涉及核酸納米和微米技術(shù)的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了由多個(gè)寡核苷酸組成的、具有受控的大小和形狀的核酸結(jié)構(gòu)，及其合成方法。結(jié)構(gòu)至少部分通過單鏈寡核苷酸的自裝配形成。所得的結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸的位置是已知的。相應(yīng)地，結(jié)構(gòu)可以由特異性進(jìn)行修飾。
【專利說明】涉及核酸納米和微米技術(shù)的組合物和方法
[0001]發(fā)明背景
[0002]涉及核酸納米結(jié)構(gòu)(或微米結(jié)構(gòu))合成的先前工作涉及“DNA折紙”方法，其中長(zhǎng)度幾千堿基的天然存在“支架”DNA通過使用多條輔助鏈折疊成結(jié)構(gòu)，所述輔助鏈各自與支架DNA的兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)非鄰接區(qū)雜交。此類折疊方法部分受限于獲得除了目前使用中那種(即長(zhǎng)度約7千堿基的M13mpl8病毒基因組DNA)外的支架的能力。它們?cè)谄渫ㄓ眯苑矫媸芟?，因?yàn)槊總€(gè)核酸結(jié)構(gòu)需要輔助鏈的特異性設(shè)計(jì)和設(shè)置，以便生成支架DNA的必需折疊。
[0003]更加早期的工作涉及核酸“瓦(tile)”單體的使用，所述核酸“瓦”單體各自由多至5個(gè)單鏈寡核苷酸構(gòu)成，具有相對(duì)剛性的核心結(jié)構(gòu)和與其他單體雜交的側(cè)翼序列，以便形成核酸結(jié)構(gòu)。使用這些瓦單體產(chǎn)生的最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)是4乘4平方結(jié)構(gòu)。
[0004]更近期的工作涉及相同單鏈寡核苷酸子集的使用，以形成特定周長(zhǎng)的DNA管。這個(gè)工作受限于其僅形成少數(shù)類型結(jié)構(gòu)即絲帶和管的能力。此外，基于用于生成結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸的性質(zhì)，最終用戶不能對(duì)此類結(jié)構(gòu)的大小施加很多控制。
[0005]發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明提供了用于制備具有已知和預(yù)定的并因此受控的大小、形狀和復(fù)雜性的核酸結(jié)構(gòu)的新型方法，以及核酸結(jié)構(gòu)自身。本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)通過使多個(gè)單鏈寡核苷酸以序列特異性方式彼此結(jié)合進(jìn)行制備。核酸結(jié)構(gòu)和單鏈寡核苷酸如此設(shè)計(jì)，使得每個(gè)結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸的位置是已知的，并且因此使得在結(jié)構(gòu)中的每個(gè)位置處的核苷酸序列是已知的。了解在結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸的位置和因此每個(gè)位置處的核苷酸序列的能力促進(jìn)以限定和受控的方式的結(jié)構(gòu)修飾。本發(fā)明還提供了多種核酸結(jié)構(gòu)，所述核酸結(jié)構(gòu)就大小、形狀和/或復(fù)雜性而言是基本上單分散的。多種核酸結(jié)構(gòu)的成員還可以就每個(gè)結(jié)構(gòu)內(nèi)的寡核苷酸定位而言彼此是相同的，允許以相同方式修飾多種核酸結(jié)構(gòu)。多種結(jié)構(gòu)因此可以表征為就修飾而言也是單分散的。如本文描述的，這種方法的通用性至少部分通過使用來(lái)自310寡核苷酸庫(kù)的子集，使用“一鍋式(one-pot)”退火反應(yīng)生成至少107個(gè)不同形狀的核酸結(jié)構(gòu)的能力得到證實(shí)。
[0007]本發(fā)明的特定核酸結(jié)構(gòu)由具有交叉或半交叉或其一些組合的平行雙螺旋組成。一般地，多個(gè)單鏈寡核苷酸退火以在結(jié)構(gòu)中形成雙螺旋。
[0008]核酸結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸可以是獨(dú)特的(即，它可以僅在每個(gè)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次)，或它可以出現(xiàn)一次、兩次、三次或甚至更頻率出現(xiàn)。本發(fā)明考慮了具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)。在一些情況下，促成雙螺旋的至少一個(gè)寡核苷酸是獨(dú)特的。在一些情況下，結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)雙螺旋包含在該螺旋或整體結(jié)構(gòu)中不同于所有其他寡核苷酸的寡核苷酸。
[0009]本發(fā)明還提供了用于生成核酸結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸。提供了不同的多個(gè)單鏈寡核苷酸，其中所述多個(gè)的性質(zhì)和組成取決于所需結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，包括形狀、大小和復(fù)雜性。如本文更詳細(xì)地解釋的，所述多個(gè)一般包含2結(jié)構(gòu)域和4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸。
[0010]本發(fā)明考慮了在性質(zhì)上是模塊的單鏈寡核苷酸和核酸結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法允許通過包括和/或排除已知寡核苷酸子集制備多種形狀的核酸結(jié)構(gòu)。該方法還考慮了例如通過使此類結(jié)構(gòu)基于序列特異性彼此退火，核酸結(jié)構(gòu)彼此的模塊裝配。在這些實(shí)施方案的一些中，彼此退火的核酸結(jié)構(gòu)可以共享共同形狀(例如兩者都可以是管，或兩者都可以是網(wǎng)格)。該方法還考慮了通過使用接頭使兩種或更多種核酸結(jié)構(gòu)彼此連接制備的復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)，所述接頭可以對(duì)于核酸結(jié)構(gòu)是整合的或不整合的。在這些實(shí)施方案中，彼此連接的核酸結(jié)構(gòu)可以具有相同或不同形狀。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步考慮了通過在單個(gè)容器中組合多個(gè)已知單鏈寡核苷酸，并允許寡核苷酸以預(yù)定的方式在合適條件下自裝配的核酸結(jié)構(gòu)合成。類似地，兩種或更多種核酸結(jié)構(gòu)可以在單個(gè)容器中組合，且允許以預(yù)定的方式在合適條件下基于核苷酸序列互補(bǔ)性而自裝配，從而形成更大的核酸結(jié)構(gòu)。
[0012]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含多個(gè)退火的寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)雙螺旋包含獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
[0013]在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)雙螺旋包含2個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，至少50%的雙螺旋包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
[0014]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含多個(gè)退火的寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)雙螺旋是獨(dú)特的。
[0015]在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)包含2個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特雙螺旋。在一些實(shí)施方案中，至少50%的雙螺旋是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，至少50%的雙螺旋包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
[0016]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含多個(gè)退火的寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)寡核苷酸是獨(dú)特的。
[0017]在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)中的至少50%寡核苷酸是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)中的所有寡核苷酸都是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
[0018]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的組合物，其中所述多個(gè)是至少50%同質(zhì)的。
[0019]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括在單個(gè)容器中使多個(gè)單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結(jié)構(gòu)的方法，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且至少一個(gè)單鏈寡核苷酸以比多個(gè)中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低10倍的摩爾濃度存在。
[0020]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括在單個(gè)容器中使多個(gè)單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結(jié)構(gòu)的方法，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且至少一個(gè)單鏈寡核苷酸以比多個(gè)中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低100倍的摩爾濃度存在。
[0021]在一些實(shí)施方案中,退火通過經(jīng)過一段時(shí)間的溫度轉(zhuǎn)變而發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，溫度轉(zhuǎn)變是從高溫到約室溫的溫度變化。在一些實(shí)施方案中，溫度轉(zhuǎn)變是從約90°C到約室溫的溫度變化。在一些實(shí)施方案中，退火經(jīng)過約12-24小時(shí)的時(shí)期發(fā)生。
[0022]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過前述方法中的任何制備的核酸結(jié)構(gòu)。
[0023]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含通過間隔物-接頭彼此綴合的，前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的至少兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)。
[0024]在一些實(shí)施方案中，間隔物-接頭包含核酸元件和非核酸元件。在一些實(shí)施方案中，間隔物-接頭包含碳鏈。在一些實(shí)施方案中，間隔物-接頭是同雙功能間隔物-接頭。
[0025]在前述方面中任一個(gè)的一些實(shí)施方案中，第一個(gè)子集的寡核苷酸包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且第二個(gè)子集的寡核苷酸包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度是21-104個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸是DNA寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含修飾例如但不限于主鏈修飾、糖修飾、堿基修飾。單鏈寡核苷酸可以是關(guān)于此類及其他修飾同質(zhì)的或異質(zhì)的。
[0026]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含多個(gè)獨(dú)特寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)，其中所有寡核苷酸長(zhǎng)度都小于lkb。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度小于100個(gè)堿基。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)中的一些寡核苷酸長(zhǎng)度是η個(gè)寡核苷酸(其中η代表10.5倍數(shù)的整數(shù))，并且一些寡核苷酸長(zhǎng)度是η/2。在一些實(shí)施方案中，一些寡核苷酸長(zhǎng)度是約42個(gè)核苷酸(例如4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸)，并且一些寡核苷酸長(zhǎng)度是約21個(gè)核苷酸(例如2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸)。
