純化的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于制備和遞送嵌合細(xì)胞因子蛋白的方法和組合物，包括細(xì)胞培養(yǎng)物、純化方法和純化的組合物。
【專利說(shuō)明】純化的蛋白質(zhì)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2011年7月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列No. 61/513, 453 ;2012年 1月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列No. 61/591，727的優(yōu)先權(quán)。將這些臨時(shí)申請(qǐng)的完整內(nèi)容 通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。
[0003] 背景
[0004] 白細(xì)胞介素-1 a (IL-1 α )和β (IL-1 β )是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的家族的原型成 員并且在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中具有幾個(gè)顯著作用。IL-la和IL-Ιβ結(jié)合白細(xì)胞介素-1受體 I(IL-IRI)，從而導(dǎo)致第二受體白細(xì)胞介素-1受體輔助蛋白（IL-lRAcP)的銜接。被IL-la 和IL-Ιβ激動(dòng)（agonized)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致放大的T細(xì)胞反應(yīng)，包括初始T細(xì)胞的增殖和 存活以及T H17細(xì)胞的發(fā)育。
[0005] 概述
[0006] 本文中表征了非天然存在的細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域，其可用于，除其它以外，調(diào)節(jié)對(duì)白細(xì) 胞介素-1受體I (IL-1RI)的細(xì)胞信號(hào)反應(yīng)，治療障礙，以及檢測(cè)和/或結(jié)合細(xì)胞受體以及 其它試劑。
[0007] 本文中還表征了白細(xì)胞介素-1 (IL-1)嵌合抑制劑的純化制劑和用于純化這樣的 蛋白質(zhì)的方法。嵌合抑制劑可包括至少兩種不同白細(xì)胞介素的表面特性，例如，與IL-1RI 相互作用的表面特性。表面特性可來(lái)自IL-Ιβ和IL-lRa、IL-la和IL-1RA或所有這三種 細(xì)胞因子。IL-1嵌合抑制劑的合成可產(chǎn)生具有未知效應(yīng)的產(chǎn)物相關(guān)種類。本文中表征的本 發(fā)明提供了以大大減少的量的這樣的產(chǎn)物相關(guān)種類產(chǎn)生蛋白質(zhì)制劑的方法。令人驚訝地， 方法中使用的陽(yáng)離子和陰離子柱對(duì)于除去大量的產(chǎn)物相關(guān)種類是有效的。
[0008] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了提供嵌合細(xì)胞因子蛋白的方法。方法包括在例如 至少1升培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含質(zhì)粒的大腸桿菌（E. coli)細(xì)胞，所述質(zhì)粒包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 系統(tǒng)控制之下的編碼嵌合細(xì)胞因子蛋白的核酸序列。培養(yǎng)體積可以是例如1L至15, 000L， 例如,5L 至 10, 000L。例如，培養(yǎng)體積可大于 2L、10L、90L、100L、400L、500L、800L、1000L、 5000L、8000L、10, 000L或12, 000L。例如嵌合細(xì)胞因子蛋白包括與實(shí)施例1中的氨基酸序 列具有至少90、95、98或100%的同一性的氨基酸序列，例如P03、P04或P05。例如，蛋白質(zhì) 是P05。核酸序列可包括實(shí)施例1中列出的核酸序列例如編碼P05的序列。
[0009] 可將細(xì)胞培養(yǎng)在具有比LB培養(yǎng)基更豐富的營(yíng)養(yǎng)物含量的培養(yǎng)基中。例如，將細(xì)胞 生長(zhǎng)在包含至少0. 5%或1%或1. 2%胰蛋白胨、至少1%、2%、2. 2%或2. 4%的酵母提取物、至 少0. 5mMEDTA(例如，0. 05mM至0. 8mMEDTA)和/或至少0. 1、0. 2或0. 4%甘油的培養(yǎng)基中。 可用微量元素補(bǔ)充培養(yǎng)基。可在培養(yǎng)過(guò)程中給細(xì)胞喂飼葡萄糖，例如至少3、5、6、7、8或9g/ L/hr。可以例如根據(jù)培養(yǎng)基pH、0D和/或細(xì)胞生長(zhǎng)條件，以超過(guò)一個(gè)速率，例如至少兩個(gè)不 同的速率喂飼細(xì)胞。
[0010] 例如，在培養(yǎng)過(guò)程中，例如以5-60、30-60、40-60或20-40%的溶解氧給細(xì)胞充氧。 可將培養(yǎng)基維持在PH6-7. 5或6. 7-7. 2或6. 9 - 7. 1。
[0011] 例如，可在大于5、10、20、30、35或40的00下，例如，通過(guò)添加1?了6來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞。 例如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)包括在一個(gè)或多個(gè)lac操縱子的控制下的T7啟動(dòng)子和編碼T7聚 合酶的基因?？蓪⒕幋a核酸序列有效地連接于Τ7啟動(dòng)子。
[0012] 方法還可包括例如在金屬螯合劑存在的情況下裂解大腸桿菌細(xì)胞以提供包含嵌 合細(xì)胞因子蛋白的裂解物。金屬螯合劑可以是例如EDTA或EGTA。例如，其是EDTA并且以 大于2. 5mM，例如大于2. 6、3、4、5、7或8mM，例如，4 - llmM的濃度存在?？墒褂冒饘衮?合劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞。
[0013] 裂解緩沖液可具有低于8· 0、7· 9、7· 5、7· 1、7· 0、6· 9,例如，5. 0至7. 0或5. 9至7. 5 或5. 9至7. 1的pH。裂解緩沖液可具有低于0. l%Triton X-100的去垢劑濃度/膠束濃度。 例如，裂解緩沖液不含去垢劑。裂解緩沖液可具有低于500mM、400mM、3(K)mM、2(K)mM、l()0mM、 50mM或10mM的NaCl或低于具有這樣的NaCl濃度的鹽溶液的電導(dǎo)率。
[0014] 方法還可包括例如通過(guò)不超過(guò)3或2個(gè)柱層析步驟從裂解物純化嵌合細(xì)胞因子蛋 白。因此，可將裂解物用于制備如本文中所述的例如用于陽(yáng)離子交換層析的負(fù)載制劑（load preparation)〇
[0015] 在一些實(shí)施方案中，方法可包括下列層析步驟的至少1、2或3個(gè)步驟：（i)陽(yáng)性交 換步驟，（ii)陰離子交換步驟，和（iii)羥基磷灰石柱層析步驟。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白使用不超過(guò)一個(gè)柱層析步驟來(lái)進(jìn)行純化。 例如，嵌合細(xì)胞因子蛋白在第一柱層析步驟后純度為至少50、60、70、80、90或95%。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，用于層析柱的負(fù)載制劑包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟，例如 使用 〇· 8/0. 45 μ m 的過(guò)濾（Sartorius Sartopore? 2);和 / 或 0· 45/0. 2 μ m 的過(guò)濾 (Sartorius Sartopore? 2)。
[0018] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了使用陽(yáng)離子交換柱和陰離子交換柱以及羥基磷灰石柱 純化嵌合細(xì)胞因子蛋白制劑的方法。可從在至少500mL、l升、2升或5升或更多培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞回收嵌合細(xì)胞因子蛋白制劑，其中大腸桿菌細(xì) 胞包含具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下表達(dá)嵌合細(xì)胞因子蛋白的核酸序列的質(zhì)粒。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將嵌合細(xì)胞因子蛋白制劑用于陽(yáng)離子交換柱（CEX);用不洗 脫嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗滌緩沖液洗滌陽(yáng)離子交換柱，利用洗脫緩沖液從陽(yáng)離子交換柱洗 脫結(jié)合的蛋白質(zhì)以提供包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的CEX洗脫物。隨后將CEX洗脫物例如在 其中嵌合細(xì)胞因子蛋白大體上不結(jié)合陰離子交換表面的條件下用于陰離子交換表面；和收 集從陰離子交換柱（AEX流通液）通過(guò)的流通液，將其加載至陶瓷羥基磷灰石柱（CHA)。緩 沖條件是使嵌合細(xì)胞因子蛋白結(jié)合CHA柱的條件。隨后從柱洗脫純化的蛋白質(zhì)。完整蛋白 質(zhì)對(duì)污染性蛋白質(zhì)亞型例如des-Ala蛋白質(zhì)亞型、甲二磺?；鞍踪|(zhì)亞型和乙酰化蛋白質(zhì) 亞型的比率在純化后增加。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，純化制劑包含少于10%的蛋白質(zhì)的 des-Ala形式，少于10%的蛋白質(zhì)的乙酰化形式和少于10%的蛋白質(zhì)的甲二磺?；问健Ｔ?另一個(gè)實(shí)施方案中，純化制劑包含少于百萬(wàn)分之50的宿主蛋白質(zhì)。
[0020] 純化的蛋白質(zhì)制劑可包含例如70%至100%，例如，80%至99%的完整蛋白質(zhì)；0%至 15%，例如，2%至7%的Des-Ala蛋白質(zhì)亞型；0%至10%，例如，0. 1%至4%的甲二磺?；鞍?質(zhì)亞型；和0%至15%，例如，0%至5%的乙酰化蛋白質(zhì)亞型。
[0021] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了方法，其包括：將包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整 形式和任選地minus-Ala(例如，des-Ala)、甲二磺?；鸵阴；问降囊环N或多種的負(fù)載 制劑用于陽(yáng)離子交換表面；用不洗脫嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗滌緩沖液洗滌陽(yáng)離子交換表 面，和用洗脫緩沖液洗脫陽(yáng)離子交換表面以提供包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式的CEX 洗脫物。例如嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式包括與實(shí)施例1中的氨基酸序列具有至少90、 95、98或100%的同一性的氨基酸序列，例如P03、P04或P05。例如，蛋白質(zhì)是P05。核酸序 列可包括實(shí)施例1中所列的核酸序列，例如，編碼P05的序列。完整蛋白質(zhì)例如P05蛋白的 Des-Ala形式、甲二磺?；鸵阴；问绞堑鞍字苿├鏟05蛋白質(zhì)制劑中的雜質(zhì)，其通過(guò) 本發(fā)明中表征的純化方法來(lái)除去。完整蛋白質(zhì)的des-Ala形式是蛋白質(zhì)的完整形式，其中 N末端Ala已通過(guò)蛋白水解除去；完整蛋白質(zhì)的甲二磺?；问绞蔷哂懈郊拥腘末端甲硫 氨酸的完整蛋白質(zhì)；嵌合細(xì)胞因子蛋白的乙?；问绞且阴；暾鞍踪|(zhì)或完整蛋白質(zhì)的 乙?；锥酋；问?。
[0022] 例如，負(fù)載制劑可具有小于5、4、3. 5或3. 3mS/cm的電導(dǎo)率。負(fù)載制劑可不含去垢 齊U。負(fù)載制劑可具有小于6. 0、5. 8、5. 6或5. 4的pH，例如約5. 3。在一些實(shí)施方案中，從先 前未被層析的裂解物制備負(fù)載制劑。方法可包括例如使用弱酸，例如使用醋酸（例如，通過(guò) 添加少于800、600、400、300或優(yōu)選約200mM醋酸的溶液）將裂解物調(diào)整至低于6. 0的pH 以制備負(fù)載制劑?？梢岳缤ㄟ^(guò)離心和/或過(guò)濾澄清負(fù)載制劑。負(fù)載制劑可具有低于5、4、 3或2g/L的蛋白質(zhì)濃度。在一些實(shí)施方案中，作為總的嵌合細(xì)胞因子蛋白的百分比，負(fù)載 制劑包含少于30%、25%或20%的嵌合細(xì)胞因子蛋白的des-Ala形式，少于30%、25%或20% 的嵌合細(xì)胞因子蛋白乙?；问胶蜕儆?0%、25%或20%的嵌合細(xì)胞因子蛋白甲二磺?；?形式。在一些實(shí)施方案中，作為總的嵌合細(xì)胞因子蛋白的百分比，負(fù)載制劑包含5%至20% 或7%至17%的des-Ala形式；1%至10%或2%至7%的甲二磺?；问剑缓?%至20%或8% 至15%的乙?；问健ｊ?yáng)離子交換表面可以是例如強(qiáng)陽(yáng)離子交換（CEX)表面。在一些實(shí) 施方案中，表面包括磺丙基官能團(tuán)。表面可以是可被填充進(jìn)柱子中的基質(zhì)（CEX基質(zhì)）。例 如，CEX基質(zhì)包括交聯(lián)的聚（苯乙烯-二乙烯苯）珠粒。示例性CEX基質(zhì)包括P〇r〇S?XS、 CM-Sephar〇se、CMC-纖維素、SP-Sephadex?:和 SP Sepharose? Fast flow。
[0023] 可以以例如低于40mg/ml的CEX基質(zhì)的濃度加載嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，基質(zhì) 具有 50-200、80-140 或 88-120 微摩爾 Na+/ml 的離子容量（ionic capacity)。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，CEX基質(zhì)存在于0. 5 - 20ml的柱子中或10mL至1000L的柱子 中，例如大于 10mL、15mL、20mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、6L、10L、50L、100L、250L、500L、 600L、700L或800L的柱子中。例如，用大于1、5或10個(gè)柱體積洗滌柱子?？捎眯∮?、4、 3. 5、3. 3mS/cm的電導(dǎo)率的緩沖液洗滌柱子。例如，洗滌緩沖液具有低于40、30或25mMNaCl ; 和/或洗滌緩沖液具有至少5、10或15mM NaCl或相當(dāng)濃度的其它鹽。洗滌緩沖液可包含 醋酸。在一些實(shí)施方案中，洗滌緩沖液具有低于6. 5、6. 0、5. 9、5. 6或5. 5,例如，5 - 5. 5,例 如，約5. 3或5至5. 5,例如，約5. 9的pH。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，洗脫不包括梯度。例如，洗脫包括分步洗脫。分步洗脫可包括 使用具有高于結(jié)合緩沖液和每一種先前的洗脫緩沖液的pH的洗脫緩沖液。分步洗脫是從 例如低于5. 7的pH至高于5. 7的pH，例如，從低于5. 6的pH至高于5. 85的pH，例如從低 于5. 5的pH至高于5. 9的pH,例如，從約5. 3的pH至至少6. 0的pH或從約5. 3的pH至至 少6. 8的pH。分步洗脫可包括應(yīng)用具有增加的鹽濃度和/或增加的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液。 例如，鹽濃度從低于或等于30mM NaCl的濃度增加至大于或等40mM NaCl或相當(dāng)濃度的其它 鹽的濃度。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的主要鹽是NaCl。
[0026] 洗脫緩沖液可具有大于3.5、4、5、5.5、6mS/cm例如5. 5 - 7，例如6-7，例如約 6. 6mS/cm的電導(dǎo)率。洗脫緩沖液可包括具有在至少pH5. 9-6. 1的范圍內(nèi)的緩沖能力的緩沖 液。例如，洗脫緩沖液包括M0PS，例如，至少50mMM0PS，例如100-250mMM0PS。洗脫緩沖液 還可包括至少20mM MOPS、pH高至約8. 0。
