人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種編碼基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的基因，為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述基于人核糖核酸酶4的重組蛋白為SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了上述基于人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化的方法，包括以下步驟：優(yōu)化RNASE4編碼基因的密碼子，使其適合于大腸桿菌原核表達；構(gòu)建RNASE4蛋白原核表達質(zhì)粒pET-11a-RNASE4；誘導大腸桿菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表達重組RNASE4蛋白；分離和純化重組RNASE4蛋白。該蛋白用于制備治療神經(jīng)退行性疾病的輔助藥物。
【專利說明】人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及人核糖核酸酶4蛋白的重組表達及其分離純化的方法，以及其在治療 神經(jīng)退行性疾病中的應用，屬于生物技術和生物制藥領域。

【背景技術】
[0002] 核糖核酸酶-4(Ribonuclease-4,RNASE4)蛋白最初是從腫瘤細胞培養(yǎng)液中純化 和鑒定的，被稱為"腫瘤核糖核酸酶"。成熟的RNASE4蛋白是一個由119個氨基酸殘基組成 的分泌型單鏈堿性蛋白質(zhì)，相對分子量約為13. 8kDa。RNASE4蛋白作為核糖核酸酶A超家族 的成員，主要通過水解底物RNA參與各種生物學過程。與家族其它成員相同，RNASE4蛋白專 一性水解RNA鏈上的嘧啶核苷酸3'端的5'-磷酯鍵，進而產(chǎn)生寡核苷酸或核苷酸。RNASE4 蛋白保留了該家族共有的結(jié)構(gòu)特性，包括三個酶催化位點（His-12，Lys-40和His-116)、保 守序列CKXXNTF(XX為任意氨基酸）和由8個半胱氨酸殘基形成的分子內(nèi)二硫鍵化7825-Cys81,Cys39_Cys92,Cys57_Cysl07 和Cys64_Cys71)。然而，RNASE4 蛋白又具自身的結(jié)構(gòu) 特征。與牛胰核糖核酸酶A(RNaseA)結(jié)構(gòu)相比較，該酶的C端缺少了核糖核酸酶活性位 點Ser-123,并且核酸催化結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一些氨基酸殘基也被相應的替換，如RNaseA上 Pro-42、Val-43 和Lys-104 分別被RNASE4 上Arg-41、Phe-42 和Arg-101 替換。以上獨特 的結(jié)構(gòu)導致RNASE4蛋白有別于其它核糖核酸內(nèi)切酶，即更偏好于水解尿嘧啶核苷酸而非 胞嘧啶核苷酸。事實上，體外核苷酸酶切反應顯示，RNASE4蛋白水解雙核苷酸能力依次為 UpA>UpG>UpC>UpU，其水解酵母tRNA產(chǎn)生的寡核苷酸3'端也絕大多數(shù)是尿嘧啶核苷酸。此 夕卜，RNASE4蛋白是整個核糖核酸酶A超家族中進化最為保守的成員。RNASE4蛋白的一級序 列在脊椎動物中的相似度高達90%，遠高于家族其它成員。RNASE4蛋白這種高度的物種間 保守性和獨有的尿嘧啶核苷酸酶切偏好性，提示該酶可能通過其獨特的核糖核酸酶活性執(zhí) 行一些基本的生物學功能。
[0003] 至今，RNASE4蛋白有如下生物學功能：1)RNASE4蛋白可參與宿主防御，是⑶8+T細 胞響應艾滋病病毒（HIV)X4病毒株感染而釋放的兩種核糖核酸酶之一，其基本作用機制是 降解病毒RNA而抑制X4病毒株的復制；2)RNASE4蛋白可促進血管新生，該活性也依賴于核 糖核酸酶活性；3)RNASE4蛋白可誘導小鼠胚胎干細胞分化成為神經(jīng)細胞，并在應激條件下 保護神經(jīng)細胞的存活，注射重組人類RNASE4蛋白可以顯著延緩小鼠的體重下降和神經(jīng)肌 肉功能的衰退。因此，RNASE4蛋白是一種潛在的抗病毒以及治療神經(jīng)退行性疾病的藥物。