[0027]本發(fā)明考慮了具有寡核苷酸的多種排列的核酸結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)構(gòu)包括寡核苷酸，其包含例如5個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)此類結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)中的不同和分離的寡核苷酸上的一個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，與另一個(gè)寡核苷酸中的單個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的2個(gè)結(jié)構(gòu)域可以不彼此鄰接，或當(dāng)與其他單個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，彼此連接。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)包含半交叉。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)含有交叉。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)含有半交叉和交叉。
[0028]應(yīng)當(dāng)理解在下文更詳細(xì)地討論的前述概念和另外概念的所有組合(條件是此類概念并不互相矛盾)考慮作為本文公開的本發(fā)明主題的部分。特別地，在本公開內(nèi)容結(jié)束時(shí)出現(xiàn)的請(qǐng)求保護(hù)的主題的所有組合考慮作為本文公開的本發(fā)明主題的部分。還應(yīng)當(dāng)理解還可以在通過引用并入的任何公開內(nèi)容中出`現(xiàn)的本文明確采用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)給予與本文公開的具體概念最一致的含義。
[0029]附圖簡(jiǎn)述
[0030]應(yīng)當(dāng)理解圖不一定按比例繪制，而是將重點(diǎn)放在一般舉例說明本文討論的多個(gè)概念上。
[0031]圖1是包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域的單鏈寡核苷酸(本文稱為4結(jié)構(gòu)域單鏈寡核苷酸)的示意圖。每個(gè)結(jié)構(gòu)域是不同核苷酸序列(如可以由不同顏色表示的)。如本文討論的，每個(gè)結(jié)構(gòu)域特征在于其序列及其長(zhǎng)度。箭頭表示寡核苷酸的3’末端，并且寡核苷酸的另一個(gè)末端是5’末端。本發(fā)明的某些寡核苷酸僅包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域(并且這些在本文中被稱為2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸)。每個(gè)寡核苷酸通過其結(jié)構(gòu)域數(shù)目、此類結(jié)構(gòu)域的次序及其總體核苷酸序列限定。
[0032]圖2Α是核酸結(jié)構(gòu)區(qū)域的示意圖，顯示4結(jié)構(gòu)域單鏈寡核苷酸(在該圖中表示為“U”形結(jié)構(gòu))和2結(jié)構(gòu)域單鏈寡核苷酸(由底部的線性結(jié)構(gòu)表示，在本文中也稱為邊界寡核苷酸)。舉例說明的是結(jié)構(gòu)域間、寡核苷酸間鍵和螺旋之間的半交叉。半交叉也得到舉例說明，并且如該圖中所示，這些由磷酸鹽主鏈部分組成。半交叉一般不包含核苷酸，并且因此不促成序列特異性結(jié)合且不指定結(jié)構(gòu)中的寡核苷酸定位或位置。為了舉例說明的目的，顯示了與彼此和/或其他寡核苷酸鍵合的4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸中的九個(gè)。在這個(gè)舉例說明中，所有九個(gè)都具有相對(duì)于彼此的獨(dú)特序列(如可以由不同顏色表示的)。
[0033]圖2B是兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)區(qū)域的示意圖，顯示2和4結(jié)構(gòu)域單鏈寡核苷酸的排列。在頂部示意圖中，每個(gè)4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸以“U”形配置，并且僅提供在它促成的兩個(gè)雙螺旋中的的單個(gè)半交叉。在下部示意圖中，4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸之一促成它促成的雙螺旋之間的兩個(gè)半交叉。該結(jié)構(gòu)因此含有交叉和多個(gè)半交叉。相同寡核苷酸可以表征為具有5’ d2-a-b-c-dl3’的結(jié)構(gòu)域次序，其中結(jié)構(gòu)域dl和d2與形成雙螺旋的結(jié)構(gòu)域d*結(jié)合。結(jié)構(gòu)域由不同標(biāo)識(shí)符標(biāo)記，以指示相對(duì)于彼此的獨(dú)特序列。
[0034]圖2C是顯示核酸結(jié)構(gòu)中的4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸的另外其他考慮的排列的示意圖。頂部結(jié)構(gòu)包含多個(gè)交叉。底部結(jié)構(gòu)包含多個(gè)半交叉。頂部結(jié)構(gòu)中的交叉之間的距離大于底部結(jié)構(gòu)中的半交叉之間的距離。例如，頂部結(jié)構(gòu)中的距離可以是4個(gè)結(jié)構(gòu)域，而底部結(jié)構(gòu)中的距離可以是2個(gè)結(jié)構(gòu)域。包含頂部排列的核酸結(jié)構(gòu)已在實(shí)驗(yàn)上制備。
[0035]圖3A是由12個(gè)不同寡核苷酸構(gòu)成的四個(gè)平行雙螺旋網(wǎng)格(A)和由40個(gè)不同寡核苷酸構(gòu)成的八個(gè)平行雙螺旋正方形(B)的示意圖。
[0036]圖3B-F是通常成形為網(wǎng)格但具有不同大小的核酸結(jié)構(gòu)的略圖。大小可以表示為雙螺旋數(shù)目和每個(gè)雙螺旋的螺旋轉(zhuǎn)角數(shù)目。一般地，螺旋轉(zhuǎn)角數(shù)目在結(jié)構(gòu)中的雙螺旋之間是相似或相同的。這些圖各自由多個(gè)獨(dú)特寡核苷酸組成，所述獨(dú)特寡核苷酸通過其結(jié)構(gòu)域含量和次序鑒定。每個(gè)結(jié)構(gòu)域通過某一字母-數(shù)字指名而鑒定，并且每個(gè)寡核苷酸通過其結(jié)構(gòu)域含量和次序而鑒定。寡核苷酸、其指名及其結(jié)構(gòu)域和序列組成的列表在表1中提供。圖3F中的網(wǎng)格是由具有表1中提供的序列的362個(gè)不同寡核苷酸構(gòu)成的24個(gè)雙螺旋網(wǎng)格。圖3B-3D中的網(wǎng)格包含這些寡核苷酸的子集，并且可以包括另外的2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸作為邊界寡核苷酸。
[0037]圖3G是顯示具有兩個(gè)相同寡核苷酸(標(biāo)記為5’ a-b-c_d3’ )的核酸結(jié)構(gòu)的區(qū)域的示意圖。
[0038]圖4是組合且退火以形成網(wǎng)格核酸結(jié)構(gòu)的多個(gè)單鏈寡核苷酸的示意圖。還顯示的是在不存在純化的情況下的退火過程產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，和這些產(chǎn)物的原子力顯微(AFM)圖像。比例尺代表lOOnm。
[0039]圖5A是多種形狀核酸結(jié)構(gòu)(頂部)和退火后產(chǎn)物的AFM圖像(底部)的示意圖。比例尺代表lOOnm。示意圖還舉例說明使用具有已知寡核苷酸圖的起始網(wǎng)格結(jié)構(gòu)用于生成多種形狀核酸結(jié)構(gòu)的方法。
[0040]圖5B和C是不同大小且具有不同邊緣的兩個(gè)三角形核酸結(jié)構(gòu)的示意圖。兩個(gè)結(jié)構(gòu)都已在實(shí)驗(yàn)上制備。
[0041]圖是可以制成管的網(wǎng)格的示意圖。頂部行的結(jié)構(gòu)域a24.X*和b24.X*將分別與底部行的a24.X和b24.x結(jié)合，以形成管形狀。
[0042]圖6是具有缺乏寡核苷酸的內(nèi)部區(qū)的矩形核酸結(jié)構(gòu)的示意圖。該圖舉例說明此類復(fù)合結(jié)構(gòu)可以通過基于結(jié)構(gòu)的預(yù)定的和已知寡核苷酸圖，簡(jiǎn)單地從用于制備結(jié)構(gòu)的多個(gè)中排除已知寡核苷酸容易地形成。
[0043]圖7是由網(wǎng)格制備的管狀核酸結(jié)構(gòu)的透射電子顯微鏡檢查(TEM)圖像，所述網(wǎng)格是圖5的矩形網(wǎng)格長(zhǎng)度的三倍和圖5的矩形網(wǎng)格寬度的三分之一。這些管使用網(wǎng)格所需的約80%寡核苷酸生成，并且包括一些另外的寡核苷酸以充當(dāng)連接物。[0044]圖8是顯示具有L形核酸結(jié)構(gòu)的四個(gè)平行雙螺旋正方形核酸結(jié)構(gòu)的退火的示意圖。該圖舉例說明根據(jù)本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)合成的模塊方法。
[0045]圖9是顯示使用間隔物-接頭三個(gè)矩形核酸結(jié)構(gòu)彼此附著的示意圖。取決于間隔物-接頭的放置和長(zhǎng)度，可以制備多個(gè)這些復(fù)合結(jié)構(gòu)。
[0046]圖1OA和B是顯示具有“手柄(handles)”的核酸結(jié)構(gòu)的示意圖(A)和AFM圖像(B)。手柄作為附著至2結(jié)構(gòu)域邊界寡核苷酸的另外結(jié)構(gòu)域提供，導(dǎo)致3結(jié)構(gòu)域邊界寡核苷酸。在該圖中，雙重T (T2)間隔物存在于第二個(gè)和第三個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，其中第三個(gè)結(jié)構(gòu)域代表手柄結(jié)構(gòu)域。與第三個(gè)結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的寡核苷酸可以包括在退火反應(yīng)中。在該圖中，這個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸指示y*，并且在其3’末端處具有生物素修飾。生物素部分隨后可以用于結(jié)合鏈霉親和素。AFM圖像顯示與標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合的此類結(jié)構(gòu)。本發(fā)明考慮了在結(jié)構(gòu)中的任何地方，包括在邊界、邊緣和/或內(nèi)部摻入此類手柄結(jié)構(gòu)域。
[0047]圖11是關(guān)于依照本發(fā)明生成的多種結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)圖(上圖)和相應(yīng)AFM圖像(下圖)的匯集。
[0048]圖12是多個(gè)矩形、內(nèi)環(huán)形結(jié)構(gòu)的AFM圖像。
[0049]發(fā)明詳述
[0050]本發(fā)明在其最廣泛的含義中涉及制備具有預(yù)定的且因此受控的形狀、大小和復(fù)雜性的核酸結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明部分基于出乎意料的發(fā)現(xiàn):選擇多個(gè)單鏈寡核苷酸可以自裝配，以形成具有受控的形狀、大小、復(fù)雜性和修飾的核酸結(jié)構(gòu)。具有多個(gè)預(yù)定的形狀和受控的大小的穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)可以僅使用多個(gè)單鏈寡核苷酸形成是尤其令人驚訝的。
[0051]本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)包含以預(yù)定的或已知方式排列(經(jīng)由序列特異性退火)的多個(gè)寡核苷酸。因此，結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸的位置是已知的。以這種方式，結(jié)構(gòu)可以例如通過在特定位置處附著部分進(jìn)行修飾。這可`以通過使用經(jīng)修飾的寡核苷酸作為其實(shí)材料或通過在形成結(jié)構(gòu)后修飾特定寡核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，了解所得到的結(jié)構(gòu)中的起始寡核苷酸各自的位置為結(jié)構(gòu)提供了可尋址性。
[0052]在一些情況下，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可以通過單鏈寡核苷酸的自裝配過程進(jìn)行制備。在這些自裝配方法中，單鏈寡核苷酸在單個(gè)容器中組合并允許基于序列互補(bǔ)性彼此退火。在一些情況下，這個(gè)退火過程涉及在高溫下放置寡核苷酸且隨后逐步降低溫度，以便有利于序列特異性結(jié)合。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“自裝配”指寡核苷酸以序列特異性方式、以預(yù)定的方式且無(wú)需外部受控的(例如通過寡核苷酸或核酸結(jié)構(gòu)的順次添加)彼此退火的能力。
[0053]本發(fā)明因此尤其提供了包含本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的組合物，制備具有多個(gè)預(yù)定的或已知大小、形狀、復(fù)雜性和修飾的核酸結(jié)構(gòu)的方法，具有多個(gè)預(yù)定的或已知大小、形狀、復(fù)雜性和修飾的核酸結(jié)構(gòu)，多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，其中此類多個(gè)可以是就大小、形狀、復(fù)雜性和修飾而言基本上單分散的，包含兩種或更多種核酸結(jié)構(gòu)的組合結(jié)構(gòu)，和制備此類復(fù)合結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)和復(fù)合結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的這些方面和實(shí)施方案將在本文中更詳細(xì)地描述。
[0054]核酸結(jié)構(gòu):
