環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成，會(huì)在一定條件下降解開(kāi)環(huán)產(chǎn)生雜質(zhì)，而這些由Asp降解產(chǎn)生的雜質(zhì)不易去除，因此本發(fā)明將易產(chǎn)生五元環(huán)結(jié)構(gòu)的Asp-Gly作為一個(gè)整體進(jìn)行偶聯(lián)，從而避免了在順序偶聯(lián)過(guò)程中五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，提高了純度及收率。由于Asp-Gly相連時(shí)側(cè)鏈極不穩(wěn)定，因此采用OtBu對(duì)Asp的側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù),采用Hmb或Dmb對(duì)Gly的側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，從而進(jìn)一步避免五元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。另外，本發(fā)明通過(guò)對(duì)替度魯泰肽序的合理劃分，將替度魯泰分為3~5個(gè)片段進(jìn)行合成，從而提高了合成效率，且降低了在逐步偶聯(lián)過(guò)程中造成的降解。因此，本發(fā)明提供的方法提高了替度魯肽的純度，縮短了合成周期，實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的方法制備的替度魯肽的純度可達(dá)99.23%，較采用現(xiàn)有方法制備的替度魯肽的純度提高0.7%，而Asp降解雜質(zhì)的含量為0.15%。較現(xiàn)有技術(shù)降低25%。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0072]圖1示市售替度魯肽醋酸鹽對(duì)照樣品檢測(cè)的結(jié)果；
[0073]圖2示采用與市售對(duì)照樣品相同檢查色譜條件對(duì)本發(fā)明實(shí)施例138中制備的替度魯肽粗肽純化、成鹽并凍干后，得到替度魯肽醋酸鹽精肽進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0074]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn) 。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0075]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:
[0076]步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；
[0077]步驟2:合成C端多肽片段-樹(shù)脂及中間多肽片段；
[0078]步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹(shù)脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹(shù)脂；
[0079]步驟4:取替度魯肽樹(shù)脂經(jīng)裂解、純化，即得；
[0080]Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ；
[0081]第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0082]C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0083]中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)~3個(gè)。
[0084]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為I時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0085]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為2時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0086]當(dāng)中間多肽片段數(shù)量為3時(shí)，步驟3中偶聯(lián)的順序?yàn)?如SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹(shù)脂、如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0087]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6 所示
[0088]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~9個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:1所示；中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO: 6所示；C端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~33個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0089]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Gly,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser> Phe、Ser>Asp-Gly、Gly、His,經(jīng)裂解即得。
[0090]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0091]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0092]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0093]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0094]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~5%。
[0095]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0096]制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0097]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0098]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0099]序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0100]序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0101]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0102] 本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin。
[0103]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp (OtBu) -Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr>Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg 和 Ala 即得。
[0104]Fmoc-Asp (OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0105]如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0106]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0107]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的混合物。
[0108]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4的裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0109]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0110]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0111]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個(gè)，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 所示
[0112]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~12個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第13~20個(gè)氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第21~33個(gè)氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:4所示。
[0113]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0114]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Asp-Gly，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Gly、His，經(jīng)裂解即得。
[0115]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0116]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0117]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0118]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~5%。
[0119]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0120]制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0121]序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Thr,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asn、Met、Glu、Asp、Ser、Phe、Ser,經(jīng)裂解即得。
[0122]序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0123]序列如SEQ ID NO:7所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0124]序列如SEQ ID N0:8所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Arg,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、lie,經(jīng)裂解即得。
[0125]序列如SEQ ID N0:8所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0126]序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0127]序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0128]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0129]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin。
[0130]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp (OtBu) -Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr>Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe 和 Asp,即得。
[0131]Fmoc-Asp (OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0132]如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0133]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0134]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的混合物。
[0135]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0136]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0137]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0138]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個(gè)，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10所示
[0139]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個(gè)時(shí)，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個(gè)氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~9個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個(gè)氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~26個(gè)氨基酸的多肽片段；(:端多肽片段-樹(shù)脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第27~33個(gè)氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0140]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0141]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Asp-Gly，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Gly、His，經(jīng)裂解即得。
[0142]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0143]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0144]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0145]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~5%。
[0146]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分?jǐn)?shù)為20%。
[0147]制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0148]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Glu，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser, Phe、Ser,經(jīng)裂解即得。
[0149]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0150]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0151]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0152]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0153]序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0154]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Leu,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg、Ala,經(jīng)裂解即得。
[0155]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt0
[0156]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過(guò)濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0157]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0158]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0159]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為Wang Resin0
[0160]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gln 和 lie,即得。
[0161]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.Smmol /I,η
[0162]如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹(shù)脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0163]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0164]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0165]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0166]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0167]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0168]本發(fā)明對(duì)各氨基酸采用的側(cè)鏈保護(hù)基情況見(jiàn)表1:
[0169]表1本發(fā)明對(duì)各氨基酸采用的保護(hù)基
[0170]
【權(quán)利要求】
1.一種替度魯肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段； 步驟2:合成C端多肽片段-樹(shù)脂及中間多肽片段； 步驟3:按照替度魯泰肽序，在所述C端多肽片段-樹(shù)脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹(shù)脂； 步驟4:取所述替度魯肽樹(shù)脂經(jīng)裂解、純化，即得； 所述 Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ； 所述第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； 所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列； 所述中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)~3個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為I個(gè)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為2個(gè)，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為3個(gè)，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:10 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述制備第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述制備第一多肽片段采用的裂解液為T(mén)FA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中所述的C端多肽片段-樹(shù)脂中的樹(shù)脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中所述偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4中所述裂解的裂解液為T(mén)FA、PhSMe、EDT、TIS 與 H2O 的混合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/605GK104072605SQ201310102450
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】宓鵬程, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司