用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明尤其涉及可用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的非人脊椎動(dòng)物例如小鼠和大鼠，其中的內(nèi)源性抗體鏈表達(dá)已經(jīng)失活。這一失活導(dǎo)致定位于嚙齒類重鏈基因座內(nèi)的ADAM6基因丟失，所述基因?qū)τ允侵陵P(guān)重要的。導(dǎo)入所述ADAM6基因的功能性拷貝使得可育的小鼠可以產(chǎn)生。
【專利說明】用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
[0001] 本發(fā)明尤其涉及可用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的非人脊椎動(dòng)物例如小 鼠和大鼠，其中的內(nèi)源性抗體鏈表達(dá)已經(jīng)失活。
【背景技術(shù)】
[0002] 包含一或多個(gè)編碼可變區(qū)的轉(zhuǎn)基因抗體基因座的產(chǎn)生抗體的非人脊椎動(dòng)物例 如小鼠和大鼠通常是本領(lǐng)域已知的，其通過以W02011004192、US7501552、US6673986、 US6130364、W02009/076464和US6586251為例的參考文獻(xiàn)的方式產(chǎn)生，上述參考文獻(xiàn)以引 文形式全文并入本文。
[0003] 使用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）技術(shù)，本領(lǐng)域提供具有轉(zhuǎn)基因抗體基因座的非人脊椎 動(dòng)物，例如小鼠和大鼠，可以在以人抗原攻擊（challenge)后從其中產(chǎn)生人或嵌合抗體。這 些抗體在其重鏈中，任選地也在其輕鏈中有效地具有人可變區(qū)。同時(shí)，為避免內(nèi)源性抗體重 鏈表達(dá)的復(fù)雜化，通常對這些脊椎動(dòng)物的基因組進(jìn)行工程化，以便使內(nèi)源性重鏈表達(dá)失活。 用于此的技術(shù)包括刪除全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，同時(shí)或在另一步驟中插入人VDJ基 因區(qū)段（例如，見W02009076464和W02002066630)。這些刪除導(dǎo)致VH和D基因區(qū)段與中間 序列一起刪除。在這樣的操作中，刪除了內(nèi)源性ADAM6基因[1-5]。
[0004] ADAM6基因編碼一種屬于A解聚素和金屬蛋白酶家族的蛋白質(zhì)。ADAM家族成員是 跨膜糖蛋白，其含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域例如pro-結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶、解聚素、富半胱氨酸、 表皮生長因子（EGF)樣、跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域。在各種生物學(xué)進(jìn)展中顯示在細(xì)胞粘附中 涉及ADAM家族。
[0005] 在小鼠中，有兩個(gè)ADAM6拷貝（ADAM6a，ADAM6b)，其位于第12染色體的IgH基因座 中的VH和D基因區(qū)段之間（在小鼠 VH5-1和D1-1基因區(qū)段之間的中間區(qū)中）。這兩個(gè)毗 連的無內(nèi)含子ADAM6基因具有95%的核苷酸序列相同性和90%的氨基酸相同性。在人和 大鼠中，只有一個(gè)ADAM6基因。小鼠 ADAM6的表達(dá)模式分析顯不其專一地表達(dá)于睪丸[6]。 盡管可以在淋巴細(xì)胞中檢測到ADAM6轉(zhuǎn)錄物，但限于細(xì)胞核，這提示ADAM6基因的轉(zhuǎn)錄特別 地是由于從D區(qū)的轉(zhuǎn)錄通讀，而不是活性信使RNA產(chǎn)生[7]。
[0006] 成熟的ADAM6蛋白定位于頂體以及精子頭部較后的區(qū)上。尤其是，ADAM6與ADAM2 和ADAM3形成復(fù)合體，這是小鼠中受精所需要的[8]。參考文獻(xiàn)[9]暗示模型中的ADAM6,其 中ADAM6被TPST2硫酸化后與ADAM3相互作用，于是ADAM6和ADAM3從無 Tpst2的精子中 丟失。研究觀察到Tpst2缺陷的小鼠具有雄性不育性、精子移動(dòng)性缺陷和可能的精子-卵 子膜相互作用異常。
[0007] 因此，保持ADAM6在精子中表達(dá)對育性是至關(guān)重要的。因此，人們認(rèn)為其中刪除了 ADAM6基因的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠和大鼠不可育。這妨礙了群體的繁殖，也妨礙了利用這些小鼠 作為轉(zhuǎn)基因抗體產(chǎn)生平臺(tái)。值得提供改良的可育產(chǎn)生抗體的非人轉(zhuǎn)基因脊椎動(dòng)物。
[0008] 參考文獻(xiàn)
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[0017] [9]. Marcello et al，Lack of tyrosylprotein sulfotransferase-2activity results in altered sperm-egg interactions and loss of ADAM3and ADAM6in epididymal sperm, J Biol Chem. 2011Aprl5 ；286 (15):13060-70. Epub2011Feb21.
【發(fā)明內(nèi)容】
[0018] 為了這一目的，本發(fā)明提供：
[0019] 一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠）的方法，所述非人脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基 因抗體重鏈基因座而言是純合的，
[0020] 所述小鼠的基因組
[0021] (a)在第12號(hào)染色體（或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體）的各自拷貝上包含 各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0022] (b)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0023] 所述方法包括以下步驟：
[0024] (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述 構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插 入到第12號(hào)染色體（或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體）的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū) 段與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或Cy)的上游可操作連接；
[0025] ⑷與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源 性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中刪除包括小鼠 ADAM6編碼核苷酸序列；
[0026] (e)與步驟（c)或（d)同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列插入到 ES細(xì)胞基因組；以及
[0027] (f)使ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于 所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的 全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。
[0028] 在第二構(gòu)型（configuration)中，本發(fā)明提供一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物（例 如，小鼠）的方法，所述非人脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，
[0029] 所述小鼠的基因組
[0030] (a)在第12號(hào)染色體（或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體）的各自拷貝上包含 各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0031] (b)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0032] 所述方法包括以下步驟：
[0033] (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述 構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插 入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選 地，C μ和/或C Y )的上游可操作連接；
[0034] ⑷與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源 性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中刪除包括小鼠 ADAM6編碼核苷酸序列；
[0035] (e)使ES細(xì)胞發(fā)育成為幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因 重鏈基因座；
[0036] (f)從所述小鼠獲得第二ES細(xì)胞并在所述第二ES細(xì)胞基因組中插入一或多個(gè) ADAM6編碼核苷酸序列；以及
[0037] (g)使所述第二ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基 因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的并且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12 號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄 性。
[0038] 在第三構(gòu)型中，本發(fā)明包含一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠）的方法， 所述非人脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，
[0039] 所述小鼠的基因組
[0040] (a)在第12號(hào)染色體（或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體）的各自拷貝上包含 各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0041] (b)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0042] 所述方法包括以下步驟：
[0043] (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述 構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插 入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選 地，C μ和/或C Y )的上游可操作連接；
[0044] ⑷與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源 性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中刪除包括小鼠 ADAM6編碼核苷酸序列；
[0045] (e)使ES細(xì)胞發(fā)育成為幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因 重鏈基因座；以及
[0046] (f)通過使用所述幼鼠（或子代）以及另外的小鼠（其基因組包含一或多個(gè)ADAM6 編碼核苷酸序列）進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對 于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的并且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12號(hào)染色 體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。 [0047] 在第四構(gòu)型中，本發(fā)明提供可育的非人脊椎動(dòng)物（任選地，雄性），其對于轉(zhuǎn)基因 重鏈基因座而言是純合的，所述脊椎動(dòng)物的基因組 [0048] (i)包含第一染色體的各自拷貝上的各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0049] (ii)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0050] 其中所述基因組的各第一染色體包含