[0055]本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)由多個(gè)寡核苷酸組成，所述多個(gè)寡核苷酸以序列特異性方式彼此結(jié)合。本發(fā)明的寡核苷酸一般包含兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域。圖1提供了4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸的示意圖。在形成核酸結(jié)構(gòu)的退火過程前，寡核苷酸處于單鏈形式。[0056]—般地，寡核苷酸的每個(gè)結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)中的另一個(gè)寡核苷酸的另一個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。圖2A提供了結(jié)構(gòu)區(qū)域中2和4結(jié)構(gòu)域單鏈寡核苷酸之間的排列和結(jié)合相互作用的示意圖。2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸在底部由直箭頭顯示，并且4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸作為U形箭頭顯示。當(dāng)存在于本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)中時(shí)，4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸具有約3nm乘7nm的面積。它們?cè)诒疚闹锌梢员环Q為單鏈塊(SST)。在核酸結(jié)構(gòu)的背景中，每個(gè)SST可以視為“分子像素”。圖各自中的箭頭代表寡核苷酸的3’末端。相似表示在圖2B (上)中提供。圖2B (下)顯示備選實(shí)施方案，其中寡核苷酸由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并且這些結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)一起與物理上分開的寡核苷酸上的另一個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。當(dāng)與其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，指示dl和d2的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不直接彼此綴合，相反在它們之間基本上存在缺口。該結(jié)構(gòu)隨后還包含基于5’-d2-a-b-c-dl-3’寡核苷酸的定向的交叉。另外其他的排列顯示于圖2C中。如舉例說明的，寡核苷酸可這樣排列，從而使得結(jié)構(gòu)包含交叉(如圖2C上所示)、半交叉(如圖2C下所示)、或這些的組合(如圖2B下所示)。寡核苷酸還可以這樣排列，從而使得交叉和/或半交叉在不同距離發(fā)生，所述不同距離包括但不限于每?jī)蓚€(gè)結(jié)構(gòu)域或每四個(gè)結(jié)構(gòu)域等。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明因此考慮了關(guān)于核酸結(jié)構(gòu)內(nèi)的寡核苷酸的多種結(jié)合排列。[0057]然而，在一些情況下，核酸結(jié)構(gòu)中的某些結(jié)構(gòu)域可能不與結(jié)構(gòu)中的另一個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。例如，在一些情況下，具有聚T結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸存在于結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選在邊界處和在導(dǎo)致聚T結(jié)構(gòu)域是單鏈的配置中。
[0058]作為另一個(gè)例子，結(jié)構(gòu)域可以用作手柄用于對(duì)其他結(jié)構(gòu)或其他部分退火。此類手柄結(jié)構(gòu)域顯示于圖1OA中網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的上和下邊界處。包含生物素部分的寡核苷酸與這些手柄結(jié)合，并且結(jié)構(gòu)隨后與鏈霉親和素接觸。鏈霉親和素結(jié)合的位置顯示于圖1OB中。
[0059]在結(jié)構(gòu)內(nèi)的寡核苷酸一般在平行排列中對(duì)自身進(jìn)行排列以形成雙螺旋。這些雙螺旋在本文中可互換地被稱為螺旋。此類結(jié)構(gòu)的例子在圖3A中提供。左圖舉例說明了 4螺旋網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，并且右圖舉例說明了 8螺旋網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。這些雙螺旋由于選擇的單鏈寡核苷酸群體彼此的序列特異性退火而形成。結(jié)構(gòu)中的每個(gè)雙螺旋由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。這些結(jié)構(gòu)域與其他寡核苷酸中的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以形成螺旋。鄰近螺旋通過半交叉彼此連接。
[0060]本發(fā)明提供了核酸結(jié)構(gòu)可以在合成前進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且其大小、形狀、復(fù)雜性和修飾可以通過在合成過程中使用某些選擇寡核苷酸進(jìn)行指定且得到控制。例如，圖3B-F舉例說明了用于許多不同大小網(wǎng)格的寡核苷酸圖。結(jié)構(gòu)中的每個(gè)結(jié)構(gòu)域和每個(gè)寡核苷酸的位置是已知的且在這些圖中提供。結(jié)構(gòu)域和寡核苷酸的核苷酸序列在表1中提供。
[0061]表1的寡核苷酸可以用于生成310 “像素”畫布(canvas)，由其可以生成多種形狀的核酸結(jié)構(gòu)。該表含有4結(jié)構(gòu)域內(nèi)部和邊界寡核苷酸的序列和2結(jié)構(gòu)域邊界寡核苷酸的序列。4結(jié)構(gòu)域內(nèi)部寡核苷酸代表像素，而2結(jié)構(gòu)域和4結(jié)構(gòu)域邊界寡核苷酸與由內(nèi)部寡核苷酸產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的上、下和側(cè)面邊緣結(jié)合，從而阻止不需要的結(jié)構(gòu)聚集。該表因此包含310個(gè)4結(jié)構(gòu)域(像素或內(nèi)部)寡核苷酸、24個(gè)4結(jié)構(gòu)域(垂直邊界)寡核苷酸、和28個(gè)2結(jié)構(gòu)域(水平邊界)寡核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)310內(nèi)部寡核苷酸庫(kù)的子集用于生成特定形狀的結(jié)構(gòu)時(shí)，取決于內(nèi)部寡核苷酸的所需結(jié)構(gòu)的邊緣處存在的序列，可能需要不同的2結(jié)構(gòu)域和4結(jié)構(gòu)域邊界寡核苷酸。使用本文提供的教導(dǎo)且參考圖中的某些包括但不限于圖2B和3A，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠測(cè)定此類邊界寡核苷酸的序列。
[0062]應(yīng)當(dāng)理解因此內(nèi)部寡核苷酸促成結(jié)構(gòu)的所需形狀，并且邊界寡核苷酸阻止結(jié)構(gòu)彼此不需要的聚集。
[0063]還應(yīng)當(dāng)理解表1的序列是自然界中的代表，并且本發(fā)明可以使用另一個(gè)寡核苷酸庫(kù)執(zhí)行。此類寡核苷酸庫(kù)可以基于本文提供的教導(dǎo)手動(dòng)或通過計(jì)算機(jī)方法設(shè)計(jì)。
[0064]例如，寡核苷酸庫(kù)可以使用如下過程進(jìn)行構(gòu)建，所述過程使序列對(duì)稱性降到最低或使具有完全隨機(jī)序列的SST基序增加。任一過程可以采用軟件例如Uniquimer。對(duì)于基于序列最小化的設(shè)計(jì)，存在序列生成的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn):1)核苷酸(即A、C、G、T) 一個(gè)接一個(gè)隨機(jī)生成。2)針對(duì)所生成的那些的互補(bǔ)核苷酸根據(jù)堿基配對(duì)原則進(jìn)行匹配:A對(duì)T并且反之亦然，C對(duì)G并且反之亦然。3)不允許超過某一長(zhǎng)度(8nt或9nt)的重復(fù)區(qū)段。當(dāng)此類重復(fù)區(qū)段在設(shè)計(jì)過程中出現(xiàn)時(shí)，最近生成的核苷酸將突變，直至滿足重復(fù)區(qū)段需求。4)不允許四個(gè)連續(xù)A、C、G或T堿基。5)在單鏈連接點(diǎn)處的預(yù)先指定的核苷酸(例如對(duì)于大多數(shù)鏈，T和G分別用于第21和22個(gè)核苷酸)用于避免在連接點(diǎn)周圍的滑動(dòng)堿基。然而，在使用完全隨機(jī)序列的設(shè)計(jì)中，不應(yīng)用在步驟3到5中的限制。
[0065]寡核苷酸中的一些或全部可以手動(dòng)設(shè)計(jì)。例如，在例示結(jié)構(gòu)的一些中，手動(dòng)設(shè)計(jì)和/或最佳化用于手柄區(qū)段序列設(shè)計(jì)(例如容納3’生物素鏈的手柄區(qū)段用于鏈霉親和素標(biāo)記和聚T結(jié)構(gòu)域的串聯(lián))。另外，在一些情況下，手動(dòng)組合來(lái)自不同SST結(jié)構(gòu)的區(qū)段，以將現(xiàn)有結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成新結(jié)構(gòu)。例如，引入另外的SST行以將矩形設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換成管設(shè)計(jì)(例如將24HX 28T矩形設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換成24HX28T桶設(shè)計(jì)，并且將24HX28T矩形設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換成8HX84T管設(shè)計(jì))。類似地，還將管設(shè)計(jì)手動(dòng)轉(zhuǎn)換成矩形設(shè)計(jì)(例如將12HX 177T管轉(zhuǎn)換成36HX41T矩形)。
[0066]在一些情況下，核酸結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)⑹仟?dú)特的，預(yù)期該結(jié)構(gòu)域僅在該結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次。結(jié)構(gòu)可以由一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域組成，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、80%或90%結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的。例如，結(jié)構(gòu)可以包含第一多個(gè)結(jié)構(gòu)域和第二多個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述第一多個(gè)結(jié)構(gòu)域各自僅在該結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次，并且這些獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以代表結(jié)構(gòu)中的總結(jié)構(gòu)域的75%，所述第二多個(gè)結(jié)構(gòu)域各自在該結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)超過一次，并且這些重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以代表結(jié)構(gòu)中的總結(jié)構(gòu)域的25%。顯而易見的是其他百分比也是可能的。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)中的每個(gè)結(jié)構(gòu)域都是獨(dú)特的。復(fù)合結(jié)構(gòu)中的每一個(gè)結(jié)構(gòu)域(即包含由間隔物-接頭彼此連接的兩個(gè)或更多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu))可以是或不是獨(dú)特的。
[0067]在一些情況下，結(jié)構(gòu)中的雙螺旋中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)⑹仟?dú)特的，預(yù)期該結(jié)構(gòu)域僅在該雙螺旋中出現(xiàn)一次。結(jié)構(gòu)域可以在相同結(jié)構(gòu)內(nèi)的其他螺旋中存在，并且因此它在整個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的背景下可以不是獨(dú)特的。這在圖3G中舉例說明。指定5’-a-b-c-d-3’的寡核苷酸在該結(jié)構(gòu)中存在兩次。指定a及其互補(bǔ)體a*和b及其互補(bǔ)體b*的結(jié)構(gòu)域存在于結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)螺旋中，如結(jié)構(gòu)域c及其互補(bǔ)體c*和d及其互補(bǔ)體d* —樣。在螺旋中可以存在