[0027] 嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式和des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；问娇?以例如以不同的動(dòng)力學(xué)和/或不同的鹽濃度或pH從陽(yáng)離子交換表面差異洗脫。例如，例如 在分步或梯度洗脫過(guò)程中，des-Ala形式在完整形式之后洗脫，乙?；问皆诩锥酋；?式和完整形式之前洗脫，甲二磺?；问皆谕暾问街跋疵摗?br> [0028] 方法可用于例如通過(guò)使一種或多種des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；问?的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%來(lái)相對(duì)于des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；?式的一種或多種富集完整形式。例如，洗脫物中的des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；?形式的一種或多種少于20%、15%、12%、10%或8%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0029] 方法可用于通過(guò)使des-Ala形式的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少 10%、20%、40%60%或70%或更多來(lái)相對(duì)于des-Ala形式富集完整形式。例如，洗脫物中的 des-Ala形式少于20%、15%、12%、10%或8%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，洗脫物中的 des-Ala形式為2%至20%、3%至10%或4%至7%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0030] 方法可用于通過(guò)使乙?；问降陌俜直葴p少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少70%、 80%、90%或99%來(lái)相對(duì)于乙?；问礁患暾问?。例如，洗脫物中的乙酰化形式少于10%、 5%、3%、1%或0. 5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，洗脫物中的乙?；问綖?. 01%至5%、 1%至3%或2%至2. 5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0031] 方法還可用于通過(guò)使甲二磺酰化形式的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%或至 少10%、20%、40%、70%或80%來(lái)相對(duì)于甲二磺?；问礁患暾问?。例如，洗脫物中的甲 二磺?；问缴儆?〇%、8%、5%、3%或2%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，洗脫物中的甲二 磺?；问綖?%至1〇%、2%至8%或3%至5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白的回收率大于20%、30%、40%、50%、60%、70% 或80%，例如，60%至80%。在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白在CEX洗脫物中的純度為 至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。例如，在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白在CEX 洗脫物中的純度為至少70%至99%、80%至98%、90%至95%。通常地，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP) 濃度相對(duì)于負(fù)載制劑減小。宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)是指與受體結(jié)合劑不同的制劑中的蛋白質(zhì)，例 如是從其制備受體結(jié)合劑的宿主細(xì)胞的內(nèi)源蛋白質(zhì)，通常地大腸桿菌蛋白質(zhì)。
[0033] 例如，CEX洗脫物具有低于1000ppm、800ppm、600ppm或500ppm的HCP。在一些實(shí)施 方案中，HCP濃度降低至少70%、80%、90%或99%。例如，HCP濃度降低80%至99. 99%或90% 至 99. 5%。
[0034] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征CEX洗脫物，其包含例如完整的嵌合細(xì)胞因子蛋白和任 選地蛋白質(zhì)的des-Ala形式、甲二磺?；问胶鸵阴；问?。洗脫物可包含80%至99%的 完整蛋白質(zhì)（例如，80%、85%、90%或95%或更多的完整蛋白質(zhì)）；3%至20%的des-Ala種類 (例如,5%、10%、15% 或 20%des-Ala 種類）；0· 1% 至 15% 的甲二磺?；N類（0· 2%、0· 5%、1%、 5%或10%的甲二磺?；N類）；和0%至5%的乙?；N類（0. 001%、0. 01%、0. 1%、1%或3%的 乙酰化種類）。
[0035] 在一些方面，將CEX洗脫物在例如其中嵌合細(xì)胞因子蛋白大體上不結(jié)合陰離子交 換表面的條件下用于陰離子交換表面。在其它實(shí)施方案中，使用結(jié)合-和-洗脫陰離子交 換層析處理CEX洗脫物。
[0036] 方法可用于純化過(guò)程，例如，其包括總共不超過(guò)3或2個(gè)額外的柱層析步驟。在一 些實(shí)施方案中，使用單個(gè)柱層析步驟。例如，在層析步驟中不進(jìn)行梯度洗脫。
[0037] 另一個(gè)方法包括將包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的制劑用于陰離子交換表面；和從陰離 子交換表面收集流通液（ΑΕΧ流通液）?？蓪⒎椒ㄅc例如陽(yáng)離子交換層析組合使用，例如， 如上文和本文中描述的。例如，ΑΕΧ流通液包含為用于陰離子交換表面的制劑的例如1/2、 1/10或1/50倍的HCP。內(nèi)毒素和核酸例如DNA相對(duì)于用于陰離子交換表面的制劑可得以 減少。在一些實(shí)施方案中，使用的制劑包含低于5000ppm的HCP，AEX流通液包含低于1000、 500、400或300ppm的HCP。在一些實(shí)施方案中，AEX流通液中的HCP進(jìn)一步減少50%、60%、 70%、80%或90%。在一些實(shí)施方案中，AEX流通液中的HCP減少50%至90%、60%至80%或65% 至 75%。
[0038] 例如，陰離子交換表面是強(qiáng)季銨陰離子交換器。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換表 面包括Capto? Q陰離子交換樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換表面包括Poros? HQ陰 離子交換樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換表面具有50-400或100-300微摩爾C1-/ ml的離子容量。陰離子交換柱的體積可在40mL至20L的范圍內(nèi)。例如，陰離子交換柱可具 有約 50mL、500mL、1L、5L、10L、20L、50L、80L、100L、120L、150L、300L、500L、600L 或 700L 的體 積。
[0039] 陰離子交換表面可以是膜。
[0040] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了 AEX流通液，其包含完整的嵌合細(xì)胞因子蛋白和任選 地蛋白質(zhì)的des-Ala形式、甲二磺?；问胶鸵阴；问?。流通液可包括例如80%至99%的 完整蛋白質(zhì)（例如，80%、85%、90%或95%或更多的完整蛋白質(zhì)）；3%至20%的des-Ala種類 (例如，5%、10%、15% 或 20% 的 des-Ala 種類）；0· 1% 至 15% 的甲二磺酰化種類（0· 2%、0· 5%、 1%、5%或10%的甲二磺?；N類）；和0%至5%的乙?；N類（0. 001%、0. 01%、0. 1%、1%或3% 的乙?；N類）。
[0041] 另一個(gè)方法包括在例如其中嵌合細(xì)胞因子蛋白結(jié)合CHA柱的條件下將包含嵌合 細(xì)胞因子蛋白的制劑用于陶瓷羥基磷灰石柱（CHA);和在例如其中嵌合細(xì)胞因子蛋白從 CHA柱釋放的條件下洗脫CHA柱，和收集包含純化的嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗脫物。例如，從 CHA柱的洗脫物收集的純化的嵌合細(xì)胞因子蛋白包含更少的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)；和/或減少 量的嵌合細(xì)胞因子蛋白的形式例如des-Ala、乙?；图锥酋；问降男问?。在一些實(shí) 施方案中，從CHA柱的洗脫物收集的制劑包含低于500ppm、200ppm、lOOppm或低于50ppm的 HCP。在一些實(shí)施方案中，CHA柱的洗脫物中的HCP進(jìn)一步減少50%、60%、70%、80%、90%、92%、 96%或98%。在一些實(shí)施方案中，CHA柱的洗脫物中的HPC減少50%至99%、60%至98%或80% 至 95%。
[0042] 嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式和des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；问娇?以以不同的動(dòng)力學(xué)和/或以不同的鹽濃度或pH從CHA交換表面差異洗脫。例如，在例如分 步或梯度洗脫過(guò)程中，des-Ala形式在完整形式之前洗脫，甲二磺酰化形式在Des-Ala形式 之前洗脫。
[0043] 方法可用于例如通過(guò)使一種或多種des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；问?的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%來(lái)相對(duì)于des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；?式的一種或多種富集完整形式。例如，洗脫物中的des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；?形式的一種或多種少于20%、15%、12%、10%或8%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0044] 方法可用于通過(guò)使des-Ala形式的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少 10%、20%、40%60%或70%或更多來(lái)相對(duì)于des-Ala形式富集完整形式。例如，洗脫物中的 des-Ala形式是1%至10%、2%至8%或3%至6%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。洗脫物中的 des-Ala形式可少于20%、15%、12%、10%或8%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0045] 方法可用于通過(guò)使乙酰化形式的百分比減少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少70%、 80%、90%或99%來(lái)相對(duì)于乙?；问礁患暾问?。例如，CHA洗脫物中的乙?；问缴儆?10%、5%、3%、1%或0.5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，洗脫物中的乙?；问綖?.01%至 5%、1%至3%或2%至2. 5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0046] 方法還可用于通過(guò)使甲二磺?；问降陌俜直葴p少至少1%、3%、5%、7%或8%或至 少10%、20%、40%、70%、80%或90%來(lái)相對(duì)于甲二磺酰化形式富集完整形式。例如，洗脫物中 的甲二磺?；问缴儆?〇%、5%、2%、1%、0. 5%或0. 05%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。例如，洗 脫物中的甲二磺酰化形式為〇. 05%至10%、1%至8%或3%至5%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白的回收率大于50%、60%、80%或90%，例如， 80%至99%。在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白在CHA洗脫物中的純度為至少50%、60%、 70%、80%、85%、90%或95%。例如，在一些實(shí)施方案中，嵌合細(xì)胞因子蛋白在CHA洗脫物中的 純度為至少70%至99%、80%至98%、90%至95%。通常地，HCP濃度相對(duì)于負(fù)載制劑減小。
[0048] 例如，CHA洗脫物具有少于1000ppm、800ppm、600ppm或500ppm的HCP。在一些實(shí)施 方案中，HCP濃度減少至少70%、80%、90%或99%。例如，HCP濃度減少80%至99. 99%或90% 至 99. 5%。
[0049] CHA柱的體積可以為例如150mL至500L。例如，陰離子交換柱可具有約200mL、 220mL、500mL、1L、5L、10L、30L、100L、500L、600L、700L 或 800L 的體積。
[0050] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征CHA洗脫物，其包含例如完整嵌合細(xì)胞因子蛋白和任選 地蛋白質(zhì)的des-Ala形式、甲二磺?；问胶鸵阴；问?。洗脫物可包括例如80%至99% 的完整蛋白質(zhì)（例如，80%、85%、90%或95%或更多的完整蛋白質(zhì)）；0· 1%至15%的des-Ala 種類（例如，2%、5%或10%的des-Ala種類）；0· 1%至10%的甲二磺酰化種類（0· 01%、0· 5%、 1%或5%的甲二磺?；N類）；和0%至5%的乙?；N類（0. 001%、0. 01%、0. 1%、1%或3%的 乙?；N類）。
[0051] 本文中描述的純化方法還可包括評(píng)價(jià)材料以檢測(cè)des-Ala形式、乙?；问胶? 或甲二磺酰化形式。例如，評(píng)價(jià)包括分析性弱陽(yáng)離子交換層析。
[0052] 純化方法還可包括進(jìn)行額外的層析步驟、陶瓷羥基磷灰石步驟和/或超濾/滲濾。
[0053] 嵌合細(xì)胞因子蛋白的總回收率可以為30%、40%、50%、60%、70%或80%的起始蛋白質(zhì) 制劑。嵌合細(xì)胞因子蛋白的回收率可以為30%至90%、40%至80%或50%至70%的總起始蛋 白質(zhì)。
[0054] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的純化制劑。例如，嵌 合細(xì)胞因子蛋白是實(shí)施例1中所列的蛋白質(zhì)，例如P03、P04或P05或與這樣的蛋白質(zhì)具有 至少90%的同一性的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)是P05。完整形式對(duì)des-Ala形式的比率為至 少1 :1、2:1、3:1、5:1、8:1或10 :1，完整形式對(duì)乙?；问降谋嚷蕿橹辽?:1、2:1、3:1、5:1、 8 :1或10:1，以及完整形式對(duì)甲二磺酰化形式的比率為至少1:1、2:1、3 :1、5:1、8:1或10:1。
[0055] 嵌合細(xì)胞因子蛋白可具有大于90%、92%、94%或95%的純度。例如，純化制劑包含 至少50%、60%、70%、80%、90%的完整形式作為總的蛋白質(zhì)的百分比。例如，des-Ala形式少 于50%、40%、30%、20%、15%或10%的制劑中的蛋白質(zhì)，和/或少于50%、40%、30%、20%、15%或 10%的總的嵌合細(xì)胞因子蛋白。完整、des-Ala、乙酰化和甲二磺?；问降南鄬?duì)量可通過(guò) 分析法例如分析性弱陽(yáng)離子交換層析來(lái)測(cè)定。制劑可包括少于10%的含量的嵌合細(xì)胞因子 蛋白的其它形式（即，除des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；问降钠渌问剑?。
[0056] 純化制劑中的嵌合細(xì)胞因子蛋白的濃度可以為至少0· 001mg/ml、0. lmg/ml、lmg/ ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/mL 或 50mg/ml。例如，蛋白質(zhì)為 10-100mg/ml、lmg/mL - 20mg/mL、 1 - 50mg/ml、10 - 50mg/ml 或 25 - 75mg/ml 或 40 - 105mg/ml〇
[0057] 制劑可以是含水制劑并且還可包括緩沖劑和藥學(xué)上可接受的鹽。制劑可以是無(wú)菌 含水制劑（例如，包括注射用水）。制劑可具有不同的體積，并且可包含至少lmg、100mg、lg、 10g、50g、100g或lkg的完整蛋白質(zhì)。
[0058] 可冷凍干燥制劑。制劑，例如如果含水，可進(jìn)行冷凍或可在4°C _8°C或室溫保存。 在一些實(shí)施方案中，制劑（例如，液體制劑或凍干制劑）在室溫（例如，21°C至25°C，例如， 23°C )穩(wěn)定至少兩周、至少1個(gè)月、至少3個(gè)月、至少6個(gè)月、至少1年或更長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，制劑穩(wěn)定冷凍（例如，在_2〇°C或_70°C或_80°C )至少6個(gè)月、至少1年、至少2年 或更長(zhǎng)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，制劑包括少于20%、15%、10%或5%的des-Ala形式、乙酰 化形式和甲二磺酰化形式。
[0059] 制劑可大體上不含核酸和內(nèi)毒素。例如，其具有低于1000ppm、500ppm、400ppm、 300ppm、200ppm、100ppm 或 50ppm 的 HCP 水平。
[0060] 在一些實(shí)施方案中，制劑包括本文中描述的緩沖條件。在一些實(shí)施方案中，制劑具 有5-6、6-7或7-8,例如，5. 5-7. 5的pH。在一些實(shí)施方案中，制劑具有小于10mS/cm、8mS/ cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm或4mS/cm的電導(dǎo)率。制劑可包括MOPS或其它緩沖劑，例如Tris 或醋酸鹽。制劑可不含去垢劑。制劑可包含磷酸鹽或可不含磷酸鹽。制劑可包含螯合劑。