[0004] 由于人源細胞中天然狀態(tài)的RNASE4蛋白含量非常低，分離獲得大量天然產(chǎn)物十 分困難。而多肽合成成本過高，缺乏作為藥物生產(chǎn)的應用前景。迄今為止，亦無文獻報道過 人源RNASE4蛋白原核表達純化方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純 化方法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種編碼基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的 基因，為SEQIDN0 :2所示的核苷酸序列；
[0007] 所述基于人核糖核酸酶4的重組蛋白為SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列。
[0008] 備注說明：
[0009] SEQIDN0 :2的序列特征如下：長度：375bp，類型：脫氧核苷酸序列，鏈型：雙鏈， 拓撲結(jié)構(gòu)：線性，特征：序列5'端和3'端下劃線標注為加入的限制性內(nèi)切酶BamHI和Nhe I位點，加粗標注的"ATG"為起始密碼子、"TAA"為終止密碼子。來源：人工合成。
[0010] SEQIDN0 :1的序列特征如下：長度：120個氨基酸，類型：氨基酸，鏈型：單鏈，拓 撲結(jié)構(gòu)：線型，特性：成熟的RNASE4蛋白包含120個氨基酸，分子量為13.8kDa，等電點為 10. 3 ;來源：人類。
[0011] 本發(fā)明還同時提供了基于人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化的方法，包 括以下步驟：
[0012] 1)、優(yōu)化RNASE4編碼基因的密碼子，使其適合于大腸桿菌原核表達；
[0013]2)、構(gòu)建RNASE4蛋白原核表達質(zhì)粒pET-lla-RNASE4;
[0014]3)、誘導大腸桿菌BL21 (DE3/pET-lla-RNASE4)表達重組 RNASE4 蛋白；
[0015] 4)、分離和純化重組RNASE4蛋白：
[0016] 包括細菌包涵體獲取、蛋白質(zhì)變性和復性、SP-瓊脂糖凝膠離子交換色譜純化以及 C18反相高效液相色譜進一步純化。
[0017] 本發(fā)明還同時提供了上述基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的用途：制備治療神經(jīng) 退行性疾病的輔助藥物。
[0018] 即，基于人核糖核酸酶4的重組蛋白（RNASE4重組蛋白）具有促進神經(jīng)細胞分化 和減緩神經(jīng)細胞受損進程作用。
[0019] 作為本發(fā)明的基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的用途的改進：神經(jīng)退行性疾病包 括肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森綜合癥、阿爾茨海默病。
[0020] 具體而言：
[0021] 本發(fā)明涉及一種重組人核糖核酸酶4(RNASE4,其成熟蛋白質(zhì)序列如SEQID NO. 1所示）蛋白的原核表達和分離純化的技術方案。本發(fā)明的具體技術方案如下：優(yōu) 化RNASE4編碼基因的密碼子，構(gòu)建RNASE4蛋白原核表達質(zhì)粒，誘導大腸桿菌BL21 (DE3/ pET-1la-RNASE4)表達重組RNASE4蛋白，分離和純化重組RNASE4蛋白。
[0022] 本發(fā)明的基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的活性包括核糖核酸酶活性和促血管 生成活性。
[0023] 本發(fā)明的基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的應用為：在制備治療神經(jīng)退行性疾病 輔助藥物中的應用。即：RNASE4重組蛋白具有促進神經(jīng)細胞分化和減緩神經(jīng)細胞受損進程 作用，可作為神經(jīng)退行性疾?。ò∥s側(cè)索硬化癥、帕金森綜合癥、阿爾茨海默病等） 輔助藥物。