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其在該螺旋中的背景下是獨(dú)特的。螺旋中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以代表該螺旋中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、80%、90%或100%結(jié)構(gòu)域。螺旋中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以位于結(jié)構(gòu)末端或附近。螺旋中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以彼此鄰接，或它們可以彼此分散開。它們可以通過重復(fù)結(jié)構(gòu)域(即，在螺旋中出現(xiàn)超過一次的結(jié)構(gòu)域)彼此分開。
[0068]該結(jié)構(gòu)可以包含具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)螺旋。這類螺旋可以代表結(jié)構(gòu)中存在的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或100%螺旋。如果超過一個(gè)這個(gè)螺旋
類型存在于該結(jié)構(gòu)中，則它們可以彼此鄰近，或它們可以由其他螺旋(包括不含獨(dú)特結(jié)構(gòu)域的螺旋)分開。例如，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)域的螺旋可以在結(jié)構(gòu)中與缺乏獨(dú)特結(jié)構(gòu)域的螺旋交替。
[0069]因此，在一些情況下，核酸結(jié)構(gòu)可以包含兩個(gè)或更多個(gè)螺旋，所述螺旋各自具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)域就個(gè)別螺旋自身而言是獨(dú)特的，并且可能在就結(jié)構(gòu)整體而言是獨(dú)特的。個(gè)別螺旋中的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以存在于結(jié)構(gòu)中的其他螺旋中。個(gè)別螺旋中的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域可以是該結(jié)構(gòu)中的其他螺旋中的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
[0070]在一些情況下，結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)螺旋各自可以完全由獨(dú)特結(jié)構(gòu)域組成，預(yù)期這些結(jié)構(gòu)域各自每個(gè)螺旋僅出現(xiàn)一次或每個(gè)結(jié)構(gòu)僅出現(xiàn)一次。
[0071]因此，在一些情況下，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)獨(dú)特的雙螺旋。獨(dú)特雙螺旋是具有如下結(jié)構(gòu)域組成的螺旋，所述結(jié)構(gòu)域組成不同于結(jié)構(gòu)中的任何其他螺旋。獨(dú)特雙螺旋因此還將具有不同于結(jié)構(gòu)中的任何其他螺旋的核苷酸序列。
[0072]在另外其他情況下，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可以這樣設(shè)計(jì)，從而使得它們包含由獨(dú)特結(jié)構(gòu)域組成的一個(gè)區(qū)域和由非獨(dú)特或重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的另一個(gè)區(qū)域。
[0073]結(jié)構(gòu)至少部分通過使單個(gè)容器中的多個(gè)已知寡核苷酸退火而形成。這在圖4中舉例說明。該圖顯示預(yù)期網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的示意圖和退火后過程的AFM圖像。退火后過程的凝膠電泳分析顯示兩個(gè)條帶，一個(gè)對(duì)應(yīng)于未結(jié)合的寡核苷酸并且一個(gè)對(duì)應(yīng)于該結(jié)構(gòu)。該方法提供了從可以用于生成某一大小的網(wǎng)格的已知寡核苷酸庫(kù)開始，可以從該庫(kù)中排除選擇寡核苷酸，以便形成不同形狀和/或大小的結(jié)構(gòu)。
[0074]可以使用這些方法制備的多種結(jié)構(gòu)顯示于圖5A (上)中。還顯示的是由此類方法產(chǎn)生的退火后產(chǎn)物?？梢杂糜谏扇切谓Y(jié)構(gòu)的詳細(xì)寡核苷酸圖也在圖5B和C中提供?？梢杂糜谏晒苄谓Y(jié)構(gòu)的詳細(xì)寡核苷酸圖在圖中提供。本發(fā)明還考慮了排除對(duì)于結(jié)構(gòu)是內(nèi)部的寡核苷酸。例如，圖6舉例說明了具有內(nèi)部空隙模式的結(jié)構(gòu)(即缺乏任何寡核苷酸的預(yù)定的區(qū)域)。
[0075]因此，在一些情況下，伴隨在結(jié)構(gòu)中的每個(gè)位置處存在的特定寡核苷酸的了解，最終用戶設(shè)計(jì)核酸結(jié)構(gòu)例如具有特定長(zhǎng)度和寬度的維度的網(wǎng)格。實(shí)際上，最終用戶有指示結(jié)構(gòu)內(nèi)的每個(gè)寡核苷酸的精確位置的物理圖。在圖中(和因此在核酸結(jié)構(gòu)中)的每個(gè)位置處每個(gè)寡核苷酸的特性的了解，允許最終用戶使用特定結(jié)構(gòu)作為起點(diǎn)改造特定模式或形狀。通過從組合的寡核苷酸混合物中排除一個(gè)或多個(gè)已知寡核苷酸以形成核酸結(jié)構(gòu)，和/或包括另外的已知寡核苷酸，可以發(fā)生此類改造。
[0076]因此，作為例子和如本文證實(shí)的，最終用戶可以設(shè)計(jì)具有特定長(zhǎng)度和寬度，并且由多個(gè)獨(dú)特寡核苷酸組成的二維網(wǎng)格。最終用戶了解網(wǎng)格中的每個(gè)位置處的寡核苷酸的特性。除了能夠合成網(wǎng)格自身外，最終用戶還能夠使用網(wǎng)格作為起點(diǎn)設(shè)計(jì)且合成一個(gè)或多個(gè)其他核酸結(jié)構(gòu)。如本文證實(shí)的，多個(gè) 形狀的核酸結(jié)構(gòu)可以通過從庫(kù)中排除一個(gè)且通常多個(gè)寡核苷酸進(jìn)行合成，所述庫(kù)將用于制備整個(gè)網(wǎng)格。這些形狀包括心形、人字形和三角形，以及具有內(nèi)部開口或洞的網(wǎng)格或其他結(jié)構(gòu)。
[0077]本發(fā)明因此提供了用于合成許多不同核酸結(jié)構(gòu)的方法，而無(wú)需從新設(shè)計(jì)每個(gè)結(jié)構(gòu)。相反，從起始核酸結(jié)構(gòu)例如網(wǎng)格開始，通過排除預(yù)先選擇的寡核苷酸和/或包括預(yù)先選擇的寡核苷酸，可以簡(jiǎn)單形成多種其他核酸結(jié)構(gòu)。以這種方式，最終用戶使用以模塊模式的單鏈寡核苷酸，取決于所需核酸結(jié)構(gòu)的最終形狀和大小，包括或排除多個(gè)的成員。多個(gè)的寡核苷酸成員之間的相互作用不預(yù)期可觀改變，并且因此最終用戶不需要基本上由草圖(scratch)設(shè)計(jì)每一個(gè)新核酸結(jié)構(gòu)。相反，最終用戶制備每個(gè)寡核苷酸的原料，且將多個(gè)原料以對(duì)應(yīng)于其在結(jié)構(gòu)和單個(gè)容器中的相對(duì)頻率的相對(duì)濃度組合在一起，以便形成所需形狀、大小和復(fù)雜性的核酸結(jié)構(gòu)。
[0078]所需形狀和大小的核酸結(jié)構(gòu)中的單鏈寡核苷酸的選擇和排列可以手動(dòng)或通過計(jì)算機(jī)算法完成。此類計(jì)算機(jī)算法的例子是對(duì)于公眾可公開獲得的Uniquimer。
[0079]如前述圖的一些中舉例說明的，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)的大小可以在退火過程期間得到控制。通過設(shè)計(jì)具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域、或者一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特螺旋的結(jié)構(gòu)，且因此在退火過程中使用選擇的寡核苷酸群體，來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)大小控制。核酸結(jié)構(gòu)的大小因此一般也是預(yù)定的。
[0080]核酸結(jié)構(gòu)的大小可以通過其維度中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的距離表示。此類維度可以各自獨(dú)立地在長(zhǎng)度是納米或微米或更長(zhǎng)。例如，結(jié)構(gòu)可以包含一個(gè)或兩個(gè)維度，各自具有在5-100納米、5-500納米、5-1000納米，包括10-100納米、10-500納米或10-1000納米范圍中的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，它們可以具有約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900nm 或更多的一個(gè)或多個(gè)維度。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)是約3nm乘7nm或約4nm乘7nm。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)是60nm乘lOOnm。
[0081]核酸結(jié)構(gòu)的大小還可以通過雙螺旋數(shù)目以及這些雙螺旋的長(zhǎng)度呈現(xiàn)。雙螺旋的長(zhǎng)度可以表示為螺旋中的螺旋轉(zhuǎn)角數(shù)目。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明考慮了制備處于納米和微米尺度或更大的結(jié)構(gòu)。
[0082]核酸結(jié)構(gòu)的大小還可以呈現(xiàn)為它包含的4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸(SST)數(shù)目。范圍可以是I到超過1000。本文例示的結(jié)構(gòu)中的`許多由等于或少于310個(gè)SST組成。然而，應(yīng)當(dāng)理解促成核酸結(jié)構(gòu)的SST的數(shù)目可以取決于所需的結(jié)構(gòu)大小和/或修飾程度和/或所需的復(fù)雜性而改變。與先前報(bào)告的一鍋式退火結(jié)構(gòu)相比較，例示結(jié)構(gòu)中的一些包含至少4倍的不同分子組分。
[0083]核酸結(jié)構(gòu)的大小還可以呈現(xiàn)為它包含的核苷酸數(shù)目。本文例示的結(jié)構(gòu)中的一些包含至少約15，000個(gè)核苷酸，并且一些包含約45，000個(gè)核苷酸。例示結(jié)構(gòu)中的一些包含是典型DNA折紙結(jié)構(gòu)(即由單個(gè)支架鏈和多個(gè)訂書針鏈組成的結(jié)構(gòu))的至少3倍的核苷酸。
[0084]本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可以采取任何形狀或形式?？梢允褂帽景l(fā)明的方法產(chǎn)生的多種形狀和形式的例子在圖5A-D、6、7和11中舉例說明。重要的是，使用本發(fā)明的方法，基于在結(jié)構(gòu)中的每一個(gè)位置處的寡核苷酸特性(和因此序列)的了解，能夠以精確控制預(yù)定且因此預(yù)先設(shè)計(jì)核酸結(jié)構(gòu)的形狀、形式和大小。該方法的功效通過在第一次嘗試中生成110個(gè)目的結(jié)構(gòu)中的103個(gè)的94%成功率加以證實(shí)。在第一次嘗試中未生成的7個(gè)結(jié)構(gòu)中，主要通過去除狹窄連接點(diǎn)和區(qū)域，將4個(gè)輕微重新設(shè)計(jì)，且隨后后續(xù)成功產(chǎn)生。顯著地，使用例如310寡核苷酸庫(kù)的不同子集制備的不同結(jié)構(gòu)可以合成和純化后混合，即使當(dāng)不同結(jié)構(gòu)包含相同SST時(shí)，也不喪失結(jié)構(gòu)完整性。
[0085]如本文討論的，核酸結(jié)構(gòu)可以通過在單個(gè)退火反應(yīng)中組合且退火多個(gè)單鏈寡核苷酸合成，以獲得所需形狀、大小、復(fù)雜性和修飾的核酸結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還考慮了通過以模塊方式使分開的更小核酸結(jié)構(gòu)彼此退火來(lái)合成核酸結(jié)構(gòu)。這種方法在圖8中舉例說明，其中分開制備4雙螺旋正方形結(jié)構(gòu)和L形結(jié)構(gòu)，并且隨后彼此組合且退火，以形成8雙螺旋正方形。相應(yīng)地，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)可以如圖4中舉例說明的使寡核苷酸彼此退火和/或通過如圖8中舉例說明的使更小的結(jié)構(gòu)彼此退火形成。這種方法已用于將網(wǎng)格形結(jié)構(gòu)彼此和管形結(jié)構(gòu)彼此融合在一起。此類融合還可以無(wú)需從其起始合成退火反應(yīng)溶液中純化結(jié)構(gòu)而發(fā)生。因此，無(wú)論是否純化，結(jié)構(gòu)都可以組合且退火。
[0086]在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)通過對(duì)其實(shí)施高溫隨后實(shí)施緩慢冷卻過程進(jìn)行退火。高溫可以是約50°C、約45°C或約40°C，并且冷卻過程預(yù)期將溶液冷卻至約室溫(例如約25°C)。冷卻期可以是幾小時(shí)，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10小時(shí)或更久。備選地，可以組合核酸結(jié)構(gòu)，且允許在單個(gè)溫度包括例如室溫下退火相同時(shí)間段。
[0087]在其他實(shí)施方案中，與所有結(jié)構(gòu)的同時(shí)混合和退火相比較，本發(fā)明考慮了結(jié)構(gòu)的交錯(cuò)或順次添加(和退火)。順次添加在更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的合成中可以是特別有用的。在一些情況下，這些及其他退火方法可以在靜止環(huán)境中或在流動(dòng)下執(zhí)行。流動(dòng)環(huán)境允許非退火的寡核苷酸或核酸結(jié)構(gòu)在后續(xù)組分添加前去除。