[0061] 制劑可包含鹽、張度劑和去垢劑的一種或多種。鹽可以是例如檸檬酸鈉、醋酸鈉、 氯化鈉等。示例性張度劑包括山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖和甘油。示例性去垢劑包括例 如泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇的其它脂肪酸酯以及聚氧乙 烯醚。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包含lmg/mL至30mg/mL嵌合細(xì)胞因子蛋白、5mM至15mM 檸檬酸鈉、2%至8%山梨醇、0. 05%至0. 15%泊洛沙姆188, pH5. 5-6. 5。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，制劑包含lmg/mL至20mg/mL嵌合細(xì)胞因子蛋白、10mM朽1檬酸鈉、5%山梨醇、0. 1%泊洛沙 姆 188, ρΗ6· 0。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含類固醇。類固醇可以是例如地塞米松、膚輕松 (fluocinolone)、氟輕松（fluocinolone acetonide)、曲安西龍、曲安奈德或其鹽或混合 物。
[0064] 在一個(gè)方面，制劑適合用于施用至眼中，例如，局部地施用至眼中。
[0065] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了評(píng)估制劑的方法，所述制劑包含本文中描述的細(xì)胞因 子蛋白，例如包含與SEQ ID N0:21的氨基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的蛋 白，所述方法包括獲得（例如直接獲得）如下水平的一個(gè)或多個(gè)或全部水平的測(cè)定：(a)所 述蛋白質(zhì)的des-Ala形式的水平；(b)所述蛋白質(zhì)的乙?；问剑ㄆ渲幸阴；问娇梢允?全長(zhǎng)序列例如嵌合細(xì)胞因子蛋白或des-Ala形式的全長(zhǎng)序列的乙酰化形式）的水平；或 (c)所述蛋白質(zhì)的甲二磺?；问剑ㄆ渲屑锥酋；问娇梢允侨L(zhǎng)序列例如嵌合細(xì)胞因 子蛋白的全長(zhǎng)序列的甲二磺酰化形式）的水平。方法還可包括將a、b和c的全部的一項(xiàng)或 多項(xiàng)的測(cè)定水平與參照值相比較，其中每一項(xiàng)可具有其自己的參照值。例如，方法可包括如 下方面的一個(gè)或多個(gè)或全部方面：可將a的測(cè)定水平與des-Ala形式的水平的參照值相比 較，可將b的測(cè)定水平與乙?；问降乃降膮⒄罩迪啾容^，可將c的測(cè)定水平與甲二磺酰 化形式的水平的參照值相比較。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，從例如所述蛋白質(zhì)的商購(gòu)可得樣品；另一個(gè)批次，例如所述蛋 白質(zhì)的更早批次；由管理機(jī)構(gòu)推薦、公布或要求的數(shù)值組；發(fā)表的說(shuō)明書(shū)或標(biāo)準(zhǔn)；由藥典當(dāng) 局例如美國(guó)藥典（U.S. PHARMACOPEIA)推薦、公布或要求的數(shù)值組測(cè)定參照值。
[0067] 測(cè)定可包括例如層析分析例如弱陽(yáng)離子交換層析分析。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括確定制劑是否具有預(yù)先選擇的與參照照值的關(guān)系， 例如其是否大于、等于或小于參照值。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)測(cè)定的反應(yīng)，處理制劑，其中處理包括選擇、接受、加工成藥 品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，改變對(duì)施用的反應(yīng)、用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法的參數(shù)。在實(shí)施方 案中，在已完成給定的改變后重復(fù)測(cè)定。
[0071] 如果乙?；?、甲二磺?；蛲暾问降囊环N或多種的水平按例如重量/重量計(jì)低 于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%，則處理制劑，其中處理包括選擇、接受、加工成藥品、 運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0072] 制劑可以例如通過(guò)將前體制劑經(jīng)歷純化步驟來(lái)制備。制劑還可通過(guò)將前體制劑與 層析基質(zhì)例如陽(yáng)離交換、陰離子交換或或羥基磷灰石基質(zhì)接觸來(lái)制備。制劑還可通過(guò)將前 體制劑與層析基質(zhì)例如陽(yáng)離子交換、陰離子交換或羥基磷灰石基質(zhì)的一種或多種或全部接 觸來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑可通過(guò)將前體制劑與以下列順序與陽(yáng)離子交換、陰離子 交換和羥基磷灰石基質(zhì)接觸來(lái)制備。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，制劑是純化過(guò)程中的中間物，在該情況下，制劑可以是例如來(lái) 自層析過(guò)程的濃縮或稀釋的洗脫液。
[0074] 制劑可包括例如來(lái)自陽(yáng)離子交換柱的洗脫液，例如來(lái)自陽(yáng)離子交換柱的濃縮或稀 釋的洗脫液或制劑可包括來(lái)自陰離子交換柱的洗脫液。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括將前體制劑經(jīng)歷純化步驟。例如，可將前體制劑與 層析基質(zhì)例如陽(yáng)離子交換、陰離子交換或羥基磷灰石基質(zhì)的一種或多種或全部接觸。與前 體制劑的接觸可以是與陽(yáng)離子交換基質(zhì)，和隨后與陰離子交換基質(zhì)，和隨后與羥基磷灰石 基質(zhì)的接觸。
[0076] 處理可包括例如配制用于給眼內(nèi)施用的制劑。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將評(píng)價(jià)儲(chǔ)存在例如計(jì)算機(jī)可讀記錄中。
[0078] 本發(fā)明的一個(gè)方面表征了通過(guò)例如下列步驟評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)制劑的方法：提供來(lái)自在 羥基磷灰石柱上純化的蛋白質(zhì)制劑的分離的級(jí)分，其中蛋白質(zhì)具有與SEQ ID N0:21的序列 具有至少90%的同一性的氨基酸序列，和利用弱陽(yáng)離子交換（wCEX)層析分析級(jí)分以測(cè)定蛋 白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问交蚣锥酋；问降囊环N或多種的水平。如果蛋白質(zhì)的 des-Ala形式、酰化形式或甲二磺?；问降囊环N或多種以低于10%的水平存在，則例如通 過(guò)選擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑來(lái)處理制劑。
[0079] 在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了例如通過(guò)提供蛋白質(zhì)的制劑的分離的級(jí)分，使用根據(jù) 權(quán)利要求93所述的方法進(jìn)行分析，來(lái)分析制備包含與SEQ ID N0:21的序列具有至少90%的 同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的制劑的過(guò)程的方法，如果蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙酰化 形式和甲二磺?；问降囊环N或多種以少于10%的百分比存在，則至少部分基于分析維持 所述過(guò)程。
[0080] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了例如通過(guò)提供制劑中蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙酰 化形式和甲二磺?；问降囊环N或多種的水平的wCEX測(cè)定，來(lái)處理包含與SEQ ID N0:21的 序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)制劑的方法，如果蛋白質(zhì)的des-Ala形 式、乙?；问胶图锥酋；问降囊环N或多種以少于10%的百分比存在，則處理所述制 齊U，其中處理包括選擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多 項(xiàng)。在一個(gè)
[0081] 處理可包括例如配制用于眼內(nèi)施用的制劑。
[0082] 在一個(gè)實(shí)施方案中，處理包括測(cè)定蛋白質(zhì)的活性。
[0083] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了分離的蛋白質(zhì)，包括包含來(lái)自至少兩個(gè)親代細(xì) 胞因子結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基（例如受體結(jié)合特性、表面特性、β鏈）和來(lái)自少兩個(gè)親代細(xì) 胞因子結(jié)構(gòu)域的環(huán)的細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域結(jié)合IL-1RI并且包括來(lái)自不同親代細(xì)胞 因子結(jié)構(gòu)域，例如來(lái)自受體激動(dòng)劑和受體拮抗劑（例如IL-Ιβ和IL-IRa或IL-la和 IL-IRa)，來(lái)自IL-1 β的IL-1 a或來(lái)自IL-IRa、IL-1 a和IL-IRa的全部三種的受體結(jié)合 特性。受體結(jié)合特性可對(duì)應(yīng)于位點(diǎn)A和B中的殘基、區(qū)段或區(qū)域。關(guān)于這樣的對(duì)應(yīng)于位點(diǎn) △和8的殘基、區(qū)段和區(qū)域，在11^-1(11^-10、11^-1〇和11^-11^)的背景中，參見(jiàn)下文中進(jìn)一 步的定義。
[0085] 關(guān)于位點(diǎn)A，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可具有：(a) (i)與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域中的對(duì) 應(yīng)殘基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的位點(diǎn)A殘基； (a) (ii)與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、 92%、95%、98%或100%的同一性的延伸的位點(diǎn)A殘基；(a) (iii)與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域 中的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位點(diǎn)A區(qū)段A1和A2 ; 和/或（a) (iv)與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、 95%或100%的同一性的位點(diǎn)A區(qū)域。
[0086] 關(guān)于位點(diǎn)B，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可具有：(b) (i)與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域中的對(duì) 應(yīng)殘基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的位點(diǎn)B殘基； (b) (ii)與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、 92%、95%、98%或100%的同一性的延伸的位點(diǎn)B殘基；(b) (iii)與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu) 域的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位點(diǎn)B區(qū)段Bl、B2 和B3 ;和/或（b) (iv)與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有至少80%、85%、88%、90%、 92%、95%或100%的同一性的位點(diǎn)B區(qū)域。
[0087] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括特性：(a)⑴和b(i)、（a) (ii)和b(ii)、 (a) (iii)和（b) (iii)或（a) (iv)和（b) (iv)，例如，其中每一個(gè)特性進(jìn)一步通過(guò)80、85、88、 90、92、95或100%的同一性來(lái)定義。例如，第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可以是IL-1 β，并且第 二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可以是IL-IRa。例如，第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可以是IL-1 α，并 且第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可以是IL-IRa。
[0088] 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域還可在結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)位置上包括減弱與細(xì)胞因子第二 受體（例如，IL-lRAcP)的相互作用的來(lái)自第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的氨基酸。例如，第 二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域是IL-IRa。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)來(lái) 自IL-IRa的位點(diǎn)C和/或D區(qū)段（例如，(：1、01、02、03、04和/或05)或與這樣的區(qū)段具 有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的序列。例如，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括（1)與 IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位點(diǎn)C殘 基；（ii)與IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一 性的位點(diǎn)D殘基；（iii)與IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98 或100%的同一性的C1區(qū)段；或（iv)與在至少3、4或5個(gè)殘基上與IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基 相同的D2區(qū)段。細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可包括特性（i)和（ii)或（ii)和（iii)，例如，其中每一 個(gè)特性進(jìn)一步通過(guò)80、85、88、90、92、95或100%的同一性來(lái)定義，或（^丨）和（"）
[0089] 結(jié)構(gòu)域可包括來(lái)自至少兩個(gè)不同的人IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，其中區(qū) 域選自A區(qū)域（具有A1和A2區(qū)段）、B區(qū)域（具有Bl、B2和B3區(qū)段）、C區(qū)域和D區(qū)域 (具有01、02、03、04和05區(qū)段）。
[0090] 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可包括來(lái)自不同細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)A區(qū)域和位點(diǎn)B區(qū)域。位 點(diǎn)A區(qū)域可來(lái)自天然存在的受體激動(dòng)劑或拮抗劑；位點(diǎn)B區(qū)域可來(lái)自天然存在的受體激動(dòng) 齊U。其可包括來(lái)自天然存在的受體拮抗劑的位點(diǎn)C區(qū)域和/或來(lái)自天然存在的受體拮抗劑 的位點(diǎn)D區(qū)域。
[0091] 例如，結(jié)構(gòu)域可以是嵌合結(jié)構(gòu)域，其具有在長(zhǎng)度上為至少5、6、10、15、20或25個(gè)氨 基酸并且與來(lái)自至少兩個(gè)不同親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域例如第一和第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域 的對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的區(qū)段。親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域 可以是IL-1RI結(jié)合細(xì)胞因子，例如IL-li3、IL_la和IL-IRa。在一些實(shí)施方案中，不存在 于來(lái)自第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的區(qū)段中的氨基酸來(lái)自兩個(gè)或更多個(gè)其它親代細(xì)胞因子 結(jié)構(gòu)域。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括至少兩個(gè)在長(zhǎng)度上具有至少5、6、10、15、 20或25個(gè)氨基酸的區(qū)段，所述區(qū)段與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至少80、 85、88、90、92、95或100%的同一性，并且不存在于這樣的區(qū)段上的氨基酸與第二親代細(xì)胞 因子結(jié)構(gòu)域中的對(duì)應(yīng)殘基具有顯著（例如，至少50、60、70、80、85、88、90、92、95或100%)同 一性。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包含（i)至少兩個(gè)在長(zhǎng)度上具有至少5、6、 10、15、20或25個(gè)氨基酸的區(qū)段，所述區(qū)段與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至 少80、85、88、90、92、95或100%的同一性，和（ii)至少1、2或3個(gè)例如在長(zhǎng)度上具有至少 5、6、7、8、10或15個(gè)氨基酸的區(qū)段，所述區(qū)段與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域相同。