[0024] 本發(fā)明根據(jù)人RNASE4基因的編碼序列，通過大腸桿菌同義密碼子優(yōu)化，構(gòu)建原核 表達質(zhì)粒，并且通過上述一系列的分離和純化過程，最終獲得RNASE4重組蛋白。
[0025] 本發(fā)明具有以下三方面的有益效果：
[0026] 1)本發(fā)明方法操作簡單，可以降低生產(chǎn)成本；
[0027] 2)本發(fā)明中RNASE4重組蛋白純度搞到99. 9%以上，且密碼子優(yōu)化后得率高，適應 于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；
[0028] 3)本發(fā)明中RNASE4蛋白具有保護神經(jīng)退行性疾病的效果，可以作為潛在的治療 藥物，具有重要的研究和醫(yī)用價值。
[0029] 本發(fā)明制備而得的重組RNASE4蛋白的使用方法和用量參照RNASE4蛋白。
[0030] 綜上所述，本發(fā)明描述了一套原核表達和分離純化RNASE4重組蛋白的技術方案， 通過構(gòu)建原核表達載體pETlla-hRNASE4,且對RNASE4蛋白的編碼密碼子進行優(yōu)化，在大腸 桿菌中高效表達重組RNASE4蛋白，進一步，分離和純化出純度高達99. 9%以上的具有核糖 核酸酶活性的重組RNASE4蛋白。本發(fā)明為研究RNASE4蛋白的生物學功能以及將其開發(fā)成 治療神經(jīng)退行性疾病新藥提供了基本實驗材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0032] 圖1是pET-lla_RNASE4質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；
[0033] 圖2是RNASE4重組蛋白表達效率圖；
[0034] 電泳泳道1表示未經(jīng)IPTG誘導的細菌裂解液，電泳泳道2表示經(jīng)IPTG誘導后的 細菌裂解液。
[0035] 圖3是C18反相高效液相色譜的色譜圖和峰值；
[0036] 圖4是RNASE4重組蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果；
[0037] 圖5是RNASE4重組蛋白的核糖核酸酶活性檢測（tRNA降解實驗）圖；
[0038] 圖6是RNASE4重組蛋白的核糖核酸酶活性檢測（總RNA降解實驗）圖；
[0039] 圖7是RNASE4重組蛋白促血管生成活性檢測（管腔形成實驗）圖；
[0040] 圖8是RNASE4基因密碼子優(yōu)化對其表達量的影響圖。

【具體實施方式】
[0041] 以下結(jié)合具體實施例對上述純化的RNASE4重組蛋白的應用做進一步說明。應理 解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。RNASE4蛋白具有核糖核酸酶和 促血管生成的活性。為此，本發(fā)明還包括RNASE4重組蛋白的生物學活性檢測。
[0042] 實施例1、基于人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化的方法，依次進行以下 步驟：
[0043] 第一，優(yōu)化RNASE4編碼基因的密碼子：
[0044] 根據(jù)《大腸桿菌同義密碼子偏好性表》等改造RNASE4的編碼基因，最終所得的密 碼子優(yōu)化后的序列如SEQIDN0. 2所示。為了方便后續(xù)原核表達載體的構(gòu)建，在合成密碼子 優(yōu)化的RNASE4基因同時在該基因的5' -和3' -端分別加入了限制性內(nèi)切酶BamHI和Nhe I位點（如SEQIDNO. 2中下劃線所示）。合成的基因構(gòu)建于pUC57載體上，便于下一步的 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0045] 第二，構(gòu)建RNASE4蛋白原核表達質(zhì)粒：