[0088]本發(fā)明還提供了多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)多個(gè)預(yù)期超過一個(gè)，并且可以與術(shù)語(yǔ)群體可互換地使用。此類多個(gè)可以包含10、50、100、500、1000個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)。此類多個(gè)可以具有不同程度的同質(zhì)性，預(yù)期多個(gè)中的一定百分比核酸結(jié)構(gòu)就大小、形狀、復(fù)雜性和/或修飾而言彼此相同。多個(gè)結(jié)構(gòu)因此可以是具有某一特征的結(jié)構(gòu)中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同質(zhì)的。例如，多個(gè)網(wǎng)格形狀的結(jié)構(gòu)可以是至少50%同質(zhì)的，預(yù)期該多個(gè)中的至少50%結(jié)構(gòu)是網(wǎng)格形狀的。
[0089]此類多個(gè)可以是單分散的，預(yù)期其成員在一個(gè)或多個(gè)特征包括大小、形狀、復(fù)雜性和/或修飾方面可以是相同的。多個(gè)對(duì)于這些特征全部可以是單分散的。在一些情況下，多個(gè)是基本上單分散的?；旧蠁畏稚⒌闹钙渲兄辽?0%、60%、70%、80%、90%或更多的結(jié)構(gòu)具有大約相同的形狀、大小、復(fù)雜性和/或具有相同的修飾的多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，至少10%、20%、30%、40%或更多的結(jié)構(gòu)具有大約相同的形狀、大小、復(fù)雜性和/或具有相同的修飾。示例性多個(gè)顯示于圖12中。
[0090]多個(gè)中的同質(zhì)性(和相反的異質(zhì)性)程度可以使用許多技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，所述技術(shù)包括但不限于AFM或TEM和凝膠電泳。這些技術(shù)已用于測(cè)定制備的結(jié)構(gòu)群體中的同質(zhì)性程度，如實(shí)施例中討論的。重要的是，已發(fā)現(xiàn)本文提供的退火方法重現(xiàn)性獲得具有占優(yōu)勢(shì)的核酸結(jié)構(gòu)種類的群體。此外，占優(yōu)勢(shì)的種類看起來(lái)與使用本發(fā)明的設(shè)計(jì)和作圖方法預(yù)期的種類相同。
[0091]如許多圖中舉例說明的，在一些情況下，一旦形成核酸結(jié)構(gòu)，就可以仍存在單鏈的結(jié)構(gòu)域。這些可以例如在邊界處存在。此類邊界由圖中提供的結(jié)構(gòu)的左和右邊界表示。已發(fā)現(xiàn)依照本發(fā)明此類結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)可以影響退火過程的效率和得率。更具體而言，如果這些單鏈區(qū)域具有混合的核苷酸序列，則結(jié)構(gòu)更可能凝聚且得率降低。此類凝聚可以通過操縱這些單鏈區(qū)域的核苷酸序列得到降低。特別地，在序列中是聚T的單鏈區(qū)域更不可能引起凝聚，導(dǎo)致更佳的結(jié)構(gòu)得率。這些聚T結(jié)構(gòu)域例如顯示于圖3B-F中，表示為TlO或T11，以指示結(jié)構(gòu)域中的胸苷數(shù)目。還可以使用聚A和聚C序列。因此，在一些實(shí)施方案中，某些單鏈結(jié)構(gòu)域可以存在于結(jié)構(gòu)中，并且此類結(jié)構(gòu)域可以在序列中彼此相同。
[0092]在某些實(shí)施方案中，邊界區(qū)域可以由聚T結(jié)構(gòu)域和混合序列的其他結(jié)構(gòu)域的混合物組成，前提是該結(jié)構(gòu)基本上不凝聚。在這些情況下，混合序列結(jié)構(gòu)域可以用于使兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)彼此退火，例如如圖8中所示。此類結(jié)構(gòu)域數(shù)目可以是6、8、10個(gè)或更多個(gè)。
[0093]本發(fā)明的結(jié)構(gòu)可以在合成過程中或合成后進(jìn)行修飾。它們可以通過使用修飾的寡核苷酸在合成過程中進(jìn)行修飾。例如，用于生成結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸可以與目的部分綴合。經(jīng)修飾的寡核苷酸可以用于生成本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，前提是此類修飾不干擾寡核苷酸與所需的其他寡核苷酸結(jié)合以便形成所需結(jié)構(gòu)的能力。另外或備選地，該結(jié)構(gòu)可以是合成后修飾的。
[0094]考慮了任何修飾，前提是它不干擾寡核苷酸與彼此的退火，并且它不使得結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定，除非那是由修飾另外預(yù)期的。修飾在性質(zhì)中可以是但不限于化學(xué)或酶促的。修飾可以涉及核酸綴合部分的使用。該部分在性質(zhì)中可以是但不限于金屬、有機(jī)和無(wú)機(jī)的。該部分可以與核酸綴合，所述核酸能夠識(shí)別且結(jié)合結(jié)構(gòu)中的寡核苷酸。例如，此類核酸可以是三聯(lián)體形成寡核苷酸。在其他情況下，一個(gè)或多個(gè)非核酸部分可以與結(jié)構(gòu)永久或瞬時(shí)、共價(jià)或非共價(jià)附著。本發(fā)明考慮了獨(dú)特和/或非獨(dú)特的寡核苷酸可以是修飾的。結(jié)構(gòu)中的寡核苷酸自身可以與一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域綴合，所述結(jié)構(gòu)域不促成結(jié)構(gòu)，而是用于使部分與結(jié)構(gòu)結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸和每個(gè)結(jié)構(gòu)域的位置可以是預(yù)定的，所以每個(gè)修飾對(duì)最終所得到的結(jié)構(gòu)的位置也可以是預(yù)定的。換言之，結(jié)構(gòu)中的每個(gè)寡核苷酸的位置的了解促進(jìn)結(jié)構(gòu)的可尋址性。
[0095]單鏈寡核苷酸:
[0096]本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)使用多個(gè)單鏈寡核苷酸進(jìn)行設(shè)計(jì)且制備，所述單鏈寡核苷酸以序列特異性方式彼此退火。寡核苷酸可以通過其長(zhǎng)度、其序列及其結(jié)構(gòu)域組成進(jìn)行表征。它們結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和序列控制每個(gè)寡核苷酸的結(jié)合活性和位置。它們的結(jié)構(gòu)域數(shù)目一般控制每個(gè)寡核苷酸將與結(jié)構(gòu)中的寡核苷酸結(jié)合的數(shù)目。
[0097]在一些情況下，用于制備結(jié)構(gòu)的寡核苷酸包含偶數(shù)數(shù)目的結(jié)構(gòu)域。每個(gè)寡核苷酸一般包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，用于制備結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可以是2和4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸。還能夠使用寡核苷酸的其他組合形成結(jié)構(gòu)，包括但不限于2和6結(jié)構(gòu)域寡核苷酸、3和6結(jié)構(gòu)域寡核苷酸、2和8結(jié)構(gòu)域寡核苷酸、4和8結(jié)構(gòu)域寡核苷酸等。
[0098]如本文使用的，結(jié)構(gòu)域指核苷酸序列(即，具有以序列特異性方式與其互補(bǔ)體結(jié)合的能力的許多鄰接核苷酸或核苷酸類似物)。多個(gè)寡核苷酸或核酸結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)域可以這樣設(shè)計(jì)，從而使得它們對(duì)另一個(gè)寡核苷酸中的結(jié)構(gòu)域退火。寡核苷酸的所有結(jié)構(gòu)域的共同互補(bǔ)性促進(jìn)此類寡核苷酸的自裝配，以形成核酸結(jié)構(gòu)。
[0099] 結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度可以改變。促成相同螺旋的兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域的組合長(zhǎng)度一般具有h Xk的長(zhǎng)度，其中h表示制備完全螺旋轉(zhuǎn)角所需的單體單位(例如核苷酸)數(shù)目，并且k表示I或更大的任何整數(shù)。例如，對(duì)于B形DNA，一般每個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角存在10.5個(gè)核苷酸，而對(duì)于RNA，每個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角存在11個(gè)核苷酸。因此，對(duì)于在性質(zhì)中是B形DNA的結(jié)構(gòu)域，促成相同螺旋的兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域的組合長(zhǎng)度可以表示為10.5*k(四舍五入至最近整數(shù))，其中k表示I或更大的任何整數(shù)，其中*指示乘號(hào)。
[0100]在其中來(lái)自相同寡核苷酸的兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域促成相同螺旋的情況下，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度將是相關(guān)的。假定兩個(gè)此類結(jié)構(gòu)域的組合長(zhǎng)度為X，其中X為如上定義的h*k。在這種情況下，一個(gè)結(jié)構(gòu)域具有長(zhǎng)度為y，并且另一個(gè)結(jié)構(gòu)域具有長(zhǎng)度為x-y，前提是y是I或更大。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)DNA結(jié)構(gòu)域各自可以長(zhǎng)度范圍為1-20個(gè)核苷酸，前提是兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的組合長(zhǎng)度是21個(gè)核苷酸。
[0101]在一些實(shí)施方案中，促成相同螺旋的兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域可以具有長(zhǎng)度約21+/-2個(gè)核苷酸的組合長(zhǎng)度，或10.5個(gè)核苷酸的任何整數(shù)倍數(shù)。因此，單個(gè)結(jié)構(gòu)域可以具有例如1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域可以具有例如19、20、21、22或23個(gè)核苷酸的總組合長(zhǎng)度。2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸可以具有例如21+/-2個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸可以具有例如42+/-4個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
[0102]因此，一般而言，參與具有如上定義的總長(zhǎng)度x=h*k的相同雙螺旋的兩個(gè)連續(xù)結(jié)構(gòu)域，X可以是h*k+/-a,其中a=0、l、2、…、y，其中y= (h/2) *k (四舍五入至最近整數(shù))。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，h=ll (在RNA的情況下)，k=l，并且y=6。因此，x可以是11+/-0、1、2、3、4、5或6。作為另一個(gè)例子，對(duì)于h=10.5 (在B形DNA的情況下)，k=2、y=10。因此，X 可以是 21+/-1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。 [0103]在一些重要實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域具有10或11個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域具有21個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸具有42個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明考慮了具有兩個(gè)鄰接結(jié)構(gòu)域(兩者促成單個(gè)螺旋)的寡核苷酸，所述結(jié)構(gòu)域具有21個(gè)核苷酸倍數(shù)的長(zhǎng)度。
[0104]本發(fā)明考慮了結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度組合例如10-11-11-10、11-10-10-11、11-10-11-10、和10-11-10-11，其中第一個(gè)數(shù)目表示第一個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，第二個(gè)數(shù)目表示第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，第三個(gè)數(shù)目呈現(xiàn)第三個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，并且第四個(gè)數(shù)目表示第四個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，并且其中四個(gè)結(jié)構(gòu)域如圖1中排列。