[0051] (iii)轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因 區(qū)段和與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或Cy)的上游可操作連接的一或 多個(gè)人JH基因區(qū)段；
[0052] (iv)所述染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體重鏈表 達(dá)失活，其中該刪除包括ADAM6 ;以及
[0053] 其中該基因組包含
[0054] (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6編碼核苷酸序列的插入。
[0055] 因此，在野生型可育的非人脊椎動(dòng)物中，ADAM6存在于每個(gè)所述第一染色體上，但 內(nèi)源性重鏈表達(dá)的失活牽涉與刪除的重鏈基因區(qū)段共定位于同一染色體上的ADAM6的刪 除。例如，如現(xiàn)有技術(shù)中使用同源重組以人VDJ基因區(qū)段精確地取代內(nèi)源性重鏈VDJ刪除 內(nèi)源性ADAM6,從而影響育性。在小鼠中，這發(fā)生在刪除第12號(hào)染色體上的全部或部分內(nèi)源 性重鏈VDJ區(qū)以使內(nèi)源性重鏈表達(dá)失活的時(shí)候。在大鼠中，這發(fā)生在刪除第6號(hào)染色體上 的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)以使內(nèi)源性重鏈表達(dá)失活的時(shí)候。本發(fā)明將ADAM6插入到 所述脊椎動(dòng)物基因組中以恢復(fù)育性。
[0056] 在第四構(gòu)型的一個(gè)方面中，所述脊椎動(dòng)物是小鼠且各第一染色體是第12號(hào)染色 體。
[0057] 因此，在第四構(gòu)型的一個(gè)方面中，所述脊椎動(dòng)物是大鼠且各第一染色體是第6號(hào) 染色體。
[0058] 本發(fā)明提供一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠）的方法，所述非人 脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的，所述方法通過在ES細(xì)胞中實(shí)施步驟（a)到 (d)和使用ES細(xì)胞基因組技術(shù)產(chǎn)生最終的非人脊椎動(dòng)物而提供，所述非人脊椎動(dòng)物具有包 含插入的ADAM6編碼核苷酸序列（純合或雜合狀態(tài)）且純合狀態(tài)的所述重鏈基因座的基因 組，其中內(nèi)源性ADAM6已被刪除。本發(fā)明還提供通過這一方法制備的可育的非人脊椎動(dòng)物 (例如，小鼠或大鼠）或其可育的雄性或雌性子代。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0059] 圖la和lb :內(nèi)源性IgH通過易位失活和保留Adam6的原理圖；
[0060] 圖2 :同源重組以人基因區(qū)段取代內(nèi)源性（小鼠）IgH基因座基因區(qū)段以及伴隨 Adam6基因的刪除的原理圖；
[0061] 圖3 :RMGR以人基因區(qū)段取代內(nèi)源性（小鼠）IgH基因座基因區(qū)段以及伴隨Adam6 基因的刪除的原理圖；
[0062] 圖4 :刪除載體的創(chuàng)建和靶向的原理圖；
[0063] 圖5 :含有Adam6基因的祀向載體的創(chuàng)建的原理圖；
[0064] 圖6 :含有Adam6基因的IgH BAC的創(chuàng)建的原理圖。
[0065] 發(fā)明詳述
[0066] 本發(fā)明提供一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠）的方法，所述非人脊椎動(dòng) 物對于轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的。在一個(gè)實(shí)施方式中該方法產(chǎn)生的最終的小鼠是雄 性，所以作為基因組操作的結(jié)果，本發(fā)明改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的不育的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠?？捎男?鼠產(chǎn)生能夠使來自雌性小鼠的卵子受精的精子。例如，通過成功地繁殖以產(chǎn)生小鼠胚胎或 幼崽可以容易地確定育性。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法制備最終的雌性小鼠。當(dāng)然， 這些雌性可用于繁殖以產(chǎn)生攜帶ADAM6且可育的雄性子代。
[0067] 本發(fā)明的這一方面的方法中，最終的小鼠的基因組包含的基因組在第12號(hào)染色 體的各自拷貝上包含轉(zhuǎn)基因重鏈基因座。野生型小鼠中的重鏈基因座發(fā)現(xiàn)于第12號(hào)染色 體上，并且，如以下每個(gè)解釋，本發(fā)明詳述了在同一染色體上建立轉(zhuǎn)基因基因座。在一個(gè)實(shí) 施例中，該轉(zhuǎn)基因基因座是嵌合基因座，其包含插入小鼠內(nèi)源性恒定區(qū)（至少是小鼠的C μ 和/或Cy)的上游的人VDJ基因區(qū)段。本發(fā)明中人基因區(qū)段與該恒定區(qū)可操作連接，所以， 在小鼠中分化為B細(xì)胞后代之后，所述B細(xì)胞能夠表達(dá)嵌合抗體，其包含具有人可變區(qū)和小 鼠恒定區(qū)的嵌合抗體。在本發(fā)明任一構(gòu)型的另一方面中，各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座包含所述與 人中龍恒定區(qū)可操作連接的人VDJ基因區(qū)段，例如，人Cy (任選地，與具有人Cy的小鼠或 人Sy)和/或人Y，而不是小鼠（或非人）恒定區(qū)。
[0068] 為了這一目的，該方法包括下列步驟：構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其 包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因 區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū)段與小 鼠內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或CY)的上游可操作連接。任選地，該人基因區(qū)段 在內(nèi)源性小鼠 Sy轉(zhuǎn)換（switch)和Cy的上游插入。這可用于利用小鼠內(nèi)源調(diào)節(jié)的控制， 其用于在以感興趣的抗原免疫最終的小鼠后，從IgM到其他類型（例如，IgG)抗體的體內(nèi) 分類轉(zhuǎn)換。在實(shí)施例中，生成的ES細(xì)胞對轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是雜合的，即該轉(zhuǎn)基因基 因座存在于細(xì)胞中的一條第12號(hào)染色體上。另一條第12號(hào)染色體可以，例如，具有內(nèi)源性 重鏈基因座，并且任選地，這是失活的（例如，通過插入功能性標(biāo)記（例如，neo或hprt)或 通過刪除全部或部分基因座，例如全部或部分內(nèi)源性VDJ區(qū)）。雜合的ES細(xì)胞能夠以預(yù)期 的過程發(fā)育成為小鼠，其對于該重鏈轉(zhuǎn)基因基因座而言是雜合的，而且用繁殖和與其它也 含有轉(zhuǎn)基因重鏈基因座的小鼠雜交，能夠獲得的生成的子代相對于該轉(zhuǎn)基因重鏈轉(zhuǎn)基因是 純合的。可以將一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列插入（如下面所進(jìn)一步描述的）到雜合祖 先小鼠的一或兩者的基因組中（例如，通過將ADAM6插入到各自ES細(xì)胞中，所述ES細(xì)胞是 祖先小鼠的祖先）；或者通過小鼠的繁殖，其中一只小鼠具有ADAM6,這樣，生成的子代就是 具有ADAM6的祖先小鼠之一?；蛘?，對于所述重鏈轉(zhuǎn)基因而言是純合的但不具有ADAM6的 子代小鼠可以與基因組含有ADAM6基因的小鼠雜交，使用繁殖方法可以獲得對于所述重鏈 轉(zhuǎn)基因而言是純合的且還含有ADAM6基因（在雜合或純合狀態(tài)）的子代。除了只使用繁殖 方法，ES細(xì)胞基因組操作可用于將ADAM6編碼核苷酸序列插入到來源于對于所述重鏈轉(zhuǎn)基 因而言純合的子代小鼠的ES細(xì)胞，并且隨后由該ES細(xì)胞（或其子代）發(fā)育為小鼠，這樣， 最終的小鼠基因組對于所述重鏈轉(zhuǎn)基因而言是純合的且還包含ADAM6基因。動(dòng)物飼養(yǎng)、雜 交、繁殖，還有ES細(xì)胞（例如，IPS細(xì)胞）基因組操作的技術(shù)是本領(lǐng)域容易獲得的且為技術(shù) 人員所熟悉。
[0069] 在本發(fā)明的方法中，與將人基因區(qū)段插入到ES細(xì)胞基因組同時(shí)或分別進(jìn)行的是， 刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失 活，即在源于該ES細(xì)胞的最終的子代小鼠中，內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)是失活的。在一個(gè)實(shí)施 方式中，內(nèi)源性VDJ刪除與人VDJ的插入同時(shí)進(jìn)行。例如，可以在技術(shù)中使用同源重組以人 VDJ基因區(qū)段精確地取代全部小鼠 VDJ區(qū)（或其包括ADAM6編碼核苷酸序列的部分）。一種 方法（例如，見W02002066630)是使用多個(gè)各具有一或多個(gè)人VH和/或D和/或JH區(qū)段 的同源重組載體（例如，細(xì)菌人工染色體，BAC)，其中載體具有側(cè)面為一或多個(gè)人VH基因區(qū) 段的置于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座5'末端的同源臂（homology arm)。在這個(gè)載體中，5'同 源臂可以是直接對應(yīng)于小鼠基因組序列內(nèi)源性重鏈基因座的5'的序列。使用標(biāo)準(zhǔn)同源重 組，精確地插入人基因區(qū)段以取代內(nèi)源性重鏈基因座5'位置內(nèi)源性小鼠基因區(qū)段。另一個(gè) 載體包含側(cè)面為一或多個(gè)人JH基因區(qū)段（和任選地，全部或部分小鼠 J-C內(nèi)含子）的置于 所述轉(zhuǎn)基因重鏈VDJ3'末端的同源臂。在這個(gè)載體中，3'同源臂可以是直接對應(yīng)于小鼠基 因組序列內(nèi)源性重鏈Cy (或另一下游內(nèi)源性恒定區(qū)）的5'的序列；或者，3'同源臂可以是 對應(yīng)于全部或部分內(nèi)源性J-C內(nèi)含子的序列。使用標(biāo)準(zhǔn)同源重組，精確地插入人基因區(qū)段 以取代內(nèi)源性重鏈基因座3'位置內(nèi)源性小鼠基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)BAC具有 重疊同源臂，并且可以用于以人VDJ基因區(qū)段取代內(nèi)源性VDJ (例如，見W02009076464)。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，通?？梢允褂靡换蚨鄠€(gè)這些同源重組技術(shù)，其具有如下修飾：將人VDJ 直接插入內(nèi)源性VDJ區(qū)的下游（3'）（例如，插入內(nèi)源性J-Cy內(nèi)含子），并且在一或多個(gè)后 續(xù)步驟中，刪除了內(nèi)源性VDJ(或其包含所述ADAM6編碼核苷酸序列的部分），例如，使用標(biāo) 準(zhǔn)位點(diǎn)特異性重組（例如，cre/lox)、轉(zhuǎn)位子（例如，piggyBac轉(zhuǎn)位子）或同源重組技術(shù)。 在另一實(shí)施方式中，人VDJ插入第一小鼠 VH基因區(qū)段的5'（例如，直接到5'或距5'100kb 以內(nèi)），并且在一或多個(gè)后續(xù)步驟中，內(nèi)源性VDJ (或其包含所述ADAM6編碼核苷酸序列的部 分）被刪除。