[0046] 將合成的RNASE4基因插入原核表達載體pET-lla，具體實驗過程如下：利用限制 性內(nèi)切酶BamHI和NheI酶切pUC57-RNASE4質(zhì)粒獲取密碼子優(yōu)化后的RNASE4基因片段， 于此同時原核表達載體pET-lla用BamHI和NheI酶切獲得線性化載體；接下來，利用T4DNA連接酶將RNASE4基因片段連接至線性化pET-lla載體上，經(jīng)細菌轉(zhuǎn)化、單克隆挑取、 質(zhì)粒提取以及測序確定讀碼框一致后，獲得RNASE4原核表達質(zhì)粒pET-1la-RNASE4。上述質(zhì) 粒構(gòu)建如圖1所示。
[0047] 第三，誘導大腸桿菌BL21 (DE3/pET-lla-RNASE4)表達重組RNASE4蛋白。
[0048] 將上述構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒pET-lla-RNASE4轉(zhuǎn)化到表達大腸桿菌BL21 (DE3)，具 體誘導表達過程如下：擴增培養(yǎng)表達菌后，將菌重新接種于1升新的2xYT培養(yǎng)液（配方： 1.6% (w/v)胰蛋白胨，1% (w/v)酵母提取物，0.5% (w/v)NaCl，和50mg/ml氨節(jié)青霉素） 中，37°C恒溫搖菌至0D_ = 0. 6?0. 8之間；加入0. 5mM異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)于 37°C誘導表達2小時后，于12000rpm離心2分鐘，得到含有所述RNASE4重組蛋白的菌體。
[0049] 備注說明：1. 6% (w/v)代表：每1000ml中含有16g。其余類同。
[0050] 然后，用100mlPBS重懸上述菌體后，取樣10yl加入2XSDS凝膠上樣緩沖液 lOiil，于100°C煮沸10分鐘；離心（12000rpm離心1分鐘）后的上清作為樣品，用15% SDS-PAGE分離細菌裂解液（即，作為樣品的上清），用考馬斯亮藍染色分析重組RNASE4蛋 白表達情況。上述分析如圖2所示，電泳泳道1表示未經(jīng)IPTG誘導的細菌裂解液，電泳泳 道2表示經(jīng)IPTG誘導后的細菌裂解液。通過圖2,我們得出結(jié)論：RNASE4重組蛋白誘導表 達成功。
[0051] 第四，分離和純化重組RNASE4蛋白，該過程主要涉及細菌包涵體獲取、蛋白質(zhì)變 性和復性、SP-瓊脂糖凝膠離子交換色譜以及C18反相高效液相色譜等步驟；
[0052] 具體如下：
[0053] ①細菌包涵體獲?。?br> [0054] RNASE4重組蛋白主要以包涵體的形式存在于表達菌體中，IPTG誘導表達后的5g 菌體（g卩，含上述RNASE4重組蛋白的菌體）經(jīng)100mlPBS洗滌后，重懸于100ml細菌裂解液 (配方：50mMTris-HClpH8. 0, 2mMEDTA，lOOmMNaCl，1%TritonX-100(v/v)，lmg/ml溶 菌酶），于室溫放置1小時。利用超聲波破碎儀對細菌進行超聲破碎（超聲方案：寧波新芝 超聲細胞破碎儀，功率400W，超30秒，間隔30秒，超聲5分鐘），細菌懸液于4°C、12000rpm 離心20分鐘后取沉淀，上述沉淀用100ml包涵體洗滌緩沖液（配方：50mMTris-HCl，pH 7. 5, 1%TritonX-100(v/v))在常溫下重懸后，攪拌洗滌30分鐘，于4°C、12000rpm離心 20分鐘后，棄去上清液，重復一次洗滌過程（即，重復使用包涵體洗滌緩沖液重懸、洗滌、離 心），最后獲得淡黃色透明膠狀的包涵體。
[0055] ②蛋白質(zhì)變性：
[0056] 然后，利用強變性劑鹽酸胍溶液（配方：7MGuanidinehydrochloride(鹽酸 狐），0.15Mreducedglutathione(還原型谷胱甘膚），0.1MTris-HCl，2mMEDTA(乙二胺 四乙酸），pH8.0)在惰性環(huán)境下溶解包涵體（用量比為：2g包涵體配用20ml強變形劑鹽 酸胍溶液），用磁力攪拌子不斷混勻，反應2小時（反應溫度為25°C)，再次離心（12000rpm 離心10分鐘），收集獲得上清用0. 45微米濾膜過濾。
[0057] 經(jīng)過本步驟，包涵體基本溶解，RNASE4蛋白呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全 部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但是其一級結(jié)構(gòu)和共價鍵并未破壞。