[0105]一般在給定合成方法或所得的結(jié)構(gòu)中，具有相同結(jié)構(gòu)域數(shù)目的寡核苷酸也將具有相同長(zhǎng)度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所有4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸將具有相同長(zhǎng)度,并且所有2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸將具有相同長(zhǎng)度(但該長(zhǎng)度將不同于4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸的長(zhǎng)度)。更具體而言，一些實(shí)施方案將使用一個(gè)長(zhǎng)度(例如η個(gè)核苷酸)的4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸和該長(zhǎng)度一半(例如η/2個(gè)核苷酸)的2結(jié)構(gòu)域寡核苷酸。
[0106]4結(jié)構(gòu)域“內(nèi)部”寡核苷酸表示用于本發(fā)明結(jié)構(gòu)的單體單位。作為獨(dú)立的單體，4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸沒有定義明確的結(jié)構(gòu)。然而，在與鄰近2和/或4結(jié)構(gòu)域寡核苷酸相互作用后，它折疊成塊樣形狀。這與先前的塊單體形成對(duì)比，所述先前的塊單體單獨(dú)折疊成具有限定的結(jié)構(gòu)上剛性(或半剛性)的主體和幾個(gè)粘性末端的多鏈結(jié)構(gòu)。
[0107]本發(fā)明考慮了包含任何數(shù)目的單鏈寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)。例如，核酸結(jié)構(gòu)可以包含而不限于少至4個(gè)和多達(dá)1000個(gè)(或更多個(gè))寡核苷酸。類似地，用于生成核酸結(jié)構(gòu)的多個(gè)寡核苷酸可以包含而不限于少至4個(gè)不同類型的寡核苷酸(如通過核苷酸序列限定的)和多達(dá)1000個(gè)(或更多個(gè))不同寡核苷酸種類(如通過核苷酸序列限定的)。因此，取決于實(shí)施方案，核酸結(jié)構(gòu)可以包含 4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500 個(gè)或更多個(gè)寡核苷酸。類似地，取決于實(shí)施方案，用于生成核酸結(jié)構(gòu)的多個(gè)寡核苷酸可以包含4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500個(gè)或更多個(gè)不同寡核苷酸。
[0108]在本發(fā)明的背景下，寡核苷酸包括DNA例如D形DNA和L形DNA和RNA，及其多種修飾。修飾包括堿基修飾、糖修飾和主鏈修飾。這些的非限制性例子在下文提供。
[0109]可以用于本發(fā)明中的DNA變體的非限制性例子是L-DNA (文獻(xiàn)中已知的DNA的主鏈對(duì)映體)、肽核酸(PNA)bisPNA夾、假互補(bǔ)PNA、鎖核酸(LNA)或上述的共核酸例如DNA-LNA共核酸。應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的產(chǎn)物和方法中使用的寡核苷酸在性質(zhì)中可以是同質(zhì)的或異質(zhì)的。例如，它們?cè)谛再|(zhì)中可以完全是DNA，或它們可以由DNA和非DNA (例如LNA)單體或序列組成。因此，可以使用核酸元件的任何組合。寡核苷酸修飾可以使得寡核苷酸在某些條件下對(duì)降解更穩(wěn)定和/或更不敏感。例如，在一些情況下，寡核苷酸是核酸酶抗性的。
[0110]寡核苷酸可以具有同質(zhì)主鏈(例如完全是磷酸二酯或完全是硫代磷酸酯)或異質(zhì)(或嵌合)主鏈。硫代磷酸酯主鏈修飾使得寡核苷酸對(duì)核酸酶更不敏感，并且因此在某些條件下更穩(wěn)定(與天然磷酸二酯主鏈核酸相比較)。可以為寡核苷酸提供更多穩(wěn)定性的其他連接包括但不限于二硫代硫酸酯連接、甲基膦酸酯連接、甲基硫代磷酸酯連接、硼膦酸酯連接、肽連接、烷基連接、去磷酸型連接等。因此，在一些情況下，寡核苷酸具有非天然存在的主鏈。
[0111]寡核苷酸可以在體外合成。用于合成核酸的方法包括自動(dòng)化核酸合成也是本領(lǐng)域已知的。具有修飾的主鏈例如包含硫代磷酸酯連接的主鏈的寡核苷酸并且包括包含嵌合修飾主鏈的那些可以使用采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學(xué)的自動(dòng)化技術(shù)合成。(F.E.Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach^IRL Press,Oxford, UK,1991,以及 M.D.Matteucci 和 Μ.H.Caruthers, Tetrahedron Lett.21,719(1980))芳基和烷基膦酸酯連接可以例如如美國(guó)專利號(hào)4，469，863中所述進(jìn)行制備；并且例如如美國(guó)專利號(hào)5，023，243和歐洲專利號(hào)092，574中所述的烷基磷酸三酯連接(其中荷電氧部分是烷基化的)可以通過自動(dòng)化固相合成使用商購(gòu)可得的試劑進(jìn)行制備。用于制備其他DNA主鏈修飾和置換的 方法已得到描述。Uhlmann E等人(1990) Chem Rev90:544 ；Goodchild J( 1990)Bioconjugate Cheml: 165 ；Crooke ST等人(1996)Annu Rev PharmacolToxicol36:107-129 ;和 Hunziker J 等人(1995)Mod Synth Methods7:331-417。
[0112]寡核苷酸可以另外或備選地在其糖中包含修飾。例如，核糖單位或e-D-2’-脫氧核糖單位可以替換為經(jīng)修飾的糖單位，其中經(jīng)修飾的糖單位例如選自β -D-核糖、a -D-2’ -脫氧核糖、L-2’ -脫氧核糖、2’ _F_2’ -脫氧核糖、阿拉伯糖、2’ -F-阿拉伯糖、2’ -O- (C1-C6)烷基-核糖，優(yōu)選地2’ -O- (C1-C6)烷基-核糖是2’ -O-甲基核糖、2’-O- (C2-C6)烯基-核糖、2’-[O- (C1-C6)烷基-O- (C1-C6)烷基]-核糖、2’_NH2_2’-脫氧核糖、β -D-木-呋喃糖、α -阿拉伯呋喃糖、2，4-雙脫氧-β -D-赤式-己-吡喃糖和碳環(huán)(例如在Froehler J (1992) Am Chem Socll4:8320中描述的)和/或開鏈糖類似物(例如在Vandendriessche等人(1993) Tetrahedron49:7223中描述的)和/或雙環(huán)糖類似物(例如在 Tarkov M 等人(1993) Helv Chim Acta76:481 中描述的)。
[0113]寡核苷酸可以包含在其堿基中的修飾。經(jīng)修飾的堿基包括經(jīng)修飾的胞嘧啶(例如5-取代胞嘧啶(例如5-甲基-胞 嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5- 二氟甲基-胞嘧啶、和未被取代或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6_取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5_氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、具有稠環(huán)系統(tǒng)的胞嘧啶類似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)、和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)、經(jīng)修飾的鳥嘌呤例如7-脫氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-取代鳥嘌呤(例如7-脫氮雜-7- (C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7-脫氮雜-8-取代鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶_2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8_取代鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤)、和6-硫代鳥嘌呤。核酸可以包含通用堿基(例如3-硝基批咯、P-喊基、4-甲基-吲哚、5_硝基-Π引哚和K喊基)和/或芳環(huán)系統(tǒng)(例如氟苯、二氟苯、苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸酰胺)?？梢該饺氡景l(fā)明的寡核苷酸內(nèi)的特定堿基對(duì)是由Yang等人NAR，2006，34 (21):6095-6101報(bào)告的dZ和dP非標(biāo)準(zhǔn)核堿基對(duì)。dZ嘧啶類似物是6-氨基-5-硝基-3- (I’ - β -D-2’ -脫氧呋喃核糖基)_2(IH)-吡啶酮，并且其沃森-克里克互補(bǔ)體dP嘌呤類似物是2-氨基-8- （-1’-β -D- 1’-脫氧呋喃核糖基)-咪唑并[l，2-a]-l，3，5-三嗪-4 (8H)-酮。
[0114]合成方法:
[0115]本發(fā)明考慮了通過退火過程合成核酸結(jié)構(gòu)。在一種方法中，一旦單鏈寡核苷酸已得到鑒定且合成(例如使用商業(yè)廠商例如Bioneer)，它們就在單個(gè)容器例如但不限于管、孔、小瓶等中組合。使用的寡核苷酸的摩爾量將取決于所需結(jié)構(gòu)中每個(gè)寡核苷酸的頻率和所需結(jié)構(gòu)的量。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以以等摩爾濃度存在。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)寡核苷酸可以以約IOOnM的濃度存在。將寡核苷酸置于溶液中。優(yōu)選地，溶液是緩沖的，盡管退火反應(yīng)也可以在不存在緩沖液的情況下發(fā)生。溶液可以進(jìn)一步包含二價(jià)陽(yáng)離子例如但不限于Mg2+。陽(yáng)離子或鹽濃度可以改變。示例性濃度是約25mM。溶液還可以包含EDTA或其他核酸酶抑制劑，以便阻止寡核苷酸的降解。
[0116]退火反應(yīng)通過使溶液加熱且隨后允許溶液緩慢冷卻來(lái)執(zhí)行。反應(yīng)的溫度應(yīng)足夠高，以使任何不希望有的二級(jí)結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)解鏈，并且確保寡核苷酸種類不會(huì)不正確地與其他非互補(bǔ)寡核苷酸結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，溫度因此可以最初升高到約100°C、約95°C、約90°C、約85°C、80°C、75°C、70°C、65°C或60°C。溫度可以通過將容器置于熱水浴或加熱塊或能夠溫度控制的裝置例如PCR機(jī)器中得到升高。容器可以在該環(huán)境中保持?jǐn)?shù)秒或數(shù)分鐘。一般地，約1-10分鐘的溫育是足夠的。
[0117]一旦在高溫下的溫育完成，溫度就可以以許多方式下降。溫度可以使用計(jì)算機(jī)算法以自動(dòng)化方式下降，所述計(jì)算機(jī)算法使溫度下降某一量，并且在再次下降溫度前使該溫度維持某一時(shí)間段。此類自動(dòng)化方法可以涉及在每個(gè)步驟中使溫度下降一度或在每個(gè)步驟時(shí)使溫度下降多度。容器隨后因此可以在相同裝置中加熱且冷卻。
[0118]提供了示例性過程。為了實(shí)現(xiàn)溫度中從約90°C到約25°C的下降，溫度以一度增量以10分鐘/度的速率(即90°C 10分鐘，89°C 10分鐘等)從90°C變成61°C。溫度隨后以一度增量和以約20分鐘/度的速率(即60°C 20分鐘，59°C 20分鐘等)從60°C變成25°C。關(guān)于這個(gè)過程的總退火時(shí)間是約17小時(shí)。依照本發(fā)明，在這些條件下，寡核苷酸自裝配成預(yù)定的和所需形狀和大小的核酸結(jié)構(gòu)。[0119]備選地，容器可以置于不同環(huán)境下，包括例如室溫環(huán)境(例如約25°C)。在其中維持延長(zhǎng)時(shí)間段，以便允許寡核苷酸以預(yù)定的方式彼此退火。冷卻期可以持續(xù)數(shù)小時(shí)，包括但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多小時(shí)。在一些情況下，冷卻期長(zhǎng)于20小時(shí)，并且可以是25、30、25、40、50、55、60或更多小時(shí)。
[0120]實(shí)施例描述了具體退火過程，使用在Tris-EDTA (TE)、25mMMgCl2溶液中的IOOnM寡核苷酸，并且將溶液加熱至約90°C，并且隨后經(jīng)過約17小時(shí)的時(shí)期將溶液冷卻至約25°C，如上所述使用在90°C和61°C之間的10分鐘/度下降和在60°C和25°C之間的10分鐘/度下降。
[0121]用于自退火的另外一組條件包括TE/Mg2+緩沖液(20mM Tris、pH7.6，2mM EDTA,
12.5mM MgCl2)和相同的降溫過程。
[0122]寡核苷酸的化學(xué)計(jì)量學(xué)不一定是緊密調(diào)節(jié)的。
[0123]在退火過程后，反應(yīng)混合物可以直接使用或它可以進(jìn)一步分餾，以便進(jìn)一步分餾核酸結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。例如，可以對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠電泳，例如2%非變性瓊脂糖凝膠電泳，以便使目的結(jié)構(gòu)與其他結(jié)構(gòu)或底物在物理上分開。一般地，觀察到單個(gè)顯著條帶。條帶可以從凝膠中提取且例如經(jīng)由離心進(jìn)一步純化。純化產(chǎn)物隨后可以再次實(shí)施凝膠電泳，具有再次預(yù)期的單個(gè)條帶。純化產(chǎn)物可以經(jīng)由AFM或TEM成像。此類成像揭示了純化產(chǎn)物的維度、任何修飾(例如鏈霉親和素修飾)的程度和位置，并且可以用于測(cè)定得率和純化程度。此類分析已揭示了具有接近預(yù)期維度的結(jié)構(gòu)的形成。