[0070] 在任一構(gòu)型的一個(gè)實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞街校ɡ纾景l(fā)明的 方法和脊椎動(dòng)物），內(nèi)源性VDJ(或其包含所述ADAM6編碼核苷酸序列的部分）通過易位到 不同種類的染色體而從染色體刪除。例如，不同的染色體是第15號(hào)染色體。小鼠中第12 和15號(hào)染色體之間的易位，例如，是值得進(jìn)行的，因?yàn)閺陌l(fā)表的觀察結(jié)果可知，在第12號(hào)染 色體上的重鏈基因座和第15號(hào)染色體上的c-myc之間的易位是可能的（見，例如，Scienc e24Decemberl982:Vol· 218ηο·4579ρρ· 1319-1321 ;"Mouse c_myc oncogene is located on chromosome 15and translocated to chromosome 12in p 1 asmacytomasCrews et al) 〇 因 此，在一個(gè)所述脊椎動(dòng)物是小鼠的實(shí)施例中，所述內(nèi)源性VDJ (或其部分）通過易位到第15 號(hào)染色體而從第12號(hào)染色體刪除。在另一個(gè)所述脊椎動(dòng)物是大鼠的實(shí)施例中，所述內(nèi)源性 VDJ(或其部分）通過易位到第15號(hào)染色體而從第6號(hào)染色體刪除。因此，在本發(fā)明的最終 的可育小鼠或小鼠子代中，內(nèi)源性重鏈表達(dá)通過將至少部分內(nèi)源性重鏈基因座VDJ易位到 非野生型染色體（即，不是第12號(hào)染色體）而失活。因此，在本發(fā)明的最終的可育大鼠或大 鼠子代中，內(nèi)源性重鏈表達(dá)通過將至少部分內(nèi)源性重鏈基因座VDJ易位到非野生型染色體 (即，不是第6號(hào)染色體）而失活。在這種情況中，易位的內(nèi)源性VDJ(或部分）保持在動(dòng)物 的基因組中，但導(dǎo)致內(nèi)源性重鏈表達(dá)無功能。這是有利的，因?yàn)閮?nèi)源性ADAM6基因從野生型 染色體位置刪除而產(chǎn)生失活，但是其隨后通過易位插入到完全不同的染色體種類（即，不 具有抗體重鏈基因組的染色體）上的基因組其他位置，所述易位以使插入的ADAM6基因有 功能（并因此在下游動(dòng)物中產(chǎn)生育性）而不用再激活內(nèi)源性重鏈表達(dá)的方式進(jìn)行。因此， 易位使失活可以伴隨著保留內(nèi)源性、野生型ADAM6基因以為生成的動(dòng)物的育性做準(zhǔn)備。這 完美地將ADAM6基因剪裁（tailor)到所述動(dòng)物的基因組（因?yàn)槠涫莾?nèi)源性序列），并且在 一個(gè)實(shí)施方式中，還使各插入的內(nèi)源性ADAM6基因與其內(nèi)源性啟動(dòng)子（和任何其它控制元 件例如增強(qiáng)子）可以一起轉(zhuǎn)移。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，失活通過刪除包含包括各自啟動(dòng) 子的一或多個(gè)ADAM6基因的染色體序列（例如，小鼠第12號(hào)或大鼠第6號(hào)染色體的序列） 而進(jìn)行，并且該序列通過易位插入到不包含重鏈基因座的染色體（例如，小鼠出第12號(hào)染 色體之外的染色體；大鼠出第6號(hào)染色體之外的染色體）。例如，這可以通過易位至少其側(cè) 翼直接連接內(nèi)源性VH基因區(qū)段最3'和內(nèi)源性D區(qū)段最5'的DNA來達(dá)成。在一個(gè)實(shí)施例 中，所述非人脊椎動(dòng)物是小鼠，易位的DNA包含來自小鼠 VH5-1到D1-1基因區(qū)段，或由其組 成。在一實(shí)施方式中，全部內(nèi)源性VD區(qū)被易位；在另一實(shí)施方式中，全部VDJ區(qū)被易位，在 任一情況中，這還將使內(nèi)含的內(nèi)源性ADAM6基因易位。
[0071] 本文描述的關(guān)于小鼠的所有技術(shù)還應(yīng)用于其他非人脊椎動(dòng)物，其中ADAM6將與內(nèi) 源性VDJ -起刪除，例如，其中ADAM6嵌入內(nèi)源性VDJ區(qū)。例如，所述技術(shù)可以應(yīng)用于另一 個(gè)轉(zhuǎn)基因鼠類物種。所述技術(shù)可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大鼠。自始至終，公開內(nèi)容應(yīng)考慮這些來 理解，這樣關(guān)于轉(zhuǎn)基因小鼠的討論等同于可應(yīng)用于制備其他非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。因此，例如， 提到小鼠第12號(hào)染色體的地方和制備轉(zhuǎn)基因小鼠，本文公開的內(nèi)容還可以理解為制備轉(zhuǎn) 基因大鼠，以及在大鼠的情況下意指第6號(hào)染色體。
[0072] 在所有情況中，染色體上的內(nèi)源性VDJ區(qū)內(nèi)的刪除優(yōu)選地包括所有ADAM6編碼核 苷酸序列的刪除。因此，當(dāng)所述脊椎動(dòng)物是小鼠時(shí)，ADAM6a和ADAM6b被刪除。例如，側(cè)翼 直接連接內(nèi)源性VH基因區(qū)段最3'和內(nèi)源性D區(qū)段最5'的DNA被刪除。在一個(gè)實(shí)施例中， 所述非人脊椎動(dòng)物是小鼠，從小鼠 VH5-1到D1-1基因區(qū)段的DNA被刪除。
[0073] 本發(fā)明通過實(shí)施提供一種制備可育非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠）的方法，所 述非人脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，所述方法通過在ES細(xì)胞中實(shí) 施步驟（a)到（d)和使用ES細(xì)胞基因組技術(shù)產(chǎn)生最終的非人脊椎動(dòng)物而提供，所述非人脊 椎動(dòng)物具有包含插入的ADAM6編碼核苷酸序列（純合或雜合狀態(tài)）且純合狀態(tài)的所述重鏈 基因座的基因組，其中內(nèi)源性ADAM6已被刪除。本發(fā)明還提供通過這一方法制備的可育的 非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠）或其可育的雄性或雌性子代。
[0074] -方面，與插入人VDJ和刪除內(nèi)源性VDJ(或其部分）同時(shí)或分別進(jìn)行，所述方法 包括
[0075] -將一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列插入到ES細(xì)胞基因組；以及
[0076] -將所述ES細(xì)胞發(fā)育為可育小鼠或其子代，其基因組對于轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言 是純合的，其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)皆已刪除； 任選地其中所述可育小鼠或子代是雄性。
[0077] 另一方面，在插入人VDJ區(qū)和刪除內(nèi)源性VDJ(或其部分）后，所述方法包括
[0078] -將所述ES細(xì)胞發(fā)育為幼鼠或其子代，其基因組包含一或多個(gè)所述轉(zhuǎn)基因重鏈基 因座（例如，對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的）；
[0079] -從所述小鼠得到第二ES細(xì)胞，并將一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列插入到所述 第二ES細(xì)胞基因組；以及
[0080] -將所述第二ES細(xì)胞發(fā)育為可育小鼠或其子代，其基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基 因座而言是純合的并編碼ADAM6,其中基因組中的第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈 VDJ區(qū)已刪除；任選地其中所述可育小鼠或子代是雄性。
[0081] 另一方面，在插入人VDJ區(qū)和刪除內(nèi)源性VDJ(或其部分）后，所述方法包括
[0082] -將所述ES細(xì)胞發(fā)育為幼鼠或其子代，其基因組包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座（例 如，對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的）；以及
[0083]-通過使用所述小所幼崽（或子代）與另一小鼠進(jìn)行繁殖，所述另一小鼠的基因組 包含一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列，產(chǎn)生可育小鼠或其子代，其基因組對于所述轉(zhuǎn)基因 重鏈基因座而言是純合的并編碼ADAM6,其中基因組中的第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源 性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地其中所述可育小鼠或子代是雄性。
[0084] 在這方面，任選地，所述另一小鼠對于ADAM6而言是純合的，例如，小鼠基因組以 純合的狀態(tài)包含ADAM6a和ADAM6b。任選地，所述小鼠是統(tǒng)一小鼠品系的。
[0085] 技術(shù)人員知道用于得到胚胎干細(xì)胞的技術(shù)。例如，可以使用用于ES細(xì)胞產(chǎn)生的 任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從胚胎（例如，囊胚狀態(tài)）產(chǎn)生所述第二ES細(xì)胞。例如，參見Proc Natl Acad Scil997May27;94(ll):5709-12 ;"The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse" ；Brook FA&Gardner RL，其公開的內(nèi)容以引文并入 本文。胚胎可以是所述幼鼠或其子代胚胎?？梢允褂闷渌麡?biāo)識(shí)ES細(xì)胞產(chǎn)生技術(shù)。在另一 實(shí)施方式中，所述第二ES細(xì)胞是IPS細(xì)胞（誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞），其得自所述幼鼠或其子 代。參見 W02007069666、TO2008118820、W02008124133、TO2008151058、TO2009006997 和 W02011027180,其提供關(guān)于IPS技術(shù)和合適的方法的指導(dǎo)，其公開內(nèi)容全部并入本文。在一 個(gè)實(shí)施例中，IPS細(xì)胞可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法從所述幼鼠或其子代小鼠的體細(xì)胞直接產(chǎn)生（即， 不需要繁殖）。
[0086] 精通ES細(xì)胞技術(shù)的技術(shù)人員會(huì)很容易地知道怎樣從基因組被操作的轉(zhuǎn)基因 ES細(xì) 胞產(chǎn)生后代。例如，將非人（例如，小鼠）ES細(xì)胞（例如包含轉(zhuǎn)基因重鏈基因座的ES細(xì)胞） 移植到供體囊胚中（例如，與該ES細(xì)胞同一品系的脊椎動(dòng)物的囊胚）。然后將該囊胚移植 到養(yǎng)母體內(nèi)，其在該處發(fā)育為后代（胚胎或出生的后代）。以這種方式，可以產(chǎn)生多個(gè)后代， 其來自各個(gè)修飾的后代ES細(xì)胞。同胞小鼠可以一起培養(yǎng)以進(jìn)行雜交提供一或多個(gè)生成的 子代，其對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施例中，通過下述步驟將本發(fā)明任何構(gòu)型、方面或?qū)嵤├男∈?ES細(xì)胞 發(fā)育為后代或子代：
[0088] (f)將所述ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到供體小鼠囊胚或更早期胚胎（例如，前桑椹胚期）中；
[0089] (g)將所述囊胚或胚胎移植到小鼠養(yǎng)母中；以及
[0090] (h)將所述囊胚或胚胎發(fā)育為可育的幼鼠或其子代，其基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重 鏈基因座而言是純合的并編碼ADAM6。
[0091] 本發(fā)明的構(gòu)型的另一方面，ADAM6編碼核苷酸序列的插入位置不限于最初的染色 體（例如，小鼠的第12號(hào)染色體或大鼠的第6號(hào)染色體）；可以插入到另一染色體，或者在 原始染色體上但與野生型ADAM6基因位置相間隔。在一個(gè)實(shí)施例中，將ADAM6基因插入到原 始染色體種，例如，當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，將ADAM6編碼核苷酸序列插入到第12號(hào)染色體； 當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因大鼠時(shí)，將ADAM6編碼核苷酸序列插入到第6號(hào)染色體。在一個(gè)實(shí)施例中，將 ADAM6編碼核苷酸序列插入到距一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座20、15、10、5、4、3、2、1或 0. 5Mb以內(nèi)。這可用于最大化插入的ADAM6和所述轉(zhuǎn)基因基因座之間的連接，最小化隨后呃 減數(shù)分裂和雜交過程中（例如子代繁殖過程中）的基因分離。因此，最終的小鼠及其子代 可以保持本發(fā)明的育性優(yōu)勢，而允許有用的后續(xù)繁殖和雜交以產(chǎn)生新的動(dòng)物品系。在另一 實(shí)施方式中，將ADAM6編碼核苷酸序列插入到一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座以內(nèi)，例如， 在人VH基因區(qū)段最3'和人D區(qū)段最5'的DNA內(nèi)，所述DNA天然具有ADAM6。