[0058] ③蛋白質(zhì)復性
[0059] 上述收集得到的20ml變性RNASE4蛋白溶液逐滴滴入1L的復性緩沖溶液（0. 5M L-Arginine-HCl (L-精氨酸鹽酸鹽），pH 8. 0, 0? 6mM Oxidized glutathione(氧化型谷胱 甘肽）），室溫中靜置24小時，于4°C、12000rpm離心去除沉淀，并稀釋于五倍體積的雙蒸水 中，得到復性的RNASE4蛋白溶液。
[0060] ④、SP-瓊脂糖凝膠離子交換色譜純化：
[0061] 取陽離子交換基質(zhì)SP-Sepharose裝柱，柱體積5. 4X20cm，用平衡緩沖溶液（配 方：25mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH8.0)流洗平衡層析柱，同時調(diào)整好紫外蛋白檢測儀的量 程及記錄儀靈敏度。將收集的復性的RNASE4蛋白溶液以3ml/min流速上樣。用平衡緩沖 溶液平衡緩液沖直至流出液吸光值恢復至基線。用洗脫緩沖液（配方：25mM Tris-HC1，1M NaCl，pH8. 0)以lml/min的流速洗脫RNASE4重組蛋白，收集穿過峰，量體積并測量蛋白質(zhì)濃 度。
[0062] ④C18反相高效液相色譜進一步純化：
[0063] 經(jīng)過SP-瓊脂糖凝膠離子交換色譜純化后的RNASE4重組蛋白液純度可以達到 85%左右，為了進一步得到高純度的RNASE4重組蛋白，利用C18反相高效液相色譜進行進 一步純化。安裝好反相高效液相色譜儀器（該設備一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、 數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成），配制固定相緩沖液A(配方：0. 1% (v/v)TFA(三氟乙酸）） 和流動相緩沖液B(配方：0. 08% (v/v)TFA，異丙醇：乙氰：水為3 :2 :2的體積比）。C18反 相高效液相色譜純化首先利用60% (體積％)的甲醇沖洗色譜柱，去除色譜柱中殘留的雜 質(zhì)，然后按照如下程序進行純化RNASE4重組蛋白。
[0064] C18反相高效液相色譜程序：
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 編碼基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的基因，其特征在于：為SEQ ID NO :2所示的 核苷酸序列； 所述基于人核糖核酸酶4的重組蛋白為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2. 如權(quán)利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4蛋白的重組表達和分離純化的方法，其 特征在于包括以下步驟： 1) 、優(yōu)化RNASE4編碼基因的密碼子，使其適合于大腸桿菌原核表達； 2) 、構(gòu)建RNASE4蛋白原核表達質(zhì)粒pET-lla-RNASE4 ; 3) 、誘導大腸桿菌BL21(DE3/pET-lla-RNASE4)表達重組RNASE4蛋白； 4) 、分離和純化重組RNASE4蛋白： 包括細菌包涵體獲取、蛋白質(zhì)變性和復性、SP-瓊脂糖凝膠離子交換色譜純化以及C18 反相高效液相色譜進一步純化。
3. 如權(quán)利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的用途，其特征在于：制備 治療神經(jīng)退行性疾病的輔助藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于人核糖核酸酶4的重組蛋白的用途，其特征在于：神經(jīng) 退行性疾病包括肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森綜合癥、阿爾茨海默病。
【文檔編號】A61P25/28GK104328131SQ201410449361
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】盛靜浩, 許正平, 李斯琪, 陳光弟 申請人:浙江大學