[0094] 例如，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可包括具有20-50、25-50、30-45或30-40個(gè)氨基酸（例如， 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40)的第一區(qū)段，和具有 20-45、20-40、25-40 或 25-35個(gè)氨基酸（例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35)的第二區(qū)段，每一個(gè)區(qū)段 與第一親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域（例如，IL-IRa)相同（或至少80、85、88、90、92、95或98%的 同一性），和與第二親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域（例如，IL-Ιβ或IL-la)相同（或至少80、85、 88、90、92、95或98%的同一性）的第三區(qū)段。例如，第三區(qū)段在長(zhǎng)度上可以為55-90、60-90、 60-85或70-85個(gè)氨基酸，例如，在長(zhǎng)度上為75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85個(gè)氨基 酸。
[0095] 在一些實(shí)施方案中：第一區(qū)段可以是與WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9,在本文中也稱為A1區(qū)段，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:3的殘基16-40和根據(jù)IL-Ιβ編號(hào)的殘 基11-36)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的區(qū)段。第二區(qū)段可以是與 SEQ ID NO: 3 (IL-lRa)的殘基 120-140 或 120-141 (對(duì)應(yīng)于殘基 121-139 或 121-140 (根據(jù) IL-Ιβ編號(hào)））具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的區(qū)段。第三區(qū)段可以 與來(lái)自 IL-1 β (SEQ ID NO: 1)的殘基 45-100 或 42-120 具有至少 80、85、88、90、92、95、98 或 100%的同一性。
[0096] 在一些情況下，第一區(qū)段可以是與SEQ ID N0:3的殘基14-45(對(duì)應(yīng)于根據(jù)IL-1 β 編號(hào)的殘基9-41)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的區(qū)段。第二區(qū)段可 以是與SEQ ID Ν0:3的殘基120-145(對(duì)應(yīng)于根據(jù)IL-Ιβ編號(hào)的殘基121-145)或SEQ ID N0:3的殘基120-147(對(duì)應(yīng)于根據(jù)IL-Ιβ編號(hào)的殘基121-147)具有至少80、85、88、90、 92、95、98或100%的同一性的區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，至少殘基11-41和120-147(根據(jù) IL-1 β編號(hào)）總體上與IL-lRa中對(duì)應(yīng)殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同 一性。
[0097] 在一些實(shí)施方案中，第一 IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的區(qū)段之一的末端位于SEQ ID NO: 1的氨基酸41的5、4、3、2或1個(gè)氨基酸內(nèi)，并且第一 IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的區(qū)段 之一的末端位于SEQ ID NO: 1的氨基酸121的5、4、3、2或1個(gè)氨基酸內(nèi)。
[0098] 在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域包括在SEQ ID N0:1的氨基酸42的5、4、3、2或1個(gè)氨 基酸內(nèi)的位置上具有N末端并且在SEQ ID NO: 1的氨基酸120的5、4、3、2或1個(gè)氨基酸內(nèi) 具有C末端的區(qū)段、和/或在SEQ IDN0 :1的氨基酸121的5、4、3、2或1個(gè)氨基酸內(nèi)的位置 上具有N末端并且在SEQ ID N0 :1的氨基酸145的5、4、3、2或1個(gè)氨基酸內(nèi)具有C末端的 區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)于殘基11-41和120-147(根據(jù)IL-Ιβ編號(hào)）的 位置上的殘基總體上與11-11^中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的 同一性。結(jié)構(gòu)域還可基于IL-1細(xì)胞因子家族成員的例如在與前述位置類似的位置上的序 列。
[0099] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括下列序列的1、2、3或更多個(gè)：
[0100] WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO ：9) ；NLEEK(SEQ ID NO ：10)；
[0101] RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO ：11) ；AMEADQP(SEQ ID NO ：12)；
[0102] FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO :13);和 / 或與前述序列具有至少 80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包 括下列序列的1、2、3或更多個(gè)：
[0103] VQGEESNDKI(SEQ ID NO :14) ;KKKMEKRF(SEQ ID NO :15);和
[0104] FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN
[0105] YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO : 16);
[0106] 和/或與前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的序列。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，β1β2、β2β3、β8β9和β10β 11環(huán)的一個(gè)或多個(gè)或全部 與來(lái)自11^-1拮抗劑例如11^-11^的對(duì)應(yīng)的環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一 性。在一些實(shí)施方案中，040 5、050 6、0607和0 70 8環(huán)的一個(gè)或多個(gè)或全部與來(lái)自 與人親代細(xì)胞因子不同的IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)環(huán)具至少80、85、88、90、92、95 或100%的同一性，所述對(duì)應(yīng)環(huán)與β1β2、β2β3、β8β9和βΙΟβΙΙ環(huán)最相似。例如， 34@5、353 6、3637和3738環(huán)的一個(gè)或多個(gè)或全部與來(lái)自11^-1激動(dòng)劑例如比-13 的這樣的環(huán)具有至少8〇、85、88、9〇、92、95或1〇〇%的同一性。在一些實(shí)施方案中，0 113 12 環(huán)與來(lái)自11^-1拮抗劑例如11^-11^的對(duì)應(yīng)環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一 性。
[0108] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包含與IL-IRa的β鏈β2、β3、β 10和β 11 的1、2、3個(gè)或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的序列。在一些實(shí)施方 案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括與IL-Ιβ的β4、β6、β7和β8或IL-Ιβ的β4、β5、β6、 β 7和β 8的1、2、3個(gè)或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的序列。
[0109] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域不包含與SEQ ID Ν0:3的氨基酸I46-G59、 A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110 或 I46-G118 具有超過(guò) 80、85、 90、95或100%的同一性的區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域不包含與SEQ ID NO: 1 的氨基酸 N7-V41、R11-M36、N102-D145 或 Y121-D145 具有超過(guò) 80、85、90、95 或 100% 的同一 性的區(qū)段。
[0110] 一般而言、細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域不是天然存在的。其與人IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域相 異。例如，其與 IL-lRa(SEQ ID N0:3)、IL-Ιβ (SEQ ID N0:1)和/或 IL-Ια (SEQ ID N0:2) 具有少于98、95、90、85、80、75、70、65、60或55%的同一性。細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域還可與這樣的 細(xì)胞因子具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%的同一性。例如，嵌合結(jié)構(gòu)域可與IL-IRa、 IL-1 β和IL-1 α具有30-95%、40-90%或45-85%的同一性。例如，嵌合結(jié)構(gòu)域可與IL-1 β 具有40-90%的同一性和與IL-IRa具有35-85%的同一性；與IL-1 β具有40-80%的同一 性和與IL-IRa具有45-80%的同一性；與IL-1 β具有45-72%的同一性和與IL-IRa具有 45-80%的同一性；與IL-1 β具有45-72%的同一性和與IL-IRa具有53-80%的同一性；與 IL-1 β具有50-72%的同一性和與IL-IRa具有53-70%的同一性；與IL-1 β具有60-72% 的同一性和與IL-IRa具有53-68%的同一性；與IL-1 β具有65-72%的同一性和與IL-IRa 具有54-60%的同一性；或與IL-1 β具有68-72%的同一性和與IL-IRa具有54-57%的同 一性。例如，嵌合結(jié)構(gòu)域可與IL-1 α具有40-90%的同一性和與IL-IRa具有35-85%的同 一性；與IL-1 α具有40-80%的同一性和與IL-IRa具有45-80%的同一性；與IL-1 α具有 45-72%的同一性和與IL-IRa具有45-80%的同一性；與IL-1 α具有45-72%的同一性和與 IL-IRa具有53-80%的同一性；與IL-1 α具有50-72%的同一性和與IL-IRa具有53-70%的 同一性；與IL-1 α具有60-72%的同一性和與IL-IRa具有53-68%的同一性；與IL-1 α具 有65-72%的同一性和與IL-IRa具有54-60%的同一性；或與IL-1 α具有68-72%的同一性 和與IL-IRa具有54-57%的同一性。
[0111] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域與IL-IRa相異，并且結(jié)合受體，同時(shí)包括天 然存在的受體拮抗劑（例如IL-IRa)的位點(diǎn)C和/或位點(diǎn)D特征。例如，結(jié)構(gòu)域與人IL-Ιβ 和/或IL-IRa具有少于98、95、92、90、85和80%的同一性。例如，結(jié)構(gòu)域與IL-IRa具有 40-95%、40-90%或45-85%的同一性。結(jié)構(gòu)域還可與IL-1家族細(xì)胞因子激動(dòng)劑例如IL-1 α 或IL-Ιβ具有40-95%、40-90%或45-85%的同一性。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域 包括：來(lái)自第一親代細(xì)胞因子的至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85%的氨基酸，其為 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑。
[0112] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域與受體激動(dòng)劑（例如IL-Ιβ或IL-la)的氨 基酸同一性（例如，至少大于5、10、15或20%)大于與受體拮抗劑（IL-IRa)的同一性，但用 作IL-1RI的拮抗劑。
[0113] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域是完全嵌合的，例如，結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)氨基 酸來(lái)自親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域之一，例如兩個(gè)親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域之一或3個(gè)或更多個(gè)親代 細(xì)胞因子之一。例如，親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域是人細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞因 子結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域是部分嵌合的，例如結(jié)構(gòu)域中的所有氨基酸 不全來(lái)自親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域之一。
[0114] 例如，分離的蛋白質(zhì)結(jié)合IL-1RI并且通過(guò)受體調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，激動(dòng)或拮抗 IL-1RI受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)當(dāng)與IL-Ιβ反應(yīng)性人細(xì)胞接觸時(shí) 未顯著誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，和/或大體上不誘導(dǎo)IL-Ιβ反應(yīng)性受體基因的產(chǎn)生（例如，以 10 μ g/ml、100 μ g/ml或lmg/ml的濃度）。一般而言，蛋白質(zhì)通過(guò)IL-1 β (例如，在本文中 描述的細(xì)胞測(cè)定中以〇. lng/ml的濃度），以小于100、50、20、10或5ηΜ的IC50抑制信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)。蛋白質(zhì)可以通過(guò)IL-Ιβ以小于IL-IRa的IC50(例如，至少小于10、20或50%)的IC50 抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0115] 在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域例如以與親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域之一相同或更 好的親和力結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域以小于100nM、50nM、20nM、10nM、5nM 或InM或小于500ρΜ、400ρΜ、ΙΟΟρΜ或50ρΜ的KD結(jié)合IL-1RI。例如，締合常數(shù)可大于1 X 104、 3X 104、1X 105 或 IX 106Μ?，解離常數(shù)可小于 IX 1(Γ3、1Χ 1(Γ4、6Χ ΚΓ4 或 6X Kr5s'