[0092] 在本發(fā)明構(gòu)型的任何方面，通過ES細(xì)胞技術(shù)和/或通過繁殖將一或多個(gè)（例如， 兩個(gè)）ADAM6編碼核苷酸序列摻入到脊椎動(dòng)物基因組。插入的ADAM6編碼核苷酸序列不需 要來自與受者非人脊椎動(dòng)物相同的物種。例如，該脊椎動(dòng)物是小鼠和大鼠或靈長類（例如， 人），插入了 ADAM6編碼核苷酸序列。例如，該脊椎動(dòng)物是大鼠和小鼠或靈長類（例如，人）， 插入了 ADAM6編碼核苷酸序列。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脊椎動(dòng)物是小鼠，且ADAM6編碼核苷酸序列插入到一或 全部兩個(gè)第12號(hào)染色體上。例如，小鼠 ADAM6a和ADAM6b或大鼠 ADAM6插入到一或全部兩 個(gè)第12號(hào)染色體上。例如，小鼠 ADAM6編碼核苷酸序列插入在人VH基因區(qū)段最3'和人D 區(qū)段最5'之間。
[0094] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脊椎動(dòng)物是大鼠，且ADAM6編碼核苷酸序列插入到一或 全部兩個(gè)第6號(hào)染色體上。例如，小鼠或大鼠 ADAM6插入到一或全部兩個(gè)第6號(hào)染色體上。 例如，小鼠 ADAM6編碼核苷酸序列插入在人VH基因區(qū)段最3'和人D區(qū)段最5'之間。
[0095] 在本發(fā)明構(gòu)型的任何方面，各ADAM6是可表達(dá)的。例如，插入插入的ADAM6編碼核 苷酸序列，這樣其與啟動(dòng)子（以及任選地，增強(qiáng)子或其它調(diào)控元件）可操作連接以表達(dá)。所 述啟動(dòng)子可以是所述非人脊椎動(dòng)物內(nèi)源性的，例如，小鼠啟動(dòng)子（例如，野生型小鼠中驅(qū)動(dòng) ADAM6表達(dá)的），或其可以是外源性的（來自不同物種）。例如，基因組中插入的ADAM6是 大鼠 ADAM6核苷酸序列，其與內(nèi)源性小鼠 ADAM6啟動(dòng)子可操作連接?；蛘?，基因組中插入的 ADAM6是小鼠 ADAM6核苷酸序列，其與內(nèi)源性大鼠 ADAM6啟動(dòng)子可操作連接。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方式中，插入ADAM6核苷酸序列，其選自SEQ ID NO: 1、2、3和4 (見下 面的序列表）。
[0097] 在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，人免疫球蛋白基因區(qū)段插入到染色體以取代 全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，這樣人基因區(qū)段的插入和內(nèi)源性VDJ DNA從染色體或基因 組刪除同時(shí)進(jìn)行；任選地，其中全部內(nèi)源性VDJ區(qū)被取代。例如，人基因的插入使用同源重 組和/或位點(diǎn)特異性重組（例如，重組酶介導(dǎo)的盒（cassette)交換）以執(zhí)行精確取代而進(jìn) 行。內(nèi)源性VDJ(尤其是全部內(nèi)源性VDJ)從基因組刪除有利于完全消除與恒定區(qū)基因區(qū)段 重組的可能性，從而必然會(huì)完全消除內(nèi)源性重鏈表達(dá)。
[0098] 在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，其中所述脊椎動(dòng)物是小鼠，插入小鼠 ADAM6a和 ADAM6b編碼核苷酸序列，這樣最終的可育小鼠能夠表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白。
[0099] 在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，最終的可育小鼠或子代的基因組對于各插入 的ADAM6編碼核苷酸序列而言是純合的。任選地，所述基因組包含多于兩個(gè)拷貝的小鼠 ADAM6a和/或ADAM6b編碼核苷酸序列。任選地，作為供替代的選擇，所述基因組包含兩個(gè) 拷貝的ADAM6a和一個(gè)拷貝的（雜合的）ADAM6b ;或一個(gè)拷貝的ADAM6a和兩個(gè)拷貝的（雜 合的）ADAM6b。
[0100] 在另一構(gòu)型中，本發(fā)明提供可育的非人脊椎動(dòng)物（任選地，雄性），其對于轉(zhuǎn)基因 抗體重鏈基因座而言是純合的，所述脊椎動(dòng)物的基因組
[0101] ⑴在第一染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0102] (ii)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0103] 其中所述基因組的各第一染色體包含
[0104] (iii)轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含與小鼠重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或 C γ )的上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人 JH基因區(qū)段；
[0105] (iv)所述染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體重鏈表 達(dá)失活，其中該刪除包括ADAM6 ;以及
[0106] 其中該基因組包含
[0107] (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6編碼核苷酸序列的插入。
[0108] 例如，所述非人脊椎動(dòng)物是鼠類。例如，所述非人脊椎動(dòng)物是小鼠或大鼠。
[0109] 一方面，本發(fā)明提供非人脊椎動(dòng)物例如小鼠（任選地，雄性小鼠），其對于轉(zhuǎn)基因 抗體重鏈基因座而言是純合的，所述小鼠的基因組
[0110] (i)在第12號(hào)染色體（或?qū)τ谒黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體）的各自拷貝上包 含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0111] (ii)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0112] 其中所述基因組的各第12號(hào)染色體包含
[0113] (iii)轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含與重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或Cy)的 上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因 區(qū)段；
[0114] (iv)所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性 抗體重鏈表達(dá)失活（分化為小鼠 /B細(xì)胞之后），其中所述刪除包括小鼠 ADAM6編碼核苷酸 序列（即，基因組中沒有保留功能性內(nèi)源ADAM6基因）；以及
[0115] 其中該基因組包含
[0116] (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6編碼核苷酸序列的插入。
[0117] 以上大體考慮了在本發(fā)明的動(dòng)物中怎樣和在哪里插入ADAM6序列。
[0118] 恒定區(qū)是，例如，小鼠恒定區(qū)，例如，內(nèi)源性恒定區(qū)。因此，當(dāng)所述脊椎動(dòng)物是小鼠 時(shí)，所述恒定區(qū)是內(nèi)源性小鼠恒定區(qū)，例如小鼠 Cy和/或小鼠 Cy，任選地，其具有內(nèi)源性 小鼠或大鼠 S μ轉(zhuǎn)換。
[0119] 另一方面，本發(fā)明提供非人大鼠（任選地，雄性大鼠），其對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基 因座而言是純合的，所述大鼠的基因組
[0120] (i)在第6號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及
[0121] (ii)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；
[0122] 其中所述基因組的各第6號(hào)染色體包含
[0123] (iii)轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含與重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和/或CY)的 上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因 區(qū)段；
[0124] (iv)所述第6號(hào)染色體的全部或部分大鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗 體重鏈表達(dá)失活（分化為小鼠/B細(xì)胞之后），其中所述刪除包括大鼠 ADAM6編碼核苷酸序 列（即，基因組中沒有保留功能性內(nèi)源ADAM6基因）；以及
[0125] 其中該基因組包含
[0126] (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6編碼核苷酸序列的插入。
[0127] 恒定區(qū)是，例如，大鼠恒定區(qū)，例如，內(nèi)源性恒定區(qū)。因此，當(dāng)所述脊椎動(dòng)物是大鼠 時(shí)，所述恒定區(qū)是內(nèi)源性大鼠恒定區(qū)，例如大鼠 Cy和/或大鼠 Cy，任選地，其具有內(nèi)源性 小鼠或大鼠 S μ轉(zhuǎn)換。
[0128] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，插入的ADAM6編碼核苷酸序列在 (i)第12號(hào)染色體上，其中所述動(dòng)物是小鼠；或（ii)第6號(hào)染色體上，其中所述動(dòng)物是大 鼠。
[0129] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，插入的ADAM6編碼核苷酸序列插入 至（i) 一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座以內(nèi)；或（ii)距一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座 20Mb以內(nèi)。
[0130] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，人基因區(qū)段取代各重鏈基因座內(nèi)的 全部或部分內(nèi)源性VDJ區(qū)。
[0131] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，所述基因組包含插入的可表達(dá)的小 鼠 ADAM6a和ADAM6b編碼核苷酸序列。
[0132] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，所述基因組包含插入的可表達(dá)的大 鼠 ADAM6編碼核苷酸序列。
[0133] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，所述基因組對于各插入的ADAM6編 碼核苷酸序列而言是純合的。任選地，所述基因組包含多于兩個(gè)拷貝的ADAM6編碼核苷酸 序列，其選自大鼠 ADAM6、小鼠 ADAM6a和小鼠 ADAM6b編碼核苷酸序列。任選地，所述基因組 包含兩個(gè)拷貝的ADAM6a和一個(gè)拷貝（雜合的）的ADAM6b;或一個(gè)拷貝的ADAM6a和兩個(gè)拷 貝的（雜合的）ADAM6b。
[0134] 在本發(fā)明的純合小鼠或大鼠的一個(gè)實(shí)施例中，所述基因組包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因輕 鏈基因座，其包含一或多個(gè)人輕鏈V基因區(qū)段和與輕鏈恒定區(qū)（例如，內(nèi)源性小鼠或大鼠 Ck恒定區(qū)）的上游可操作連接的一或多個(gè)輕鏈J基因區(qū)段。
[0135] 通過易位的內(nèi)源性抗體鏈表達(dá)的失活
[0136] 在一個(gè)構(gòu)型中，本發(fā)明提供：
[0137] 非人脊椎動(dòng)物（任選地，小鼠或大鼠）或非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞（任選地，小鼠或大鼠 細(xì)胞），其基因組
[0138] (i)包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地， 在抗體基因重排之后）；以及
[0139] (ii)內(nèi)源性抗體表達(dá)失活；
[0140] 其中
[0141] (iii)內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段易位到在野生型非人脊椎動(dòng)物中不含有抗體可變區(qū) 基因區(qū)段的染色體種類（例如，第15號(hào)染色體），從而使內(nèi)源性抗體表達(dá)失活。