[0124]所需產(chǎn)物的得率也可以在退火后進(jìn)行測(cè)定?！把b配得率”可以首先通過非變性凝膠電泳進(jìn)行估計(jì)，其中樣品用SYBR安全染色。得率(被稱為“凝膠得率”)計(jì)算為所需產(chǎn)物條帶的熒光強(qiáng)度和整個(gè)泳道的熒光強(qiáng)度(在本底校正后)之間的比例。該比例因此將是得率的指示劑。測(cè)量的凝膠得率范圍為6-40%。已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明此類比例可以是估計(jì)過高的，因?yàn)樵赟YBR安全的染色效率中存在明顯的結(jié)構(gòu)和序列依賴性變化。在一些情況下，得率可以是測(cè)量的凝膠得率的約60-100%。`
[0125]退火過程的效率還可以通過測(cè)量作為AFM視野中的所有可鑒定形狀百分比的“充分形成”結(jié)構(gòu)的份數(shù)進(jìn)行測(cè)定。如果結(jié)構(gòu)在其預(yù)期輪廓中沒有直徑大于15nm的缺陷且在其內(nèi)部中沒有直徑大于IOnm的缺陷，則它視為“充分形成的”。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，跨越一系列結(jié)構(gòu)已觀察到范圍為約20-85%的“充分形成的”比例或“AFM得率”。在某些情況下，這個(gè)比例可能是純化產(chǎn)物內(nèi)“充分形成的”結(jié)構(gòu)的實(shí)際比例的低估數(shù)據(jù)，由于在一些情況下結(jié)構(gòu)的相對(duì)脆性和顯著的純化后損害，所述純化后損害可能在樣品沉積或成像過程中發(fā)生。通過將更多共價(jià)鍵引入裝配結(jié)構(gòu)內(nèi)，例如經(jīng)由4寡核苷酸SST的兩個(gè)末端的連接或鄰近4寡核苷酸SST的交聯(lián)，此類脆性可以得到減輕。
[0126]對(duì)于具有深度的一些結(jié)構(gòu)(例如管或桶)，充分形成的結(jié)構(gòu)的程度可以使用TEM成像進(jìn)行測(cè)定。在這些情況下，TEM得率定義為基于3.5nm/螺旋轉(zhuǎn)角估計(jì)，在與預(yù)期全長(zhǎng)(例如管或桶長(zhǎng)度)5nm偏差內(nèi)測(cè)量的可鑒定結(jié)構(gòu)(例如管或桶)的百分比。
[0127]本發(fā)明考慮了用于合成本發(fā)明結(jié)構(gòu)的手動(dòng)或自動(dòng)方法。自動(dòng)方法的例子計(jì)算機(jī)程序(例如MATLAB程序)提供了圖形界面，其展示由其制備結(jié)構(gòu)的畫布(例如在310寡核苷酸庫(kù)的情況下，矩形畫布是起點(diǎn))。鑒定在其上作圖所需結(jié)構(gòu)的畫布和合成該結(jié)構(gòu)所需的像素(或SST)。該程序還可以使用液態(tài)處理機(jī)器人(Bravo，Agilent)幫助使鏈挑選和混合過程自動(dòng)化。因此，一旦最終用戶使結(jié)構(gòu)對(duì)圖形界面作圖，計(jì)算機(jī)程序就輸出關(guān)于機(jī)器人液態(tài)處理器的指令，以挑選且混合合適的鏈用于后續(xù)退火。鏈混合物隨后在標(biāo)準(zhǔn)一鍋式退火中用于產(chǎn)生用于AFM成像的形狀。在多個(gè)測(cè)試中，已發(fā)現(xiàn)每個(gè)機(jī)器人批次在大約48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生48個(gè)形狀，將每個(gè)形狀幾個(gè)人工勞力小時(shí)有效減少到I機(jī)器小時(shí)，并且避免潛在的人為錯(cuò)誤。此類機(jī)器人系統(tǒng)用于生成本文描述的44個(gè)形狀。
[0128]程序界面特征為三個(gè)功能:(I)形狀設(shè)計(jì)，(2)移液管順序生成和(3)方案輸出。使用該程序，三個(gè)步驟涉及設(shè)計(jì)靶形狀且生成用于該形狀的退火前鏈混合物。首先，該程序展示2D網(wǎng)格(“分子畫布”)的示意圖，并且允許用戶由草圖描繪形狀，或上載圖像且將其轉(zhuǎn)換為靶形狀。隨后，對(duì)于該形狀生成組成成分鏈列表?；谟蓹C(jī)器人使用的96孔板中的來(lái)源鏈排列，這個(gè)鏈列表隨后轉(zhuǎn)換為移液管順序列表。最后，生成以xml格式的一組指令(運(yùn)行組)，并且可以由機(jī)器人控制軟件(Vfforks ,Agilent)直接裝載且執(zhí)行。
[0129]復(fù)合結(jié)構(gòu):
[0130]本發(fā)明進(jìn)一步考慮了本文描述的核酸結(jié)構(gòu)自身可以基本上用作單體或構(gòu)件塊，以便形成更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的復(fù)合結(jié)構(gòu)由使用間隔物-接頭彼此連接的核酸結(jié)構(gòu)組成。接頭一般對(duì)于核酸結(jié)構(gòu)不是整合的，盡管它們可以經(jīng)由合適的官能團(tuán)與結(jié)構(gòu)附著。將兩個(gè)或更多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)附著在一起的能力允許制備具有更大大小和復(fù)雜性的結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)和排列的例子顯示于圖9中。
[0131]無(wú)限制地，這些復(fù)合結(jié)構(gòu)的維度可以范圍為500nm_100微米或1-1000微米。
[0132]應(yīng)用:
[0133]本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可以用于多種應(yīng)用中，包括將獲益于在納米或微米尺度上精確地定位且重要地排列一個(gè)或多個(gè)部分的能力的應(yīng)用。
[0134]例如，結(jié)構(gòu)可以用作模板用于排列或模式化無(wú)機(jī)材料，例如在電子學(xué)、等離子體學(xué)和量子計(jì)算應(yīng)用中有用的無(wú)機(jī)材料?？梢耘c核酸結(jié)構(gòu)附著的部分包括金屬顆粒例如金納米顆粒(參考文獻(xiàn)5，35)、量子點(diǎn)(參考文獻(xiàn)6)、碳納米管(參考文獻(xiàn)7)等。以這種方式，由本發(fā)明提供的核酸結(jié)構(gòu)充當(dāng)支架，在其上可以排列其他部分和/或可以伴隨納米精確度和控制合成其他結(jié)構(gòu)。例如，碳納米管可以組構(gòu)成功能分子電子學(xué)系統(tǒng)；金納米顆粒的可調(diào)幾何學(xué)排列可以用于制備功能分子電子學(xué)線路和新型等離子體學(xué)線路；磁顆粒的組構(gòu)的預(yù)定的排列可以用于制備納米感應(yīng)器或存儲(chǔ)裝置；并且量子點(diǎn)的組構(gòu)和預(yù)定的排列可以用于制備新型量子計(jì)算機(jī)。
[0135]在其他方面，本發(fā)明考慮了本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可以金屬化，以制備用于電子學(xué)的部件。DNA管已金屬化成納米線(參考文獻(xiàn)4，15，19)。本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)的受控的金屬化可以尤其用于制備具有受控的直徑且因此具有受控的電子學(xué)性質(zhì)的納米線。進(jìn)一步地，新型分子電子學(xué)部件和線路可以通過由本發(fā)明提供的基于支柱的核酸結(jié)構(gòu)的受控的金屬化進(jìn)行制備。
[0136]核酸結(jié)構(gòu)還可以用作用 于生物學(xué)或有機(jī)分子的模板。此類模板分子和系統(tǒng)可以例如用于診斷和研究應(yīng)用中。生物學(xué)或有機(jī)分子包括但不限于蛋白質(zhì)和肽例如抗體和抗體片段、酶和酶結(jié)構(gòu)域、受體和受體結(jié)構(gòu)域、生物配體例如激素及其他發(fā)信號(hào)部分、多糖、細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)塊等。不同策略已對(duì)于在DNA網(wǎng)格上的模板蛋白質(zhì)加以證實(shí)(參考文獻(xiàn)4，23，36)。蛋白質(zhì)以可編程納米精確度組構(gòu)成預(yù)定的幾何學(xué)模式可以用于例如研究生物學(xué)動(dòng)力蛋白的合作行為(參考文獻(xiàn)37)。某些核酸結(jié)構(gòu)也可以用于細(xì)胞或組織培養(yǎng)中。在這些實(shí)施方案中，例如，結(jié)構(gòu)可以用生物學(xué)部分例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)組分進(jìn)行官能化。以這種方式，官能化結(jié)構(gòu)可以在培養(yǎng)中排列，以模擬二維或三維體內(nèi)環(huán)境。作為進(jìn)一步例子，考慮可以制備更高級(jí)別的官能化結(jié)構(gòu)，其顯示出用于任何特定生物學(xué)部分的濃度梯度。這些系統(tǒng)隨后可以用于研究關(guān)于任何數(shù)目的細(xì)胞類型的細(xì)胞發(fā)育、分化和/或運(yùn)動(dòng)。在另外其他情況下，本發(fā)明的更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)可以用作支架用于體外或體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。
[0137]在這些應(yīng)用的多個(gè)中，本發(fā)明進(jìn)一步考慮了一旦由本發(fā)明結(jié)構(gòu)組成的核酸支架停止作為模板，它就可以被保留或它就可以被去除(例如通過消化或降解)。例如，如果目的是產(chǎn)生金顆粒的預(yù)定的排列，并且此類顆粒不依賴核酸支架根據(jù)需要彼此連接，則支架可以被去除，僅留下金納米顆粒網(wǎng)絡(luò)。
[0138]包括下述實(shí)施例用于舉例說明的目的并且不預(yù)期限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0139]實(shí)施例1.[0140]材料與方法
[0141]樣品制備。DNA鏈由 Integrated DNA Technology, Inc.或 Bioneer Corporation合成。為了裝配結(jié)構(gòu)，在補(bǔ)充有12.5或25mM MgCl2的0.5XTE緩沖液(5mM Tris, ρΗ7.9，ImM EDTA)中，將DNA鏈混合至對(duì)于大多數(shù)結(jié)構(gòu)每個(gè)鏈種類IOOnM的大致等摩爾終濃度(除了以200nM制備的基于24HX 28T矩形的不同形狀外)。濃度基于制造商規(guī)格單，并且不執(zhí)行另外的內(nèi)部校正。因此，關(guān)于鏈的化學(xué)計(jì)量學(xué)不受緊密控制。通過使用不同冷卻程序經(jīng)過17-58小時(shí)的時(shí)期從90°C冷卻到25°C，混合物隨后在PCR熱循環(huán)儀中退火。隨后將退火的樣品應(yīng)用于在冰水浴中的1.5或2百分比的瓊脂糖凝膠電泳(在補(bǔ)充有IOmM MgCl2的0.5XTBE緩沖液中制備且用SYBR安全預(yù)染色的凝膠)。隨后，切割靶凝膠條帶且置于Freeze，N Squeeze柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.)內(nèi)。通過在柱中的微管研棒將凝膠小片擠壓成精細(xì)小片，并且隨后對(duì)柱直接實(shí)施以438g共3分鐘的離心。通過測(cè)量在260nm處的紫外吸收，收集離心通過柱的樣品用于濃度估計(jì)。此類估計(jì)將用于在AFM或TEM成像前估計(jì)稀釋因子。`
[0142]鏈霉親和素標(biāo)記。鏈霉親和素標(biāo)記用兩種不同方法完成。I)標(biāo)記24HX28T矩形的上和下行或內(nèi)部位置。24HX28T矩形的上和下行(或內(nèi)部位置)的每個(gè)塊修飾為具有3’17nt手柄(TT作為間隔物和GGAAGGGATGGAGGA，SEQ ID NO:363與3’生物素修飾的鏈互補(bǔ)，所述3’生物素修飾的鏈的序列為TCCTCCATCCCTTCC-生物素，SEQ ID N0.364)。上和下行(或內(nèi)部位置)的特別塊和矩形網(wǎng)格的組分塊的剩余部分與1-2X濃度的30生物素修飾的鏈混合(當(dāng)特別和共同組分塊的濃度為IOOnM并且存在14個(gè)不同特別塊種類時(shí)，3’生物素修飾的鏈的IX濃度為100X14=1400nM)，所述3’生物素修飾的鏈與在TE緩沖液(25mMMgCl2)中的特別塊的手柄序列互補(bǔ)。它們隨后經(jīng)過17小時(shí)退火并且在瓊脂糖凝膠電泳后純化。隨后對(duì)純化的樣品實(shí)施AFM成像。在第一輪成像后，在再成像前，將鏈霉親和素(在0.5XTE緩沖液(IOmM MgCl2)中的I μ L10mg/mL)加入成像樣品(~40 μ L)共溫育2分鐘。2)標(biāo)記管結(jié)構(gòu)的聚-T末端。在管純化后，將3’生物素修飾的聚A鏈(5-10Χ至聚T配對(duì)物)與樣品在室溫混合過夜。隨后對(duì)樣品實(shí)施AFM成像。在第一輪成像后，在再成像前，將鏈霉親和素(在0.5XTE緩沖液(IOmM MgCl2)中的I μ L10mg/mL)加入在云母上的成像樣品共溫育2分鐘。
[0143]用于樣品制備的機(jī)器人自動(dòng)化。設(shè)計(jì)MATLAB程序以幫助復(fù)雜形狀設(shè)計(jì)和通過液體處理機(jī)器人(Bravo, Agilent)的自動(dòng)化鏈混合。對(duì)于每個(gè)形狀，挑選5 μ L水溶液中的10 μ M每個(gè)單鏈塊，并且混合成小于2mL的終體積(確切體積由用于靶形狀的組成成分鏈數(shù)目決定)，并且隨后真空蒸發(fā)至200 μ L的250ηΜ溶液。這個(gè)混合物隨后補(bǔ)充50 μ L62.5mMMg2+緩沖液，以達(dá)到準(zhǔn)備用于退火的250 μ L最終混合物。這個(gè)退火前溶液具有下述終濃度:200nM DNA鏈/SST種類和12.5mM Mg2+。每次運(yùn)行容納48個(gè)形狀并且花費(fèi)約兩天結(jié)束。