[0116] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域以比IL-1 β或IL-IRa更好的親和力（例如， 更低的KD)和/或更慢的解離結(jié)合IL-1RI。例如，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可以以小于或等于IL-1 Ra 的解離常數(shù)的解離常數(shù)和/或以大于或等于IL-1 β的締合常數(shù)結(jié)合IL-1RI。
[0117] 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域在長(zhǎng)度上可為約120-180個(gè)氨基酸，在長(zhǎng)度上可為140-170個(gè)氨 基酸，在長(zhǎng)度上可為148-160個(gè)氨基酸，或在長(zhǎng)度上可為150-156個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方 案中，結(jié)構(gòu)域在長(zhǎng)度上為152個(gè)氨基酸，在長(zhǎng)度上為153個(gè)氨基酸或在長(zhǎng)度上為154個(gè)氨 基酸。通常地，結(jié)構(gòu)域包括至少1〇、11或12個(gè)β-鏈，并且是穩(wěn)定折疊的。在一些實(shí)施方 案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域具有至少 38°C、40°C、42°C、44°C、46°C、48°C、50°C、52°C、54°C、56°C、 58°C、60°C、62°C或 64°C 的 Tm，如本文中描述的。其可具有 51-61°C、51-66°C、56-6rC或 56-661：的1'111。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域在至少481：、501：、511：、551：、571：、 58°C或59°C后才開(kāi)始展開(kāi)。例如，其在生理緩沖液中具有至少在IL-IRa和/或IL-Ιβ的 Tm的10°C或5°C內(nèi)的Tm。在一些實(shí)施方案中，其在生理緩沖液中比IL-IRa和/或IL-Ιβ 更具熱穩(wěn)定性。例如結(jié)構(gòu)域在生理緩沖液中可具有比IL-IRa和/或IL-1 β的Tm高至少 2°C、4°C 6°C、7°C或8°C，例如在約0· 5mg/ml的濃度下比IL-IRa和/或IL-1 β的Tm高約 5-12°C、5-10°C或 7-10°C 的 Tm。
[0118] 蛋白質(zhì)可包括本文中描述的其它特性。
[0119] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了包括嵌合IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的分離的 蛋白質(zhì)。IL-1細(xì)胞因子家族成員的實(shí)例包括IL-la、IL-Ιβ、IL-IRa、IL-18、IL-1F5、 IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10和IL-33。細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域可包括前述細(xì)胞因子 之一的受體結(jié)合區(qū)域或包括一種或多種這樣的細(xì)胞因子的元件的蛋白質(zhì)序列。例如，細(xì)胞 因子結(jié)構(gòu)域可包括兩個(gè)或更多個(gè)IL-1細(xì)胞因子家族成員的嵌合結(jié)構(gòu)域。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)長(zhǎng)度為至少5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65或70個(gè)氨基酸并且具有與第一11^-1家族細(xì)胞因子相同的氨 基酸（或與其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性）的區(qū)段，和 長(zhǎng)度為至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40個(gè)氨基酸并且具有與第二IL-1家族細(xì)胞 因子相同的氨基酸（或與其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一 性）的另一個(gè)區(qū)段。嵌合結(jié)構(gòu)域可與第一和第二IL-1家族細(xì)胞因子的之一或兩者具有少 于90、85、80或75%的同一性。
[0121] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二IL-1家族細(xì)胞因子選自IL-Ιβ、IL-la和 IL-IRa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二IL-1家族細(xì)胞因子選自IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7 和IL-1F8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一 IL-1家族細(xì)胞因子選自激動(dòng)劑并且第二家族細(xì)胞因 子選自拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域包括少于120、110、100、90或80個(gè)來(lái)自相 同親代細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的連續(xù)氨基酸。
[0122] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域在至少50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)位置上 與第一 IL-1家族細(xì)胞因子相同，并且在至少50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)位置（包 括可單獨(dú)地與這兩種細(xì)胞因子相同的位置）上與第二IL-1家族細(xì)胞因子相同。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域包括至少2、3或4個(gè)不連續(xù)區(qū)段，每一個(gè)具有至少 5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度并且具有與第一 IL-1家族細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)區(qū)段相 同的氨基酸（或與其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性），并 且在其余位置上包括主要來(lái)自第二IL-1家族細(xì)胞因子的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合 結(jié)構(gòu)域包括4、5、6或7個(gè)區(qū)段，其中相鄰區(qū)段來(lái)自不同的親代IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域。 例如，結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)氨基酸位于來(lái)自天然存在的人IL-1家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度 為至少5或個(gè)6氨基酸的肽中。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域包括如下區(qū)段的至少1、2或 3個(gè)：⑴來(lái)自IL-1 β的長(zhǎng)度為至少50、60、65、70或75個(gè)氨基酸的區(qū)段、（ii)來(lái)自IL-IRa 的長(zhǎng)度為至少15、20、25個(gè)氨基酸的區(qū)段；和（iii)來(lái)自IL-IRa的長(zhǎng)度為至少15、20、25個(gè) 氨基酸的另一個(gè)區(qū)段。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方案中，不連續(xù)區(qū)段包括根據(jù)IL-Ιβ中的這樣的位置的編號(hào)的殘基 (i)1-6 和 45-61、（ii)1-6 和 86-95、（iii)45-61和 86-95、（iv)1-6 和 148-153、（v)45-61和 148-153或（vi) 86-95和148-153。來(lái)自第一 IL-1家族細(xì)胞因子的3個(gè)不連續(xù)區(qū)段可包括 例如根據(jù)IL-1 β中的這樣的位置的編號(hào)的殘基1-8、42-120和141-153、殘基1-10、37-125 和131-153或殘基1-6、45-61、86-95和148-153。嵌合結(jié)構(gòu)域在其余位置上可與第二IL-1 家族細(xì)胞因子具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。在一 個(gè)實(shí)施方案中，不連續(xù)區(qū)段的邊界的一個(gè)或多個(gè)位于其中第一和第二IL-1家族細(xì)胞因子 相同或保守的位置上。蛋白質(zhì)可具有本文中描述的其它特性。
[0125] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了分離的IL-1抑制劑，包括結(jié)合IL-1RI的IL-1 家族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域。例如，IL-1抑制劑包括上述或本文中其它地方描述的一個(gè)或多個(gè)特 性。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括：（a)在下列位置ARG11、SER13、GLN14、GLN15、 GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、 △1^127、61^128、45附29、]\^1'13〇和61^141(根據(jù)11^-10的編號(hào)）上與11^-11^相同的氨基 酸，和（b)在下列位置：ALA1、PR02、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、 LYS55、ILE56、PR057、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150 和 SER152上與IL-1 β相同的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)A區(qū)段A1和A2與IL-IRa的對(duì) 應(yīng)區(qū)段具有至少80%的同一性（總體上）。在一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)B區(qū)段B1、B2和B3與 IL-1 β的對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至少80%的同一性（總體上）。例如，位點(diǎn)A區(qū)段A1和A2與IL-IRa 的對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至少90%的同一性（總體上）；并且位點(diǎn)B區(qū)段Bl、B2和B3與IL-1 β的 對(duì)應(yīng)區(qū)段具有至少90%的同一性（總體上）。例如，位點(diǎn)Α區(qū)段Α1和Α2與IL-IRa的對(duì)應(yīng) 區(qū)段相同；以及位點(diǎn)B區(qū)段B1、B2和B3與IL-Ιβ的對(duì)應(yīng)區(qū)段相同。
[0126] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括與IL-IRa的β鏈β2、β3、β 10和β 11 具有至少80%的同一性（總體上）的序列和與IL-1 β的β鏈β 4、β 6、β 7和β 8具有 至少80%的同一性（總體上）的序列。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括與IL-IRa 的β鏈β 2、β 3、β 10和β 11相同的序列和與IL-1 β的β鏈β 4、β 6、β 7和β 8相 同的序列。在一些實(shí)施方案中，上文中鑒定的來(lái)自IL-1 β的區(qū)段和特性來(lái)源于IL-1 α或 IL-1 β或IL-1 α的組合。
[0127] 在一些實(shí)施方案中，IL-1抑制劑包括下列性質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)（例如，至少2、3、4、 5、6或7個(gè)）：⑴與IL-1 β、IL-1 α或IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少60、70、80、85、88、 90、92、95、98或100%的同一性的位點(diǎn)A或位點(diǎn)B殘基（和/或延伸的位點(diǎn)A和延伸的位點(diǎn) B殘基）；（ii)在總體上與IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100% 的同一性的A1和A2區(qū)段；（iii)在總體上與IL-1 β或IL-1 α中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少80% 的同一性的Β1、Β2和Β3區(qū)段；（iv)與IL-IRa中的對(duì)應(yīng)殘基具有至少80、85、88、90、92、95、 98或100%的同一性的位點(diǎn)A區(qū)域；（v)與IL-1 β或IL-1 α中對(duì)應(yīng)的殘基具有至少80、85、 88、90、92、95、98或100%的同一性的位點(diǎn)Β區(qū)域；（vi)與IL-IRa或IL36Ra中對(duì)應(yīng)的殘基 具有至少50、60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位點(diǎn)C和/或位點(diǎn)D殘基， (vii)與IL-IRa中對(duì)應(yīng)的殘基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性 的C1區(qū)段；（viii)在至少3、4或5個(gè)殘基上與IL-IRa中對(duì)應(yīng)的殘基相同的D2區(qū)段。細(xì) 胞因子結(jié)構(gòu)域與IL-IRa相異，例如，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域與IL-IRa具有少于99、98、95、90、85、 80、75、70、65、60% 的同一性和 / 或與 IL-IRa 具有至少 30、40、45、50、55、60、65、70% 的同一 性，例如與IL-IRa具有40-95%、40-90%或45-85%的同一性。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因 子結(jié)構(gòu)域不包含與 SEQ ID N0:3 的氨基酸 I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、 I46-S110、V49-S110 或 I46-G118 具有大于 80、85、90、95 或 100% 的同一性的區(qū)段。在一些 實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域不包含與SEQ IDNO:l的氨基酸N7-V41、R11-M37、N102-D144 或Y121-D144具有大于80、85、90、95或100%的同一性的區(qū)段。
[0128] 在一些實(shí)施方案中，抑制劑以小于100、50、20、10、5或InM的KD結(jié)合IL-1RI。在 一些實(shí)施方案中，抑制劑以比IL-Ιβ或IL-IRa更好的親和力（例如，更低的K D)和/或更 慢的解離速率結(jié)合IL-1RI。
[0129] 在一些實(shí)施方案中，抑制劑，當(dāng)與IL-1 β反應(yīng)性人細(xì)胞接觸時(shí)大體上不誘導(dǎo)IL-6 表達(dá)。一般而言，抑制劑通過(guò)IL-Ιβ，例如例如以小于100、50、20、10或5恤的扣50抑制信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0130] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括下列序列的1、2、3或更多個(gè)： WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9) ；NLEEK(SEQ ID NO:10) ；RIWDVNQKTFYLRNNQLVA GYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11) ；AMEADQP(SEQ ID NO: 12) ；FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKF Y(SEQ ID NO: 13);和/或與前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性。 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域包括下列序列的1、2、3或更多個(gè)：VQGEESNDKI(SEQ ID N0:14) ;KKKMEKRF(SEQ IDN0:15);和 FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVD PKN YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO: 16);和 / 或與前述序列具有至少 80、85、88、 90、92、95、98或100%的同一性的序列。抑制劑可包括本文中描述的其它特性。