[0142] 所述脊椎動(dòng)物可以是本文公開的任何非人脊椎動(dòng)物物種。所述轉(zhuǎn)基因抗體基因座 可以是根據(jù)任何本文公開的物種獲得。
[0143] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段易位到在野生型所述非人脊椎動(dòng)物 中不含有抗體可變區(qū)基因區(qū)段的染色體種類（例如，第15號(hào)染色體），所述易位在祖先細(xì)胞 中進(jìn)行（例如，ES細(xì)胞），本發(fā)明的脊椎動(dòng)物或細(xì)胞起源于所述祖先細(xì)胞。
[0144] 本發(fā)明還提供：
[0145] 小鼠或小鼠細(xì)胞，其基因組
[0146] (i)包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地， 在抗體基因重排之后）；以及
[0147] (ii)內(nèi)源性小鼠抗體表達(dá)失活；
[0148] 其中
[0149] (iii)多個(gè)內(nèi)源性小鼠可變區(qū)基因區(qū)段從基因組中的第12號(hào)染色體缺失，但所述 基因區(qū)段（彼此之間）以種系構(gòu)型存在于一或多個(gè)非第12號(hào)染色體的染色體上（例如，所 述基因區(qū)段在第15號(hào)染色體上），從而使內(nèi)源性小鼠抗體表達(dá)失活。
[0150] 此外，本發(fā)明提供：
[0151] 大鼠或大鼠細(xì)胞，其基因組
[0152] (i)包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地， 在抗體基因重排之后）；以及
[0153] (ii)內(nèi)源性大鼠抗體表達(dá)失活；
[0154] 其中
[0155] (iii)多個(gè)內(nèi)源性大鼠可變區(qū)基因區(qū)段從基因組中的第6號(hào)染色體缺失，但在所 述基因區(qū)段（彼此之間）以種系構(gòu)型存在于一或多個(gè)非第6號(hào)染色體的染色體上（例如， 所述基因區(qū)段在第15號(hào)染色體上），從而使內(nèi)源性大鼠抗體表達(dá)失活。
[0156] 當(dāng)本發(fā)明涉及細(xì)胞，例如ES細(xì)胞時(shí)，內(nèi)源性抗體表達(dá)的失活涉及分化的產(chǎn)生抗體 的子代細(xì)胞或表達(dá)內(nèi)源性抗體（即，其可變區(qū)只是所述非人脊椎動(dòng)物類型（例如，小鼠或大 鼠抗體）而不是人可變區(qū)的抗體）的非人脊椎動(dòng)物失去功能。因此，在本發(fā)明中，所述脊椎 動(dòng)物、小鼠、大鼠及表達(dá)包含人可變區(qū)的轉(zhuǎn)基因抗體而不（或基本不）表達(dá)內(nèi)源性抗體。在 一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因抗體基因座可以經(jīng)歷體內(nèi)重排，例如，在以預(yù)先確定的抗原免疫 所述脊椎動(dòng)物、小鼠或大鼠之后。重排之后，所述生物體能夠從所述重排的基因座表達(dá)抗體 鏈，這些鏈形成包含人可變區(qū)的抗體。
[0157] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞基因組包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈 基因座（處于雜合或純合狀態(tài)），所述基因座包含與非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠）恒 定區(qū)（任選地，Cy和/或Cy)的上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人 D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段；且所述內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段選自內(nèi)源性
[0158] (a) VH ；
[0159] (b)D ；
[0160] (c) JH ；
[0161] (d)VH和 D;
[0162] (6)0和邛；以及
[0163] 出￥!1、0和邛。
[0164] 在（a)到（f)中，可以包括基因區(qū)段之間的中間序列。
[0165] 在這一實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)施例中，所述恒定區(qū)是內(nèi)源性恒定區(qū)，例如，內(nèi)源性Cy 和/或C Y，例如內(nèi)源性小鼠 C μ和/或內(nèi)源性小鼠 C Y。
[0166] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞基因組包含可表達(dá)的ADAM6 基因或ADAM6編碼核苷酸序列。
[0167] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞是雄性脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠 或細(xì)胞，例如，其基因組包含內(nèi)源性ADAM6基因。
[0168] 在一個(gè)實(shí)施方式中，基本上全部內(nèi)源性VDJ(或其包括ADAM6編碼核苷酸序列 的部分）通過異位到不同的染色體種類而從該染色體刪除。例如，所述不同的染色體是 第15號(hào)染色體。例如，小鼠中第12和15號(hào)染色體之間的易位值得進(jìn)行，因?yàn)閺陌l(fā)表的 觀察結(jié)果可知，在第12號(hào)染色體上的重鏈基因座和第15號(hào)染色體上的c-myc之間的易 位是可能的（見，例如，Science24Decemberl982:Vol.218no. 4579ρρ· 1319-1321 ;"Mouse c-myc oncogene is located on chromosome15and translocated to chromosome12in plasmacytomas" ；Crews et al)。因此，在一個(gè)所述脊椎動(dòng)物是小鼠的實(shí)施例中，所述內(nèi)源 性VDJ(或其部分）通過易位到第15號(hào)染色體而從第12號(hào)染色體刪除。在另一個(gè)所述脊 椎動(dòng)物是大鼠的實(shí)施例中，所述內(nèi)源性VDJ(或其部分）通過易位到第15號(hào)染色體而從第 6號(hào)染色體刪除。因此，在本發(fā)明的最終的可育小鼠或子代中，內(nèi)源性重鏈表達(dá)通過將至少 部分內(nèi)源性重鏈基因座VDJ易位到非野生型染色體（即，不是第12號(hào)染色體）而失活。因 此，在本發(fā)明的最終的可育大鼠或子代中，內(nèi)源性重鏈表達(dá)通過將至少部分內(nèi)源性重鏈基 因座VDJ易位到非野生型染色體（S卩，不是第6號(hào)染色體）而失活。在這種情況中，易位的 內(nèi)源性VDJ (或部分）保持在動(dòng)物的基因組中，但導(dǎo)致內(nèi)源性重鏈表達(dá)無功能。這是有利的， 因?yàn)閮?nèi)源性ADAM6基因從野生型染色體位置刪除而產(chǎn)生失活，但是其隨后通過易位插入到 完全不同的染色體種類（即，不具有抗體重鏈基因組的染色體）上的基因組其他位置，所述 易位以使插入的ADAM6基因有功能（并因此在下游動(dòng)物中產(chǎn)生育性）而不用再激活內(nèi)源性 重鏈表達(dá)的方式進(jìn)行。因此，易位使失活可以伴隨著保留內(nèi)源性、野生型ADAM6基因以為生 成的動(dòng)物的育性做準(zhǔn)備。這完美地將ADAM6基因剪裁（tailor)到所述動(dòng)物的基因組（因 為其是內(nèi)源性序列），并且在一個(gè)實(shí)施方式中，還使各插入的內(nèi)源性ADAM6基因與其內(nèi)源性 啟動(dòng)子（和任何其它控制元件例如增強(qiáng)子）可以一起轉(zhuǎn)移。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，失活 通過刪除包含包括各自啟動(dòng)子的一或多個(gè)ADAM6基因的染色體序列（例如，小鼠第12號(hào)或 大鼠第6號(hào)染色體的序列）而進(jìn)行，并且該序列通過易位插入到不包含重鏈基因座的染色 體（例如，小鼠出第12號(hào)染色體之外的染色體；大鼠出第6號(hào)染色體之外的染色體）。例 如，這可以通過易位至少其側(cè)翼直接連接內(nèi)源性VH基因區(qū)段最3'和內(nèi)源性D區(qū)段最5'的 DNA來達(dá)成。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人脊椎動(dòng)物是小鼠，易位的DNA包含來自小鼠 VH5-1 到D1-1基因區(qū)段，或由其組成。在一實(shí)施方式中，全部內(nèi)源性VD區(qū)被易位；在另一實(shí)施方 式中，全部VDJ區(qū)被易位，在任一情況中，這還將使內(nèi)含的內(nèi)源性ADAM6基因易位。
[0169] 因此，本發(fā)明提供：
[0170] -種制備非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞（任選地，小鼠或大鼠細(xì)胞）或非人脊椎動(dòng)物（例如， 小鼠或大鼠）的方法，所述方法包括
[0171] (i)將一或多個(gè)包含人可變區(qū)基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因抗體基因座插入到非人ES細(xì)胞 基因組中；以及
[0172] (ii)通過將內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段（例如，全部內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)）易位到在野 生型所述非人脊椎動(dòng)物中不含有抗體可變區(qū)基因區(qū)段的染色體種類（例如，第15號(hào)染色 體）使內(nèi)源性抗體表達(dá)失活；
[0173] 由此，產(chǎn)生非人脊椎動(dòng)物ES細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生子代細(xì)胞（例如B細(xì)胞或雜交瘤）， 在所述子代細(xì)胞中，內(nèi)源性抗體表達(dá)失活，并且其中所述子代能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗 體；以及
[0174] (iii)任選地，將所述ES細(xì)胞分化為所述子代細(xì)胞或包含所述子代細(xì)胞的非人脊 椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠）。
[0175] 在一個(gè)實(shí)施例中，將種系構(gòu)型中包括中間序列的全部（或基本上全部）內(nèi)源性重 鏈VDJ區(qū)易位。任選地，所述細(xì)胞/脊椎動(dòng)物的基因組對于此易位而言是純合的。作為選 擇或另外，將輕鏈VJ區(qū)易位，例如，將種系構(gòu)型中包括中間序列的全部（或基本上全部）內(nèi) 源性輕鏈（例如，κ )VJ區(qū)易位。
[0176] 本發(fā)明的非人脊椎動(dòng)物可用于在以感興趣的目標(biāo)抗原或表位免疫后產(chǎn)生抗體。有 效地，產(chǎn)生的抗體具有人重鏈（和任選地也具有輕鏈）可變區(qū)。重鏈（和任選地也具有輕 鏈）恒定區(qū)是所述非人脊椎動(dòng)物的，例如所述動(dòng)物內(nèi)源性的，這使得可以利用內(nèi)源性抗體 表達(dá)和B細(xì)胞發(fā)育控制機(jī)制，從而增強(qiáng)抗體產(chǎn)生?？乖庖吆蟮倪M(jìn)行分離，此后，所選的抗 體可以通過用常規(guī)技術(shù)將所述恒定區(qū)交換為人恒定區(qū)而格式化（formatted)以提高給人 施用的相容性。
[0177] 從本發(fā)明的動(dòng)物分離的抗體（或衍生的抗體）具有使其包含人重鏈可變區(qū)的格式 (format)。例如，本發(fā)明適用于4-鏈抗體，其中各抗體含有2個(gè)重鏈和2個(gè)輕鏈?；蛘?， 本發(fā)明可以應(yīng)用于具有人V區(qū)的H2抗體（重鏈抗體），并且其缺乏CH1和輕鏈（與駱駝科 動(dòng)物（Camelid)H2 抗體等價(jià)的：見，例如，Nature. 1993Jun3 ;363 (6428) :446-8 ;Naturally occurring antibodies devoid of light chains ;Hamers-Casterman C,Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R) 〇 這些抗體 能特異性結(jié)合抗原，這樣的抗體與駱駝科動(dòng)物（例如，無峰駝、駱駝、羊駝）血液中發(fā)現(xiàn)的 那些類似。這些具有人VH對的抗體可以合成地產(chǎn)生以提供治療和預(yù)防的藥物（例如，見 W01994004678、W02004041862、W02004041863)。轉(zhuǎn)基因小鼠也可以產(chǎn)生這樣的抗體，并且體 內(nèi)產(chǎn)生所述抗體使所述小鼠的免疫系統(tǒng)可以選擇人VH-VH配對，有時(shí)選擇其中由小鼠體內(nèi) 導(dǎo)入突變的配對以容納所述配對（W02010109165A2)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所 述重鏈轉(zhuǎn)基因缺乏CH1基因區(qū)段并且所述基因組不包含功能性抗體輕鏈基因座?；蛘?，檢 測抗體是抗體片段，例如，F(xiàn)ab或Fab2,其包含恒定區(qū)和人重鏈可變區(qū)。