[0144]AFM 成像。AFM 圖像使用具有 Digital Instruments Nanoscope V 控制器(Vecco)的SPM Multimode獲得。將伴隨純化的退火樣品的5 μ L小滴(2~5ηΜ)隨后為0.5ΧΤΕ(IOmM MgCl2)的40μ L小滴應(yīng)用于新鮮切割的云母表面上，并且靜置約2分鐘。有時(shí)，執(zhí)行樣品的另外稀釋以達(dá)到所需樣品密度。在少數(shù)情況下，加入補(bǔ)充的IOmM NiCl2，以增加DNA-云母結(jié)合的強(qiáng)度。樣品使用液態(tài)輕敲模式進(jìn)行成像。使用的AFM尖端很短，并且SNL-1O氮化娃懸臂芯片(Vecco Probes)中的薄懸臂。
[0145]TEM成像。對(duì)于成像，將3.5 μ L樣品(I~5ηΜ)吸收到輝光放電碳涂布TEM格柵上4分鐘，且隨后使用含有25mM NaOH的2%甲酸雙氧鈾水溶液染色I(xiàn)分鐘。成像使用在80kV 下操作 JEOL JEM-1400 執(zhí)行。
[0146]用SYBR安全染色的得率定量。得率首先通過非變性凝膠電泳進(jìn)行估計(jì)。采用靶條帶的熒光強(qiáng)度和整個(gè)泳道的熒光強(qiáng)度之間的比例以呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)形成的總得率。對(duì)于24HX28T矩形，作為獨(dú)立的備選定量程序，比較靶條帶的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)樣品(Ikb梯混合物的1500bpDNA)。基于標(biāo)準(zhǔn)樣品由強(qiáng)度-質(zhì)量曲線推導(dǎo)靶條帶的質(zhì)量值，并且用于計(jì)算所需結(jié)構(gòu)的得率。
[0147]測(cè)量和統(tǒng)計(jì)學(xué)。使用由Veeco提供的Nanoscope Analysis (版本1.20)獲得AFM測(cè)量。對(duì)于距離測(cè)量任務(wù)(不同大小的矩形的長(zhǎng)度和寬度)應(yīng)用橫截面函數(shù)。選擇“充分形成的”結(jié)構(gòu)用于測(cè)量。使用NIH的ImageJ (版本1.43u)分析管的TEM圖像。應(yīng)用“直線”函數(shù)以便測(cè)量管的寬度。應(yīng)用“分割線”函數(shù)以突出顯示且測(cè)量管的伸直長(zhǎng)度。收集三十個(gè)樣品點(diǎn)用于每個(gè)距離測(cè)量(例如24HX28T矩形的寬度)，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)(例如平均值、標(biāo)準(zhǔn)差)基于30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0148]實(shí)施例2.[0149]使用本文描述的方法，我們已使用多個(gè)單鏈寡核苷酸，以構(gòu)建與由現(xiàn)有技術(shù)DNA折紙法制備的那些一樣大的DNA結(jié)構(gòu)。更具體而言，我們已自裝配362個(gè)不同單鏈DNA，以構(gòu)建大小為約60nm乘約IOOnm的矩形網(wǎng)格,及其衍生結(jié)構(gòu)。
[0150]合成(例如Bioneer)寡核苷酸，并且在具有MgCl2 (濃度25mM)的TE緩沖溶液中以所需濃度(例如IOOnM)混合在一起。對(duì)混合物實(shí)施涉及緩慢冷卻的退火程序(例如如本文描述的，經(jīng)過17小時(shí)的過程，在約90°C開始且在約25°C結(jié)束)。這個(gè)退火程序允許寡核苷酸自裝配，從而形成核酸結(jié)構(gòu)。
[0151]一旦退火完成，就在結(jié)構(gòu)純化前和后分析反應(yīng)混合物。使用瓊脂糖凝膠電泳、AFM和TEM表征結(jié)構(gòu)。
[0152]已使用這種方法制備的結(jié)構(gòu)包括圖3B-F、5B_D和IOA中所示的那些(使用圖中所示的寡核苷酸，參考下表1)。圖4和5中所示的結(jié)構(gòu)已使用這種方法進(jìn)行制備。
[0153]實(shí)施例3.[0154]我們隨后還嘗試連接各為管形狀的兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)，以形成更大的更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)。[0155]首先，管形結(jié)構(gòu)各自通過如本文描述的混合且退火的寡核苷酸進(jìn)行制備。使用經(jīng)過約17小時(shí)的過程從約90°C到約25°C的溫度轉(zhuǎn)變，將寡核苷酸組合且退火。隨后將所得的核酸結(jié)構(gòu)混合在一起，并且使用經(jīng)過約7小時(shí)的過程從約45°C到約25°C的溫度轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步退火。與僅僅將結(jié)構(gòu)在室溫維持相同時(shí)間段相比較，這個(gè)過程提供了改善得率。此外，應(yīng)當(dāng)注意結(jié)構(gòu)可以充分退火，與它們?cè)诘谝粋€(gè)退火步驟后是否純化無(wú)關(guān)。
[0156]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸結(jié)構(gòu),其包含 多個(gè)退火的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)雙螺旋包含獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1或2的核酸結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)雙螺旋包含2個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的核酸結(jié)構(gòu)，其中至少50%的所述雙螺旋包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中第一個(gè)子集的寡核苷酸包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且第二個(gè)子集的寡核苷酸包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度是21-104個(gè)核苷酸。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
9.一種核酸結(jié)構(gòu),其包含 多個(gè)退火的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)雙螺旋是獨(dú)特的。
10.權(quán)利要求9的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含2個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特雙螺旋。
11.權(quán)利要求9或10的核酸結(jié)構(gòu)，其中至少50%的所述雙螺旋是獨(dú)特的。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中至少50%的所述雙螺旋包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
14.權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中第一個(gè)子集的寡核苷酸包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且第二個(gè)子集的寡核苷酸包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域。
15.權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度是21-104個(gè)核苷酸。
16.權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
17.權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu),其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
18.一種核酸結(jié)構(gòu)，其包含 多個(gè)退火的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸包含排列成至少兩個(gè)平行雙螺旋的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)寡核苷酸是獨(dú)特的。
19.權(quán)利要求18的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)中的至少50%寡核苷酸是獨(dú)特的。
20.權(quán)利要求18的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)中的所有寡核苷酸都是獨(dú)特的。
21.權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)平行雙螺旋。
22.權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中第一個(gè)子集的寡核苷酸包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且第二個(gè)子集的寡核苷酸包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求18-22中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度是21-104個(gè)核苷酸。
24.權(quán)利要求18-23中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
25.權(quán)利要求18-23中任一項(xiàng)的核酸結(jié)構(gòu)，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
26.—種包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)的組合物，其中所述多個(gè)是至少50%同質(zhì)的。
27.—種方法,其包括 在單個(gè)容器中使多個(gè)單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結(jié)構(gòu)，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且其中至少一個(gè)單鏈寡核苷酸以是所述多個(gè)中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低10倍的摩爾濃度存在。
28.—種方法,其包括 在單個(gè)容器中使多個(gè)單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結(jié)構(gòu)，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且其中至少一個(gè)單鏈寡核苷酸以是所述多個(gè)中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低100倍的摩爾濃度存在。
29.權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)的方法，其中退火通過經(jīng)過一段時(shí)間的溫度轉(zhuǎn)變而發(fā)生。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述溫度轉(zhuǎn)變是從高溫到約室溫的溫度變化。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述溫度轉(zhuǎn)變是從約90°C到約室溫的溫度變化。
32.權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述退火經(jīng)過約12-24小時(shí)的時(shí)期發(fā)生。
33.權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的方法，其中第一個(gè)子集的寡核苷酸包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且第二個(gè)子集的寡核苷酸包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求26-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度是21-104個(gè)核苷酸。
35.權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
36.權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
37.一種核酸結(jié)構(gòu),其通過權(quán)利要求26-36中任一項(xiàng)的方法制備。
38.一種復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)，其包含 通過間隔物-接頭彼此綴合的，權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的至少兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)。
39.權(quán)利要求38的復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)，其中所述間隔物-接頭包含核酸元件和非核酸元件。
40.權(quán)利要求38或39的復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)，其中所述間隔物-接頭包含碳鏈。
41.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的復(fù)合核酸結(jié)構(gòu)，其中所述間隔物-接頭是同雙功能間隔物_接頭。
【文檔編號(hào)】C07H21/00GK103889998SQ201280047057
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】尹鵬, 魏迪明 申請(qǐng)人:哈佛學(xué)院院長(zhǎng)等