[0131] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了分離的蛋白質(zhì)，其包括與本文中描述的序列例 如表4和實(shí)施例1中所列的序列（例如，P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序 列）或?qū)嵤├?、5、6或本文中其它地方的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99%或100%的同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，氨基酸序列包括 至少至少一個(gè)置換、插入或缺失。氨基酸序列可包括少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或 2個(gè)非保守置換或少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個(gè)總的置換。氨基酸序列可包括 至少1、2、3、4或5個(gè)置換例如保守置換。
[0132] 還提供了分離的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基 酸序列或?qū)嵤├?、5、6中或本文中其它地方的序列的N末端包括甲硫氨酸，以及包括P01、 P02、P03、P04、P05、P06或P07或?qū)嵤├?、5、6中或本文中其它地方的序列的氨基酸序列， 其中N末端上的丙氨基酸不存在。這些形式分別代表完整蛋白質(zhì)的甲二磺?；蚫es-Ala 亞型。還提供了乙酰化的分離的蛋白質(zhì)。乙?；问桨ㄒ阴；耐暾鞍踪|(zhì)、乙?；锥?橫酸酯化蛋白質(zhì)和乙?；痙es-Ala亞型。前述序列可包括本文中公開(kāi)的其它特性。例如， 序列還可在例如相對(duì)于IL-1RI結(jié)合序列的N末端或C末端包括標(biāo)簽，例如六組氨酸序列。 序列還可包括改變IL-1RI結(jié)合序列的穩(wěn)定性或藥代動(dòng)力學(xué)的部分。序列還可包括血清白 蛋白和/或其Fc結(jié)構(gòu)域或其一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，例如一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域或 一個(gè)或多個(gè)白蛋白結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)可具有本文中描述的其它特性。在一些實(shí)施方案中，分 離的蛋白質(zhì)由本文中公開(kāi)的序列或嵌合結(jié)構(gòu)域組成或基本上由所述序列或結(jié)構(gòu)域組成。
[0133] 在其它方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了分離的蛋白質(zhì)，其包括具有本文中描述的細(xì)胞因 子結(jié)構(gòu)域例如表4中所列的細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀排列形式的結(jié)構(gòu)域和/或包括SEQ ID N0:3的結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)還可在互換形式的N或C末端具有任選地通過(guò)接頭間隔的異源序列 (例如Fc結(jié)構(gòu)域或白蛋白）。蛋白質(zhì)可具有本文中描述的其它特性。
[0134] 本公開(kāi)內(nèi)容還表征了包含一種或多種本文中描述的受體結(jié)合劑（例如包括嵌合 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)）的藥物組合物。組合物可以是眼科藥物組合物、局部組合物或 用于胃腸外施用的組合物。
[0135] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了調(diào)節(jié)受試者的免疫或炎癥反應(yīng)的方法。方法可 包括以有效地調(diào)節(jié)受試者的免疫或炎癥反應(yīng)的量給受試者施用包含本文中描述的受體結(jié) 合劑的組合物。
[0136] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了治療受試者的IL-1介導(dǎo)的障礙的方法。方法包 括給受試者施用包含可結(jié)合IL-1RI的蛋白，例如本文中描述的受體結(jié)合劑的組合物。例 如，障礙可以是自身免疫障礙例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、斯耶格倫氏 綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、白塞氏綜合征、炎性腸病、哮喘、脈管炎或銀屑病。障礙可以是與聚 集體形成相關(guān)的障礙，例如，高尿酸血癥、痛風(fēng)、糖尿?。òǚ且纫蕾囆蕴悄虿。?、阿爾茨 海默病、第二反應(yīng)性淀粉樣變性、肌萎縮側(cè)索硬化（ALS)、亨廷頓病或帕金森氏病。障礙可以 是CAPS(CIAS1相關(guān)周期性綜合征）障礙或本文中描述的其它障礙。
[0137] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了治療受試者的IL-1介導(dǎo)的眼障礙的方法。方法 可包括給受試者施用包含可結(jié)合IL-1RI的蛋白例如本文中描述的受體結(jié)合劑的組合物。 例如，組合物是給受試者的眼或周圍區(qū)域局部施用的眼科組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，障 礙是干眼障礙。在一些實(shí)施方案中，受試者不顯示全身性自身免疫性病的表現(xiàn)。在一些實(shí) 施方案中，受試患有斯耶格倫氏綜合征。在一些實(shí)施方案中，受試者具有移植物抗宿主病 (GVHD)。在其它實(shí)施方案中，障礙是葡萄膜炎。
[0138] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了抑制IL-1活性的方法。方法包括將可結(jié)合 IL-1RI的受體結(jié)合劑與響應(yīng)IL-1的細(xì)胞或與受試者接觸。一般而言，以有效地抑制與細(xì)胞 相關(guān)的IL-1活性或受試者中的IL-1活性的量提供蛋白質(zhì)。可將蛋白質(zhì)離體地與來(lái)自受試 者的細(xì)胞接觸。
[0139] 在另一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容表征了分離的核酸，其包括一個(gè)或多個(gè)編碼本文中描 述的蛋白質(zhì)的序列或本文中（例如，表5中）描述的核酸，與這樣的核酸雜交或與這樣的核 酸具有至少 80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或100%的同一性的序 列。示例性雜交序列可在長(zhǎng)度上具有至少200、300、400、420或450個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為 420-480個(gè)核苷酸。核酸還可包括本文中公開(kāi)的其它特性。
[0140] 還表征了重組宿主細(xì)胞，其包含包括一個(gè)或多個(gè)編碼本文中描述的蛋白質(zhì)的序列 的核酸及其多肽鏈。受體結(jié)合劑可通過(guò)這樣的方法產(chǎn)生，所述方法包括將宿主細(xì)胞維持在 允許受體結(jié)合劑表達(dá)的條件下，和任選地例如從細(xì)胞或與宿主細(xì)胞相關(guān)的培養(yǎng)基回收受體 結(jié)合劑。例如，可從細(xì)胞的裂解物純化受體結(jié)合劑?？梢岳缋觅x形劑、穩(wěn)定劑和緩沖劑 的一種或多種配制純化的受體結(jié)合劑。
[0141] 還表征了提供嵌合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的方法。方法包括鑒定至少2個(gè)具有共同折疊的 親代蛋白質(zhì)（例如，第一親代蛋白質(zhì)和第二親代蛋白質(zhì)）、定位第一親代蛋白質(zhì)內(nèi)的至少兩 個(gè)區(qū)段和構(gòu)建核酸，所述核酸具有編碼包括兩個(gè)來(lái)自第一親代蛋白質(zhì)的區(qū)段和在其余位置 上主要來(lái)自第二親代蛋白質(zhì)的殘基的嵌合氨基酸序列的序列。結(jié)構(gòu)域可以是主要由β-折 疊片組成的結(jié)構(gòu)域或主要由α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)域或具有這樣的元件的組合的結(jié)構(gòu)域。例 如，結(jié)構(gòu)域可具有細(xì)胞因子的折疊。第一和第二親代蛋白質(zhì)可通過(guò)同源性例如10-40%氨基 酸的同一性相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自第一蛋白質(zhì)的區(qū)段位于單個(gè)折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域內(nèi)，并且嵌合氨基酸序列包括與第一和第二親代蛋白質(zhì)中的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域不同一的折疊蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形式。在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)親代蛋白質(zhì)具有不同的功能性質(zhì)，并且嵌合結(jié) 構(gòu)域可具有親代蛋白質(zhì)之一或兩者的性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)來(lái)自 第一親代蛋白質(zhì)的結(jié)合界面，和另一個(gè)來(lái)自第二親代蛋白質(zhì)的結(jié)合界面。
[0142] 在本文中參考IL-1家族細(xì)胞因子中與位點(diǎn)A、B、C和D相關(guān)的不同區(qū)域、區(qū)段和殘 基。這樣的殘基、區(qū)段和區(qū)域在人IL-1 MSEQ ID NO: 1)的序列中的定位及對(duì)應(yīng)的位置提供 于下文中和圖1中：
[0143] 位點(diǎn) A。IL-Ιβ 中的位點(diǎn) A 殘基包括：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、SER21、GLU25、 LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLU128、ASN129 和 MET130， 其它IL1細(xì)胞因子家族成員的對(duì)應(yīng)殘基（在本文中稱為"位點(diǎn)A殘基"）。在某些特別地 與IL-1 β相關(guān)的上下文中，參考"延伸的位點(diǎn)殘基"，其包括位點(diǎn)A殘基以及GLN149和 PHE150,以及其它IL1細(xì)胞因子家族成員的對(duì)應(yīng)殘基。此外，其可能定義如圖4中所示的"位 點(diǎn)A區(qū)域"，包括例如A1區(qū)段（在IL-1 β中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的11-36)和A2區(qū)段（在 IL-Ιβ中對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:1的125-131)和其它IL1細(xì)胞因子家族成員中的對(duì)應(yīng)區(qū)段。
[0144] 位點(diǎn) B。IL-1 β 中的位點(diǎn) B 殘基包括：ALAI、PR02、ARG4、GLN48、GLU51、ASN53、 ILE56、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105 和 ASN108、以及其它 IL1 細(xì)胞因子家族成員的 對(duì)應(yīng)殘基（在本文中稱為"位點(diǎn)B殘基"）。在某些特別地與IL-Ιβ相關(guān)的上下文中，參考 "延伸的位點(diǎn)B殘基"，其包括位點(diǎn)B殘基以及在圖4中的位點(diǎn)B區(qū)域外的PHE46和SER152。 此外，其可能定義如圖4中所示的"位點(diǎn)B區(qū)域"，包括例如B1區(qū)段（在IL-Ιβ中對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 1 的 1-5)、B2 區(qū)段（在 IL-1 β 中對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 1 的 48-56)和 B3 區(qū)段（在 IL-Ιβ中對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:1的92-98)，以及其它IL1細(xì)胞因子家族成員中的對(duì)應(yīng)區(qū)段。
[0145] 位點(diǎn) C。IL-Ιβ 中的位點(diǎn) C 殘基包括：ILE104、ILE106、ASN107、LYS109、GLU111、 THR137、LYS138、GLY139、GLY140、GLN141、THR144 和 ASP145 以及其它 IL1 細(xì)胞因子家族成 員的對(duì)應(yīng)殘基（在本文中稱為"位點(diǎn)C殘基"）。此外，其可能定義如圖4中所示的"位點(diǎn)C 區(qū)域"，包括例如C1區(qū)段（在IL-1 β中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的136-145)和其它IL1細(xì)胞因 子家族成員中的對(duì)應(yīng)區(qū)段。
[0146] 位點(diǎn) D。IL-1 β 中的位點(diǎn) D 殘基包括：LEU6、THR9、LYS63、GLU64、LYS65 和 ASN66 以及其它IL1細(xì)胞因子家族成員的對(duì)應(yīng)殘基（在本文中稱為"位點(diǎn)D殘基"）。此外，其可 能定義如圖4中所示的"位點(diǎn)D區(qū)域"，包括例如D1區(qū)段（在IL-1 β中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1 的6-9)、D2區(qū)段（在IL-1 β中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的37-41)、D3區(qū)段（在IL-1 β中對(duì)應(yīng) 于 SEQ ID NO: 1 的 63-66)、D4 區(qū)段（在 IL-1 β 中對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 1 的 86-91)和 D5 區(qū)段 (在IL-1 β中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的150-153)，以及其它IL1細(xì)胞因子家族成員中的對(duì)應(yīng) 區(qū)段。
[0147] 位點(diǎn)A、B、C和D的殘基和區(qū)域的位置的進(jìn)一步鑒定可通過(guò)所述細(xì)胞因子與圖4中 顯示的序列的比對(duì)來(lái)發(fā)現(xiàn)。
[0148] 本文中參照的 IL-1 β (人）的氨基酸序列是：APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALH LQGQDMEQQVVFSMSFVQ GEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK RFVFNKIEI NNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFT MQFVSS(SEQ ID NO: 1) 〇
[0149] 本文中參照的 IL-1 α (人）的氨基酸序列是：SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQ SIIRANDQYLTAAALHNLDEA VKFDMGAYKSSKDDAKI TV ILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTI TGSE TNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDF QILENQA(SEQ ID N0:2) 〇
[0150] 本文中參照的 IL-IRa(人）的氨基酸序列是：RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQ LVAGYLQGPNVNLEEKIDV VPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKS⑶ETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRF AFIRSDS GPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY FQED(SEQ ID N0:3)。本文中使用的術(shù)語(yǔ) IL-1 β、IL-1 α和IL-IRa是指各自成熟的蛋白質(zhì)。
[0151] 本文中參照的和圖4中顯示的β折疊片是指下列序列：
[0152] 表 1
[0153]
【權(quán)利要求】