[0178] 技術(shù)人員熟悉用于以抗原免疫的常規(guī)方法和方案，例如，使用初始免疫和加強(qiáng) (prime and boost)免疫方案。合適的方案是 RIMMS (見 Hybridomal997Aug ; 16 (4) :381-9 ; "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS" ； Kilpatrick et al)。對于免疫本發(fā)明的脊椎動(dòng)物，合適的人祀位或表位可以來自任何合適 的來源，例如，通過克隆來自人供體的血液或組織樣品的DNA獲得。
[0179] 貫穿本文，以及應(yīng)用于本發(fā)明的任何構(gòu)型、方面、實(shí)施方式或?qū)嵤├?，術(shù)語"內(nèi)源 性"(例如，內(nèi)源性恒定區(qū)）涉及非人脊椎動(dòng)物或細(xì)胞、其元件或特征（例如，"內(nèi)源性ADAM6" 或"內(nèi)源性恒定區(qū)"），該術(shù)語說明所述元件是一類通常發(fā)現(xiàn)于非人椎動(dòng)物或細(xì)胞株系的元 件（與外源性恒定區(qū)、ADAM6或序列通常未發(fā)現(xiàn)于這樣的脊椎動(dòng)物或細(xì)胞中的其它元件相 反）。
[0180] 在一個(gè)實(shí)施例中，各小鼠或ES細(xì)胞具有129小鼠遺傳背景。在一個(gè)實(shí)施例中，所 述小鼠或ES細(xì)胞具有AB2. 1小鼠遺傳背景。在另一實(shí)施例中，所述小鼠或ES細(xì)胞具有選 自 129、C57BL/6N、C57BL/6J、JM8、AB2. 1、AB2. 2、129S5 或 129Sv 的小鼠品系的遺傳背景。
[0181] 從本發(fā)明的脊椎動(dòng)物分離的抗體可以隨后，例如，通過添加（例如通過化學(xué)綴合） 標(biāo)簽或毒素、PEG或其它部分進(jìn)行衍生，以制備藥物產(chǎn)物。例如，當(dāng)值得給開發(fā)自抗體的藥 物添加額外的功能時(shí)，衍生是有益的。例如，對于癌癥指示，值得添加額外的幫助細(xì)胞殺傷 的部分。在另一實(shí)施方式中，從所述脊椎動(dòng)物分離的抗體的恒定區(qū)是體內(nèi)或體外親和力成 熟的（例如，通過噬菌體展示、核糖體展示、酵母展示等）。在另一實(shí)施方式中，從所述脊椎 動(dòng)物分離的抗體的恒定區(qū)是體內(nèi)或體外突變的（例如，通過隨機(jī)或定向的、特異性突變和 通過噬菌體展示、核糖體展示、酵母展示等任選的）。所述恒定區(qū)可以突變以失去（ablate) 或增強(qiáng)Fc功能（例如ADCC)。
[0182] 在一個(gè)實(shí)施方式中，最終的脊椎動(dòng)物的基因組包含一或多個(gè)輕鏈抗體基因 座，其包含 VJ 基因區(qū)段，例如，如 W02011004192、US7501552、US6673986、US6130364、 W02009076464和US6586251任一者所描述的，上述文獻(xiàn)公開的內(nèi)容以引文全部并入本文。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述最終的脊椎動(dòng)物包含
[0183] (a)重鏈基因座，各包含位于內(nèi)源性非人脊椎動(dòng)物（例如，內(nèi)源性小鼠或大鼠）恒 定區(qū)（例如，Cy和/或Cy)上游的一或多個(gè)人重鏈V基因區(qū)段、一或多個(gè)人重鏈D基因 區(qū)段和一或多個(gè)人重鏈JH基因區(qū)段；
[0184] (b) κ輕鏈基因座（任選地處于純合狀態(tài)），其包含位于內(nèi)源性非人脊椎動(dòng)物（例 如，內(nèi)源性小鼠或大鼠）κ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人 K鏈￥基因區(qū)段和一或多個(gè)人K鏈 Jk基因區(qū)段；以及任選地
[0185] (c) λ輕鏈基因座（任選地處于純合狀態(tài)），其包含位于內(nèi)源性非人脊椎動(dòng)物（例 如，內(nèi)源性小鼠或大鼠）λ恒定區(qū)上游一或多個(gè)人λ鏈V基因區(qū)段和的一或多個(gè)人λ鏈 JA基因區(qū)段；以及
[0186] (d)其中所述脊椎動(dòng)物在所述基因座重排和以抗原免疫后，能夠產(chǎn)生嵌合抗體。
[0187] 如本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，提供產(chǎn)生IPS細(xì)胞的方法。例如，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞可以 從小鼠胚胎以及隨后使用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生的IPS細(xì)胞產(chǎn)生。例如，參見Proc Natl Acad Sci ;20110ctll;"Rapid and efficient reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homologl";Wang et al，其公開的內(nèi)容以引文并入本文?？梢允褂闷渌麡?biāo)準(zhǔn)IPS產(chǎn)生技術(shù)。
[0188] 在本發(fā)明任一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)使用IPS細(xì)胞時(shí)，所述IPS細(xì)胞時(shí)小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞。
[0189] 人DNA(例如，作為重鏈和/或輕鏈基因區(qū)段來源）很容易從商業(yè)途徑和學(xué)術(shù)文 庫（例如，含有人DNA的細(xì)菌人工染色體（BAC)文庫）獲得。例如人RPCI-11和-13文庫 (Osoegawa et al, 2001 - see below ：http://bacpac.med. buffalo, edu/1lframehmale. htm)和 "CalTech" 人 BAC 文庫（CalTech Libraries A, B, C and/or D, http: //www. tree, caltech. edu/lib status, html)。
[0190] CalTech 人 BAC 文庫 D :
[0191] 見：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/clone/library/genomic/16/
[0192] 加利福尼亞理工學(xué)院的Hiroaki Shizuya實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了 3個(gè)不同的人BAC文庫 (可從 Open Biosystem 獲得）。Cal Tech B(CTB)和 Cal Tech C(CTC)文庫一起代表 15X 的 基因組覆蓋。Cal Tech D(CTD)文庫代表人基因組的17X的覆蓋。整個(gè)保藏（collection)和 單個(gè)克隆都是可得的。關(guān)于構(gòu)建這些文庫的詳細(xì)信息可在http: //informa, bio, caltech. edu/idx www tree, html 找至丨J。
[0193] 文庫概述
[0194] 文庫名稱：CalTech人BAC文庫D
[0195] 文庫縮寫：CTD
[0196] 生物體：智人
[0197] 經(jīng)銷商：Invitrogen、Open Biosystem
[0198] 載體類型：BAC
[0199] # 克隆 Clone DB :226, 848
[0200] # 末端序列 Clone DB :403, 688
[0201] # 插入序列 Clone DB :3, 153
[0202] #具有兩端序列的克?。?53, 035
[0203] 文庫詳細(xì)信息
[0204]
【權(quán)利要求】
1. 一種制備小鼠細(xì)胞或可育小鼠的方法，所述小鼠細(xì)胞或可育小鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重 鏈基因座而言是純合的， 所述小鼠的基因組 (a) 在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及 (b) 內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活； 所述方法包括以下步驟： (c) 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建 通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到 第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣所述人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)（任選地，C μ和 /或C γ )的上游可操作連接； (d) 與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重 鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因； (e) 與步驟（c)或⑷同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)ADAM6基因插入到ES細(xì)胞基因組； 以及任選地 (f) 使ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述 轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的全部 或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。
2. -種制備小鼠細(xì)胞或可育小鼠的方法，所述小鼠細(xì)胞或可育小鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重 鏈基因座而言是純合的， 所述小鼠的基因組 (a) 在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及 (b) 內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活； 所述方法包括以下步驟： (c) 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建 通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到 第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣所述人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)（任選地，C μ和 /或C γ )的上游可操作連接； (d) 與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重 鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因； (e) 使ES細(xì)胞發(fā)育成為幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈 基因座； (f) 從所述小鼠獲得第二ES細(xì)胞并在所述第二ES細(xì)胞基因組中插入一或多個(gè)ADAM6 基因；以及任選地 (g) 使所述第二ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組 對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的并且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12號(hào)染 色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。
3. -種制備可育小鼠的方法，所述小鼠對于轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的， 所述小鼠的基因組 (a)在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及 (b) 內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活； 所述方法包括以下步驟： (c) 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建 通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到 第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)（任選地，C μ和/或 Cy)的上游可操作連接； (d) 與步驟（c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重 鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因； (e) 使ES細(xì)胞發(fā)育成為幼鼠或其子代，所述幼鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈 基因座；以及 (f) 通過使用所述幼鼠（或子代）以及另外的小鼠（其基因組包含一或多個(gè)ADAM6基 因）進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因 重鏈基因座而言是純合的并且編碼ADAM6,其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的內(nèi)全部或 部分源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。 4. ADAM6基因在生產(chǎn)用于產(chǎn)生可育小鼠（例如，可育雄性小鼠）的小鼠中的用途， 其中所述小鼠的基因組包含 (a) 轉(zhuǎn)基因重鏈基因座，其包含插入到第12號(hào)染色體的DNA中的一或多個(gè)人VH基因區(qū) 段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒 定區(qū)（任選地，C μ和/或C γ )的上游可操作連接；以及 (b) 所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體重 鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因；以及 其中將一或多個(gè)ADAM6基因插入基因組。 5. ADAM6基因在生產(chǎn)用于產(chǎn)生能夠發(fā)育成可育小鼠（例如，雄性小鼠）的細(xì)胞的小鼠細(xì) 胞中的用途； 其中所述小鼠細(xì)胞的基因組包含 (a) 轉(zhuǎn)基因重鏈基因座，其包含插入到第12號(hào)染色體的DNA中的一或多個(gè)人VH基因區(qū) 段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒 定區(qū)（任選地，C μ和/或C γ )的上游可操作連接；以及 (b) 所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體重 鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因；以及 其中將一或多個(gè)小鼠 ADAM6基因插入基因組。
6. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，其中ADAM6基因插入至一或全部兩個(gè)第12號(hào)染 色體上。
7. 權(quán)利要求6的方法或用途，其中ADAM6基因插入至（i) 一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基 因座以內(nèi)或（ii)距一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座20Mb以內(nèi)。
8. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，其中將所述人基因區(qū)段插入第12號(hào)染色體以 取代全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，這樣人基因區(qū)段的插入和內(nèi)源性VDJ DNA的刪除同時(shí) 進(jìn)行；任選地，其中取代全部內(nèi)源性VDJ區(qū)。
9. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，其中插入小鼠 ADAM6a和ADAM6b基因，這樣最終 的可育小鼠可以表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白。
10. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，其中最終的可育小鼠或子代的基因組對于各 插入的ADAM6基因而言是純合的；任選地，其中該基因組包含多于兩個(gè)拷貝的小鼠 ADAM6a 和/或ADAM6b基因。
11. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，可選地，各生物體是大鼠而非小鼠，并且各所 述染色體是第6號(hào)染色體而非第12號(hào)染色體；或可選地，各細(xì)胞是大鼠細(xì)胞而非小鼠細(xì)胞， 并且各所述染色體是第6號(hào)染色體而非第12號(hào)染色體。
12. 包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座的小鼠（任選地，雄性小鼠），所述小鼠的基因組 (i) 在第12號(hào)染色體上包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及 (ii) 內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活； 其中所述基因組的所述第12號(hào)染色體包含 (iii) 轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和 /或Cy)的上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè) 人JH基因區(qū)段； (iv) 所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體 重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠 ADAM6基因；以及 其中該基因組包含 (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6基因的插入。
13. 權(quán)利要求12的小鼠，其中所述基因組在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含轉(zhuǎn)基因抗 體重鏈基因座。
14. 包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座的大鼠（任選地，雄性大鼠），所述大鼠的基因組 (i) 在第6號(hào)染色體上包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及 (ii) 內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活； 其中所述基因組的所述第6號(hào)染色體包含 (iii) 轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，其包含與大鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)（任選地，Cy和 /或Cy)的上游可操作連接的一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè) 人JH基因區(qū)段； (iv) 所述第6號(hào)染色體的全部或部分大鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)的刪除以使內(nèi)源性抗體重 鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括大鼠 ADAM6基因；以及 其中該基因組包含 (v) -或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6基因的插入。
15. 權(quán)利要求13的大鼠，其中所述基因組在第6號(hào)染色體的各自拷貝上包含轉(zhuǎn)基因抗 體重鏈基因座。
16. 權(quán)利要求12或13的小鼠或權(quán)利要求14或15的大鼠，其中各插入的ADAM6基因 在（i)第12號(hào)染色體上，其中所述動(dòng)物是小鼠；或（ii)第6號(hào)染色體上，其中所述動(dòng)物是 大鼠。
17. 權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中插入的ADAM6基因插入至（i) 一或全部 兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座以內(nèi)；或（ii)距一或全部兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重鏈基因座20Mb以內(nèi)。
18. 權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中人基因區(qū)段取代各重鏈基因座內(nèi)的全 部或部分內(nèi)源性VDJ區(qū)。
19. 權(quán)利要求12-18任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中所述基因組包含插入的可表達(dá)的小鼠 ADAM6a 和 ADAM6b 基因。
20. 權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中所述基因組包含插入的可表達(dá)的大鼠 ADAM6基因。
21. 權(quán)利要求12-20任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中所述基因組對于各插入的ADAM6基因而 言是純合的；任選地，其中所述基因組包含多于兩個(gè)拷貝的ADAM6基因，其選自大鼠 ADAM6、 小鼠 ADAM6a和小鼠 ADAM6b基因。
22. 權(quán)利要求12-21任一項(xiàng)的小鼠或大鼠，其中所述基因組包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因輕鏈 基因座，各輕鏈基因座包含與輕鏈恒定區(qū)（例如，內(nèi)源性小鼠或大鼠 Ck恒定區(qū)）的上游可 操作連接的一或多個(gè)人輕鏈V基因區(qū)段和一或多個(gè)輕鏈J基因區(qū)段。
23. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、小鼠或大鼠，其中所述基因組包含外源性 ADAM6。
24. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、小鼠或大鼠，其中所述基因組包含從靶向載體 (例如，BAC載體）插入的ADAM6。
25. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、小鼠或大鼠，其中所述基因組包含通過靶向或 隨機(jī)插入到ES細(xì)胞或受精卵中而插入的ADAM6外顯子。
26. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、小鼠或大鼠，其中內(nèi)源性ADAM6從基因組刪除。
27. 非人脊椎動(dòng)物（任選地，小鼠或大鼠）或非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞（任選地，小鼠或大鼠 細(xì)胞），其基因組 (i) 包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地，在抗 體基因重排之后）；以及 (ii) 內(nèi)源性抗體表達(dá)失活； 其中 (iii) 內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段易位到在野生型所述非人脊椎動(dòng)物中不含有抗體可變區(qū) 基因區(qū)段的染色體種類（例如，第15號(hào)染色體），從而使內(nèi)源性抗體表達(dá)失活。
28. 小鼠或小鼠細(xì)胞，其基因組 (i) 包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地，在抗 體基因重排之后）；以及 (ii) 內(nèi)源性小鼠抗體表達(dá)失活； 其中 (iii) 多個(gè)內(nèi)源性小鼠可變區(qū)基因區(qū)段從基因組中的第12號(hào)染色體缺失，但所述基因 區(qū)段（彼此之間）以種系構(gòu)型存在于一或多個(gè)非第12號(hào)染色體的染色體上（例如，所述基 因區(qū)段在第15號(hào)染色體上），從而使內(nèi)源性小鼠抗體表達(dá)失活。
29. 大鼠或大鼠細(xì)胞，其基因組 (i) 包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗體基因座，其能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體（任選地，在抗 體基因重排之后）；以及 (ii) 內(nèi)源性大鼠抗體表達(dá)失活； 其中 (iii)多個(gè)內(nèi)源性大鼠可變區(qū)基因區(qū)段從基因組中的第6號(hào)染色體缺失，但所述基因 區(qū)段（彼此之間）以種系構(gòu)型存在于一或多個(gè)非第6號(hào)染色體的染色體上（例如，所述基 因區(qū)段在第15號(hào)染色體上），從而使內(nèi)源性大鼠抗體表達(dá)失活。