1. 一種純化包含與SEQ ID N0:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的嵌合 細(xì)胞因子蛋白質(zhì)制劑的方法，所述方法包括使用陽(yáng)離子交換柱、陰離子交換柱或羥基磷灰 石柱的至少兩種來(lái)純化所述蛋白質(zhì)制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包括使用陽(yáng)離子交換柱、陰離子交換柱和羥基磷灰 石柱的全部3種來(lái)純化所述蛋白質(zhì)制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中從在至少1升培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸 桿菌細(xì)胞收獲所述嵌合細(xì)胞因子蛋白質(zhì)制劑，其中所述大腸桿菌細(xì)胞含有包含核酸序列的 質(zhì)粒，所述核酸序列在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下表達(dá)所述嵌合細(xì)胞因子蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中在0. 05mM至0. 8mMEDTA存在的情況 下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少2. 5mM EDTA存在的情況下裂 解所述細(xì)胞。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中： (a) 將所述嵌合細(xì)胞因子蛋白質(zhì)制劑施用于陽(yáng)離子交換柱（CEX); (b) 用不洗脫所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗滌緩沖液洗滌所述陽(yáng)離子交換柱，并且用洗 脫緩沖液從所述陽(yáng)離子交換柱洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)以提供包含所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的CEX 洗脫物； (c) 將所述CEX洗脫物施用于陰離子交換表面； (d) 收集來(lái)自所述陰離子交換柱的所述流通液（AEX流通液），將其加載至陶瓷羥基磷 灰石柱（CHA)上； (f)從所述CHA柱洗脫所述結(jié)合的蛋白質(zhì)； 從而純化所述嵌合細(xì)胞因子蛋白質(zhì)制劑。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中完整蛋白質(zhì)對(duì)des-Ala蛋白質(zhì)亞型、 甲二磺酰化蛋白質(zhì)亞型和乙?；鞍踪|(zhì)亞型的比率在純化后增加。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化的制劑包含少于10%的所述 蛋白質(zhì)的des-Ala形式，少于10%的所述蛋白質(zhì)的乙?；问胶蜕儆?0%的所述蛋白質(zhì)的 甲二磺?；问?。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化的制劑包含少于百萬(wàn)分之 50的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化的蛋白質(zhì)制劑包含： 70%至100%的完整蛋白質(zhì)； 0%至15%的Des-Ala蛋白質(zhì)亞型； 0%至10%的甲二磺酰化蛋白質(zhì)亞型；和 0%至15%的乙?；鞍踪|(zhì)亞型。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化的蛋白質(zhì)制劑包含： 80%至99%的完整蛋白質(zhì)； 2%至7%的Des-Ala蛋白質(zhì)亞型； 0. 1%至4%的甲二磺?；鞍踪|(zhì)亞型；和 0%至5%的乙?；鞍踪|(zhì)亞型。
12. -種純化嵌合細(xì)胞因子蛋白的方法，所述蛋白包含與SEQ ID N0:21的所述序列具 有至少90%的同一性的氨基酸序列，所述方法包括： (a) 將包含所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式和任選地des-Ala形式的負(fù)載制劑施用 于陽(yáng)離子交換表面； (b) 用不洗脫所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗滌緩沖液洗滌所述陽(yáng)離子交換表面，并且用 所述洗脫緩沖液洗脫所述陽(yáng)離子交換表面以提供包含所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式 的CEX洗脫物； (c) 將所述CEX洗脫物施用于陰離子交換表面； (d) 從所述陰離子交換表面收集流通液（AEX流通液）； (e) 將所述AEX流通液加載至陶瓷羥基磷灰石柱（CHA)上； (f) 洗脫所述CHA柱； (g) 收集包含純化的嵌合細(xì)胞因子蛋白的所述洗脫物； (h) 任選地將所述洗脫物經(jīng)歷超濾和/或滲濾步驟，并且收集包含純化的嵌合細(xì)胞因 子蛋白的所述滲余物。
13. -種嵌合細(xì)胞因子蛋白的純化的制劑，所述蛋白包含與SEQ ID NO:21的序列具有 至少90%的同一性的氨基酸序列，所述制劑使用根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法產(chǎn)生。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的純化的制劑，其中所述蛋白質(zhì)的純度大于90%，其中所述制 劑包含少于10%的des-Ala形式，少于10%的乙?；问胶蜕儆?0%的甲二磺酰化形式。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的純化制劑，其中所述制劑包含少于百萬(wàn)分之 50的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。
16. -種方法，其包括將包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式和任選des-Ala、乙?；?甲二磺酰化形式的負(fù)載制劑施用于陽(yáng)離子交換表面，所述嵌合細(xì)胞因子蛋白包含與SEQ ID NO:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列； 用不洗脫所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的洗滌緩沖液洗滌所述陽(yáng)離子交換表面，并且用洗脫 緩沖液洗脫所述陽(yáng)離子交換表面以提供包含所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式的CEX洗 脫物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述負(fù)載制劑具有小于5、4、3. 5、3. 3mS/cm的電 導(dǎo)率。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述負(fù)載制劑不含去垢劑。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中從先前未被層析的裂解物制備所 述負(fù)載制劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中通過(guò)離心和/或過(guò)濾澄清所述負(fù)載制劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述負(fù)載制劑具有低于6. 0、5. 8、5. 6或5. 4或 5. 3 的 pH。
22. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述負(fù)載制劑包含少于30%、25%或20%的所述 嵌合細(xì)胞因子蛋白的des-Ala形式。
23. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述負(fù)載制劑包含少于30%、25%或20%的所述 嵌合細(xì)胞因子蛋白的乙?；问?。
24. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述負(fù)載制劑包含少于30%、25%或20%的所述 嵌合細(xì)胞因子蛋白的甲二磺?；问?。
25. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其還包括將所述裂解物調(diào)整至低于6. 0的pH以制備 所述負(fù)載制劑。
26. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述陽(yáng)離子交換表面是強(qiáng)陽(yáng)離子交換（CEX)表 面。
27. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述表面包含可被填充至柱子中的CEX基質(zhì)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX基質(zhì)包含交聯(lián)的聚（苯乙烯-二乙烯 苯）珠粒。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述表面包含磺丙基官能團(tuán)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX基質(zhì)是P〇r〇s?XS、CMC-纖維素、 SP-Sephadex?:和SP-Sepharose? FF。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX基質(zhì)存在于大于20ml體積的柱子中。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中用大于1、5或10倍柱體積洗滌所述柱子。
33. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中用具有小于5、4、3. 5或3. 3mS/cm的電導(dǎo)率的緩 沖液洗滌所述柱子。
34. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述洗滌緩沖液具有低于40、30或25mM的NaCl 并且所述洗滌緩沖液具有至少5、10或15mM的NaCl。
35. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中用兩種不同的緩沖液洗滌所述陽(yáng)離子交換表 面。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中一種洗滌緩沖液具有pH5. 3,并且另一種洗滌緩 沖液具有PH6. 2。
37. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述洗脫包括分步洗脫。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分步洗脫包括使用具有更高pH的洗脫緩沖 液。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分步洗脫是從低于5. 5的pH至高于5. 9的 pH〇
40. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分步洗脫包括使用具有增加的鹽濃度和/ 或增加的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述鹽濃度從小于30mM NaCl的濃度增加至大 于40mMNaCl的濃度。
42. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述洗脫緩沖液中的主要鹽是NaCl。
43. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述洗脫緩沖液具有大于4的電導(dǎo)率。
44. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包括具有在至少pH5. 9-6. 1的 范圍內(nèi)的緩沖能力的緩沖液。
45. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述嵌合細(xì)胞因子蛋白的完整形式和des-Ala 形式以不同的動(dòng)力學(xué)洗脫。
46. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述des-Ala形式在所述完整形式之后洗脫。
47. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法通過(guò)使所述des-Ala形式在所述CEX 洗脫物中的百分比相對(duì)于負(fù)載制劑減少至少1、3、5、7或8%來(lái)相對(duì)于所述des-Ala形式富 集所述完整形式。
48. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX洗脫物中的所述des-Ala形式低于20、 15、12或10%的所述總嵌合細(xì)胞因子蛋白。
49. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述乙酰化和甲二磺?；问皆谒鐾暾问?之前洗脫。
50. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法通過(guò)使所述乙酰化和甲二磺酰化形式 在所述CEX洗脫物中的百分比相對(duì)于所述負(fù)載制劑減少至少1、3、5、7或8%來(lái)相對(duì)于所述 乙?；图锥酋；问礁患鐾暾问?。
51. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX洗脫物中的所述乙?；图锥酋；?形式各自低于20、15、12或10%的所述總嵌合細(xì)胞因子蛋白。
52. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述嵌合細(xì)胞因子蛋白在所述CEX洗脫物中的 純度為至少 50、60、70、80、85、90 或 95%。
53. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CEX洗脫物具有比所述負(fù)載制劑更低的 HCP水平。
54. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中將所述CEX洗脫物在其中所述嵌合細(xì)胞因子蛋 白大體上不結(jié)合所述陰離子交換表面的條件下施用于陰離子交換表面。
55. -種嵌合細(xì)胞因子蛋白的制劑，所述嵌合細(xì)胞因子蛋白包含與SEQ ID NO:21的氨 基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列，其中所述制劑包含通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求16所 述的方法獲得的所述CEX洗脫物。
56. -種方法，其包括將包含含有與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少90%的同一 性的氨基酸序列的嵌合細(xì)胞因子蛋白的制劑施用于陰離子交換（AEX)表面；和 從所述陰離子交換表面收集所述AEX流通液。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述AEX流通液包含比用于陰離子交換表面的 制劑更少的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56或57所述的方法，其中所述陰離子交換表面具有100-300微摩爾 Cl_/ml的尚子容量。
59. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述陰離子交換表面是強(qiáng)季銨陰離子交換器。
60. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述陰離子交換表面包括Poros? HQ或 CaptoTM Q陰離子交換樹(shù)脂。
61. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述陰離子交換表面包括膜。
62. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AEX流通液中的內(nèi)毒素相對(duì)于施用于所述 陰離子交換表面的制劑減少。
63. -種產(chǎn)生分批蛋白質(zhì)制劑的方法，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0:21的序列具有至 少90%的同一性的氨基酸序列，所述方法包括如下步驟： 提供來(lái)自在羥基磷灰石柱上純化的所述蛋白質(zhì)的分批制劑的級(jí)分； 通過(guò)wCEX層析評(píng)價(jià)所述級(jí)分以測(cè)定所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问胶图锥?酰化形式的一種或多種的存在；和 基于所述測(cè)定，通過(guò)方法進(jìn)一步處理所述分批蛋白質(zhì)制劑，所述方法包括一個(gè)或多個(gè) 選自澄清、選擇、接受、丟棄、釋放、扣留、加工成藥品、運(yùn)送、移至不同位置、配制、貼標(biāo)簽、包 裝、釋放至商業(yè)中、銷售和提供用以銷售所述批次的步驟。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问胶图锥?磺?；问降囊环N或多種被測(cè)定為以低于10%的水平存在于所述批次中。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中進(jìn)一步加工的步驟包括接受所述批次以產(chǎn)生所 述蛋白質(zhì)制劑。
66. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中評(píng)價(jià)包括基于所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙酰 化形式和甲二磺?；问降囊环N或多種的水平確定所述批次是否滿足預(yù)定參照值。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中評(píng)價(jià)額外地包括儲(chǔ)存所述測(cè)定。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中儲(chǔ)存包括儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀記錄中。
69. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述參照值是從商購(gòu)可得蛋白質(zhì)樣品或從先前 批次測(cè)定的值。
70. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述參照值是或包括由監(jiān)管機(jī)構(gòu)強(qiáng)加的生產(chǎn)標(biāo) 準(zhǔn)。
71. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述參照值是或包括頒布標(biāo)準(zhǔn)。
72. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其還包括基于測(cè)定而改變所述蛋白質(zhì)制劑的產(chǎn)生中 的步驟。
73. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定與所述蛋白質(zhì)制劑的期 望性質(zhì)相關(guān)的存在或量。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述性質(zhì)列于蛋白質(zhì)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上。
75. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述性質(zhì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的美國(guó)藥典中。
76. -種提供嵌合細(xì)胞因子蛋白的方法，所述方法包括： 培養(yǎng)包含編碼含有與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)的核酸序列的大腸桿菌細(xì)胞， 以提供所述嵌合細(xì)胞因子蛋白。
77. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述核酸序列包含在質(zhì)粒中。
78. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述核酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制之 下。
79. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中在至少1升、10L、100L、1000L或5000L的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
80. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID N0:29的核苷酸序列。
81. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述細(xì)胞在具有比LB培養(yǎng)基更豐富的營(yíng)養(yǎng)物含 量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
82. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述細(xì)胞在含有至少0. 5%或1%或1. 2%胰胨蛋 白，至少1%、2%、2. 2%或2. 4%的酵母提取物和/或至少0. 1、0. 2或0. 4%的甘油的培養(yǎng)基中 生長(zhǎng)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄可用IPTG誘導(dǎo)。
84. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中在0D大于5、10、20、30、35或40時(shí)誘導(dǎo)所述細(xì) 胞。
85. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其還包括在金屬螯合劑存在的情況下裂解所述大腸 桿菌細(xì)胞以提供包含蛋白質(zhì)的制劑。
86. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述金屬螯合劑是EDTA并且以大于2. 5mM的濃 度存在。
87. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述裂解緩沖液的pH低于7. 5。
88. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述裂解緩沖液不含去垢劑。
89. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述裂解緩沖液具有低于200mM的NaCl或小于 具有這樣的NaCl濃度的鹽溶液的電導(dǎo)率。
90. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其還包括通過(guò)不超過(guò)3或2個(gè)柱層析步驟從所述裂 解物純化所述蛋白質(zhì)。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述嵌合細(xì)胞因子蛋白在第一柱層析步驟后純 度為至少 50、60、70、80、90 或 95%。
92. -種包含嵌合細(xì)胞因子蛋白的組合物，其中所述組合物通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求85所述 的裂解方法獲得，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90%的同一性 的氨基酸序列。
93. -種嵌合細(xì)胞因子蛋白的純化的制劑，所述嵌合細(xì)胞因子蛋白包含與SEQ ID NO:21 的氨基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列，其中所述嵌合細(xì)胞因子蛋白具有大于 90%的純度，其中所述制劑包含低于10%的des-Ala形式、低于10%的乙?；问胶偷陀?0% 的甲二磺?；问?。
94. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的制劑，其中HCP水平低于lOOOppm。
95. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的制劑，其基本上不含核酸和內(nèi)毒素。
96. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的制劑，其是冷凍干燥的。
97. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的制劑其是含水的。
98. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的制劑，其中所述蛋白為l-100mg/ml。
99. 一種評(píng)價(jià)包含蛋白質(zhì)的制劑的方法，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ IDN0:21的氨基酸序列 具有至少90%的同一性的氨基酸序列，所述方法包括： 獲得如下水平的一個(gè)或多個(gè)或全部的測(cè)定： a) 所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式的水平； b) 所述蛋白質(zhì)的乙?；问降乃?；或 c) 所述蛋白質(zhì)的甲二磺酰化形式的水平； 從而評(píng)價(jià)所述制劑。
100. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述方法還包括將a、b和c的全部的一項(xiàng)或 多項(xiàng)的測(cè)定水平與參照值相比較，其中每一項(xiàng)可具有其自己的參照值。
101. 根據(jù)權(quán)利要求1〇〇所述的方法，其中從以下測(cè)定所述參照值：所述蛋白質(zhì)的商購(gòu) 可得樣品；所述蛋白質(zhì)的另一個(gè)批次；由監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦、公開(kāi)或要求的數(shù)值組；頒布規(guī)范或 標(biāo)準(zhǔn)；由藥典當(dāng)局推薦、公開(kāi)或要求的數(shù)值組。
102. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述測(cè)定包括層析分析。
103. 根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其還包括確定所述制劑是否具有與參照值的預(yù)先 選擇的關(guān)系。
104. 根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中響應(yīng)所述測(cè)定，處理所述制劑，其中處理包括 選擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
105. 根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中響應(yīng)所述測(cè)定，改變用于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的 方法的參數(shù)。
106. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中如果a、b或c中的形式的一個(gè)或多個(gè)的水平 按重量/重量計(jì)低于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%，則處理所述制劑，其中處理包括選 擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
107. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中通過(guò)將前體制劑經(jīng)歷純化步驟來(lái)制備所述制 劑。
108. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中通過(guò)將前體制劑與層析基質(zhì)的一種或多種或 全部接觸來(lái)制備所述制劑。
109. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中通過(guò)將前體制劑以下列順序與陽(yáng)離子交換、陰 離子交換和羥基磷灰石基質(zhì)接觸來(lái)制備所述制劑。
110. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述制劑是純化過(guò)程中的中間產(chǎn)物。
111. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述制劑包含來(lái)自純化過(guò)程的洗脫液。
112. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述制劑包含來(lái)自陽(yáng)離子交換柱的洗脫液。
113. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述制劑包含來(lái)自陰離子交換柱的洗脫液。
114. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其還包括將前體制劑經(jīng)歷純化步驟。
115. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其還包括將前體制劑與層析基質(zhì)接觸。
116. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其還包括將前體制劑與層析基質(zhì)的一種或多種或 全部接觸。
117. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其還包括將前體制劑以下列順序與陽(yáng)離子交換、陰 離子交換和羥基磷灰石基質(zhì)接觸。
118. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所述處理包括配制用于眼內(nèi)施用的制劑。
119. 根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其還包括儲(chǔ)存所述評(píng)價(jià)。
120. 根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中儲(chǔ)存包括儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀記錄中。
121. -種評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)制劑的方法，其包括： 提供來(lái)自在羥基磷灰石柱上純化的蛋白質(zhì)的制劑的分離級(jí)分，其中所述蛋白質(zhì)包含與 SEQ ID NO:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列； 利用弱陽(yáng)離子交換（wCEX)層析分析級(jí)分以測(cè)定所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙酰化形 式和甲二磺?；问降囊环N或多種的水平； 其中如果所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；问降囊环N或多種 以低于10%存在，則處理所述制劑，其中處理包括選擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo) 簽、包裝或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)； 從而分析所述蛋白質(zhì)制劑。
122. -種分析制備蛋白質(zhì)制劑的過(guò)程的方法，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0:21的序列 具有至少90%的同一性的氨基酸序列，所述方法包括： 提供所述蛋白質(zhì)的制劑的分離級(jí)分， 使用根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法分析所述級(jí)分，和 如果所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺?；问降囊环N或多種以低于 10%存在，則至少部分基于所述分析而維持所述過(guò)程。
123. -種處理蛋白質(zhì)制劑的方法，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:21的序列具有至少 90%的同一性的氨基酸序列，所述方法包括： 提供制劑中所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；问降囊环N或多種 的水平的wCEX測(cè)定，和 如果所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式、乙?；问胶图锥酋；问降囊环N或多種以低于 10%存在，則處理所述制劑，其中處理包括選擇、接受、加工成藥品、運(yùn)送、配制、貼標(biāo)簽、包裝 或銷售制劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
124. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其中所述處理包括配制用于眼內(nèi)施用的制劑。
125. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其還包括測(cè)定所述蛋白質(zhì)的活性。
126. -種包含蛋白質(zhì)、鹽、張度劑和去垢劑的組合物，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:21 的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列。
127. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述鹽是檸檬酸鈉、醋酸鈉或氯化鈉或三 羥基氨甲烷醋酸鹽。
128. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述去垢劑是泊洛沙姆188、聚山梨酯20、 聚山梨酯80或聚乙氧基化物。
129. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述張度劑是山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻 糖或甘油。
130. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，所述組合物具有pH5. 5、pH5. 6、pH5. 8、pH5. 9、 pH6、ρΗ6· 1、ρΗ6· 3、ρΗ6· 5 或 ρΗ6· 6。
131. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其包含lmg/mL至20mg/mL的含有SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、10mM檸檬酸鈉、5%山梨醇、0. 1%泊洛沙姆188并且具有pH6。
132. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其適合給眼施用。
133. -種包含蛋白質(zhì)的制劑，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少 90%的同一性的氨基酸序列，所述制劑包含： a) 0%至15%的所述蛋白質(zhì)的des-Ala形式； b) 0%至15%的所述蛋白質(zhì)的乙?；问剑缓? c) 0%至15%的所述蛋白質(zhì)的甲二磺?；问?。
134. 根據(jù)權(quán)利要求133所述的制劑，其中所述制劑中至少80、90、95、99%的蛋白質(zhì)是所 述蛋白質(zhì)和來(lái)自a、b和c的形式。
135. 根據(jù)權(quán)利要求133所述的制劑，其包含至少6克、60克、600克、6000克、10kg、 50kg、100kg或150kg的所述蛋白質(zhì)。
136. -種包含多肽的制劑，所述制劑包含： 70%至100%的所述多肽； 0% 至 15% 的 Des-Ala 多肽； 0%至10%的甲二磺?；嚯?；和 0%至15%的乙酰化多肽， 其中所述多肽包含與SEQ ID N0:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列。
137. 根據(jù)權(quán)利要求136所述的制劑，所述制劑包含： 80%至99%的所述多肽； 2%至7%的Des-Ala多肽； 0. 1%至4%的甲二磺?；嚯?；和 0%至5%的乙酰化多肽。
【文檔編號(hào)】C07K14/545GK104066439SQ201280046036
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】T.M.巴恩斯, J.侯, G.扎比斯-帕帕斯托伊西斯, E.B.希爾莫, G.L.麥克尼爾, K.戈?duì)柕? 申請(qǐng)人:十一生物治療股份有限公司