30. 權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)的脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組包含轉(zhuǎn)基 因抗體重鏈基因座（處于雜合或純合狀態(tài)），所述基因座包含與非人脊椎動(dòng)物（例如，小鼠 或大鼠）恒定區(qū)或人恒定區(qū)（任選地，Cy和/或Cy)的上游可操作連接的一或多個(gè)人VH 基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段；且所述內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū) 段選自內(nèi)源性 (a) VH； (b) D ； (c) JH； (d) VH 和 D ; (6)0和邛；以及 (f)VH、D 和 JH。
31. 權(quán)利要求27-30任一項(xiàng)的脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組包含可表 達(dá)的內(nèi)源性ADAM6基因。
32. 權(quán)利要求27-31任一項(xiàng)的脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其是雄性。
33. -種制備非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞（任選地，小鼠或大鼠細(xì)胞）的方法，所述方法包括 (i) 將一或多個(gè)包含人可變區(qū)基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因抗體基因座插入到非人ES細(xì)胞基因 組中；以及 (ii) 通過將內(nèi)源性可變區(qū)基因區(qū)段易位到在野生型所述非人脊椎動(dòng)物中不含有抗體 可變區(qū)基因區(qū)段的染色體種類（例如，第15號(hào)染色體）使內(nèi)源性抗體表達(dá)失活； 由此，產(chǎn)生非人脊椎動(dòng)物ES細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生子代細(xì)胞，在所述子代細(xì)胞中，內(nèi)源性抗 體表達(dá)失活，并且其中所述子代能夠表達(dá)包含人可變區(qū)的抗體；以及 (iii) 任選地，將所述ES細(xì)胞分化為所述子代細(xì)胞或包含所述子代細(xì)胞的非人脊椎動(dòng) 物（例如，小鼠或大鼠）。
34. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含插入的人VDJ區(qū)，其包括來自人第14號(hào)染色體的第105, 400, 051位到第106,368,585 位喊基
35. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 在Ig重鏈、IgA和IgK基因座是純合的。
36. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中內(nèi)源性重鏈 Ig基因座的非人脊椎動(dòng)物VDJ區(qū)和內(nèi)源性λ和κ基因座的VJ區(qū)已經(jīng)失活。
37. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含 (i) 重鏈轉(zhuǎn)基因，其包含基本上全部人IgH V、D和J區(qū)的庫；以及 (ii) 基本上全部人Ig κ V和J區(qū)的庫和/或基本上全部人Ig λ V和J區(qū)的庫。
38. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含 (a) 重鏈基因座，各包含位于內(nèi)源性非人脊椎動(dòng)物恒定區(qū)或人恒定區(qū)（例如，Cy和/ 或C γ )上游的一或多個(gè)人重鏈V基因區(qū)段、一或多個(gè)人重鏈D基因區(qū)段和一或多個(gè)人重鏈 JH基因區(qū)段； (b) κ輕鏈基因座（任選地處于純合狀態(tài)），其包含位于內(nèi)源性非人脊椎動(dòng)物（例如， 內(nèi)源性小鼠或大鼠）κ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人 K鏈￥基因區(qū)段和一或多個(gè)人K鏈了匕 基因區(qū)段；以及任選地 (c) λ輕鏈基因座（任選地處于純合狀態(tài)），其包含位于λ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人 λ鏈V基因區(qū)段和一或多個(gè)人λ鏈JA基因區(qū)段；以及 (d) 其中所述脊椎動(dòng)物在所述基因座重排和以抗原免疫后，能夠產(chǎn)生嵌合抗體。
39. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠或細(xì)胞，其中所述脊椎動(dòng)物是具 有選自 129、BALB/c、C57BL/6N、C57BL/6J、JM8、AB2. 1、AB2. 2、129S5 或 129Sv 的小鼠遺傳背 景的小鼠。
40. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠或細(xì)胞，其中所述脊椎動(dòng)物 是小鼠，并且所述基因組包含人輕鏈κ VJ的插入，所述插入靶向小鼠第6號(hào)染色體坐標(biāo) 70, 673, 899和70, 675, 515之間，適當(dāng)?shù)?，位?0, 674, 734位，或第16號(hào)染色體上的小鼠 λ基因座中的等價(jià)位置。
41. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含λ抗體轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含全部或部分人IgA基因座，所述基因座包括至少一個(gè) 人JA區(qū)和至少一個(gè)人CA區(qū)。
42. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含λ轉(zhuǎn)基因，所述λ轉(zhuǎn)基因包含人Ελ增強(qiáng)子；和/或 κ轉(zhuǎn)基因，所述κ轉(zhuǎn)基因包含 人Εκ增強(qiáng)子。
43. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述基因組 包含（作為重鏈和/或輕鏈基因區(qū)段來源的）人DNA，所述DNA來自選自人RPCI-11文庫、 RPCI-13 文庫、CalTech Α 文庫、CalTech Β 文庫、CalTech C 文庫或 CalTech D 文庫的文庫。
44. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物或細(xì)胞，其中所述脊椎動(dòng)物是小鼠、大 鼠、兔、駱駝科動(dòng)物或鯊魚。
45. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中所述脊椎動(dòng) 物能夠產(chǎn)生至少1X 1〇6種不同的功能性嵌合抗體序列組合的多樣性。
46. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法、用途、脊椎動(dòng)物、小鼠、大鼠或細(xì)胞，其中從基因組刪 除天然反向的VH或假基因 VH。
47. 分離抗體或編碼抗體的核苷酸序列的方法，所述方法包括 (a) 以人目標(biāo)抗原免疫前述權(quán)利要求所述的脊椎動(dòng)物（例如，小鼠或大鼠），這樣所述 脊椎動(dòng)物產(chǎn)生抗體；以及 (b) 從所述脊椎動(dòng)物分離特異性結(jié)合所述抗原的抗體和/或分離編碼這樣的抗體的至 少重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；以及 任選地，所述抗體的可變區(qū)隨后與人恒定區(qū)連接。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述免疫采用初始免疫和增強(qiáng)方案。
49. 權(quán)利要求47的方法，其中所述免疫采用RMMS方案。
50. 權(quán)利要求47-49任一項(xiàng)的方法，其包括在步驟（b)之后，突變抗體的重鏈和/或輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列以提高與所述抗原結(jié)合的親和力。
51. 權(quán)利要求47-50任一項(xiàng)的方法，其包括在步驟（b)之后，突變抗體的重鏈和/或輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列以改良所述抗體的一或多種生物物理學(xué)特性，例如，熔解溫度、溶液 狀態(tài)、穩(wěn)定性和表達(dá)（例如，在CHO中或大腸桿菌（E.coli)中）中的一或多種。 52. 4-鏈抗體、H2抗體或抗體片段（例如，F(xiàn)ab或Fab2)，其由權(quán)利要求47-51任一項(xiàng)的 方法產(chǎn)生，其中所述抗體或片段與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合，并且包含人重鏈可變區(qū)和恒定 區(qū)；或所述抗體或片段的衍生物。
53. 通過使自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的抗體的可變區(qū)發(fā)生親和力 成熟而產(chǎn)生的抗體，其中該抗體與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。
54. 通過使自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的抗體的恒定區(qū)發(fā)生突變而 產(chǎn)生的抗體，其中該抗體與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。
55. 用作治療或預(yù)防性藥物的權(quán)利要求52、53或54的抗體（例如，完全人源化形式的 抗體）。
56. 權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)的脊椎動(dòng)物應(yīng)答于抗原攻擊而產(chǎn)生的多克隆抗體。
57. 用作治療或預(yù)防性藥物的權(quán)利要求56的抗體（例如，完全人源化形式的抗體）。
58. 自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的抗體或其衍生物或片段，其用于醫(yī) 學(xué)用途，其中該抗體與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。
59. 自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的多克隆抗體，其用于醫(yī)學(xué)用途。
60. 自通過權(quán)利要求47-51任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的重鏈或輕鏈可變區(qū)產(chǎn)生的人可變區(qū) (例如，結(jié)構(gòu)域抗體），并且其與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。
61. 編碼權(quán)利要求52-60任一項(xiàng)的抗體、片段、衍生物或可變區(qū)的核苷酸序列，任選地， 其中所述核苷酸序列是載體的一部分。
62. 藥物組合物，其包含 -自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的抗體，或包含所述抗體的衍生物；或 包含自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物分離的多克隆抗體；以及 -稀釋劑、賦形劑或載劑； -任選地，其中所述組合物位于IV容器（例如，IV袋）或與IV注射器連接的容器內(nèi)， 其中所述抗體與人目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。
63. 源自權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)所述的脊椎動(dòng)物的細(xì)胞系（例如永生化細(xì)胞系、ES細(xì)胞 或iPS細(xì)胞系）、B細(xì)胞、雜交瘤或干細(xì)胞。
64. 權(quán)利要求63的干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是BALB/c、JM8、AB2. 1或AB2. 2胚胎干細(xì)胞。
65. 權(quán)利要求63或64的細(xì)胞系、細(xì)胞或雜交瘤，其中所述脊椎動(dòng)物是小鼠 BALB/c、 C57BL/6N、C57BL/6J、129S5 或 129Sv 品系。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK104160031SQ201280059193
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】G·A·弗里德里希, E-C·李 申請人:科馬布有限公司